La présente invention concerne le domaine technique des produits cosmétiques de comblement, des biomatériaux, des matériaux de reconstruction physiologique cutanée, de la médecine régénérative, de la chirurgie réparatrice en particulier de antivieillissement cutané, chez l'Homme ou éventuellement l'animal. En particulier, la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane permettant de viser spécifiquement les adipocytes. L'invention a également pour objet de telles compositions pour leur utilisation comme composition dermatologique, cosmétique, ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable. Différents produits de comblement injectables notamment chez l'être humain sont déjà connus.

Le collagène a longtemps été le produit de choix comme produit de comblement pour le visage, en particulier pour le comblement des rides et des ridules ou encore pour réourler les lèvres. Cependant, depuis la mise sur le marché des acides hyaluroniques, ces derniers sont les plus utilisés. En effet, à la biodégradabilité du collagène jugée trop rapide, s'ajoutent les problèmes de sécurité liés à l'origine animale (bovine ou porcine) de celui-ci. L'injection directe d'acide hyaluronique présente l'avantage d'avoir un effet de comblement immédiat associé à une réaction inflammatoire mineure, du fait de sa biocompatibilité. Toutefois, son implantation est associée à une biodégradation rapide qui rend le produit insatisfaisant, même si la durée de vie du produit injecté a pu être prolongée grâce à l'utilisation d'acides hyaluroniques réticulés. Néanmoins, les produits les plus utilisés aujourd'hui en médecine et chirurgie esthétique sont des produits résorbables dont la durée de vie est généralement inférieure à 12 mois. On trouve encore sur le marché des produits de comblement qualifiés de « permanents », dans le sens où leur biorésorption peut nécessiter plusieurs années. Ces produits contiennent entre autres des polymères synthétiques ou biosynthétiques, tels que des dérivés acryliques, des polyacrylamides, qui induisent une encapsulation fibreuse importante à l'origine de la longévité du comblement. Toutefois, la persistance du produit injecté dans les tissus présente un risque de complications à long terme ou de phénomènes inflammatoires à retardement, par exemple la formation de granulomes inflammatoires, kystes... plusieurs mois, voire plusieurs années, après leur injection.

D'autres produits synthétiques constituent une alternative intéressante : il s'agit de PLA (acide polylactique), un polymère dont la biodégradation est plus lente que celle des autres polymères naturels, tels que le collagène ou l'acide hyaluronique. On estime en effet que le comblement persiste jusqu'à deux ans après l'injection. Ces produits ont été commercialisés notamment sous le nom de New-Fill® (ou Sculptra®). Le principal défaut de cette technologie est que l'effet de comblement n'est visible qu'après un délai de huit semaines, ce qui n'apporte pas une complète satisfaction au patient. Par ailleurs, la fibrose observée lors de l'utilisation de produits non dégradables est apparue de grand intérêt en terme d'effet esthétique à long terme, et c'est ainsi qu'ont été développés des produits de comblement qualifiés de « semi-permanents » qui, par leur composition hétérogène « particules-vecteurs » ont un effet pro-fibro tique tout en demeurant biodégradables. On citera par exemple le produit Atlean® qui propose une dispersion de particules de TCP (phosphate tricalcique) dans de l'acide hyaluronique et le produit Radiesse® qui propose une dispersion de particules d'hydroxyapatite de calcium dans un gel de carboxyméthyl cellulose. Dans tous les cas, le gel vecteur assure l'effet esthétique de comblement immédiat, tandis que les particules génèrent petit à petit une fibrose qui garantit l'effet à long terme. L'intérêt de ces produits, outre ce double mécanisme d'action (mécanique et inducteur de tissu), est qu'ils sont finalement totalement résorbés.

Dans ce contexte, le chitosane est une autre molécule ayant trouvé son intérêt dans le domaine. En effet, le chitosane, de par sa structure chimique unique et biomimétique, se comporte vis-à-vis de l'organisme comme un « leurre » du milieu biologique (A. Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol, A.Domard, Biochimie, 88 (2006), 551-64): d'une part, il est suffisamment « reconnu » pour ne pas induire de réaction inflammatoire dangereuse, et d'autre part suffisamment « méconnu » pour ne pas être dégradé trop rapidement.

La molécule est en effet constituée d'une succession de motifs N-acétyl-D-glucosamine et D- glucosamine, le premier étant un constituant de molécules de la matrice extracellulaire (on trouve ce résidu dans l'acide hyaluronique par exemple), et le second étant complètement absent de celle-ci, le chitosane est donc plus difficile à dégrader d'un point de vue biologique. Par ailleurs, le chitosane est connu dans la littérature pour stimuler certaines cellules immunitaires, telles que les macrophages, qui produisent en sa présence une quantité accrue de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont des médiateurs biologiques qui favorisent la production de matrice extracellulaire et la prolifération des fibroblastes, cellules productrices des fibres de collagène. Ainsi, le chitosane favorise la synthèse de tissu fibreux, ce qui permet un comblement « biologique » à long terme, notamment un comblement des défauts cutanés ou des cavités du corps humain ou du visage, telles que les rides. Le Demandeur s'était précédemment attaché au chitosane en vue de l'application susmentionnée, ce qui a fait l'objet d'une demande de brevet WO 2013/07964.

Néanmoins, malgré ces avancées, il existe toujours un besoin pour des molécules et des moyens pour traiter la peau, permettant le comblement, le traitement des rides et ridules et plus généralement ayant une action anti vieillis sèment et/ou la reconstruction physiologique cutanée chez l'homme ou éventuellement l'animal. De plus, des compositions équivalentes capables de traiter des dépressions cutanées plus importantes, suite à une chirurgie ou une maladie sont demandées par les praticiens. Ainsi, de manière totalement surprenante, le Demandeur s'est aperçu qu'un effet technique supplémentaire inattendu sur la peau apparaissait lorsqu'une composition aqueuse spécifique de chitosane, inconnue jusqu'à présent, était utilisée. En effet une étude plus méticuleuse a permis de mettre en évidence que lorsqu'une solution de chitosane à une concentration particulière de ce composé était utilisée, il y avait une action directe sur les adipocytes présents dans les couches cutanées. Ainsi, les adipocytes soumis à ce traitement prolifèrent et gonflent de manière contrôlée, et permettent à la peau de se raffermir par comblement des rides et ridules ou de permettre le comblement de default(s) cutané(s) ou la reconstruction volumétrique de tissus. Ce constat a mené le Demandeur à s'intéresser plus particulièrement aux adipocytes. Ainsi, plusieurs points ont été dégagés par le Demandeur. Celui-ci s'est aperçu d'abord qu'une concentration trop élevée de chitosane, sans en retirer les autres bienfaits, pouvait néanmoins s'avérer toxique pour les adipocytes. Il a également été observé par le Demandeur que la présence d'au moins un composé de la matrice extracellulaire dans la composition aqueuse permet d'augmenter la capture d'acide gras des adipocytes. In vivo la composition de chitosane selon la présente invention induit la synthèse de fibres de collagène. Au vu des éléments recueillis par le Demandeur, l'ajout d'au moins un composant de la matrice extracellulaire (ou un substituant) permet de potentialiser l'action du chitosane.

Ainsi, le Demandeur propose des compositions aqueuses ayant une action directe sur les adipocytes au niveau (sous)-cutané permettant d'ajouter une solution technique originale à l'art dans le domaine du traitement de la peau et de la chirurgie reconstructive. RESUME DE L'INVENTION

L'objet de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans l'augmentation du volume et/ou du nombre d' adipocytes. En particulier, l'augmentation du volume et/ou du nombre d' adipocytes ainsi obtenue permet une utilisation dans le traitement ou la lutte contre le vieillissement de la peau, pour le comblement des défauts cutanés tels que les rides ou pour la réparation ou la reconstruction des tissus cutanés ou sous-cutanés.

En d'autres termes, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour augmenter le volume et/ou le nombre d' adipocytes. En particulier, cette utilisation est de préférence cosmétique, et non-thérapeutique.

En effet, hormis le fait qu'une injection ou l'introduction d'un implant selon la présente invention va de fait combler un volume au niveau cutané ou sous-cutané de par le volume inhérent de la composition, ladite composition selon la présente invention va en outre générer un gonflement local grâce à son action sur les adipocytes (augmentation du nombre et/ou du volume) aux alentours de cette composition. Ainsi, la composition aqueuse selon la présente invention peut être utilisée pour le comblement des cavités du corps ou du visage, telles que les rides ou les ridules, pour la création ou l'augmentation de volumes du visage ou du corps humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.

Les adipocytes sont communément connus pour être des cellules animales présentes dans les tissus adipeux, et spécialisées dans le stockage de la graisse. En outre, les adipocytes sont également compris au niveau du tissu viscéral et dans l'hypoderme qui est la couche profonde de la peau, contenant plus ou moins de tissu adipeux, servant d'interface entre le derme et les structures mobiles situées en dessous de lui (organes, muscles etc.). Ainsi, les adipocytes sous-cutanés se situent à une profondeur variable de la surface de la peau, variant de quelques millimètres à plusieurs centimètres de profondeur. De manière préférée, par « adipocytes » dans le cadre de la présente invention, il est considéré les adipocytes humains.

L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse telle que décrite présentement, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable pour l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes.

Par « biorésorbable » ou « biorésorption », on entend une biodégradation qui aboutit à la dégradation totale ou essentiellement totale du produit injecté. De manière avantageuse selon la présente invention, la composition aqueuse présente une bonne biocompatibilité et est biorésorbable. En particulier, le produit selon l'invention a une durée de biorésorption plus longue que les produits à base d'acide hyaluronique du type acide hyaluronique réticulé, pour un effet prolongé, tel qu'un effet de comblement prolongé.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire pour diminuer la toxicité à l'égard des adipocytes d'une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition.

Composition

La présente invention a pour objet une composition aqueuse de chitosane.

Par « composition aqueuse » on entend une composition comprenant au moins 1% en poids d'eau, avantageusement au moins 50% en poids d'eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d'eau.

Les pourcentages, de manière générale pour la présente invention, lorsqu'ils ne sont pas précisés, correspondent à des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition considérée.

De manière préférée, la composition aqueuse de chitosane selon l'invention présente un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 7,6. Toutefois, lorsqu'on souhaite injecter la composition de chitosane directement dans les tissus qui se trouvent au pH physiologique (entre 6,8 et 7,4), il serait souhaitable d'utiliser une composition présentant un pH le plus proche possible du pH physiologique afin d'éviter la nécrose des tissus du fait de l'acidité de la formulation injectée. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le pH de ladite solution est supérieur ou égal à 5,5, avantageusement compris entre 5,5 et 7,5, de préférence entre 6,2 et 6,8. La composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement une solution aqueuse de chitosane, une solution gélifiante aqueuse de chitosane ou un gel aqueux de chitosane.

Par « solution », on entend au sens de la présente invention une composition se présentant sous forme liquide, par opposition à une composition gélifiée. Une solution présente une phase liquide contenant au moins deux espèces chimiques. Une « solution aqueuse » comprend au moins 1% en poids d'eau, avantageusement au moins 50% en poids d'eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d'eau. De manière préférée, une solution aqueuse selon la présente invention comprend majoritairement de l'eau, avec éventuellement d'autres composés. Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse chitosane.

Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse homogène de chitosane. Par « solution aqueuse homogène de chitosane », on entend au sens de la présente invention que tout le polymère de chitosane est solubilisé et que la solution ne contient pas de particules solides de chitosane en suspension dans la phase liquide. La solution aqueuse ainsi constituée, comprend au moins de l'eau dans les proportions mentionnées ci-dessus et du chitosane avec éventuellement d'autres composés. La solution aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention est typiquement transparente.

La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut être utilisée pour former un gel.

Par « gel », il pourra être admis selon la présente invention qu'il s'agit d'un corps ayant un module de conservation supérieur au module de perte (cf. H. H. Winter, F. Chambon Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point J. Rheol., 30 (1986), pp. 367-382). La stabilité et l'intégrité de ce corps sont maintenues soit par des interactions non covalentes (gel physique) soit par une réticulation chimique covalente (gel chimique).

Ce gel peut être formé par toute technique connue dans l'art, par exemple par une variation de pH ou de température. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est gélifiée à un pH compris entre 6 et 9, avantageusement compris entre 6,5 et 8,5, plus avantageusement compris entre 7 et 8. De manière préférée, la solution aqueuse (qu'elle soit homogène ou pas) de chitosane est d'abord préparée puis gélifiée. Par composition ou solution « gélifiante » aqueuse de chitosane, il est compris dans le contexte de la présente invention une composition ou une solution aqueuse de chitosane telle que définie ci-dessus, susceptible de fournir un gel aqueux de chitosane, en particulier lorsqu'elle est injectée dans le milieu biologique. Ainsi, un objet selon la présente invention concerne un gel obtenu à partir de la composition ou solution aqueuse telle que décrite ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ce gel est formé avant son incorporation dans une composition telle que décrite présentement.

Dans un autre mode de réalisation particulier selon la présente invention, ce gel est formé après son incorporation dans une composition. Ceci peut être effectué par variation de pH (passage à un pH physiologique, i.e. entre 6,8 et 7,8, préférentiellement à un pH de 7,4+0,2).

De manière particulièrement avantageuse, la composition aqueuse selon l'invention est injectable dans le corps humain ou animal, typiquement par injection intradermique, sous- cutanée ou intrapéritonéal. La composition peut être conditionnée dans une seringue telle qu'une seringue stérile.

Ainsi, la composition aqueuse présente une viscosité appropriée pour assurer une bonne seringuabilité (écoulement satisfaisant à travers une aiguille dans une seringue) et une facilité d'injection. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon l'invention est stérilisée avant injection, par exemple par autoclavage. Ainsi, la composition selon la présente invention peut être formulée pour être administrée par injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.

Une injection intradermique est l'administration d'un composé dans le derme de la peau, situé juste en dessous de l'épiderme. Une injection sous-cutanée consiste à introduire une aiguille dans la couche sous-cutanée de la peau, pour y injecter une molécule d'intérêt. Une injection intrapéritonéale est localisée au-delà du péritoine dans la cavité abdominale, i.e. dans le tissu adipo-viscéral.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est comprise ou consiste en un implant permettant de traiter les dépressions cutanées. Il peut s'agir de dépressions cutanées de faibles volumes (i.e. égale ou inférieurs à 5 mL équivalent environ à 5 gramme selon la densité de la composition) ou qui ne peuvent être comblées par des injections de faibles volumes. C'est le cas par exemple, du comblement de l'ablation d'un organe ou d'un tissu suite à un accident ou une maladie (e.g. une mammoplastie, lipodystrophie aiguë, lipoatrophie aiguë, traitement de comblement suite à une poliomyélite), en chirurgie réparatrice. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition de chitosane présente un temps de résorption long une fois injectée, typiquement de quelques semaines à plusieurs mois, par exemple de l'ordre de 3 ou 4 semaines jusqu'à 12 à 18 mois. Le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention bénéficie du caractère bactério- et fongistatique du chitosane, bien connu dans le monde de l'industrie agro-alimentaire et des pansements cicatrisants. Ces propriétés facilitent la conservation du produit et contribuent à limiter les risques d'infection liés à l'injection ou les phénomènes inflammatoires à retardement pour d'autres produits tels qu'évoqués ci-dessus. Face aux molécules naturelles (collagène, acide hyaluronique) utilisées à ce jour pour le comblement de dépression ou la reconstruction de volume (e.g. rides, ridules, mamoplastie ou encore lipodystrophie), le chitosane est le seul à présenter de telles propriétés. Par ailleurs, le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention assure un comblement biologique efficace avantageusement immédiat. En outre, le chitosane peut favoriser la synthèse de collagène et permettre un comblement des défauts cutanés, tels que les rides, par stimulation de mécanismes naturels. En outre, la composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement apte à former des particules cristallines de chitosane après injection. En effet, de cette manière les effets tels que décrits précédemment dans WO201307964 sont cumulés aux effets liés à la présente invention.

Chitosane

La composition selon l'invention comprend au moins un chitosane.

Le chitosane est un amino-polysaccaharide généralement obtenu par N-désacétylation de la chitine, polysaccharide aussi répandu dans la biomasse que la cellulose. La chitine est notamment présente dans les cuticules des arthropodes, l'endo squelette des céphalopodes, les parois cellulaires de champignons, levures ou algues. Avantageusement selon la présente invention, le chitosane est un produit naturel qui provient d'une source animale, par exemple de crustacés du type crabes, crevettes ou calmars, ou d'une source végétale, telle que des champignons ou des algues. Le chitosane et la chitine sont des copolymères linéaires respectivement de 2-acetamido-2-desoxy-D-glucane et de 2-amino-2-desoxy-D-glucane. On parle plus communément d'unités N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et D-Glucosamine (GlcN)), liées par des liaisons glycosidiques β(1→4). Chitine et chitosane se différencient par la fraction molaire (exprimée en %) des unités GlcNAc présentes dans le copolymère, appelée aussi degré d'acétylation (DA).

Les structures chimiques du chitosane et de la chitine sont représentées schématiquement ci- dessous en fonction du degré d'acétylation (DA) :

Le DA se calcule grâce à la formule

... , aOkNA

avec nGlcNAc = nombre de motifs acétylés et nGlcN = nombre de motifs désacétylés.

Le DA peut ainsi être déterminé selon les standards en vigueur actuellement (à savoir « Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials Intended for Use in Biomédical and Tissue-Engineered Médical Product Applications, Book of Standards Volume: volume 13.01 ; ASTM-F2103 »).

Avantageusement selon la présente invention, le chitosane a un degré d'acétylation (DA) inférieur à 30 %, encore plus avantageusement inférieur ou égal à 20 %, par exemple inférieur à 15%. De manière préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 15 %, avantageusement inférieur à 10%, plus avantageusement inférieur à 8%, encore par avantageusement inférieur à 5%. De manière encore préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 4 %, avantageusement inférieur à 3%, plus avantageusement inférieur à 2%, encore par avantageusement inférieur à 1%. Par exemple le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA compris entre 1 et 20%, avantageusement compris entre 2 et 15 %, avantageusement compris entre 3 et 10 %, par exemple entre 4 et 8%. Le degré d'acétylation est de préférence mesuré selon la méthode décrite dans la publication «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic médium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005).

Le chitosane mis en œuvre dans les solutions de l'invention a de préférence une masse moléculaire moyenne en masse (déterminée avant stérilisation selon la méthode décrite dans «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic médium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005) comprise entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 200 000 et 1 000 000 g/mol, plus avantageusement entre 250 000 et 500 000 g/mol, et encore plus avantageusement entre 300 000 et 400 000 g/mol. Après stérilisation, le chitosane a typiquement une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 80 000 et 1 000 000 g/mol, et avantageusement comprise entre 120 000 et 300 000 g/mol.

Classiquement un chitosane de masse molaire comprise entre 100 000 à 1 000 000 g.mol ^"1 peut aussi être caractérisé par sa viscosité (Classiquement à une concentration de 1% dans une solution aqueuse à 1% en acide acétique à 25°C). Avec cette considération, la masse molaire du chitosane peut aussi être définie par une viscosité comprise entre 5 Pa.s et 20 Pa.s.

La viscosité de la composition est mesurée à 25 °C à l'aide d'un rhéomètre DHR1 (TA Industries) et une géométrie plan de 40 mm selon un mode dynamique avec taux de cisaillement appliqué de 0,01 à 1 s ^"1 . Selon un mode préféré de réalisation, le chitosane mis en œuvre dans les solutions selon l'invention n'est pas modifié chimiquement, et en particulier, n'est pas greffé pour favoriser sa solubilité en solution aqueuse à des pH proches de la neutralité (entre 6,2 et 7,2). Il se distingue en ce sens des chitosanes mis en œuvre dans la demande WO03/042250 ou la demande JP-H02-69502, dans la publication « Synthesis and char acte rization of sugar- bearing chitosan derivatives : aqueous solubility and biodegradability », Jae Hyung Park et al., Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, et dans la publication « Water solubility of partially N-acetylated chitosans as a function of pH : ejfect of chemical composition and depolymerization » Varum K. M. et al., Carbohydrate polymers 25 (1994), 65-70.

Dans ce mode de réalisation, cet autre chitosane peut se présenter sous forme de particules de chitosane réticulé. Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention est exempte de chitosane présentant un degré d'acétylation élevé, en particulier supérieur à 20% et plus spécifiquement compris entre 40 et 60%.

Selon un mode autre particulier de réalisation, la composition selon l'invention est exempte d'un oligomère additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de faible masse moléculaire moyenne, notamment inférieure à 20 000 g/mol.

Par « exempte » de chitosane présentant un degré d'acétylation élevé ou d'un oligomère additionnel, on entend au sens de la présente invention que la composition aqueuse de chitosane comprend moins de 1% en poids de ces composés, en particulier moins de 0,5% en poids, et plus préférentiellement, ne contient pas ces composés. Agent de dispersion

Outre le chitosane, la composition aqueuse selon la présente invention peut comprendre au moins un agent de dispersion du chitosane. Ce type d'agent de dispersion est très bien connu dans l'art et peut par exemple être choisi parmi le mannitol, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges. Tampon

La composition selon l'invention peut également comprendre un tampon pH pour se placer au pH physiologique. Tout tampon pH communément utilisé à cette fin peut être utilisé, par exemple le PBS (« Phosphate Buffer Saline » - solution saline de tampon phosphate).

Sel Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend un sel tel que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium, ou tout autre excipent acceptable avantageusement pour ajuster l'osmolarité de la composition. L'ajout d'un sel tel que le chlorure de sodium, ou de potassium, peut être intéressant pour obtenir une solution isotonique. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition peut comprendre en outre au moins un composé ayant une activité thérapeutique reconnue.

Composé ou un excipent additionnels

La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable.

Actifs

En outre la composition selon la présente invention peut comprendre au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.

Composé ou substituant de la matrice extracellulaire

Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention peut comprendre un composé ou un substituant de la matrice extracellulaire. La « matrice extracellulaire » désigne typiquement l'ensemble de macromolécules extracellulaires du tissu conjonctif et des autres tissus. Un composé de la matrice extracellulaire selon la présente invention est avantageusement un polymère organique, par exemple d'une taille supérieure à 1000 Daltons (Da), ou encore supérieure 5000 Da. De manière avantageuse, les polymères organiques de la matrice extracellulaire selon la présente invention peuvent être de nature protéique, glucosidique, protéoglucosique ou encore glucoprotéique. Typiquement les polymères organiques de la matrice extracellulaire peuvent être le collagène, l'acide hyaluronique ou la fibronectine. Un « substituant de la matrice extracellulaire » est un composé non ubiquitaire (i.e. qui n'est pas trouvé naturellement chez l'homme pour cette fonction) permettant de remplir le rôle de matrice extracellulaire. Ce type de composé est connu dans l'art (Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair, S. V., & Tamura, H. (2010). Biomédical applications of chitin and chitosan based nanomaterials— A short review. Carbohydrate Polymers, 82(2), 227-232).

Le composé de la matrice extracellulaire est de préférence choisi parmi les protéines, les glycosaminoglycanes et leurs mélanges. Les protéines et leurs dérivés glycosylés peuvent de préférence être choisies parmi le collagène, l'élastine, la fibronectine, la laminine ou leurs mélanges.

Les glycosaminoglycanes peuvent de préférence être choisis parmi l'acide hyaluronique, la chondroïtine sulfate, l'héparane sulfate, la kératane sulfate ou un mélange d'au moins deux de ces glycosaminoglycanes.

Selon un mode préféré de réalisation, le composé de la matrice extracellulaire est choisi parmi les protéines et leurs dérivés glycosylés, de préférence parmi le collagène, la fibronectine, et un mélange de collagène et de fibronectine.

Le substituant de la matrice extracellulaire peut quant à lui être choisi parmi la carboxymethylcellulose, l'ester de chitosane, l'ester de chitine ainsi que le mélange d'au moins deux substituants de la matrice extracellulaire.

Selon un mode préféré de réalisation, lorsque la composition selon l'invention comprend un composé ou un substituant de la matrice extracellulaire, elle est exempte d'un oligomère additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de faible masse moléculaire moyenne, notamment inférieure à 20 000 g/mol.

La composition aqueuse selon la présente invention contient préférentiellement moins de 5% en poids, par rapport au poids total de la composition d'au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou d'au moins un substituant de la matrice extracellulaire, en particulier entre 0,01 et 5% en poids, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.

La composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient de manière préférée une quantité de chitosane inférieure ou égale à 5% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, avantageusement inférieure ou égale à 4% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, plus inférieure ou égale à 3% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, encore inférieure ou égale à 2% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient entre 0,1 et 5 , avantageusement entre 0,5 et 3,5 , en particulier entre 1 et 2 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient entre 1,5 et 2 , avantageusement entre 1,6 et 1,9 , en particulier entre 1,7 et 1,8 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière encore plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient moins de 2 , avantageusement moins 1,9 , en particulier moins de 1,8 , plus avantageusement moins 1,7 , encore plus avantageusement moins de 1,6 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse.

Procédé de préparation des compositions

La composition aqueuse de chitosane selon l'invention, telle que décrite présentement, peut notamment être préparée par les étapes successives suivantes : a. la dissolution du chitosane dans de l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, ou tel qu'un acide fort, ledit acide fort étant avantageusement l'acide chlorhydrique, et leurs mélanges, b. l'ajout le cas échéant d'au moins un composé et/ou un substituant de la matrice extracellulaire et c. le réajustement optionnel du pH pour obtenir une composition aqueuse présentant un pH inférieur à 8,5.

De manière préférée, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le glycérol, le sorbitol...) est ajouté le cas échéant à l'une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ou après l'une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, la composition aqueuse de chitosane, gélifiée peut être dispersée par l'ajout d'un agent de dispersion tel que présenté ci-dessus, éventuellement avec une étape de fragmentation mécanique du gel de ladite composition aqueuse de chitosane. La composition obtenue peut dans tous les cas être une suspension ou une solution, administrable par exemple par injection, préférentiellement gélifiante. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse de la présente invention, susceptible d'être obtenue par les étapes décrites ci-dessus.

Le contrôle du pH des solutions est très important pour éviter d'une part la nécrose acide des tissus après injection comme expliqué ci-dessus, et également pour protéger les compositions de l'hydrolyse et la dégradation du chitosane si l'on met en œuvre une stérilisation (par exemple par autoclave à 121°C pendant 15 minutes). Le pH est réajusté si nécessaire avec un composé tel que le bicarbonate de sodium ou un tampon PBS, typiquement dans des quantités réduites. La valeur du pH est avantageusement contrôlée grâce à un pH-mètre.

Dans la cadre de la présente invention, l'ajustement du pH peut de préférence être réalisé de manière très progressive par dialyse.

La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions en solution. Ainsi, dans le cadre de la présente demande, la solution aqueuse de chitosane selon l'invention peut être dialysée contre une solution tampon présentant un pH égal au pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), c'est à-dire au moins supérieur à 6,2, avantageusement compris entre 6,2 et 7,2, de préférence entre 6,25 et 7,1. Lorsque la solution tampon présente un pH supérieur au pH de gélification de la solution (par exemple 7,5), la dialyse devrait alors être surveillée pour éviter la gélification de la solution.

La solution tampon peut, par exemple, être une solution saline de tampon phosphate (PBS, TBS, PBS-acide lactique), la tris (tris(hydroxymethyl)methylamine), 4-2-hydroxyethyl-l- piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 2-{ [tris(hydroxymethyl)methyl]amino}- ethanesulfonic acid (TES), 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), piperazine-N,N'- bis(2-ethanesulfonic acid)), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (PIPES), du chlorure de sodium (NaCl).

Selon un mode préféré de réalisation, la solution tampon est une solution de tampon phosphate PBS (« Phosphate Buffer Saline » - solution saline de tampon phosphate) composée d'un sel « acide » NaH ₂ P0 ₄ , d'un sel «basique » le Na ₂ HP0 ₄ et de NaCl.

Selon un mode particulier de réalisation, le tampon est physiologiquement acceptable, c'est-à- dire qu'il ne présente aucun risque d'intolérance ou de toxicité lors de l'injection dans les tissus de la solution injectable selon l'invention. A ce titre, le tampon est de préférence différent du glycérophosphate, et en particulier du β-glycérophosphate qui, bien que peu irritant pour la peau, pose des problèmes de calcification lorsqu'il est injecté dans les tissus. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la dialyse peut être réalisée de manière statique dans un seul bain contre une solution tampon telle que décrite précédemment. Lorsque la dialyse est réalisée de manière statique dans un seul bain contre une solution tampon, il est préférable que ladite solution tampon présente un pH égal au pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), par exemple entre 6,5 et 6,9.

Selon un mode plus préféré de réalisation, la dialyse peut être réalisée de manière statique dans plusieurs bains successifs contre des solutions tampon présentant des pH différents de plus en plus proches du pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible).

Selon un mode particulièrement préféré de réalisation, la dialyse est réalisée de manière dynamique, c'est-à-dire en faisant circuler en continu au moins une solution permettant l'augmentation progressive du pH au travers d'une ou plusieurs poches de dialyse constituées d'une membrane de dialyse renfermant la solution aqueuse de chitosane. Ce type de dialyse est par exemple décrit dans la demande de brevet WO 2016/170284 du Demandeur.

Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, le chitosane est dissous dans l'eau à l'aide d'un acide fort du type acide chlorhydrique. Dans ce cas, le pH est réajusté avec un composé de type bicarbonate de sodium ou d'ammonium ou PBS par exemple, et/ou une base de type NaOH ou KOH par exemple (toujours en contrôlant le pH de manière à ce qu'il reste inférieur à 8,5, préférentiellement inférieur à 6,9).

Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité nécessaire à la dissolution du chitosane. On peut utiliser ainsi un excès d'acide pour certains chitosanes, par exemple les chitosanes difficiles à solubiliser avec la quantité strictement nécessaire d'acide, puis on reprécipite le chitosane, à l'aide d'ammoniaque par exemple. Après une série de lavages destinés à éliminer l'excédent d'ammoniaque et les sels, on peut alors lyophiliser le chitosane pour récupérer la matière sèche. Celle-ci sera alors plus facile à solubiliser.

Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité au moins nécessaire à la dissolution du chitosane, telle que la quantité stœchiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites NH ₂ .

De manière particulièrement avantageuse, le pH de la composition aqueuse selon la présente invention est inférieur à 8,5, et est typiquement compris entre 4 et 7,6. Dans le cadre de l'invention, le chitosane est solubilisé en solution aqueuse, telle que l'eau, dans un environnement acide dans les gammes de pH mentionnées précédemment, avantageusement par protonation des groupes amine du chitosane. Ces gammes de pH ont été en particulier choisies afin de maximiser la stabilité de la composition aqueuse selon l'invention.

L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse, telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que ladite composition est liquide, sous forme de gel ou obtenue après dispersion de ladite composition aqueuse de chitosane dans un véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable.

Par « véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable », il est compris dans le cadre de la présente invention tout excipient dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, ou toute matrice ou dispositif dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, permettant l'administration de la composition aqueuse selon la présente invention.

Lorsqu'une composition aqueuse telle que décrite présentement est comprise dans une composition avec éventuellement un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable, son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable peut être administré aux dosages suivants. La quantité de chitosane peut être comprise entre 0,1 et 5 % en poids, avantageusement entre 1 et 2% en poids, plus avantageusement entre 1,1 et 1,9 % en poids, encore plus avantageusement entre 1,2 et 1,8% en poids, et de manière encore plus avantageuse entre 1,3 et 1,7% en poids ou encore entre 1,4 et 1,6% en poids, par exemple à 1,5% ± 0,05% en poids de chitosane par rapport à la quantité totale de composition aqueuse administrée. En outre, la quantité de composition ou composition aqueuse administrée en une seule dose est comprise entre 0,01 et 20 grammes par injection, avantageusement comprise entre 0,05 et 10 grammes par injection, plus avantageusement comprise entre 0,1 et 5 grammes par injection, encore plus avantageusement entre 0,4 et 1 gramme par injection, par exemple 0,7 grammes ± 0,1 gramme par injection. Le nombre d'injections peut varier de 1 à 20 fois dans les cas les plus extrêmes. De manière plus routinière, ce nombre d'injection est inférieur à 5 fois pour combler efficacement des cavités d'un volume inférieur à 50 mL (donc à température physiologique). Dans le cas de chirurgie réparatrices plus importantes tels qu'évoqués précédemment (e.g. mammoplastie, lipodystophie aiguë, lipoatrophie aiguë, etc.) les quantités de composition selon la présente invention pouvant être injecté et/ou implantés peuvent s'additionner à des masses égales ou inférieures à 500 grammes, plus communément égales ou inférieures à 350 grammes, encore plus communément égales ou inférieures à 200 grammes, ou encore égales ou inférieures à 100 grammes. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25 °C (donc avant administration). L'utilisation cosmétique selon la présente invention est définie de fait comme n'étant pas invasive dans l'administration de la composition selon la présente invention. Ceci exclu tout acte chirurgical. Néanmoins, l'utilisation cosmétique selon la présente invention peut être effectuée avec des seringues et aiguilles de petit calibre, dans un acte comparable à l'application d'un tatouage. Ainsi de manière arbitraire, les quantités injectées de composition selon la présente invention supérieures à 5 grammes par injection sont exclues dans le cadre d'une utilisation cosmétique. Dans ce cadre, le nombre d'injections est limité arbitrairement à 5 fois au plus pour une quantité totale injectée de 10 grammes.

En outre, la quantité de composition aqueuse administrée en une seule dose peut être comprise entre 0,001 et 1 gramme par cm ² de surface de peau, avantageusement comprise entre 0,01 et 0,5 gramme par cm ² de surface de peau. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25°C.

En outre l'utilisation selon la présente invention peut être faite de manière in vitro ou in vivo.

L'utilisation in vitro est applicable à toutes les applications visées par la présente invention, et en particulier à des buts de détermination de concentrations/quantité d'actifs à administrer.

DESCRIPTIF DES FIGURES

Figure 1A et 1B : Effet sur la prolifération des 3T3L1. La figure 1 montre que pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d'atteindre la confluence en 5 jours bien que deux jours après ensemencement, la morphologie des cellules suggère un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %. La figure 1B précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l'Adipored (vert expérimentalement, vs. Rouge pour Hoecht).

Figures 2A, 2B et 2C : ces figures montrent l'influence de la concentration en chitosane sur le stockage d'acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Le marquage AdipoRed (Fig. 2A) montre une accumulation d'acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. La figure 2B précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l'Adipored (vert expérimentalement). La quantification de cette accumulation (Fig. 2C) démontre qu'elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5%.

Figure 3 : Cette figure montre une distribution des gouttelettes lipidiques (n> 10000) des 3T3L1 exposés une composition de chitosane et à une formulation comprenant du chitosane combinées à du collagène et de la fibronectine. La Figure 3 montre que (Col 2+FNl)+Chitosan2%) sont les meilleures formulations pour augmenter le nombre et la taille moyenne (volume) des gouttelettes lipidiques.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation des solutions

Deux stratégies de préparation d'une gamme de concentration de solutions gélifiantes de chitosane sont utilisées.

Par dilution finale

4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM en NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L ¹ ). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d'acide acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.

Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L ^"1 ) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.

Le pH de la solution de acide de chitosane est rehaussé jusqu'à ce qu'il soit compris entre 6 et 6.5. Cette étape est réalisée par dialyse contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Lors de cette étape, le gonflement de la solution de chitosane est contrôlé pour atteindre une concentration finale de 3 % (w/w) (taux de gonflement de 33 %). Les solutions de chitosane sont généralement stérilisées (121 °C pendant 15 min dans un autoclave) pour être stockées avant utilisation. Cette solution est dialysée pour obtenir un pH proche de 6 et une concentration de 3% (w/w).

Avant utilisation, la solution de chitosane à 3 % peut être diluée dans une solution saline à 150 mM en NaCl + 1 % en acide acétique pour accéder à des concentrations inférieures.

Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d'un milieu de culture.

Par dilution initiale

4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM de NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L ^"1 ). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d'acide acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.

Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L ^"1 ) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.

Cette solution mère (4 %) est ensuite diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L ^{" l} ) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique en différente concentration allant de 4 % à 0.1 %. Chaque solution est alors dialysée contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Le taux de gonflement est mesuré afin de contrôler les concentrations finales de chaque solution. La dialyse est stoppée quand le pH des solutions est compris entre 6.0 et 7.4. Chaque solution est stérilisée par autoclave (121 °C pendant 15 min). Les solutions sont utilisées en l'état sans autre forme de dilution ce qui préserve leur pH.

Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d'un milieu de culture

Exemple 2 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la prolifération, la différenciation et la capture d'acide gras par la lignée adipocytaire murine 3T3L1

Matériels et Méthodes

Différentes solutions de chitosane (2%, 1%, 0.75 % et 0.5 %) sont préparées par dilution des solutions obtenues dans l'exemple 1. Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1 (DA : 2 , Mw : 450000 g.mol ¹ , BIOXIS Pharmaceuticals S.A. S.) est diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L ^"1 ) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique dans un puits (en plaques 24 puits) puis distribuée sur la moitié des autres puits, séchée, rincée au PBS puis avec le milieu de culture avant ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1 ATCC CL- 173™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d'un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d'acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans OA jusqu'au lendemain afin d'éviter un bruit de fond éventuel de ΟΑ. La prolifération est analysée par microscopie à contraste de phase (x20) : les images sont prises à différents temps (2 jours et 5 jours post ensemencement), à une position identique pour chaque puits. La différenciation et le stockage d'acide oléique sont analysés en microscopie à fluorescence : les cellules sont fixées puis marquées avec AdipoRed (vert de manière expérimentale ou tel qu'identifié dans les figures) mettant en évidence la présence d'acides gras sous forme de triglycérides (TG) stockés dans plusieurs gouttelettes au cours de la différenciation, fusionnant en une seule gouttelette lorsque les adipocytes sont matures) et avec Hoechst 3352 (rouge de manière expérimentale) pour le marquage des noyaux. Le marquage est observé en microscopie à fluorescence et la quantification effectuée par imagerie. L'imagerie et la quantification de fluorescence sont effectuées sur une station d'imagerie en temps réel. Les contrôles sont fixés avant induction de différenciation (confluence, D0).

Résultats

Deux jours après ensemencement, pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d'atteindre la confluence en 5 jours (Figure 1A et 1B). Ainsi, aux concentrations testées, les adipocytes augmentent en nombre et en volume. La morphologie des cellules suggère toutefois un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %.

La Figure 2 montre l'influence de la concentration en chitosane sur le stockage d'acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Ainsi, les mêmes cellules que celles testées à la figure 1 sont mise en œuvre en présence d'acide oléique (acide gras que les cellules adipocytaires ont la capacité de capter). Le marquage AdipoRed (Fig. 2A et 2B) montre une accumulation d'acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 , 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. Ainsi, en présence de chitosane, les cellules 3T3L1 captent davantage d'acide oléique que le témoin. La quantification de cette accumulation démontre qu'elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5% (figure 2C).

Conclusion

Les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer en présence de chitosane. Après deux jours en culture, la présence de chitosane semble toutefois avoir un effet toxique sur la lignée 3T3L1 pour des concentrations supérieures ou égales à 2 %. Le chitosane favorise la capture d'acides gras de manière dose-dépendante. Parmi les solutions testées, il semble que ce soit les solutions à 0.5 % qui présentent la meilleure efficacité. Cette capture permettrait une augmentation du volume des adipocytes et donc, par extrapolation, du tissus graisseux in vivo.

Exemple 3 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la capture d'acide gras en présence de fibronectine et de collagène par la lignée adipocytaire murine 3T3L1

Matériels et Méthodes

Différentes solutions de chitosane (2 %, 1 % 0.75 % et 0.5 %) sont préparées par dilution des solutions obtenues dans l'exemple 1.

Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1 Pour cela, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) (DA : 2 %, Mw : 450000 g.mol ^"1 , BIOXIS Pharmaceuticals S.A. S.) Les solutions ont été utilisées en l'état sans subir de pré dilution en solution saline acide. De plus, une solution à base de Collagène I 2mg/ml + Fibronectine I lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) est aussi évaluée. Les compositions sont distribuées en plaque 96 puits après ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1, ref ATCC CL-173™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d'un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d'acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans acide oléïque jusqu'au lendemain avant observation sur Cytation 3. La distribution en taille des gouttelettes lipidiques (volume des adipocytes) est observée.

Résultats

La Figure 3 montre que la solution Collagène I 2mg/ml + Fibronectine I lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) présente moins d' adipocytes de taille inférieure à 15μιη et plus d' adipocytes de taille comprise entre 15 et 55μιη que la solution de chitosane à 2%. L'ajout de composés de la matrice extracellulaire comme le collagène ou la fibronectine permet donc de favoriser l'augmentation du nombre et de la taille moyenne (donc du volume) des gouttelettes lipidiques.

Conclusion Le chitosane seul permet d'accroître la taille des gouttelettes lipidiques. Cet effet est encore majoré en présence de fibronectine et de collagène.