Die Erfindung betrifft kationische Lipide der allgemeinen Formel I,

I wobei n=2,3,4,6,8 und m=2,3,6,8 sein kann und R. = H, CH ₃ , CH ₂ CH ₂ OH; R ₂ - H, CH ₃ , CH ₂ CH OH, (CH )3N ⁺ (Rι) ₃ , R ₃ einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest C ₇ -C ₂₁ , Z - CH ₂ , O, NH, Y = CH ₂ , O, NH und X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet;

kationische Lipide der Formel II,

II wobei R _] einen aliphatischen, aromatischen oder heteroaliphatischen α-C-Atom- Substituenten der α-Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Cystein, Cystin, Methionin, Tryptophan, Arginin, Lysin, Ornithin, Histidin, R ₂ einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest C ₇ -C ₂₁ , X = Cl, Br, I, CH3COO, CF ₃ COO, Y = CH ₂ , O, NH und Z = CH ₂ , O, NH bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel III,

III wobei R, = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₃ NH ₂ ⁺ X-(CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ X- , R ₃ = H, (CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ X" , R ₂ einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest C ₇ -C _{2 ]} und X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel IV,

IV wobei n=l -4 sein kann und R einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest C ₇ -C ₂₁ , Y = CH ₂ , O, NH, Z = CH ₂ , O, NH und X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF3COO bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel V,

wobei n=2,3,4,6,8 und m=2,3,6,8 sein kann und R] = H, CH ₃ , CH ₂ CH ₂ OH; R ₂ = H. CH ₃ , CH ₂ CH ₂ OH, (CH ₂ ) ₃ N ⁺ (Rι ) ₃ und X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel VI,

wobei R, = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₃ NH ₂ ⁺ X-(CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ X-, (CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ X- . R-> = H, (CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ X- und X = Cl, Br, I, CH3COO, CF ₃ COO bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel VII,

VII wobei m=2-6 sein kann und Y eine Gruppe N(R) ₃ ⁺ X- mit R = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₂ OH oder eine Gruppe NH-C(NH ₂ ⁺ X")NH ₂ mit X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet; kationische Lipide der allgemeinen Formel VIII,

VIII wobei Y eine Gruppe N(R) ₃ ⁺ X- mit R = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₂ OH oder eine Gruppe NH-C(NH ₂ ⁺ X ^* )NH ₂ mit X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet;

kationische Lipide der allgemeinen Formel IX und X,

wobei n=2,3,4,6,8 und m=2,3,6,8 sein kann und Ri = H, CH ₃ , CH ₂ CH ₂ OH; _. R ₂ = H, CH ₃ , CH ₂ CH ₂ OH, (CH ₂ ) ₃ N ⁺ (Rι) ₃ , R = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₂ OH, Y eine Gruppe Carbonyl (=0 (Östron)) oder eine Gruppe OH (Östradiol), Z eine Gruppe N(R) ₃ ⁺ X" mit R = H, CH ₃ , (CH ₂ ) ₂ OH oder eine Gruppe NH-C(NH ₂ ⁺ X")NH ₂ und X = Cl, Br, I, CH ₃ COO, CF ₃ COO bedeutet.

Kationische Lipide der allgemeinen Formel I-X sind geeignete Reagenzien für den liposomalen Gentransfer (Transfektion). Anwendungsgebiete derartiger

Transfektionsreagenzien liegen in der Medizin und in der Gentechnik. Das Einbringen genetischen Materials in eukaryontische Zellen ist ein grundlegendes Verfahren zum Studium biologischer Funktionen und von zunehmender Bedeutung für die gentherapeutische Behandlung verschiedener Erkrankungen, von denen die Tumoren an erster Stelle zu nennen sind.

Man unterscheidet hierbei biologische, physikalische und physikochemische Methoden für den Transfer von DNA, RNA und Proteinen in die Zielzelle [Wagner J, Madry, H., Reszka. R (1995). In vivo gene transfer: focus on the kidney. Nephrol. Dial.TransplantlO:1801-1807 Zhu J, Zhang L, Hanisch U-K, Feigner PL,. Reszka R (1996). In vivo gene therapy of experimental brain turnors by continuous administration of DNA-liposome complexes. Gene Therapy 3: 472-476, Kiehntopf, M., Brach MA & Hermann F (1995). Gentherapie in der Onkologie: Perspektiven, Chancen und Risiken. Onkologie 18 (Sonderheft): 16-26]. Physikalische Methoden wie Elektroporation und Mikroinjektion sind nur für den ex vivo und in vitro Transfer geeignet. Die sogenannte "Jet"- Injektions-Methode läßt sich darüberhinaus auch für den in vivo Gentransfer anwenden (Leber, Haut). Physikochemische Methoden wie Kalziumphosphatpräzipitationstechnik (KPP)- und DEAE-Dextran-Transfektion, sind auf in vitro und ex vivo Anwendungen begrenzt. Der zur Zeit in einer Reihe von klinischen Studien (Phase I/II) erprobte retrovirale Gentransfer mit Hilfe virusproduzierender Zellen ist durch eine längeranhaltende, aber relativ niedrige Genexpression in sich teilende Zellen gekennzeichnet. Problematisch beim retroviralen Gentransfer ist vor allem die Entwicklung einer spezifischen Irnmunantwort gegen die implantierten virusproduzierenden Helferzellen, die Möglichkeit der Generierung replikationskompetenter Viren und die Gefahr einer Aktivierung von zellulären Onkogenen bzw. Inaktivierung von Suppressorgenen als Resultat der zufälligen Lokalisation der Geninsertion. Die notwendigen umfangreichen zellbiologischen und medizinischen Vorarbeiten und die aufwendigen Sicherheitsvorkehrungen lassen hohe Kosten bei der klinischen Anwendung des retroviralen Gentransfers erwarten.

Vektoren auf der Basis von Adenoviren sind ebenfalls aussichtsreiche Gentransfervehikel. Diese erreichen hohe Transfektionsraten auch in sich nicht teilendem Gewebe. Da die DNA nicht in das Genom integriert wird, ist die Dauer der Fremdgenexpression begrenzt und einer

wiederholten Anwendung in vivo steht die starke spezifische Immunantwort des Wirtsorganismus bei wiederholten Applikationen entgegen.

Der liposomal vermittelte Gentransfer hat dagegen in den letzten Jahren auch für in vivo Anwendungen an Bedeutung gewonnen. Die Genkonstrukte lassen sich entweder in die Liposomen verkapseln oder werden mit der Membran assoziiert. Liposomale Präparationen zeichnen sich durch eine einfache Handhabung, geringe Immunreaktivität und damit wiederholbare Anwendbarkeit bei niedrigem Sicherheitsrisiko für Anwender und "Empfänger" aus. Noch am Anfang steht die Anwendung von Immuno liposomen als Transportvehikel für genetisches Material.

Ein ebenfalls interessanter Ansatz ist die Verwendung fusogener Liposomen, die in ihrem Inneren einen Komplex aus DNA und Kernprotein (HMG I) tragen [Kaneda, Iwai, K., Uchida, T(1989). Increased expression of DNA eointrodueed with nuclear protein in adult rat liver Science 243, 375-378,Kaneda Y, Kato, K., Nakanishi, M., Uchida, T.(1996) Introduction of plasmid DNA and nuclear protein into cells by using erythrocyte ghosts, liposomes, and Sendai virus. Methods-Enzymol. 221 :317-327].

Seit einigen Jahren werden kationische Liposomen für den Transfer von DNA (Feigner PL, Gadek TR, Holm M et al. (1987). Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure. Proc Natl Acad Sei USA 84:7413-7417, Feigner JH, Kumar R, Sridhar CN et al. (1994). Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem 269:2550-2561), Antisense-Oligomeren, Proteinen und Ribozymen mit Erfolg eingesetzt. DNA wird dabei über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Membran der Liposomen assoziiert und über einen bisher noch unvollständig verstandenen Mechanismus in die Zielzelle transferiert. Die Transferrate in vitro ist dabei in Abhängigkeit von der Zellinie mit der Effizienz des retroviralen Gentransfer vergleichbar. Zur Zeit befinden sich die ersten kationischen Liposomen/DNA/Komplexe [DMRIE DOPE und DOTMA/DOPE (Lipofectin, Gibco BRL USA) sowie DC-Chol DOPE] in einer klinischen Phase I/II Prüfung (Gao, X., Huang, L. (1995) Cationic liposome-mediated gene transfer. Gene Therapy 2:710-722).

Kationische, amphiphile Moleküle, bestehend aus einem Lipidteil (Steroid-oder Diglycerid- Gerüst) und einer positiv geladenen Kopfgruppe (Ammonium-Ionen) sind in der Lage, entweder spontan oder nach Zusatz eines Hilfslipids (Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE)) Liposomen auszubilden. DNA wird dabei über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Membran der Liposomen assoziiert und über einen bisher noch unvollständig verstandenen Mechanismus in die Zielzelle transferiert.

Für einen möglichst effizienten in vitro und in vivo Gentransfer sollten die zur Generierung der Liposomen verwendeten kationischen Lipide die folgenden Kriterien erfüllen: 1. Sie sollten nicht toxisch und biologisch abbaubar sein und keine Immunreaktionen hervorrufen

2 Sie sollten möglichst effizient mit der DNA komplexieren, diese vor Abbaureaktionen schützen und hohe Transferraten aufweisen

3 Sie sollten Zellen rezeptorspezifisch transfizieren

4 Sie müssen leicht und in größeren Mengen synthetisiert werden können

Sowohl die Syntheseverfahren als auch die Moleküle selbst der bislang in der Literatur beschriebenen kationischen Amphiphile weisen eine Reihe von Nachteilen auf Die Synthese der kommerzialisierten Transfektionsreagenzien DOTMA (Lipofektin), DOGS und DOSPA verläuft über viele Stufen mit zum Teil sehr geringen Ausbeuten und die Aufreinigung der Produkte erfordert eine aufwendige säulenchromatographische Reinigung Bei vielen Verbindungen wie z B DOTMA, DMRIE und DOSPA sind die kationischen Kopfgruppen mit langkettigen Fettalkoholen über Etherbindungen verknüpft, welche eine sehr schlecht biologische Abbaubarkeit und somit eine hohe Toxizitat des Moleküls zur Folge haben

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, neuartige kationische Lipide zu finden, welche im Vergleich mit den bislang bekannten Verbindungen höhere Gentransferraten und geringere Toxizitäten aufweisen Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, Verfahren zu finden, welche die Synthese der kationischen Lipide in wenigen Reaktionsstufen und mit hohen Ausbeuten ermöglicht

Diese Aufgaben wurde gemäß den Ansprüchen I-IX gelost Mit den neuartigen kationischen Lipiden der Formeln I-XI werden Verbindungen zur Verfügung gestellt, die den Anforderungen der Aufgabenstellung entsprechen. So wird z.B in Abbildung 2-6 an unterschiedlichen Tumorzellinien gezeigt, daß die aus den Lipiden SP-Chol, O-Chol, Put-Chol und DOSGA und dem Helferlipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) (in den beschriebenen molaren Verhältnissen) hergestellten Liposomen im Vergleich zu DC- Chol/DOPE Vesikel deutlich höher transfizieren in Abwesenheit von Serum An der Ratten- Kolonkarzinomlinie CC531 (Abb.3) transfizieren SP-Chol und O-Chol/DOPE signifikant höher als DC-Chol/DOPE bei einem 5%igem Serumanteil. Besonders überraschend sind die in Abb 5 und 6 gezeigen hohen Transferraten, die unter Verwendung von DOSGA/DOPE-Liposomen bei einem 5%igem Serumanteil an humanen und Rattenglioblastomzellen (N64, F98) gewonnen wurden Auch sind SP-Chol/DOPE-Liposomen in serumhaltigen Medium sehr gut geeignet, humane Brusttumorzellen (MaTu) zu transfizieren (Abb 1) Zuordnung der Lipide

Lipide Verbindungsklasse

DC-Chol 1 ß N-(N ^" ,N ^" -Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol

Sp-Chol V Beispiel 4

Put-Chol VII Beispiel 4

O-Chol VI Beispiel 5

DOSGA IV Beispiel 3

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt gemäß den beigefügten Schemata.

Schema I beschreibt das Verfahren zur Herstellung neuartiger kationischer Lipide mit 1 ,3- Diglycerid-Grundgerüst an denen die kationische Kopfgruppe über einen Carboxylat-Spacer angeknüpft ist.

Schema II beschreibt das Verfahren zur Synthese 1,3-Diglycerid-modifϊzierter Aminosäuren.

Schema III beschreibt das Verfahren zur Synthese 1,3-Diglycerid-modifizierter Guanidin- Derivate.

Schema IV beschreibt das Verfahren zur Synthese neuartiger Cholesterol-Derivate mit biogenen Aminen als kationischen Kopfgruppen.

Schema V beschreibt das Verfahren zur Synthese Aminosäure-modifizierter Cholesterol- Derivate.

Schema VI beschreibt das Verfahren zur Synthese Glucosamin-modifϊzierter Cholesterol- Derivate.

Schema VII beschreibt das Verfahren zur Synthese kationisch-modifizierter Oestradiol- Derivate.

Schema VIII beschreibt das Verfahren zur Synthese kationisch-modifizierter Oestron- Derivate.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, das es nunmehr möglich ist. durch die beschriebenen Verfahren unter kostengünstigen Bedingungen und unter Verwendung preiswerter Chemikalien Transfektionsreagenzien zu synthetisieren, welche eine unerwartet hohe Gentransferrate und eine gute biologische Abbaubarkeit aufweisen.

P

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Herstellung von 2-(Λ^-carbamoyl-(V ¹ ,Λ ^f1 0,Λ ^{rl 4} -ammoniumtetraazadecan))-l,3-dioleoyloxy- propan-tri-trifluoracetat I

247 μl (1 mmol) l,3-Dibenzyloxy-2-propanol wurden mit 7 ml einer 20%igen Lösung von Phosgen in Toluol versetzt und 48 h bei RT gerührt. Nach dieser Zeit wurde überschüssiges Phosgen mit Argon ausgetrieben und der Ansatz zu einer Lösung von 302 mg (0.6 mmol) und 300 μl Triethylamin in 5 ml Methylenchlorid zugetropft und für 4 h bei RT gerührt. Anschließende Säulenchromatographische Reinigung (Kieselgel 60) ergaben 375 mg (47%) 2-(/V ⁵ -carbamoyl-(/ ¹ yV ¹⁰ Jv ^fl -tris-BOC-tetraazadecan))-l,3- dibenzyloxy-propanol (zähes Öl).

670 mg (0.84 mmol) 2-(Λ ^r5 -carbamoyl-(N ^{1 10} _y N ¹⁴ - ris-BOC-tetraazadecan))-l,3- dibenzyloxy-propanol wurden daraufhin in 25 ml Ethanol gelöst, mit 150 mg Pd/C (5%) versetzt und 24 h hydriert. Nach Absaugen des Katalysators erhielt man 520 mg (100%) 2- (Λ^-carbamoyHiV ^{1 10} ^V ¹⁴ -tris-BOC-tetraazadecan))-l,3-propantriol (zähes Öl). 472 mg (0.76 mmol) 2-(Λ ^ö -carbamoyl-( ^'I Jv ^*10 ,Nl ris-BOC-tetraazadecan))-l,3-propantriol wurden mit 452 mg (1.6 mmol) Ölsäure, 334 mg (1.62 mmol) DCC und 20 mg DMAP in 30 ml Methylenchlorid gelöst und 24 h bei RT gerührt. Anschließende Säulenchromatographische Reinigung (Kieselgel 60) ergaben 457 mg (52%) 2-^- carb--moyl-(V ^I V ¹⁰ »iV ^{, 4} -tris-BOC-tetraazadecan))-l,3-dioleoyloxy-propan (zähes Öl). 200 mg (0.17 mmol) 2-(/V ⁵ -carbamoyl-(N ¹ J^10^v ^rl4 -tris-BOC-tetraazadecan))-l,3- dioleoyloxy-propan wurden mit 3 ml TFA/CH ₂ C1 ₂ (1 :1) versetzt und 30 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit 10 ml Dioxan verdünnt und im Hochvakuum vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 202 mg (99%) 2-(/V ⁵ -carbamoyl-(Λ^ ¹ ^ ¹⁰ ^ ¹ -ammoniumtetraazadecan))- 1,3-dioleoyloxy-propan-tri-trifluoracetat I (zähes, farbloses Öl):

Beispiel 2 Herstellung von 2-L-Alanyl-(l,3-dioleoyIoxy)propylamid-trifluoracetat II

4 mmol (756 mg) Boc-L-alanin (M= 189.21) und 4.3 mmol (436 mg = 600 μl) Triethylamin (M=101.19, d=0.726), wurden in 10 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und mit Aceton/N ₂ (fl.) auf -10°C abgekühlt. Nun wurden 4 mmol (320 μl) Chlorameisensäuremethylester (M=94.50, d=l .228) zugegeben und 30 min bei 0°C gerührt. Nach Zugabe von 5 mmol (456 mg) 2- Amino-l,3-propandiol (M=91.1 1) wurde noch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Entfernen des Tetrahydrofurans am Rotationsverdampfer wurden 50 ml Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde mit 5 ml ges. NaHCO ₃ -Lösung und 10 ml ges. NaCl- Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Einrotieren im Wasserstrahlvakuum wurden letzte Lösungsmittelreste im Olpumpenvakuum entfernt. Man erhielt 332 mg (32%) 2-BOC-L-Alanyl-(l ,3-dihydroxy)propylamid (farbloses Öl).

2.28 mmol (598 mg) 2-BOC-L-Alanyl-(l ,3-dihydroxy)propylamid, 5.70 mmol (1.610 g) Ölsäure (M=282.47), 5.70 mmol (1.176 g) Dicyclohexylcarbodiimid (M=206.33) und 0.23 mmol (28 mg) Dimethylaminopyridin (M=122.17) gelöst in 40 ml abs. CH C1 wurden 12 h bei RT gerührt. Anschließende Reinigung des Rohprodukts durch Säulenchromatographie (Kieselgel 60) ergab 1.450 g (80%) 2-BOC-L-Alanyl-(l,3-dioleoyloxy)propylamid. 0.89 mmol (702 mg) 2-BOC-L-AIanyl-(l ,3-dioleoyloxy)propylamid wurden mit 6 ml TFA/CH C1 ₂ (1 : 1 ) versetzt und 30 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit 10 ml Dioxan verdünnt und im Hochvakuum vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 712 mg (99%) 2-L- Alanyl-(1 ,3-dioleoyloxy)propylamid-trifluoracetat II.

Beispiel 3 Herstellung von 2-(Guanidino-ß-alanyl)-l,3-dioleoyloxypropylamid-hydrochlor id III

1.892 g (10 mmol) N-BOC-ß-alanin wurden analog zu Beispiel 2 zu 2-BOC-ß-Alanyl-l,3- dioleoyloxypropylamid (15% über beide Stufen) umgesetzt. 500 mg (0.64 mmol) 2-BOC-ß- Alanyl-l,3-dioleoyloxypropylarnid wurden mit 3 ml TFA/CH ₂ C1 ₂ (1 :1) versetzt und 30 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit 50 ml Methylenchlorid verdünnt und mit zwei mal 5 ml ges. NaHCO ₃ -Lösung extrahiert. Die über Natriumsulfat getrocknete organische Phase wurde am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand mit 103 mg (0.7 mmol) 1-H-Pyrazol-l-carboxamidin-hydrochlorid und mit 120 μl (0.7 mmol) DIEA in 20 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT gerührt. Anschließende Reinigung des Rohprodukts durch Säulenchromatographie (Kieselgel 60) ergab 480 mg (98%) 2-(Guanidino- ß-alanyl)-l,3-dioleoyloxypropylamid-hydrochiorid III (zähes Öl).

Beispiel 4 Herstellung von 3 ß-(N ⁵ -carbamoyl-(N ¹ ,-V ¹ °,/V ¹⁴ -ammoniumtetraazadecan))-cholesterol-tri- hydrochlorid V

610 mg (1.2 mmol) N^^N^-tris-BOC-spermin wurden in 10 ml Methylenchlorid gelöst und mit 674 mg (1.5 mmol) Cholesterolchlorformiat und mit 210 μl (1.5 mmol) NEt ₃ versetzt.

Der Ansatz wurde für 4 h bei RT gerührt und anschließend säulenchromatographisch gereinigt. Man erhielt 570 mg (52%) 3ß-(.V ⁵ -carb.-moyl-(N ¹ ,N ¹⁰ ,N ¹ -tris-BOC- tetraazadecan))-cholesterol (farbloser Schaum). 275 mg (0.3 mmol) 3ß-(7V ⁵ -carbamoyl-

/.o

(Λ^ ¹ ,N ¹⁰ ,Λ^ ¹⁴ -tris-BOC-tetraazadecan))-cholesterol wurden mit 6 ml MeOH ( 10 mmol HC1 enthaltend) versetzt, 30 min bei RT gerührt und im Hochvakuum vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 205 mg (94%) 3ß-(Λ^-carbamoyl-(7v ^"1 ,γV ¹⁰ ,N ¹⁴ -ammoniumtetras-zadecan))- cholesterol-tri-hydrochlorid V (farbloser Feststoff). Auf analoge Weise wurde ausgehend von BOC-Putrescin Sß-^-Ammonium-Λ^ ^' -carbamoyl-l ^-diaminobutan^cholesterol-hydrochlorid VII (farbloser Feststoff) synthetisiert.

Beispiel 5 Herstellung von 3ß-Ornithyl-cholesterol-dihydrochlorid VI

997 mg (3 mmol) Di-BOC-Ornithin wurden in 40 ml Methylenchlorid gelöst, mit 1.16 g (3 mmol) Cholesterol, 640 mg (3.1 mmol) DCC, 50 mg DMAP versetzt, und 24 h bei RT gerührt. Es wurde vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 5 ml Hexan umkristallisiert. Man erhielt 1.62 g (77%) 3ß-di-BOC- Omithyl-cholesterol (farbloser Feststoff). 190 mg (0.27 mmol) 3ß-di-BOC-Omithyl- cholesterol wurden mit 6 ml MeOH (enthielt 10 mmol HC1) versetzt und 60 min bei RT gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum erhielt man 146 mg (94%) 3ß- Ornithyl-cholesterol-dihydrochlorid VI (farbloser Feststoff).

Beispiel 6 Herstellung von 6-(3ß-Carboxycholesteroyl)-glucosamin-hydrochlorid VIII

279 mg (1 mmol) N-BOC-Glucosamin wurden in 8 ml Pyridin gelöst, mit 449 mg (1 mmol) Cholesterylchlorformiat versetzt und für 24 h bei RT gerührt. Daraufhin wurde im Hochvakuum Pyridin entfernt, in 50 ml Ether aufgenommen und mit 0.01 n HC1 extrahiert. Die organische Phase wurde vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand säulenchro atographisch (Kieselgel 60) gereinigt. Man erhielt 210 mg (30%) 6-(3ß- Carboxycholesteroyl)-N-BOC-glucosamin (farbloser Feststoff). 100 mg (0.15 mmol) 6-(3ß- Carboxycholesteroyl)-N-BOC-glucosamin wurden mit 3 ml ml MeOH (enthielt 5 mmol HC1) versetzt und 60 min bei RT gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum erhielt man 95 mg (99%) 6-(3ß-Carboxycholesteroyl)-glucosamin-hydrochlorid VIII (farbloses, zähes Öl).

Beispiel 7 Herstellung von 3-(/V ⁵ -carbamoyl-(Λ ^fl ,jV ¹⁰ ,N ¹ -ammoniumtetraazadecan))-oestradiol-tri- hydrochlorid IX

216 mg (0.8 mmol) Östron wurden in 10 ml Dioxan gelöst, mit 241 μl (2 mmol) Diphosgen und 152 μl (1.2 mmol) Dimethylanilin versetzt und 12 h bei RT gerührt. Daraufhin wurde im Hochvakuum eingeengt und der Rückstand in 15 ml Methylenchlorid gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde zu einer Lösung von 300 mg (0.6 mmol) N^N ¹⁰ ,N ¹⁴ -tris-BOC-spermin und 277 μl (2 mmol) Triethylamin in 5 ml Methylenchlorid zugetropft und 4 h bei RT gerührt. Anschließende säulenchromatographische Reinigung ergab 290 mg (61%) 3-(Λ ^/5 -carbamoyl- (N ¹ ,/V ¹⁰ ,/V ¹⁴ -tris-BOC-tetraazadecan))-oestron (zähes Öl).

220 mg (0.28 mmol) 3-(7V ⁵ -carbamoyl-(N ¹ ^/ ¹⁰ yV ¹⁴ -tris-BOC-tetrassZadecan))-oestron wurden daraufhin in 5 ml Dioxan gelöst und mit 37 mg (0.96 mmol) Natriumborhydrid versetzt. Nach 2 stündigem Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 0.1 N HC1 auf pH 6 gebracht und drei mal mit je 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 219 mg (96%) 3-(N5-carbamoyl-(N ¹ ,N ¹⁰ _f N ¹⁴ -tris-BOC-tetraazadecan))-oes.radiol (farbloser Schaum). Die Verbindung wird analog dem Beispiel 4 mit MeOH/ HC1 zu S-fΛ^-carbamoyl- (N^N ⁱ⁰ V ¹ -arrmτomumtetraazadecan))-oestradiol-tri-hydrochlorid IX umgesetzt.

Beispiel 8 Herstellung von 3-(NsV-dimethylammoniumethylendiamin-iV'-carbamoyl)-oestron- hydrochlorid X

541 mg (2 mmol) Östron wurden in 20 ml Dioxan gelöst, mit 603 μl (5 mmol) Diphosgen und 380 μl (3 mmol) Dimethylanilin versetzt und 12 h bei RT gerührt. Daraufhin wurde im Hochvakuum eingeengt und der Rückstand in 15 ml Methylenchlorid gelöst. Diese Lösung wurde mit 800 μl (7.3 mmol) N,N-Dimethylaminoethylendiamin versetzt, 4 h bei RT gerührt und dann mit 100 ml Methylenchlorid verdünnt. Es wurde fünf mal mit je 20 ml 0.01 N HC1 extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. Anschließende säulenchromatographische Reinigung (Kieselgel 60) ergab 573 mg (68%) 3-(N^-dimethylammoniumethylendiamin-V'-carbamoyl)-oestron-hy drochlorid X (farbloser Feststoff).

A2-

Schema

43

Ölsäure; DCC; CH ₂ C1 ₂

Trifluoressigsäure CH ₂ C1 ₂

II

,

Schema III

IV

Λ5

Schema IV 3 eq (BOC) ₂ 0 BOCHN ^' NBOC

H.N BOCHN, NH

4t

Schema V

diimid

VI

1}

Schema VI

din /RT

49

Schema VII

l.NaBHs, 2. HCl

Schema VIII

Diphosgen. DMA

Zo