La présente invention concerne le domaine technique des inhibiteurs de la phosphatase alcaline tissu non-spécifique (TNAP). Plus précisément, l'invention concerne de nouveaux dérivés du benzo[ô]thiophène, présentant une activité inhibitrice de la TNAP et qui sont, notamment, utiles pour le traitement de la calcification du cartilage articulaire dans le cas de l'arthrose à un stade avancé, des enthésophytes et syndesmophytes lors des spondylarthropathies ou de calcifications vasculaires (et en particulier, celles qui sont localisées dans la média des artères chez les patients diabétiques ou atteints d'insuffisance rénale chronique).

Les maladies associées aux calcifications appartiennent à une grande famille de maladies, qui peuvent avoir pour origine non seulement les tissus squelettiques (arthrose, spondylarthrite ankylosante, chondrocalcinose, pseudo goutte, etc.), mais également des tissus non squelettiques (calcification vasculaire).

L'arthrose à un état avancé conduit à une calcification de la matrice du cartilage hyalin articulaire. ^1,2 Les complexes de calcium et de phosphates (BCP, de l'anglais « basic calcium phosphate »), et particulièrement l'hydroxyapatite (HA) sont des cristaux minéraux prédominants dans le cartilage arthrosique ^{1 4} et sont trouvés chez tous les patients ayant l'arthrose à un stade avancé. ⁴

Dans le cas de l'arthrose, les exercices physiques et la perte de poids sont des traitements basiques de choix. Dans le cas de l'arthrose à l'état avancé, la chirurgie de remplacement du joint articulaire, les injections intra- articulaires de stéroïdes ou d'hyaluronate, ou l'utilisation des antiinflammatoires, paracétamol, ou des inhibiteurs de cyclooxygénase 2, etc.. sont actuellement employés. En ce qui concerne les agents antiinflammatoires, aussi efficaces soient-ils pour le traitement de la douleur, ils ne peuvent pas toujours être efficients pour certains patients et ils ne permettent pas de traiter complètement l'arthrose. Par conséquent, il y a un réel besoin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l'arthrose.

Les spondylarthropathies regroupent un ensemble de maladies inflammatoires pouvant engendrer des ossifications pathologiques : la spondylarthrite ankylosante, l'arthrite psoriasique... La spondylarthrite ankylosante est une maladie inflammatoire initialement localisée aux enthèses (insertions osseuses des tendons et ligaments), qui entraîne l'ossification des tendons et ligaments principalement au niveau des vertèbres, et qui conduit à l'ankylose de la colonne vertébrale. L'emploi de médicaments anti-inflammatoires est une stratégie relativement satisfaisante pour soulager la douleur des patients atteints d'arthrite ankylosante. Cependant, l'utilisation d'anti-cytokiniques ou de NSAIDS (de l'anglais « non- steroidal anti-inflammatory drugs ») ne permet pas de freiner l'ossification et l'ankylose chez les patients atteints.

Dans ce contexte, la phosphatase alcaline tissu non-spécifique (TNAP), fortement exprimée dans les tissus minéralisés, et essentielle pour la minéralisation de l'os, représente une cible thérapeutique pertinente pour le traitement des calcifications pathologiques affectant les tendons et les ligaments (spondylarthrite ankylosante), le cartilage (arthrose) ou les artères (calcifications vasculaires). ⁵ TNAP, en hydrolysant les phosphomonoesters et les pyrophosphates (inhibiteur de la formation d'HA) peut favoriser la formation d'HA en fournissant du phosphate inorganique (Pj) selon les conditions physiologiques pendant la croissance de l'os et le remodelage de l'os comme le montre la Figure unique. ⁶ La Figure unique ci-jointe illustre le fait que la TNAP, la protéine ankylosante progressive (ANK), le nucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase-1 extracellulaire (NPP1) et le pyrophosphate (PPi) régulent le dépôt de HA. NPP1 et ANK contribuent à augmenter PPi, tandis que TNAP contribue à diminuer PPi en l'hydrolysant.

Le PPi extracellulaire serait exporté des chondrocytes par l'intermédiaire d'un transporteur ANK ou serait produit à la suite de l'hydrolyse d'un nucléotide triphosphate extracellulaire par NPP1. ⁷ Le PPi est un inhibiteur de formation d'HA et le rapport Pi/PPi pourrait réguler la minéralisation. Par conséquent, la TNAP peut être considérée comme une enzyme antagoniste de l'ANK et de NPPl. Une inhibition sur la TNAP peut avoir des effets drastiques sur la formation minérale, car non seulement elle induit une diminution du produit Ca x Pi et, par conséquent, une réduction de la formation d'HA mais, de plus, elle permet de laisser le PPi non hydrolysé. L'accumulation du PPi (non hydrolysé) va à son tour inhiber la formation d'HA.

L'activité de la TNAP est augmentée lors d'une calcification pathologique comme dans le cas de l'arthrose, ⁶ suggérant que l'inhibition de la TNAP pourrait contribuer à prévenir la calcification de la matrice du cartilage articulaire et à préserver les articulations. De même, dans le cas de la formation des enthésophytes (ossifications à partir des enthèses) et des syndesmophytes (enthésophytes au niveau de la colonne vertébrale), survenant dans la spondylarthrite ankylosante, ainsi que dans le cas des calcifications vasculaires, l'inhibition de la TNAP devrait bloquer les calcifications pathologiques.

Il existe donc un besoin crucial pour de nouvelles molécules telles que les inhibiteurs de la TNAP qui pourraient servir de traitement thérapeutique des calcifications du cartilage dans l'arthrose, des ossifications pathologiques de la spondylarthrite ankylosante et des calcifications vasculaires. ^7,8 En effet, les mécanismes moléculaires conduisant à ces calcifications ectopiques sont très similaires à ceux qui se produisent lors de l'arthrose, ainsi qu'aux mécanismes physiologiques de minéralisation. Les deux types de calcification sont induits par des vésicules matricielles qui ont une activité de phosphatase alcaline élevée. Néanmoins, très peu d'inhibiteurs de phosphatase alcaline, pouvant avoir une activité thérapeutique ont été reportés dans la littérature, à l'exception d'une famille de dérivés de pyrazolo, décrits dans la demande de brevet WO 2009/017863 ⁹ et du levamisole.

Le lévamisole (1) ou le L-stéréoisomère tétramisole est un inhibiteur connu de la TNAP ¹⁰ qui a été utilisé pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, pathologie distincte de l'arthrose. ^11"13 Dans le cas du traitement de la polyarthrite rhumatoïde, le levamisole a été utilisé comme agent immunostimulant vers les années 1970-1980 et non pas en tant qu'inhibiteur de TNAP. La cible du lévamisole en tant qu'immunostimulant n'est pas encore connue et n'est pas forcément la TNAP. Par ailleurs, des effets secondaires du lévamisole tels que des éruptions cutanées et de l'agranulocytose ont été observés, limitant son utilisation thérapeutique. ^14,15 Le lévamisole, en tant qu'inhibiteur spécifique de la TNAP, a servi de molécule de référence par rapport aux autres molécules, afin de pouvoir comparer leur propriété d'inhibition sur la TNAP. Récemment, Millan et al. ont effectué des tests de criblage d'une librairie de macromolécules afin de sélectionner des inhibiteurs de la TNAP ^8,16,17 démontrant le grand intérêt dans la recherche de nouveaux hétérocycles biologiquement actifs. La poursuite de ces travaux a conduit à une famille de dérivés de pyrazolo, décrits dans la demande de brevet WO 2009/017863 ⁹ en tant qu'inhibiteurs de la TNAP. De tels dérivés de pyrazolo sont proposés en tant que médicaments pour le traitement des calcifications vasculaires.

Certains des inventeurs de la présente demande de brevet se sont intéressés à des dérivés de benzo[£]thiophènes (2) et (3) ¹⁸ , dont la formule et les Ki sont repris ci-dessous, avec celle du Lévamisole (1) :

1 2 3

Levamisole (L-tetramisole) 3-Benzo[i>)thiopherio-tetrarriisole 3-Benzol->]t iopheno-2,3-de ydrotetramisole

Κ,= 93 μ Κ,= 85 μΜ Κ,= 135 μΜ

(Le Ki donné est une constante d'inhibition pour un inhibiteur calculé à partir de l'équation Michaelis-Menten ; les mesures de Ki ont été effectuées à pH =7,8 ; 0,1 M tris HCI, 5 mM MgCI ₂ , 5 μΜ ZnCI ₂ et à 37°C, en présence de 6 μg mL ^"1 de TNAP et de 0,01- 1 mM de a a-nitrophosphophénol, la concentration de l'inhibiteur a été variée entre 0,1 et 0,5 mM). Les composés (2) et (3) sont sous forme chlorhydrate.

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont démontré qu'en modifiant la substitution du thiophène de la position 3 à la position 2, non seulement l'activité inhibitrice de la TNAP était conservée, mais celle-ci était significativement augmentée sur le test in vitro tel que détaillé dans les exemples.

Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir de nouveaux inhibiteurs de la TNAP comportant un benzo[£>]thiophène substitué non pas en position 3, mais en position 2, par un hétérocycle azoté.

Aussi, la présente invention concerne les composés de formule (I) :

dans laquelle :

- R-i représente un atome d'hydrogène, de chlore, brome, iode ou fluor, ou un groupe choisi parmi les groupes (CrC ₁₂ )alkyle, cycloalkyle ou aryle, -C(0)(C Ci ₂ )alkyle, -C(0)0(Ci-Ci ₂ )alkyle, -CN, -CHO, -CH ₂ CN, -O-aryle, -R'-N0 ₂ , -R'-COOH, -R'-OH, -0(d-C ₁₂ )alkyle, -R'-S-aryle, -R'-S(C C ₁₂ )alkyle, -NH-OH, -CF _3l -R'-NRaRb, - '-C(0)NRa b avec R' qui représente une liaison directe ou un groupe (CrG alkyle et Ra et Rb identiques ou différents qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ci2)alkyle, cycloalkyle ou aryle ou bien R _a et R peuvent être liés entre eux, pour former avec l'atome d'azote auxquels ils sont liés, une pyrrolidine, une pipéridine, une pipérazine ou une morpholine,

- R ₂ , R3, R4, R5, identiques ou différents, représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, de chlore, brome, iode ou fluor, ou un groupe choisi parmi les groupes (Ci-Ci ₂ )alkyle, -0(Ci-Ci2)alkyle, aryle, O-aryle, -OH, -COOH, -NRcRd avec Rc et Rd identiques ou différents qui représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (CrCi ₂ )alkyle, cycloalkyle ou aryle ou bien Rc et Rd peuvent être liés entre eux, pour former avec l'atome d'azote auxquels ils sont liés, une pyrrolidine, une pipéridine, une pipérazine ou une morpholine,

- Re représente S, SO ou SÛ2,

- X représente CH ₂ , 0, NH ou S,

- Y représente Chb, CH ou N,

- X et Y sont liés entre eux par un bras hydrocarboné, saturé ou insaturé, comportant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, et notamment ^x ^ correspond à X-CH=Y ou X-CH ₂ -Y, en fonction de la nature de X et Y,

sous la forme d'isomère optique pur ou de mélange d'isomères optiques en toutes proportions, ainsi que leurs hydrates, sels ou solvats pharmaceutiquement acceptables.

Selon un mode de réalisation particulier, les composés de formule (I) répondent à la form

(la)

dans laquelle, Ri, R ₂ , R3, 4, 5 et R ₆ sont tels que définis précédemment pour (I).

Selon un autre mode de réalisation particulier, les composés de formule (I) répondent à la formule (Ib) :

(Ib) dans laquelle, Ri, R2, R3, R , Rs et Re sont tels que définis précédemment pour (I). Selon un autre mode de réalisation particulier, les composés de formule (I) répondent à la

dans laquelle, Ri, R2, R3, R4, Rs et R$ sont tels que définis précédemment pour (I).

Selon des modes de réalisation particuliers, les composés de formule (I), (la), (Ib) et (le), sous la forme d'isomère optique pur ou de mélange d'isomères optiques en toutes proportions, ainsi que leurs sels, soivats ou hydrates, présentent l'une ou l'autre des caractéristiques suivantes, ou une combinaison des caractéristiques suivantes lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre :

- Ri représente un atome d'hydrogène,

- Re = S,

un ou deux des substituants R ₂ à R ₅ est (sont) différent(s) de l'hydrogène, les autres substituants représentant un atome d'hydrogène,

- R ₂ = R ₃ = R4 = R5 = H.

Les composés ci-dessous sont des exemples de composés de formule

(I) :

- le 2-benzo[£]thio héno-tétramisole (7) :

et ses formes énantiomériques pures ou enrichies (/?) et (5) ci- dessous :

- le 2-benzo[-¾thiophéno-2,3-déhydrotétramisole (10) :

et ses formes énantiomériques pures ou enrichies (R) et (S) ci- dessous :

- le 6-benzo[Z7]thiophèn-2-yl-5,6-dihydro-imidazo[2,l- ô][l,3,4]thiadiazole (13) :

et ses formes énantiomériques pures ou enrichies ( ?) et (5) ci-

ainsi que leurs hydrates, sels ou solvats pharmaceutiquement acceptables et notamment leur chlorhydrate.

Par forme énantiomérique (R) ou (S) enrichie, on entend une forme enrichie respectivement en énantiomère (R) ou (S) avec un excès énantiomérique supérieur à 80 %, notamment appartenant à la gamme 80- 95%.

La présente invention a également pour objet les composés tels que définis précédemment, pour leur utilisation en tant que médicament, et, en particulier, pour leur utilisation en tant que médicament pour le traitement de l'arthrose, de spondylarthrite ankylosante ou de calcifications vasculaires.

Les compositions pharmaceutiques comprenant un composé tel que précédemment défini, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, font également partie intégrante de l'invention.

La description ci-après permet de mieux comprendre l'invention. En préliminaire, un certain nombre de définitions est rappelé.

Par groupe alkyle, on entend une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée. A titre d'exemple de groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et de préférence de 1 à 7 atomes de carbone, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, /7-propyle, /sopropyle, /7-butyle, tert- butyle, sec-butyle, hpentyle, /7-hexyle, /7-heptyle, -CH[CH(CH ₃ ) ₂ ]2.

Par groupe aryle, on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycyclique, comportant de préférence de 6 à 12 atomes de carbone, comprenant au moins un groupe aromatique, par exemple, un radical phényle, cinnamyle ou naphtyle. Le phényle est le groupe aryle particulièrement préféré.

Et si besoin Par groupe cycloalkyle, on désigne une chaîne hydrocarbonée saturée, cyclique, comprenant de 3 à 7 atomes de carbone. A titre d'exemple de groupe cycloalkyle, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle et cycloheptyle.

Sulfhydryle désigne -SH et carboxyie -COOH.

Le terme « traitement » désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie ou désordre conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution d'un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression de la maladie ou du désordre qui y est associé.

Par « quantité thérapeutiquement efficace », on désigne toute quantité d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques de l'affection traitée. Les composés utilisés dans le cadre de l'invention sont préparés selon des techniques classiques. Ils peuvent, notamment être obtenus selon le SCHEMA 1 ci-après dans lequel R'i, R'2, R'3, R' ₄ et R' ₅ représentent respectivement Ri, R2, R3, R4 et R5 ou un précurseurs de ces derniers et X, Y et Re sont tels que définis précédemment pour (I), à partir des composés (II), pour former le composé (III) qui est ensuite soumis à une réduction de la fonction cétone, en alcool, par exemple avec du borohydrure de sodium, pour donner le composé (IV) qui est cycliser par un traitement avec SOCI2 suivi d'un traitement acide.

Les conditions de formation du composé (III) dépendent de l'enchaînement ^λ ' . Pour plus de détails, on pourra notamment se

*

référer aux exemples dans les cas où ^Y correspond à S-CH=CH, S-CH2-CH2 OU S-CH=N.

Lorsque l'un des groupes R'i, R' ₂ , R'3, 4 ou R'5 est différent respectivement de Ri, R ₂ , R3, et R ₅ , l'une ou l'autre de ces réaction est suivie d'une ou plusieurs transformations supplémentaires permettant de convertir le groupe R'i, R' _2/ R'3, R' ou R' ₅ en question pour obtenir le groupe i, 2, R3, R ou R' ₅ souhaité. La préparation des composés de formule (II) est réalisée selon des méthodes connues.

Les groupes fonctionnels éventuellement présents dans la molécule des composés de formule (I) et dans les intermédiaires réactionnels peuvent être protégés au cours des synthèses, soit sous forme permanente soit sous forme temporaire, par des groupes protecteurs qui assurent une synthèse univoque des composés attendus. Les réactions de protection et déprotection sont effectuées selon des techniques bien connues de l'Homme de l'art. Par groupe protecteur temporaire des aminés, alcools ou des acides carboxyliques on entend les groupes protecteurs tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed John Wiley et Sons, 2006 et dans Protecting Groups, Kocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlag.

Les molécules de formule (I) sont donc d'accès chimique simple, et peuvent être obtenues à un faible coût de préparation.

Les sels des composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'Homme de l'art. Les sels des composés de formule (I) selon la présente invention comprennent ceux avec des acides ou des bases, en fonction des substituants présents. Ces acides ou bases peuvent être choisis parmi les acides et bases minéraux et organiques qui permettent une séparation ou une cristallisation convenable des composés de formule (I), ainsi que des sels pharmaceutiquement acceptables. En tant qu'acide approprié, on peut citer : l'acide oxalique ou un acide optiquement actif, par exemple un acide tartrique, un acide dibenzoyltartrique, un acide mandélique ou un acide camphosulfonique, et ceux qui forment des sels physiologiquement acceptables, tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, l'hydrogénosulfate, le dihydrogénophosphate, le maléate, le fumarate, le 2-naphtalènesulfonate, le paratoluènesulfonate, le mésylate, le bésylate, l'isotionate. En tant que base appropriée, on peut citer : la lysine, l'arginine, la méglumine, la bénéthamine, la benzathine et celles qui forment des sels physiologiquement acceptables, tels que des sels de sodium, de potassium, de calcium.

Comme composé sous forme hydratée, on peut citer, à titre d'exemple, les semi-hydrates, monohydrates et polyhydrates.

Lorsqu'un composé selon l'invention présente un ou plusieurs carbones asymétriques, les isomères optiques de ce composé font partie intégrante de l'invention. Les différents composés selon l'invention peuvent donc se trouver sous toutes les formes isomériques possibles, éventuellement en mélange selon toutes proportions, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement sur la formule générale (I). La nomenclature (R) ou (5) désigne l'énantiomère (R) ou (S) sous forme optiquement pure. De façon avantageuse, les composés de formule (I) de l'invention sont sous forme optiquement pure, en particulier le carbone symbolisé par une * sur la formule générale (I), ci- dessous présente une

Les composés (I) sont isolés sous forme d'isomères optiques purs ou sous une forme enrichie en un énantiomère ( ) ou (S) par les techniques classiques de séparation : on pourra utiliser, par exemple des recristallisations fractionnées d'un sel du racémique avec un acide ou une base optiquement active dont le principe est bien connu ou les techniques classiques de chromatographies sur phase chirale ou non chirale.

Les composés de formule (I) ci-dessus comprennent également ceux dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène, de carbone ou d'halogène, notamment de chlore ou de fluor ont été remplacés par leur isotope radioactif par exemple le tritium ou le carbone- 14. De tels composés marqués sont utiles dans des travaux de recherche, de métabolisme ou de pharmacocinétique, dans des essais biochimiques.

Dans le cadre de l'invention, l'activité des composés de formule (I) sur l'inhibition de la TNAP est déterminée selon le test in vitro décrit dans les exemples ci-après. Sur ce test, les composés selon l'invention présentent une ICso, en général, comprise entre 10 et 200 Μ (TABLEAUX 2 et 3). Les composés présentant une IC ₅₀ meilleure que le levamisole sont préférés. L'ICso est définie comme la concentration de l'inhibiteur nécessaire pour inhiber 50% de l'activité de la TNAP.

Les composés de formule (I) ne sont pas cytotoxiques. De par leur activité, les composés de formule (I), (la), (Ib) et (le) précédemment décrits, quelque soit leur forme isomérique, ainsi que leurs sels, solvats et hydrates, peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destinés à traiter la calcification, notamment dans le cas de l'arthrose, spondylarthrite ankylosante ou dans le cas de la calcification vasculaire.

La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques administrables aux animaux et, en particulier à l'homme, contenant une dose efficace d'un composé de formule (I), (la), (Ib) ou (le), sous la forme d'un isomère optique pur pu d'un mélange d'isomères optiques en toute proportion, ou d'un sel, d'un solvat ou d'un hydrate pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un ou des excipients convenables.

Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra- veineuse, intracartilage, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les principes actifs de formule (I), (la), (Ib) ou (le), sous la forme d'un isomère optique pur ou d'un mélange d'isomères optiques en toute proportion, ou leurs sels, solvats et hydrates éventuels, peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des troubles ou des maladies ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale, telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intracartilage ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades ou lotions.

Afin d'obtenir l'effet, la dose de principe actif varie, de préférence, entre

0,001 et 1 mg par kg de poids du corps et par jour.

Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.

On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.

Les compositions pharmaceutiques contenant un composé de formule (I), (la), (Ib) ou (le), sous la forme d'un isomère optique pur ou d'un mélange d'isomères optiques en toute proportion, ou d'un de ses sels, solvats ou hydrates, peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.

Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparabène et du propylparabène comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût.

D'une façon générale, les mêmes variantes que celles indiquées précédemment pour les composés (I) sont applicables mutatis mutandis aux médicaments, compositions et utilisations mettant en uvre ces composés.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.

Les composés (7) et (10) (correspondant respectivement aux Exemples 1 et 2) ont été préparés conformément au SCHEMA 2 ci-dessous.

SCHEMA 2 : Réactifs et conditions: (a) 2-aminothiazole, /sopropanol, reflux, (92%); (b) NaBH ₄ , MeOH, ta.; (c) SOCI ₂ , base-DCM, reflux; (d) HCI- éther, DCM; (e) 2-aminothiazoline, CH ₃ CN, reflux (86%)

Le 2-(2-bromoacétyl)-benzo[b]thiophène (4) a été synthétisé par acétylation (BuLi, DMA, éther) suivie par bromation (B^, DCM). (Sarker, A. M.; Kaneko, Y.; Neckers, D. C. Chem. Mater. 2001 , 13, 3949). Les composés intermédiaires (5) et (8) sont obtenus à partir du 2-(2-bromoacétyl)- benzo[b]thiophène par condensation respectivement avec le 2-aminothiazole et le 2-aminothiazoline. Après réduction en présence de borohydrure de sodium et cyclisation intramoléculaire en présence de chlorure de thionyle, les composés (7) et (10) sont obtenus avec des rendements globaux de 29% et 21 % respectivement.

EXEMPLE 1

l-(Benzo[ô]thiophén-2-yl)-2-(2-iminothiazol-3(2«)- yl)éthanone (5): Une solution de composé 2-(2- acétylbromo)benzo[&]thiophène (4) (10 mmol, 2,56 g) en présence de 2- aminothiazole (11 mmol, 1,1g) dans le 2-propanol (25 ml) est chauffée à reflux pendant une heure. Le solide obtenu est filtré et trituré avec une solution aqueuse 10% a ₂ C03 puis filtré et séché. Le produit brut est purifié par chromatographie flash sur gel de silice (AcOEt) pour donner le composé

(5) (2,53 g, 92%, solide blanc). 1H RMN (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8,56 (s, 1H); 8,13 (dd, J = 7,7; 1,5 Hz, 2H); 7,62-7,50 (m, 2H); 7,44 (d, J = 4,5 Hz, 1H); 7,09 (d, J = 4,5 Hz, 1H); 5,95 (s, 2H); ¹³ C RMN (75 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 185,5; 169,1; 141,4; 139,2; 138,9; 132,1; 130,6; 128,2; 126,6; 125,9; 123,3; 107,5; 54,6; HR ESIMS calculé pour Ci ₃ HnN ₂ OS ₂ ⁺ = 275,0307; trouvé = 275,0308.

l-(Benzo[ô]thiophén-2-yl)-2-(2-iminothiazol-3(2/ -yl)éthanol

(6) : A une solution de (5) (5 mmol, 1,38 g) dans le méthanol (30 ml) maintenue à 10°C, est ajouté NaBH ₄ (8 mmol, 303 mg) en petites portions.

Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, un excès supplémentaire de NaBH ₄ (3 mmol, 113 mg) est ajouté et le mélange réactionnel est agité pour 2 heures. Après concentration du milieu, le résidu est repris dans l'eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée puis concentrée pour donner un solide qui est purifié par chromatographie sur colonne (AcOEt). Le composé (6) (0,72 g, 52%) est obtenu sous la forme d'un solide blanc. *H RMN (300 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 7,92 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 7,77 (dd, J = 7,0; 1,3 Hz, 1H); 7,37-7,28 (m, 2H); 7,28 (s, 1H); 6,67 (d, J = 4,9 Hz, 1H); 5,92 (d, J = 4,9 Hz, 1H); 5,26 (dd, J = 3,9; 3,9 Hz, 1H); 4,02 (dd, J = 4,1; 13,8 Hz, 1H); 3,88 (dd, J = 7,7; 13,8 Hz, 1H); ¹³ C RMN (75 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 162,8; 148,5; 139,5; 138,6; 129,3; 124,3; 123,9; 123,4; 122,5; 119,8; 96,5; 67,1; 52,8; HR ESIMS calculé pour Ci3H ₁₃ N ₂ OS2 ⁺ = 277,0464; trouvé = 277,0463.

2-Benzo[&]thiophéno-tétramisole (7) : A une solution de composé (6) (1,08 mmol, 0,3 g) dans le dichlorométhane (5 ml), refroidie à 4°C, est ajouté goutte à goutte le chlorure de thionyle (3 ml) sur une période de 30 minutes. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu dissous dans un mélange de solution aqueuse de aïCC à 10% (20 ml) et de chlorure de méthylène (20 ml) est chauffé à reflux pendant 2 heures. Après extraction de la phase aqueuse avec du chlorure de méthylène, les phases organiques sont combinées, séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, puis évaporation, un solide blanc est obtenu. La purification par chromatographie sur colonne (AcOEt) conduit au composé (7) sous forme de base (0,17 g, 61%) comme solide blanc. Ce composé (7) est dissous dans un mélange d'acétone (2 ml) et d'acide chlorhydrique 2N dans l'éther (1 ml). Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, le solvant est évaporé pour conduire à un solide blanc. Après lavage à l'acétone et séchage, le composé (7) sous forme chlorhydrate est obtenu. H RMN (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 7,92 (dd, J = 1,3; 7,0 Hz, 1H); 7,77 (dd, J = 1,3; 7,0 Hz, 1H); 7,38-7,30 (m, 2H); 7,29 (s, 1H); 6,67 (d, J = 4,9 Hz, 1H); 5,93 (d, J = 4,9 Hz, 1H); 5,26 (dd, J = 3,9; 3.9 Hz, 1H); 4,03 (dd, J = 4,1; 13,8 Hz, 1H); 3,89 (dd, J ~ 7,7; 13,8 Hz, 1H); ¹ C RMN (75 MHz, DMSO-d ₆ ) Ô 170,0; 142,5; 139,0; 138,9; 125,5; 125,1; 124,9; 124,1; 123,1; 122,8; 112,7; 62,5; 54,8; HR ESIMS calculé pour Ci ₃ Hii ₂ S2 ⁺ = 259,0358; trouvé = 259,0360.

Dans l'objectif d'évaluer l'influence de la stéréochimie de la position C-6, la résolution énantiomérique du composé (7) a été réalisée en suivant une stratégie similaire à celle utilisée pour la résolution du lévamisole avec l'acide O,Odibenzoyl-(2/?,3R)-tartrique ((+)-DBTA) (Faigl, F.; Fogassy, E.; Nogradi, M.; Palovics, E. Tetrahedron Asymm. 2008, 19, 519). L'énantiomère (-)-2- benzo[/fr]thiophéno-tétramisole (ee = 95%) (11) est obtenu, et l'autre énantiomère, (+)-2-benzo[£]thiophéno-tétramisole (ee = 80%) (12) est préparé avec l'acide 0,O-dibenzoyl-(25,35)-tartrique ((-)-DBTA) conformément au SCHEMA 3 ci-dessous.

Protocole expérimental pour la résolution du composé racémique 7 : Le composé 7 (30 mg, 0,12 mmol) et l'acide 0,( dibenzoyl-(2/?,3/?)-tartrique (14 mg, 0,06 mmol) sont solubilisés séparément dans de l'isopropanol absolu (2 ml) puis mélangés. Après agitation à 50°C pendant 1 heure, le précipité formé est filtré. Le solide est lavé avec du MeOH chaud (10 ml). Le résidu est placé dans une solution aqueuse de NaOH 2N (20 ml) et extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS0 ₄ , filtrée puis concentrée pour conduire au composé enrichi (9 mg, 50%, solide jaunâtre)

SCHEMA 3

(7)

2-benzo[£>]-thiophéno- 2,3-dihydrotétramisole

racémique

décomposition Précipitation :

énantiomère (-) 7 > énantiomère (+) complexe énantiomère (-) > complexe énantiomère (+)

EXEMPLE 2

l-(Benzo[Z?]thiophén-2-yl)-2-(2-iminothiazolidin-3- yl)éthanone (8) : Le 2-aminothiazoline (11 mmol, 1,12 g) est dissous dans l'acétonitrile (25 ml) et des petites portions de 2-(2- acéty1bromo)benzo[£]thiophène (4) (10 mmol, 2,56 g) sont additionnées. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 2 heures puis filtré. Le précipité est trituré en présence d'une solution de 10% a ₂ C0 ₃ , puis filtré et séché. Le produit brut est purifié par chromatographie flash sur colonne (AcOEt) pour donner le composé (8) (2,38 g, 86%) sus la forme d'un solide blanc. ^l RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 8,15 (s, 1H); 7,91 (dd, J = 1,2; 7,7 Hz, 1H); 7,88 (dd, J = 1,7; 7,0 Hz, 1H); 7,52-7,40 (m, 2H); 5,12 (s, 2H); 3,78 (t, J = 7,8 Hz, 2H); 3,21 (t, J = 7,8 Hz, 2H); ¹³ C RMN (75 MHz, CDCI ₃ ) δ 187,7; 171,6; 142,6; 140,7; 139,4; 130,3; 128,1; 126,3; 125,4; 123,1; 53,1; 50,0; 27,3; HR ESIMS calculé pour Ci ₃ Hi3N ₂ OS2 ⁺ = 277,0464; trouvé = 277,0459. 1- (Benzo[Î7]thiophén-2-yl)-2-(2-iminothiazolidin-3-yl)éthan ol

(9) : A une solution de (8) (5 mmol, 1,39 g) dans le méthanol (30 ml) maintenue à 10 °C, est ajouté NaBH ₄ (8 mmol, 303 mg) en petites portions. Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, un excès supplémentaire de NaBH ₄ (3 mmol, 113 mg) est ajouté et le mélange reactionnel est agité pendant 2 heures. Après concentration du milieu, le résidu est repris dans l'eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS0 ₄ , filtrée puis concentrée pour donner un solide qui est purifié par chromatographie sur colonne (AcOEt). Le composé (9) (0,64 g, 46%) est obtenu sous la forme d'un solide blanc. H RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 7,80 (dd, J = 1,2; 7,7 Hz, 1H); 7,70 (dd, J = 1,7; 7.0 Hz, 1H); 7,36-7,24 (m, 2H); 7,23 (s, 1H); 5,30 (dd, J = 2,5; 2,5 Hz, 1H); 3,88 (dd, J = 2,5; 14,5 Hz, 1H); 3,70 (dd, J = 6,1; 14,5 Hz, 1H); 3,56-3,40 (m, 1H); 3,48-3,42 (m, 1H); 3,15-3,07 (m, 2H); ¹³ C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 167,7; 148,2; 139,8; 139,5; 124,2; 123,9; 123,4; 122,5; 119,9; 71,2; 55,6; 54,8; 28,5; HR ESIMS calculé pour Ci ₃ H ₁₅ N ₂ OS2 ⁺ = 279,0620; trouvé = 279,0580.

2- Benzo[£]thiophéno-2,3-déhydrotétramisole (10) :

A une solution du composé (9) (1,15 mmol, 0,32 g) dans le dichlorométhane (5 ml), refroidie à 4 °C, est ajouté goutte à goutte le chlorure de thionyle (3 ml) sur une période de 30 minutes. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu dissous dans un mélange de solution aqueuse de Na ₂ C0 ₃ à 10% (20 ml) et de chlorure de méthylène (20 ml) est chauffé à reflux pendant 2 heures. Après extraction de la phase aqueuse avec du chlorure de méthylène, les phases organiques sont combinées, séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, puis évaporation, un solide blanc est obtenu. La purification par chromatographie sur colonne (AcOEt) conduit au composé (10) sous forme de base (0,156 g, 52%) sous la forme d'un solide blanc. Ce composé (10) est dissous dans un mélange d'acétone (2 ml) et d'acide chlorhydrique 2N dans l'éther (1 ml). Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, le solvant est évaporé pour conduire à un solide blanc. Après lavage à l'acétone et séchage, le composé (10) sous forme chlorhydrate est obtenu. H RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 7,79 (dd, J = 1,4; 7,2 Hz, 1H); 7,69 (dd, J = 1,3; 6,7 Hz, 1H); 7,29 (m, 2H); 7,18 (s, 1H); 5,71 (dd, J = 2,5; 2.5 Hz, 1H); 4,28 (t, pseudot, 1H); 4,01 (t, J = 7,3 Hz, 2H); 3,86 (t, pseudot, 1H); 3,83 (t, J = 7,3 Hz, 2H); 3,30 (ddd, 7 = 4,9; 6,5; 8,6 Hz, 1H); 3,18 (t, J = 7,3 Hz, 1H); 3,16-3,07 (m, 1H); ¹³ C RMN (75 MHz, CDCI ₃ ) δ 175,1; 147,4; 139,7; 139,4; 124,1; 123,8; 123,3; 122,3; 119,8; 72,8; 57,8; 48,9; 34,1; HR ESIMS calculé pour Ci3Hi _{3 2} S ₂ ⁺ = 261,0515; trouvé = 261,0516.

EXEMPLE 3

SCHEMA 4 : Réactifs et conditions: (a) 2-amino-l,3,4-thiadiazole, acétone, reflux, (86%); (b) NaBH ₄ , MeOH, t.a. (50%); (c) SOCI ₂ , base-DCM, reflux; d) HCI-éther, DCM (51%)

13 l-Benzo[/7]thiophén-2-yl-2-(2-imino-[l,3,4]thiadia20l-3-yl) - éthanone (14) :

La 2-amino-l,3,4-thiadiazole (11 mmol, 1,1 g) est dissous dans l'acétone (25 ml) et des petites portions de 2-(2- acétylbromo)benzo[.7]thiophène (4) (10 mmol, 2,56 g) sont additionnées. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 2 heures puis filtré. Le précipité est trituré en présence d'une solution de 10% Na2CÛ3, puis filtré et séché. Le produit brut est purifié par chromatographie flash sur colonne (AcOEt) pour donner le composé (8) (2,38 g, 86%) sus la forme d'un solide rose. 1H RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 10,00 (bs, 1Η, NH); 8,99 (s, 1H); 8,61 (s, 1H); 8,13 (d, J = 8,1 Hz, 2H); 7,63-7,52 (m, 2H); 6,14 (s, 2H). ¹³ C RMN (75 MHz, CDCI ₃ ) δ 185,2; 144,8; 144,8; 141,6; 138,9; 138.9; 132,7; 128,4; 126,6; 125,7; 123,3; 56,7. HR ESIMS calculé pour Ci2H ₁₀ N ₃ OS ₂ ⁺ = 276,0260; trouvé = 276,0265. l-Benzo[ô]thiophén-2-yl-2-(2-imino-[l,3,4]thiadiazol-3-yl) - éthanol (15) :

A une solution de (14) (5 mmol, 1,38 g) dans le méthanol (30 ml) maintenue à 10 °C, est ajouté NaBH ₄ (8 mmol, 303 mg) en petites portions. Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, un excès supplémentaire de NaBH ₄ (3 mmol, 113 mg) est ajouté et le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures. Après concentration du milieu, le résidu est repris dans l'eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS0 ₄ , filtrée puis concentrée pour donner un solide qui est purifié par chromatographie sur colonne (AcOEt). Le composé (12) (0,69 g, 50%) est obtenu sous la forme d'un solide laiteux. H RMN (300 MHz, CDC ) δ 7,90 (dd, J = 1,3; 7,5 Hz, 1H); 7,80 (dd, J = 1,9; 6,8 Hz, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,47-7,35 (m, 3H); 5,60-5,52 (m, 1H); 4,53 (t, J = 5,3 Hz, 2H). ¹³ C RMN (75 MHz, CDCb) δ 164,2; 146,5; 139,7; 139,4; 133,6; 124,2; 124,0; 123,5; 122,4; 120,3; 70,5; 56,8. HR ESIMS calculé pour C ₁₂ Hi2N30S ₂ ⁺ = 278,0416; trouvé - 278,0425.

6-Benzo[ô]thiophen-2-yl-5,6-di ydro-imidazo[2,l- 6][l,3 _/ 4]thiadiazole (13) :

A une solution du composé (15) (2,2 mmol, 0,61 g) dans le dichlorométhane (5 ml), refroidie à 4 °C, est ajouté goutte à goutte le chlorure de thionyle (3 ml) sur une période de 30 minutes. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu dissous dans un mélange de solution aqueuse de Na2CÛ3 à 10% (20 ml) et de chlorure de méthylène (20 ml) est chauffé à reflux pendant 2 heures. Après extraction de la phase aqueuse avec du chlorure de méthylène, les phases organiques sont combinées, séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, puis évaporation, un solide blanc est obtenu. La purification par chromatographie sur colonne (AcOEt) conduit au composé (13) sous forme de base sous la forme d'un solide blanc. Ce composé (13) est dissous dans un mélange d'acétone (2 ml) et d'acide chlorhydrique 2N dans l'éther (1 ml). Après agitation à température ambiante pendant 12 heures, le solvant est évaporé pour conduire à un solide blanc. Après lavage à l'acétone et séchage, le composé (13) sous forme chlorhydrate est obtenu. H RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 7,80 (dd, J = 1,4; 7,7 Hz, 1H); 7,70 (dd, J = 2,0; 7,9 Hz, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,39-7,26 (m, 2H); 7,23 (s, 1H); 5,81 (t, J = 9,4 Hz, 1H); 4,44 (t, 7 = 9,3 Hz, 1H); 3,99 (t, J = 9,0 Hz, 1H). ¹³ C RMN (75 MHz, CDCI ₃ ) δ 169,3; 146,5; 139,6; 139,6; 138,0; 124,4; 124,3; 123,6; 122,5; 120,4; 71,4; 56,2. HR ESIMS calculé pour Ci ₂ HioN ₃ S2 ⁺ = 260,0311; trouvé = 260,0315.

RESULTATS DES TESTS BIOLOGIQUES

A Test d'inhibition de la TNAP et Détermination de i

Les inhibiteurs ont été testés sur TNAP (foie de porc, Sigma) dans un tampon 1 contenant lOOmM Tris HCI, 5 mM de MgCI ₂ , 5 μΜ de ZnCI ₂ à pH 7,8 et à une température de 38°C. Dans un premier temps, 10pL de TNAP (0,52 - 0,86 pg.pL ¹ ) sont mélangés avec 980 pL du tampon contenant 0,1 - 0,5 mM inhibiteur. La solution de 990 pL est incubée pendant 10 min à 37°C sans le substrat /^ara-nitrophosphophénol (pNPP). Ensuite une solution de 10 pL ^"1 de pNPP préalablement incubée à 37°C pendant 10 mn est ajoutée à la solution de 990 pL, puis mélangée pour amorcer la réaction enzymatique. Le volume final (1 mL) contient environ 5,2 - 8,6 pg.mL ¹ de TNAP ; 0,125- 0,500 mM inhibiteur (soit 125, 250 et 500 mM) et 0 - 40 μΜ pNPP (soit 10, 20 et 40 μΜ) dans le tampon 1. Les Ki apparents ont été déterminés selon l'équation Michaelis Menten pour un inhibiteur incompétitif. A titre indicatif, les valeurs de Ki de composés de l'art antérieur : levamisole (1) et composés (2) et (3) sous forme chlorhydrate ⁽¹⁸⁾ sont présentés dans le TABLEAU 1. Bien que les Ki et IC ₅ o sont des paramètres différents, tous les deux expriment l'activité d'inhibition sur la TNAP et dans ce cas particulier l'ordre de grandeur est similaire.

TABLEAU 1. Evaluation in vitro de l'inhibition de TNAP des composés (1) (lévamisole), (2), (3) de l'art antérieur

Composé Ki (μΜ /pH à 7,8) ^[a] IC ₅₀ (μΜ /pH à 7,8)

(1) 93 ± 4 43,5 ± 2,4 ^{[ ]} 78 ±17 ^[b]

(2) 85 ± 6 39 ± 2,8 ^[c]

(3) 135 ± 3 66 ± l,4 ^[c]

[a] Ki (trois mesures indépendantes) déterminées à 37°C et à pH 7,8 (conditions physiologiques), [b] Deux séries de IC ₅₀ déterminées à 37°C et à pH 7,8 avec deux lots d'enzyme différents. A chaque fois, l'IC ₅ o (qui correspond à la concentration de l'inhibiteur nécessaire pour inhiber 50 % de l'activité de la TNAP) est estimée sur la base de trois séries de mesures indépendantes, [c] Valeurs dX ₅₀ calculées à partir de la valeur du Ki.

B. Test d'inhibition de la TNAP et Détermination IC ₅₀

Les inhibiteurs ont été testés sur TNAP (foie de porc, Sigma) soit dans un tampon 1 contenant 25 mM de pipérazine, 25 m de glycylglycine, 5 mM de MgCb, 5 μΜ de ZnC à pH 10,4 ou soit dans un tampon 2 contenant 10 mM de Tris HCI, 5 mM de MgCI ₂ , 5 μΜ de ZnCI ₂ à pH 7,8. Dans un premier temps, ΙΟμί de TNAP (0,52 - 0,86 μg.μL ^~1 ) sont mélangés avec 680 μΙ_ soit du tampon 1 soit du tampon 2 (volume total = 690μΙ_). Ensuite 0 - 60 μΙ_ de solution contenant lOmM inhibiteur dans le DMSO est ajouté afin d'obtenir 0 - 400 μΜ d'inhibiteur dans le milieu. Dans le cas des concentrations élevées d'inhibiteurs, 800-μΜ d'inhibiteur est préparé à partir d'une solution de 20- mM d'inhibiteur. La quantité finale de DMSO est ajustée à 60 μΙ_ afin d'obtenir une solution de 750 μΙ_. La solution de 750 μί est incubée pendant 10 min à 37°C sans le substrat ara-nitrophosphophénol (pNPP).

Enfin, le mélange de 750-pL (soit dans le tampon 1 ou dans le tampon 2) est ajouté avec une autre solution de 750μί de pNPP 0,lmM (respectivement dans le tampon 1 ou dans le tampon 2) en mélangeant pendant 5 secondes et en incubant à 37°C, afin d'initier la réaction. L'activité est mesurée à 400 nm, en utilisant un coefficient d'absorption molaire de 18,5 cm ^"1 mM ^"1 (correspondant à un pH 10,4) ou de 13,9 crrf ¹ mM ^'1 (correspondant au pH 7,8) et à 37°C. La concentration finale de DMSO est de 4% v/v. L'activité de chaque échantillon contenant l'inhibiteur est comparée avec le contrôle (sans inhibiteur). Au moins trois mesures indépendantes sont effectuées. ICso (qui correspond à la concentration de l'inhibiteur nécessaire pour inhiber 50 % de l'activité de la TNAP) est estimé sur la base de trois séries de mesures indépendantes.

Les composés (7), (10), (11) et (12) obtenus sous forme chlorhydrate ont été testés pour évaluer l'inhibition de la TNAP à pH 10,4, qui correspond aux conditions optimales des mesures d'activités de la TNAP ainsi qu'à pH 7,8 qui correspond aux conditions physiologiques.

Le composé 2-benzo[£]thiophéno-2,3-déhydrotétramisole (7) a une valeur de IC ₅₀ de 32 μΜ (pH=10,4) et de 9,5 μΜ (pH=7,8), qui sont d'environ trois à cinq fois plus faibles que ceux du lévamisole (1). Le composé 2-benzo[ô]thiophéno-tétramisole (10) a également des valeurs de IC ₅₀ plus faibles que ceux du lévamisole (1). Les différents résultats sont présentés dans le TABLEAU 2 ci-dessous

TABLEAU 2. Evaluation in vitro de l'inhibition de TNAP des composés (1) (lévamisole), (7), (10), (13)

Composé IC ₅₀ (μΜ /pH à 10,4) ^[a] IC _S0 (μΜ /pH 7,8)

(1) 93±23 43.5 ± 2,4 ^[b] 78 ±17 ^[b]

(2) 39 ± 2,8 ^[c]

(3) 66 ± l,4 ^[c]

(7) 32±12 9,5 ± 0,3 ^[b] 14 ± 2 ^{[ ]}

(10) 71 ± 26 14.6 ± 0,3 ^[b]

(13) 156 ± 70 27 ± 4 ^[b]

[a] IC ₅ o (trois mesures indépendantes) ont été déterminées à 37°C et à pH 10, 4 (optimal pour les mesures d'activités), [b] Deux séries de IC ₅₀ (avec pour chacune, trois mesures indépendantes) correspondant à des lots d'enzyme différents ont été déterminées à 37°C et à pH 7,8 (conditions physiologiques). LICso correspond à la concentration nécessaire de l'inhibiteur pour diminuer de moitié l'activité de la TNAP. [c] Valeurs d1C ₅ o calculées à partir de la valeur du Ki (voir Tableau 1)

On constate que les composés de l'invention tels qu'exemplifiés et testés présentent tous une activité d'inhibition de la TNAP in vitro. Pour certains, cette activité est même très supérieure à celle du Lévamisole.

On obtient également, de façon inattendue, un gain d'activité en modifiant la substitution du thiophène de la position 3 à la position 2.

Si l'on compare le composé (2) de l'art antérieur avec le composé (7) selon l'invention, la substitution du thiophène de la position 3 à la position 2, permet de passer d'une IC ₅₀ de 39 à 9,5 μΜ.

Si l'on compare le composé (3) de l'art antérieur avec le composé (10) selon l'invention, la substitution du thiophène de la position 3 à la position 2, permet de passer d'une IC50 de 66 à 14,6 μ .

Le composé racémique (7) a pu être séparé de ses deux énantiomères

(pureté de 95 % pour le composé (11) (-) et pureté de 80% pour le composé (12) (+)). Leurs valeurs d'IC ₅ o ont été déterminées et sont présentées dans le TABLEAU 3 ci-dessous. TABLEAU 3. Evaluation In vitro de l'inhibition de TNAP des composés (1), (7), (11), (12)

Composé IC50 (MM /pH à 10,4) ^[a]

(1) 93 ± 23

(7) (racémique) 32 ± 12

(11) ((-) ee:95%) 26 ± 12

(12) ((+) ee:80%) 56 ± 23

[a] IC50 valeurs (trois mesures indépendantes) déterminées à 37°C et à pH 10,4 (optimal pour les mesures d'activités). IC50 correspond à la concentration nécessaire de l'inhibiteur pour diminuer de moitié l'activité de la TNAP.

L'énantiomère (11) (-)-benzo[£]thiophéno-tétramisole inhibe la TNAP à une concentration plus basse (IC ₅₀ = 26 ± 13 μΜ) que celle du lévamisole (ICso = 93 ± 23 μΜ) (TABLEAU 2). L'autre énantiomère (+)- benzo[ô]thiophéno-tétramisole a également la propriété d'inhiber la TNAP (IC50 = 56 ± 23 μΜ) à une concentration plus faible que celle du lévamisole.

Par ailleurs, certains des composés se sont montrés très sélectifs : les composés (7) et (10) inhibent sélectivement la TNAP mais pas du tout les autres isoenzymes de la phosphatase alcaline de l'intestin et celle du placenta.

B. Test de cytotoxicités

Les effets des composés (7), (10), (11), (12) et (13) sous forme chlorhydrate à 10 ^"5 M (ΙΟμ ) dans le DMSO ont été testés sur des lignées cellulaires KB (carcinome oral), HCT116 (lignée tumorale humaine du colon), MCF7 (cancer du seil, A549. (Test de cytotoxicité in vitro ou test MTT : Mosmann, T. R. 3. ImmunoL Met ods 19S3, 65, 55; Magaud, J. P.; Sargent, I.; Mason, D. Y. J. Immunol. Methods 1988, 106, 95). Trois mesures indépendantes dont les résultats sont rassemblés TABLEAU 3 ont été effectuées. Tous les échantillons à ΙΟμΜ n'ont aucun effet sur la prolifération sur ces quatre lignées cellulaires.

TABLEAU 3

[1] Ea, H. K.; Lioté, F. Curr. Opin. Rheumatoi. 2009, 21, 150-157.

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