La présente invention porte sur une nouvelle génération de produits biocides qui ne présentent pas de risques chroniques et très peu d'impacts aigus pour la santé et l'environnement.

En effet, les substances actives et les adjuvants qui composent les formulations biocides selon l'invention sont d'origine végétale, de préférence agricole, et renouvelable, et sont par ailleurs totalement, naturellement et rapidement biodégradables.

Les différentes applications de ces nouveaux produits biocides sont également revendiquées .

Les produits biocides sont communément utilisés dans une large variété de produits, incluant des désinfectants ménagers et/ou industriels, des insecticides, des produits de traitement du bois, etc .

Ces produits peuvent être utilisés pour nettoyer et désinfecter tous types de surfaces, y compris la peau.

Les produits biocides sont destinés à détruire, repousser ou rendre inefficaces les organismes indésirables, jugés nuisibles ou non, comme notamment les bactéries, les virus, les champignons, à en prévenir l'action ou à les combattre de toute autre manière par une action chimique ou biologique.

Ces catégories de produits sont des produits actifs sur le plan chimique ou biologique, et, de ce fait, sont susceptibles d'avoir des effets nuisibles sur l'homme, l'animal et/ou 1 ' environnement .

Plus particulièrement, un biocide se caractérise en général par son champ d'application : bactéricide, fongicide, antiviral et/ou insecticide.

Les bactéricides ont une action contre certaines bactéries Gram+ et/ou Gram-. Les fongicides ont une action contre certains champignons et certaines levures. En ce qui concerne les antiviraux, ceux-ci ont une action contre certains virus.

Les actifs biocides peuvent donc présenter un risque majeur pour la santé humaine, animale mais également pour l'environnement ; d'ailleurs, d'un point de vue étymologique « bios » signifie « la vie » et « -cide » signifie « qui tue ». En effet, les actifs biocides peuvent agir longtemps, se diffuser, être partiellement dégradés, ou ne pas être dégradés du tout suivant leur nature, et ils sont alors considérés comme (bio) accumulables et toxiques .

Les substances actives qui composent les biocides sont en général des principes actifs d'origine pétrochimique.

Quelques rares substances d' origine végétales peuvent être répertoriées, comme de l'éthanol ou des huiles essentielles ayant des propriétés bactériostatiques et limitées. De plus, ces substances sont hors marchés professionnels .

Enfin, les biocides peuvent également comporter un mélange des deux dernières catégories de composants, c'est-à-dire des principes actifs d'origine pétrochimique et des substances d'origine végétale, dans le but d'atteindre l'efficacité souhaitée.

On connaît ainsi, dans l'état de la technique, les dérivés d'ammonium quaternaires qui représentent une classe majeure des substances biocides d'origine chimique qui sont utilisées dans les désinfectants de surface et pour l'hygiène des mains.

D'autres substances sont également utilisées comme 1' hypochlorite de sodium (Eau de Javel) , les di- ou tri-amines ou le 5-chloro-2- (2 , 4 dichlorphenoxy) phénol (Triclosan®) .

Leur classification réglementaire au regard de leurs effets préoccupants, corrosifs, sensibilisants et très toxiques pour les organismes aquatiques, de même que la suspicion d'effet CMR (Cancérigène, Mutagène, eprotoxique) et de perturbateur endocrinien de certains représentants de cette classe, impose la plus grande prudence à l'utilisation de ces produits.

Une prise de conscience internationale à ce sujet a abouti à l'adoption de Règlements européens (REACH : 1907/2006 et Biocides : 528/2012) ayant pour objectif de limiter la commercialisation de substances chimiques dangereuses et d'en réguler strictement 1' utilisation .

En effet, le marché des produits biocides pour l'Europe représente un volume de 300 000 à 750 000 tonnes par an (Étude de l'impact de la directive Biocides 98/8/EC - 2007) ce qui correspond à un marché mondial annuel de 7 milliards d'euro. Il y a donc un intérêt considérable développer de nouveaux produits biocides pour lutter contre des microorganismes indésirables. Ces biocides devront avoir la capacité d'être intégralement dégradés de façon naturelle après leur utilisation, de sorte à diminuer les risques pour l'homme, l'animal et l'environnement, tout en limitant les résistances induites.

En particulier, pour l'homme et l'animal, ces risques peuvent être « directs », liés à la toxicité dite aiguë, et surtout « indirects », liés à la toxicité chronique.

En outre, les produits biocides doivent être efficaces à faible concentration de façon à proposer des solutions industrielles et économiques conformes aux positionnements économiques des marchés sanitaires .

Afin de proposer des produits biocides qui ne soient pas toxiques et/ou préjudiciables pour l'homme et l'environnement, et qui soient également biodégradables et biocompatibles pour l'homme, des biocides d' origine naturelle ont alors été développés .

En effet, les produits biocides d'origine végétale semblent les plus appropriés pour répondre à ces objectifs combinés.

La majorité des solutions biocides d'origine végétale contiennent une base lavante combinée à une base désinfectante. Cependant, ces produits ne présentent pas la même efficacité biocide ni la même facilité d'utilisation (rapport dose / temps d'action / spectre d' action) que les solutions biocides contenant des actifs et/ou des adjuvants chimico-synthétiques .

Il y a donc une nécessité de développer une alternative durable et sécuritaire à l'utilisation de produits chimico- synthétiques, et qui permette d'obtenir une efficacité biocide et une facilité d'usage de produit à diluer.

On connaît déjà, par le document de brevet WO 2012/114039 une composition biocide comprenant :

- entre 0,01% et 20% d'agent chélatant ;

- entre 0,03% et 25% de tensioactifs non-ioniques de type polyols et de préférence entre 0,03% et 25% de tensioactifs non-ioniques de type glycosides, esters de polyglycérols ou esters de sorbitan ; - entre 0,03% et 25% de tensioactifs anioniques, de préférence de type carboxylates ou polycarboxylates ;

- entre 0,1% et 75% d'un ou plusieurs acides organiques ;

- entre 0,001% et 8% de parfum naturel.

Toutefois, cette composition, bien que présentant une origine végétale et ayant une activité biocide sur certains pathogènes, peut encore être améliorée .

En effet, la composition décrite dans ce document ne présente pas une efficacité optimale à l' encontre d'organismes indésirables et susceptibles d'être pathogènes, par exemple certaines souches de champignons ou encore certains virus indésirables ou pathogènes .

La présente invention porte ainsi sur une nouvelle génération de formulations biocides pour le nettoyage et la désinfection de tous types de surfaces .

Leur impact sur l'environnement est très limité, voir nul, et dans tous les cas il n'est pas considéré comme préoccupant. Cela résulte des données toxicologiques des composants et du mélange, qui sont significativement inférieures aux seuils critiques de classification imposées .

En effet, ces formulations biocides sont issues de ressources végétales renouvelables, de préférence des ressources agricoles, et elles sont intégralement biodégradables sur l'ensemble de la formulation .

La substance active des formulations biocides selon l'invention consiste en au moins un acide organique d'origine végétale . Cet acide organique peut être issu directement d' une ressource végétale, de préférence agricole, ou d'une ressource agricole transformée .

La présente invention décrit une formulation biocide concentrée biodégradable, comportant des composés provenant de ressources végétales renouvelables, ladite formulation étant caractérisée en ce qu'elle comporte au moins les composés suivants :

- au moins un acide organique dans une proportion comprise entre 76 et 98 % en masse, par rapport à la masse totale de la formulation ; - au moins un tensioactif anionique dans une proportion comprise entre 2 et 24 % en masse, par rapport à la masse totale de la formulation.

De manière avantageuse, la proportion en acide organique est comprise entre 76 et 92%, et plus avantageusement encore, entre 76 et 84%. Pour ce qui est de la proportion en tensioactif anionique, celle-ci est préfèrenttellement comprise entre 3 et 15%, de préférence entre 5 et 10%.

La formulation biocide selon l'invention comporte des composés provenant de ressources végétales, notamment agricoles, qui sont entièrement renouvelables. En conséquence, ladite formulation biocide est entièrement biodégradable.

Plus précisément, la composition est biodégradable à 100% selon les résultats des essais relatifs au protocole expérimental de 1 ' OCDE .

En plus d'un impact significativement réduit sur l'environnement par rapport à l'état de l'art, les formulations biocides selon l'invention présentent un effet innovant de mise à disposition biologique de l'actif biocide grâce à des structures tensioactives adaptées et sous l'effet de modifications physicochimiques du mélange, ce qui se traduit par une combinaison recherchée entre les constituants et des performances permettant de substituer, à équi-concentration, les produits chimiques et dangereux du marché .

La présente formulation biocide présente une action efficace à 1' encontre de certains organismes indésirables ou pathogènes, et un effet amélioré par rapport aux formulations biocides connues de l'art antérieur. L'action de la formulation est illustrée dans les exemples ci-dessous .

En particulier, cette formulation biocide permet de lutter contre des champignons appartenant à l'espèce Aspergillus niger, qui est susceptibles d'être toxique et pathogène, notamment en provoquant des mycoses pulmonaires chez l'homme.

La formulation selon l'invention présente en outre une activité biocide, notamment virucide, à l' encontre de souches de virus appartenant à la famille des adénovirus, ceux-ci pouvant être responsables de maladies comme la pharyngite, les pneumonies, ou encore les conjonctivites. L'effet virucide a également été démontré à l' encontre de rotavirus, responsables notamment de gastroentérites .

En ce qui concerne les acides organiques utilisables dans la composition des formulations biocides selon la présente invention, on citera, notamment, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide succinique, l'acide pyruvique, l'acide glycolique.

Le choix de l'acide organique est fait en fonction du domaine d' application des formulations biocides et des organismes cibles à éliminer ou dont on souhaite ralentir le développement . Dans un mode de réalisation particulier, le ou les acides organiques sont l'acide lactique et l'acide citrique.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, seul l'acide lactique est utilisé.

En effet, l'acide lactique est l'un des éléments indispensables du métabolisme humain, mais également du métabolisme des animaux et des micro-organismes. L'acide lactique présente de façon intrinsèque des propriétés d' interférence sur les microorganismes car il agit directement sur leur pH ainsi que sur leur cycle énergétique. Par ailleurs, il a également une action antimicrobienne en inhibant leur croissance (pour Escherichia Coli entre autres) .

En plus de l'acide organique, la formulation biocide concentrée selon l'invention comporte également au moins un tensioactif anionique .

Celui-ci est avantageusement choisi parmi les carboxylates de sodium comprenant un nombre d' atomes de carbone compris entre 5 et 16.

Le tensioactif anionique peut également consister en un carboxylate de potassium comprenant un nombre d' atomes de carbone compris entre 5 et 16.

De préférence, la chaîne carbonée des tensioactifs anioniques est issue d'alcool gras ou d'acide gras végétaux.

Ainsi, par exemple, le tensioactif anionique consiste en un alkyl carboxylate de type caprate de sodium, caprylate de sodium, laurate de sodium, C8-C16 alkyl sulfate de sodium, d'ammonium ou de potassium, un ester d'acide gras carboxylé. Le tensioactif anionique peut également être constitué par les espèces acides issues de ces sels .

La formulation biocide concentrée selon l'invention peut également comporter d'autres ingrédients.

Ainsi, ladite formulation peut comporter, en plus de l'acide organique et du tensioactif anionique, au moins un tensioactif non- ionique et/ou au moins un parfum naturel et/ou au moins un agent chélatant .

Les tensioactifs non-ioniques ou autres composants de type huiles essentielles ou chélatant pouvant entrer dans la composition du produit biocide selon l'invention sont sélectionnés en fonction du type de performance et d' application demandée : un judicieux mélange est nécessaire afin de ne pas perturber ou modifier les propriétés biocides recherchées initialement. Effectivement, par exemple, des propriétés désinfectantes performantes et/ou dégraissantes sont nécessaires dans l'univers de la restauration ou de l' agro-industrie avec des produits peu ou pas toxiques afin d'éviter toute contamination chimique préoccupante, notamment par la présence de résidus chimiques sur les surfaces après la procédure de désinfection .

Dans un mode de réalisation particulier, la formulation biocide selon l'invention peut comporter au moins un tensioactif non-ionique, de préférence dans une proportion comprise entre 2 et 15% en masse par rapport à la masse totale de la formulation.

De manière avantageuse, ce tensioactif non-ionique est choisi parmi les glycosides et les alkyl polyglycosides dont la chaîne carbonée comporte entre 5 et 20 atomes de carbone, plus avantageusement encore entre 5 et 18 atomes de carbone et le groupement hydrophile est préférentiellement composé de résidus pentose ou hexose .

Ainsi, de préférence, la formulation selon l'invention peut comporter un tensioactif non-ionique sélectionné parmi les octyl glucosides, les décyl glucosides, les lauryl glucosides, les coco glucosides, les D-glucopyranose, D-xylopyranose C10-C16 alkylpolyglycosides .

Les agents chélatants pouvant entrer dans la composition de la formulation biocide selon l'invention sont des agents conventionnels dans le domaine du nettoyage et de la désinfection des surfaces à usage domestique ou professionnel.

Ils sont sélectionnés parmi les chélatants couramment utilisés dans les produits biocides, tels que l'acide citrique, issu du jus de citron ou de la fermentation de sucres végétaux simples ou complexes, notamment le glucose, le fructose, et le saccharose, ou l'acide sorbique, issu du sorbier, ou l'acide oxalique, issu des racines ou des rhizomes de nombreuses plantes (oseille, betterave, etc.), les monomères ou polymères séquestrants comme les extraits de chicorée, ou des dérivés d'acides aminés.

En outre, l'agent chélatant peut également, dans un mode de réalisation, être issu de la fermentation de matériel agricole. Ce matériel agricole de base peut consister par exemple en des résidus de mélasse permettant d'obtenir des agents complexants de type gluconates .

Préférentiellement , le ou les agents chélatants sont présents à raison de 0,1% à 10% en masse par rapport à la masse totale de la formulation .

Les propriétés olfactives des produits biocides selon l'invention peuvent être conférées par la présence d'au moins un parfum naturel issu d' une ressource naturelle renouvelable et biodégradable .

Ce parfum naturel peut être avantageusement choisi parmi les huiles essentielles, les essences végétales ou encore les extraits végétaux.

On citera notamment à titre d'exemple la menthe A, la menthe N ou l'eucalyptus G.

Préférentiellement , le ou les parfums naturels sont présents dans la formulation biocide concentrée à raison de 0,01% à 10% en masse par rapport à la masse totale de la formulation.

La présence du parfum apportera avantageusement une note olfactive, sans participer à l'activité biocide du produit. Ainsi, celui-ci pourra être retiré dans des conditions où des formulations sans parfum s'imposent, telles que dans l'industrie agroalimentaire . Une formulation contenant le produit biocide selon l'invention peut être diluée de 1 à 500 fois dans l'eau en fonction de l'utilisation envisagée.

Les formulations selon l'invention sont conformes à la réglementation européenne en termes d'efficacité. Elles répondent aux normes EN1040, EN1276, EN1656, EN 1275, EN 13697, EN1650 et EN14476+A1 en conditions de saleté ou de propreté.

En outre, ces formulations efficaces sont sans danger particulier pour l'Homme et sans préjudice pour l'Environnement.

Les formulations biocides selon l'invention sont susceptibles d'être utilisées à des taux de dilution et dans des temps d'action comparables à ceux requis par le marché professionnel. En outre, elles sont conformes aux exigences d'efficacité biocide requises, sans danger particulier à l'application, biodégradables et sans écotoxicité après élimination .

Dans un mode de réalisation préféré, les formulations biocides selon l'invention sont fournies sous forme liquide concentrée. Elles peuvent être très diluées, par exemple de 50 à 500 fois, notamment dans de l'eau, et conserver tout aussi bien leurs activités en fonction de l'application envisagée.

Ainsi, la présente invention porte également sur une composition liquide aqueuse comprenant au moins la formulation biocide décrite plus haut et de l'eau, et toutes les dilutions dans l'eau de ladite composition jusqu'à une concentration minimale de 0,2% de ladite composition.

Le restant de la composition comporte au moins de l'eau. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la composition liquide aqueuse selon l'invention peut également comporter d'autres ingrédients de manière à améliorer les propriétés de nettoyage ou/et organoleptiques, sans toutefois modifier l'activité biocide de ladite formulation.

Dans un exemple de réalisation préférentiel, la formulation biocide selon l'invention est présente, dans ladite composition liquide aqueuse, dans une proportion comprise entre 0,2 et 2% en masse, par rapport à la masse totale de ladite composition. En d'autres termes, ladite formulation peut être diluée avantageusement entre 50 et 500 fois et être toujours active sur les organismes indésirables que l'on souhaite éliminer.

Plus préfèrentiellement encore, la formulation biocide selon l'invention est présente, dans ladite composition liquide aqueuse, dans une proportion comprise entre 1 et 2% en masse, plus avantageusement entre 1,5 et 2% en masse, par rapport à la masse totale de ladite composition.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer cette efficacité, notamment à l' encontre de certaines souches pathogènes ou indésirables de levures, de champignons et de bactéries, mais également à l' encontre de certains virus pathogènes.

En particulier, les formulations biocides sont particulièrement intéressantes car elles restent toujours efficaces même à des taux de dilution élevés, et présentent une efficacité comparable à des formulations plus concentrées mais qui sont moins intéressantes d'un point de vue économique.

Les applications envisagées pour les formulations biocides selon l'invention sont basées sur une action désinfectante mais aussi détergente, dégraissante, émolliente, olfactive, etc..

On citera à titre d'exemples, mais sans que cette liste ne soit exhaustive, une application des formulations selon l'invention à des produits anti-mousse pour nettoyer les ouvrages de maçonnerie ; des produits pour nettoyer les pontons et les coques de bateaux des mousses et algues qui les colonisent ; des solutions détergentes désinfectantes pour tous types de surface ; des solutions pour l'hygiène des mains par lavage ou par friction ; des solutions de désinfection des denrées alimentaires ; des solutions pour la désinfection de locaux, bâtiments et matériels de transport et d' élevage ; des solutions de désinfection des surfaces pour l'industrie agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique ; des solutions de désinfection pour locaux et/ou transport des ordures ménagères, des solutions de désinfection du matériel de traite, des trayons, des litières d'animaux.

Dans un mode de réalisation particulier, les formulations biocides selon l'invention sont utilisées pour l'hygiène des mains, par lavage ou par friction, sous forme liquide ou semi-liquide, avec ou sans rinçage à l'eau.

La présente invention porte également sur un substrat imprégné avec une formulation biocide concentrée selon l'invention, permettant l'application de ladite formulation sur une surface à nettoyer et à désinfecter.

Ce substrat peut consister en un tissu, une lingette ou une serviette .

Sur son substrat, la formulation selon l'invention peut être pure et déshydratée et n'être activée qu'une fois en présence d'eau ou encore être déjà diluée et prête à l'emploi.

En d'autres termes, le substrat peut également être imprégné de la composition liquide aqueuse telle que décrite ci-dessus, ladite composition comportant au moins la formulation biocide et de l'eau, ladite formulation étant présente dans une proportion comprise entre 0,2% et 2% en masse par rapport à la masse totale de ladite composition.

Exemple de formulation biocide :

Dans un exemple de réalisation, la formulation biocide selon l'invention présente les composés suivants, dans les proportions suivantes :

2,4% de tensioactifs non-ioniques de type glycosides ;

5% de tensioactifs anioniques de type sels d'acides gras avec une chaîne contenant 8 à 14 atomes de carbone de type cocoate de sodium;

91% d' acide lactique

1,6% d'eau.

Cette formule est uniquement classée irritante selon la réglementation en vigueur, au même titre que l'acide lactique utilisé dans ladite formulation. Un tel classement lui permet de passer au travers de dossiers d' instruction lourds et coûteux pour une mise sur le marché. En outre, cette formulation ne présente aucun danger pour l'homme ou pour l'environnement comparativement aux substances d' origines chimiques qui sont commercialisées sur le marché .

Cette formulation est diluée en fonction des surfaces à nettoyer, à assainir et de l'efficacité désinfectante recherchée. La formule diluée active permettant une désinfection de surface ne présente aucun danger connu et/ou réglementé.

Dans un deuxième exemple de réalisation, la formulation biocide selon l'invention est composée comme suit :

76% d'acide lactique ;

24% de tensioactifs anioniques de type sels d'acides gras avec une chaîne contenant 8 à 10 atomes de carbone de type alkyl carboxylate de sodium.

Dans un troisième exemple de réalisation, la formulation biocide selon l'invention est composée comme suit :

80% d'acide lactique ;

5% de tensioactifs anioniques de type sels d'acides gras de type cocoate de sodium;

1% de composition parfumante à base d'extraits végétaux ;

14% eau.

Dans un quatrième exemple de réalisation, la formulation biocide selon l'invention est composée comme suit :

76% d'acide lactique ;

10% de tensioactif non-ioniques de type alkyl polyglycosides ;

10% de tensioactif anioniques de type C10-C12 carboxylate de sodium ;

4% eau.

Tests d'efficacité de la formulation biocide

La formulation biocide qui a été testée est celle qui est précisée ci-dessus et qui comporte :

2,4% de tensioactifs non-ioniques de type C10-C16 alkyl polyglycosides ;

5% de tensioactifs anioniques de type sels d'acides gras type caprylate de sodium; 91% d' acide lactique ;

1,6% eau.

1. Levures - Candida albicans

Cet essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de l'activité levuricide de base de la formulation selon l'invention est réalisé par un Laboratoire de Microbiologie. Cet essai est réalisé en conditions de saleté et en conditions additionnelles .

Méthode : Une méthode de dilution/neutralisation est appliquée à une formulation selon l'invention. Le neutralisant est constitué de chlorure de sodium (0,85% P/V) , de Na ₂ C0 ₃ (0,1%), complété par de l'eau distillée.

La formulation selon l'invention est diluée dans de l'eau physiologique aux concentrations suivantes : 1%, 1,2%, 1,5% et 2%.

Les tests sont réalisés sur une souche de Candida albicans (ATCC 90028) à une température de 20° C (± 1°C) . Le temps de contact est limité à 5 minutes (± 10 secondes) .

La substance interférente est de l'albumine bovine (fraction V) à raison de 3,00 g/1. Ceci constitue la condition de saleté.

Les tests sont incubés à une température de 25,0°C (± 0,2°C) pendant 48h .

Résultats : conformément aux dispositions de la norme NF EN 1275 (Avril 2006) la formule selon l'invention présente une activité levuricide en conditions de saleté (3,00 g/1 d'albumine bovine) après 5 minutes de contact à 20°C vis-à-vis d'une souche de référence de Candida albicans pour la concentration de 1,2%.

2. Champignons - Aspergillus niger

Il a également été testé l'activité fongicide de la formulation biocide selon l'invention, plus particulièrement sur un champignon appartenant à l'espèce Aspergillus niger.

La formulation biocide est diluée à une concentration de 2% dans de 1 ' eau .

Les essais ont été conduits à une température de 20°C (± 1°C) . Deux temps de contact ont été testés : 15 min et 30 min. La substance interférente est de l'albumine bovine (fraction V) à raison de 0,30 g/1. Ceci constitue la condition de propreté.

Les tests sont incubés à une température de 30 °C pendant une durée de 2 jours .

Résultats : La formulation diluée à 2% présente une activité fongicide à l' encontre de la souche Aspergillus niger après un temps de contact de 30 min à une température de 20 °C et en conditions de propreté (0,30g/l d'albumine bovine).

Les résultats obtenus pour C. albicans et A. niger sont repris dans le tableau ci-dessous .

Tableau 1. Essais d'activité fongicide selon EN1650, conditions de saleté (3 g/L de

BSA) et de propreté (0,3g/L de BSA), 20°C

3. Virus - Rotavirus et Adénovirus

Ce test d' efficacité virucide est réalisé selon la méthodologie de la norme NF EN 14476+A1 (Janvier 2007) sur deux virus .

a) Rotavirus

Le premier virus testé est un Rotavirus (souche ATCC VR-1290) et les essais ont été conduits sur 3 échantillons de produit désinfectant prêts à l'emploi, selon la formulation de la présente invention diluée à 2% dans de l'eau.

Méthode : Le test est réalisé à 20°C (± 1°C) . Le temps de contact est de 15 minutes. Les échantillons sont dilués dans de l'eau distillée stérile. La substance interférente est de l'albumine bovine (BSA 3,00 g/1).

La souche virale a été testée sur des cellules MA-104 à 36,5°C sous 5% de C0 ₂ . La technique d'arrêt de l'action virucide est l'adjonction d'une solution contenant Na ₂ C0 ₃ , à raison de 70 g/1, pH 10,85 et 10ml de solution d'arrêt pour 10 ml de solution d'essai. Une telle solution permet de stopper l'action du désinfectant sur le virus et de mesurer l'efficacité de la formulation biocide testée.

Le virus est titré en UFP/ml (unités formant plage) soit en nombre de particules virales infectieuses par ml et plus communément en logarithme du titre viral .

Résultats : Les trois échantillons de formulation biocide selon l'invention ont une activité virucide sur la souche de Rotavirus à une concentration de 2% pour 15 min de contact. b) Adénovirus

Le second virus testé est un Adénovirus (souche adénoïd 75 ATCC VR-5) .

La formulation biocide selon l'invention est diluée à 2% dans de l'eau et la méthode d'essai est la même que celle utilisée sur le Rotavirus et décrite ci-dessus.

Toutefois, le temps de contact est de 60 min.

La souche virale a été testée sur des cellules HEp-2 à 36,5°C sous 5% de C0 ₂ .

Résultats : Les trois échantillons de formulation biocide selon l'invention ont une activité virucide sur la souche d' Adénovirus à une concentration de 2% pour 60 min de contact.

Les résultats obtenus pour les tests d'activité virucide sont repris dans le tableau ci-dessous :

Temps BSA

Concentration Réduction Activité

Souche virale Lot testé de (g/L)

d'essai (w/w) log virucide

contact

0212/2013 2% 15 min R = 4,25 OUI 0,3

Rotavirus

souche ATCC 0226/2013 2% 15 min R = 4, 375 OUI 0,3

VR-1290

0227/2013 2% 15 min R = 4, 125 OUI 0,3

Adénovirus 0395A/2013 2% 60 min R = 4, 125 OUI 0,3

souche

0406A/2013 2% 60 min R = 4,25 OUI 0,3 adénoïd

75 ATCC VR-5 0406B/2013 2% 60 min R = 4, 125 OUI 0,3 Tableau 2. Essais d'activité virucide selon EN 14476+A1, conditions de propreté (0,3 g/L de BSA), 20°C

Il a également été démontré que la présente formulation biocide est efficace à une concentration de 1% sur les virus enveloppés à génome ADN, tels que ceux appartenant à la famille des Herpesviridae . En outre, la formulation biocide est également efficace à 1% sur des virus influenza.

4. Bactéries

Cet essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de l'activité bactéricide des formulations selon la présente invention est réalisé par un Laboratoire de Microbiologie .

Méthode : Une méthode de dilution/neutralisation est appliquée à une formulation selon l'invention. Le neutralisant est constitué de chlorure de sodium (0,85% P/V) , de Na ₂ C0 ₃ (0,1%), complété par de l'eau distillée. Cette méthode de dilution/neutralisation permet de stopper l'action biocide du produit à la fin du temps de contact testé .

La formulation selon l'invention est diluée dans de l'eau physiologique aux concentrations suivantes : 0,5%, 1,2% et 1,5%.

Les tests sont réalisés sur des souches de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) , Escherichia coli (ATCC 10536) , Enterococcus hirae (ATCC 10541) et Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) à une température de 20° C (± 1°C) . Le temps de contact est limité à 5 minutes (± 10 secondes) .

La substance interférente est de l'albumine bovine (fraction V) à raison de 3,00 g/1. Ceci constitue la condition de saleté.

L'incubation est effectuée à une température de 37,0°C (± 0,2°C) pendant 24h.

Résultats : Selon les indications de la norme NF EN 1276 (octobre 1997) , une formule concentrée de désinfection selon la formulation de la présente invention, présente une activité bactéricide en conditions de saleté (3,00 g/1 d'albumine bovine) après 5 minutes de contact à 20°C visDàDvis des 4 souches de référence testées pour la concentration test de 1% . Le microorganisme limitant est Staphylococcus aureus (ATCC 6538) .

Les résultats des tests bactéricides sont représentés dans le tableau 3 ci-dessous .

Tableau 3. Essais d'activité selon EN 1276, conditions de saleté (3 g/L de BSA), temps de contact 5min, 20 °C

Des tests sont également réalisés selon une méthode normalisée (EN13697) de manière à démontrer l'effet bactéricide et/ou levuricide par application sur des surfaces .

Les surfaces témoins utilisées sont des disques en acier inoxydables sur lesquels est déposée une solution de bactéries et/ou de levures. Il s'agit plus particulièrement des souches microbiennes exposées ci-dessus . Les disques sont ensuite immergés dans la solution biocide à 20°C (+/- 0,2°C) pendant un temps de contact de 5 minutes . La concentration microbienne résiduelle est déterminée après incubation à 37 °C (+/-2°C) pour les bactéries ou à 25°C (+/- 0,2°C) pour les levures.

Résultats : Selon les indications de la norme EN 13697 (novembre 2001) , une formule concentrée de désinfection selon la formulation de la présente invention, présente une activité bactéricide et levuricide en conditions de saleté (3,00 g/1 d'albumine bovine) après 5 minutes de contact à 20°C vis-à-vis des 4 souches bactériennes de référence testées et de la souche levurienne pour la concentration test de 1%.

5. Biodégradabilité

Cet essai est une évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime d'un échantillon de la formulation concentrée selon l'invention.

Cet essai est réalisé selon les dispositions de la méthode OCDE 301 A utilisant un échantillon contenant une teneur en carbone organique dissous de 10 mg/1 (COD pour carbone organique dissous) . L'évolution de la disparition du carbone organique dissous est suivi pendant une période de 28 jours dans l'essai « Désinfection concentré » à 10 mg/1 de COD ». L'analyse physico-chimique est réalisée suivant la norme ASTM D5291.

La figure 1 ci jointe représente les courbes de résultats de dégradation du carbone organique dissous au bout de 28 jours. La substance de référence correspond à de l'acétate de sodium. L'échantillon référencé « désinfection concentrée » correspond à la fomulation biocide testé décrite ci-dessus et l'échantillon « essai inhibition » correspond à un mélange entre la formulation selon l'invention et l'acétate de sodium.

Résultats :

L'essai est considéré comme valide car :

- Le pourcentage de dégradation de la substance de référence (acétate de sodium) est supérieur à 70 % (99 %) au quatorzième jour ;

- La différence entre les valeurs de mesures de COD du produit étudié est inférieure à 20% à chaque prélèvement ;

- Le degré d'élimination du COD dans l'essai inhibiteur, contenant le composé d'essai et la substance de référence, étant supérieur à 35% au bout de 14 jours (98%), l'échantillon n'est pas considéré comme toxique vis-à-vis de l'ensemencement.

Conclusion L'évaluation en milieux aqueux de la biodégradabilité "ultime" de l'échantillon testé suivant la ligne directrice OCDE 301 A donne les résultats suivant :

- Le degré de biodégradation maximal de l'échantillon à 10 mg/1 de COD est égal à 100% après 28 jours d'incubation ;

- Le temps de biodégradation (correspondant à 90 % du taux de biodégradation maximal) est d'environ 25 jours ;

- D'après la ligne directrice OCDE 301 A, l'échantillon testé « Désinfection concentrée » est considéré comme facilement biodégradable (le niveau de seuil de diminution du COD de 70% étant acquis dans un intervalle de 10 jours après que 10% de biodégradabilité soit atteint (94% à la fin de l'intervalle de 10 jours au ll ^tee jour de test) .

Le degré de biodégradabilité mesuré prend en compte la totalité de la formulation effectivement il n'y a pas de sous- produit de dégradation car la formulation est exclusivement composée d'atomes de carbone, d'oxygène et d'hydrogène provenant d'extraits végétaux. C'est une mesure vraie de biodégradabilité ultime.