一类可用作 KCNQ钾通道 m¾剂的新型化合物、 其制备

和用途 技术领域 本发明属于药学领域， 具体而言， 涉及一类可用作钾离子通道激动剂的 新型化合物， 其制备方法， 以及该化合物及其药学上可接受的盐或含有它 们 中任何一种的药物组合物在制备治疗神经系统 疾病如癫痫、 惊厥、 神经性疼 痛、 急性局部缺血性中风以及神经退行性疾病的药 物中的应用。

背景技术

癫痫 （印 i l印 sy) 是一种大脑神经元突发性异常放电导致的神经 功能失 调综合征， 表现为运动、 感觉、 意识、 精神、 植物神经等方面障碍， 发病率 近 1%， 严重威胁人类生命与健康。 癫痫发生的神经电生理基础是神经元过度 同步放电， 亦称为癫痫样放电。 神经兴奋性失调是引发癫痫样放电的主要原 因。 中枢神经系统分布的钾、 钠、 钙离子通道的活动的平衡决定着神经元的 兴奋性，如果这种平衡失调， 可能会导致神经兴奋性异常进而导致癫痫发作 。

钾离子通道在调节神经元的兴奋性方面发挥着 重要的作用， 其离子基础 是胞内钾离子浓度高于胞外， 膜电位去极化激活通道后， 带正电荷的钾离子 外流， 膜电位因而变负（负极化甚或超极化）， 细胞兴奋性降低。 近年来对癫 痫遗传学的研究表明， 钾离子通道异常可直接导致癫痫 （Wulff，H.等， Chem Rev 2008, 7^ (5), 1744-73. ) , 如良性新生儿家族性惊厥 （BFNC)。

电压门控离子通道 （VGICs ) 是继蛋白激酶和 G蛋白偶联受体后第三大 类信号传导分子 ( Harmar, A. J.等， Nucleic Acids Res 2009, 37 (Database issue), D680-5. ) , 在其 78个家族成员中， 超过一半是钾离子通道， 按其功能及结构 特点， 钾离子通道主要可以分为四大类： 内向整流钾通道 （K _k ) _; 双孔钾通 道 （K _2p ) ; 钙激活钾通道 （K _Ca ) 及电压门控钾通道 （K _v ) ( Wulff，H.等， Nat Rev Drug Discov 2009, <^ (12), 982-1001. )。

电压门控钾通道 （K _v ) 是钾通道超家族中的重要成员， 共有 12个成员 (K _V 1.X-K _V 12.X)。其中 KCNQ通道是电压门控钾通道的第 7个成员（Κν7)， 它包括五个亚型，分别命名为 KCNQ1到 KCNQ5。与其它钾通道相比， KCNQ 通道激活阈值较低， 在动作电位阈值下 （-60mV) 即可打开， 并且其激活缓 慢， 在持续去极化时也不失活， 这些特点使 KCNQ通道在调节细胞兴奋性方 面处于基础水平， 其开放可降低神经兴奋性， 而功能抑制则可引起神经细胞 膜电位去极化， 兴奋性增强， 诱发更多的神经冲动。

基于 KCNQ靶点的显著优点， 其激动剂被认为是治疗癫痫的有效药物。 该类钾通道激动剂通过激活钾通道， 降低神经细胞兴奋性， 不仅可用于治疗 癫痫， 也可用于其它神经兴奋性过高引起的疾病如惊 厥、 神经性疼痛、 急性 局部缺血性中风以及神经退行性疾病。

已报道的 KCNQ激动剂主要有如下几种：

1 ) 专利 US5384330 一些化合物。

其结构特点是含有一个邻氮二取代苯环。

2 ) 专利 WO2005/087754 KCNQ激动剂。

其结构特点是含有对二氮取代苯环， 且其中一个氮又在一个饱和环 （也 可能是杂环， 此时 W=O ) 中。 而另外一个氮相邻位置有 Rl， R2取代。

3)专利 WO2008024398-B1中描述了如下结构 此类化合物的结构与专利 WO2005/087754结构相似，只是在饱和环上又 增加了一个并环结构单元。

目前最有代表性的 KCNQ激动剂是 GSK (葛兰素史克)开发的已上市抗癫 痫药 Retigabine (瑞替加

Retigabine是第一个系统研究的 KCNQ激动剂， 其能够激活 KCNQ2-5, 主要用于部分发作型癫痫成人患者的治疗。 Retigabine 吸收较快， 单次给药 后约 1.5-2小时便会达到最大血浆浓度。

Retigabine 的结构中含有一个富电子被三个氮所取代的苯 环， 其中有两 个氮原子处于邻位， 且一个氮原子以氨基的形式存在， 该结构特点导致 Retigabine 在合成及储存时容易氧化变质。 此外， 本申请的发明人在研究 Retigabine组织分布时发现， Retigabine在小鼠的脑组织浓度不高， 这很可能 影响了其药效最大程度的发挥。 因此有必要开发活性更高、 性质更加稳定、 特别是更加利于脑组织浓度分布的钾通道激动 剂， 用于开发治疗神经系统疾 病如癫痫、 惊厥、 神经性疼痛、 急性局部缺血性中风以及神经退行性疾病等 的新型药物。

本申请的发明人研究发现， 当 Retigabine分子中仲胺 -NH-上的 N原子进 一步被取代时，所得化合物不仅保持或增强了 Retigabine的钾通道激动活性， 且与 Retigabine相比具有更高的脑组织分布浓度，因� �具有更佳的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新型的化合物及其 药学上可接受的盐， 所述 化合物可作为 KCNQ钾通道激动剂。 本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备 方法。

本发明的另一目的在于提供一类药物组合物， 所述药物组合物包含作为 有效成分的所述化合物或其药学上可接受的盐 以及药学上可接受的辅料。

本发明的又一目的是提供上述化合物及其药学 上可接受的盐或含有它们 中任何一种的药物组合物在制备治疗神经系统 疾病等的药物中的用途。

本发明所述的化合物

其中 _:

L是连接基团， 为不存在， 或选自 "^ , \^^"， 或^^^ ， 它 们均可任选地被 C _r C ₄ 垸基取代；

Ri选自： H， d-C ₆ 垸基， 可任选被羟基、 氨基、 d-C ₄ 垸氧基、 CrC ₄ 垸基羰基、卤素原子、 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基或卤代 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基取代的 d-C ₆ 垸基， C ₃ -C ₆ 环垸基， C _r C ₆ 垸基羰基， C _r C ₆ 垸氧基羰基， C _r C ₆ 垸胺基羰基， C ₂ -C ₈ 链烯 基， 可任选被羟基、 氨基、 C _r C ₄ 垸基羰基、 C _r C ₄ 垸氧基、 卤素原子、 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基或卤代 C ₆ -d。芳基取代的 c ₂ -c ₈ 链烯基， c ₅ -c ₇ 环烯基， c ₂ -c ₈ 链炔基， 可任选被羟基、 氨基、 d-C ₄ 垸基羰基、 c _r c ₄ 垸氧基、 卤素原子、 c ₆ -c ₁₀ 芳 基或卤代 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基取代的 (： ₂ -(： ₈ 链炔基或 c ₆ -c ₁₍₎ 芳基；

R ₂ 选自卤素原子、 C _r C ₄ 垸氧基；

选自： H， 卤素原子， 三氟甲基， 氰基， 硝基， d-C^垸基羰基、 C C4 垸氧基羰基；

X为 O， S或 NH;

Y为不存在， O或 NR ₇ ，其中 R ₇ 选自 H、C _r C ₆ 垸基、 C ₂ -C ₆ 链烯基、 C ₂ -C ₆ 链炔基、 C ₃ -C ₈ 环垸基；

R ₄ 选自： CrC ₆ 垸基， C ₂ -C ₆ 链烯基， C ₂ -C ₆ 链炔基或 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基； X

HN Y

R ₅ 胺基， X 或 R ₅ 与其 相邻的 的并环结构;

R ₆ 为 H， CrC ₆ 垸基， C ₃ -C ₆ 环垸基；

上述取代基的定义中所述卤素原子或卤代基团 中的卤素原子为 F、 C1或

Br。

更优选的， 本发明所述的化合物具有如通式 II所述结构:

II

其中：

选自： H， C _r C ₆ 垸基， 可任选被羟基、 氨基、 C _r C ₄ 垸基羰基、 卤素 原子、 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基或卤代 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基取代的 C _r C ₆ 垸基， C ₃ -C ₆ 环垸基， C _r C ₆ 垸基羰基， d-C ₆ 垸氧基羰基， C _r C ₆ 垸胺基羰基， C ₂ -C ₈ 链烯基， 可任选被羟 基、氨基、 Cr 垸基羰基、 d-C ₄ 垸氧基、卤素原子、 c ₆ -c ₁₍₎ 芳基或卤代 c ₆ -c ₁₀ 芳基取代的 0： ₂ -0： ₈ 链烯基， C ₅ -C ₇ 环烯基， 0： ₂ -0： ₈ 链炔基， 可任选被羟基、 氨 基、 c _r c ₄ 垸基羰基、 c _r c ₄ 垸氧基、 卤素原子、 c ₆ -c ₁₍₎ 芳基或卤代 c ₆ -c ₁₍₎ 芳 基取代的 c ₂ -c ₈ 链炔基， 或 c ₆ -c ₁₍₎ 芳基；

R ₂ 选自卤素原子、 CH34垸氧基；

R ₃ 选自： H， 卤素原子， 三氟甲基， 硝基；

X为 O;

Y为不存在或 O;

R ₄ 选自： CrC ₆ 垸基， C ₂ -C ₆ 链烯基， C ₂ -C ₆ 链炔基或 C ₆ -C ₁₍₎ 芳基；

〇 〇

HN人。 HN人。

R ₅ 选自： H，卤素原子，氨基， ，或 与其相邻的 Y 起形成 的并环结构；

R ₆ 为 H， CrC ₆ 垸基， C ₃ -C ₆ 环垸基；

上述取代基的定义中所述卤素原子或卤代基团 中的卤素原子为 F、 C1或

Br。

最优选的本发明所述的化合物具有如通式 III的结构：

其中 _:

选自： H， C _r C ₆ 垸基， 任选被羟基、 氨基、 C _r C ₄ 垸基羰基、 卤素原 子、 苯基或卤代苯基取代的 ^^^垸基， C ₂ -C ₈ 链烯基， 任选被羟基、 氨基、 卤素原子、 苯基或卤代苯基取代的 C ₂ -C ₈ 链烯基， C ₅ -C ₇ 环烯基， C ₂ -C ₈ 链炔 基， 任选被羟基、 氨基、 卤素原子、 苯基或卤代苯基取代的 0： ₂ -0： ₈ 链炔基；

R ₂ 选自 F、 C1或甲氧基；

选自： H， 卤素原子或三氟甲基；

Y为不存在或 O;

R ₄ 选自： C _r C ₆ 垸基， C ₂ -C ₆ C ₂ -C ₆ 链炔基或 C ₆ -C ₁₍₎

R ₅ 选自 H，卤素原子，氨基， ，或 R ₅ 与其相邻的 的并环结构;

R ₆ 为 H， C _r C ₆ 垸基。

根据本发明最优选方案， 部分代表性优选化合物如下: :w

36 37 38 39

本发明中上述化合物或其药学上可接受的盐为 上述化合物与酸形成的 盐， 所述酸选自为马来酸、 琥珀酸、 柠檬酸、 酒石酸、 富马酸、 甲酸、 乙酸、 丙酸、 丙二酸、 草酸、 苯甲酸、 邻苯二甲酸、 甲磺酸、 苯磺酸、 甲苯磺酸、 萘磺酸、 1，5-萘二磺酸、 樟脑酸、 樟脑磺酸、 水杨酸、 乙酰水杨酸、 天门冬 氨酸、 谷氨酸、 乳酸、 葡萄糖酸、 维 C酸、 没食子酸、 杏仁酸、 苹果酸、 山 梨酸、 三氟乙酸、 牛磺酸、 高牛磺酸、 2-羟基乙磺酸、 肉桂酸、 盐酸、 氢溴 酸、 氢碘酸、 硫酸、 硝酸、 磷酸或高氯酸。

本发明的另一方面提供了上述化合物或其药学 上可接受的盐的制备方 法， 主要有以下几种制备方法。 其中 P为任选氨基保护基， 具体可参考 《有 机合成中的保护基》 （华东理工大学有机化学教研组， 华东理工大学出版社， 2004)。 方法一：

羰基化合物 a与苯胺 b在弱酸如对甲苯磺酸催化下缩合得到亚胺 c， 后 者在还原剂如硼氢化钠作用下还原亚胺得仲胺 d。 仲胺 d通过与卤代烃的取 代反应、 α，β-不饱和羰基化合物的加成反应、 或者是酰化反应等手段引入取 代基 得到中间体 f。 利用本领域人员知晓的公知条件脱去中间体 d或 f中

X

的胺基保护基 P得到中间体胺 f或 g， 胺 f或 g再与酰化剂 CI ^A Y^ ^r 4反应得 到如通式 I所示化合物。

方法一 方法二：

羰基化合物 a与硝基取代的苯二胺类化合物 h在弱酸如对甲苯磺酸催化 下缩合得到亚胺 i，后者在还原剂如硼氢化钠作用下还原亚胺� �到中间体胺」。 采用本领域人员熟知方法如 Pd-C催化氢化或 SnCl ₂ (氯化亚锡）还原硝基后 得二氨基中间体 k， 通过引入两个氨基保护基 P后得中间体 1， 采用与方法一 中相似的方法引入取代基！^得中间体 m，再脱除保护基 P后裸露两个氨基得

X

中间体 n， 再与酰化剂 ci ^A Y^ ^r 4作用得到如通式 I所示化合物。

万法二 方法三：

X

酰化剂 ci ^{A R4} 与硝基取代的苯胺类化合物 0反应得中间体 p，还原硝基 后的氨基化合物 q， 采用前述方法引入取代基！^得中间体 r， 中间体 r进一

「

步通过与卤代烃^" °或 ^ 「发生取代反应得到如通式 I所示化合物。

方法三 方法四

当通式 I所示化合物中的取代基 为链烯基或链炔基时，还可进一步通 过烯烃复分解反应 （Olefin metathesis) 得到其它如通式 I所示的本发明所述 化合物。 所述常规烯烃复分解反应为金属钌卡宾配合物 （Grubbs催化剂）催 化下烯烃与烯烃或烯烃与炔 通式如下：

方法五： 化合物盐的合成

本发明所述的如通式 I所示化合物还可转化为其药学上可接受的盐� �盐 酸盐等， 一般方法是将相应的酸的溶液加入到上述化合 物的溶液中， 成盐完 全后减压除去溶剂即得本发明所述化合物的相 应的盐。

本发明的又一方面提供了上述化合物及其药学 上可接受的盐或含有它们 中任何一种的药物组合物作为 KCNQ钾通道激动剂的用途，特别是在制备治 疗神经系统疾病等的药物中的用途。

本发明的又一方面提供了一种药物组合物， 所述药物组合物包含治疗有 效量的作为有效成分的所述化合物或其药学上 可接受的盐以及药学上可接受 的辅料。

本发明的再一方面提供了一种治疗神经系统疾 病的方法， 其包括向需要 该治疗的患者给药治疗有效量的上述化合物及 其药学上可接受的盐或含有它 们中任何一种的药物组合物。

所述神经系统疾病包括癫痫、 惊厥、 神经性疼痛、 急性局部缺血性中风 以及神经退行性疾病。 有益效果

本发明中描述的新型化合物相对于现有药物瑞 替加宾 (Retigabine), 其性 质更加稳定， 不易氧化变质。 同时， 本发明所提供的化合物不仅保持了 Retigabine的钾通道激动活性， 且体内抗癫痫效应显著， 具有更高的脑组织分布浓度， 因而具有更佳的治疗效 果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述， 但本发明不局限于这些实施 例。

一、 化合物的制备实施例

下述制备实施例中， NMR用 Varian 生产的 Mercury- Vx 300M仪器测定， NMR定标： 5 H 7.26 ppm(CDCl ₃ )， 2.50 ppm(DMSO-d ₆ ), 3.15 ppm(CD ₃ OD) _; 试剂主要由上海化学试剂公司提供； TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅 胶开发有限公司生产， 型号 HSGF 254; 化合物纯化使用的正相柱层析硅胶 为山东青岛海洋化工厂分厂生产， 型号 zcx-l l , 200-300目。

制备实施例 1: 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸甲酯（K1) 的合成

将单 Boc-对苯二胺（2.57g， 0.0123mol)和对甲苯磺酸（62mg， 0.32mmol) 加入甲苯（50mL) 中， 然后再加入对氟苯甲醛（1.68g， 0.0135mol)， 加热共 沸除水 12小时， 趁热过滤， 滤液冷却后固体析出， 过滤干燥后得粗产物， 直 接进行下一步反应。

上述粗产物 （3.5g， l l .lmmol) 溶于二氧六环 /MeOH (30mL， 二氧六环 /甲醇的体积比为 4:1 ) 中， 分批加入 NaBH ₄ (697mg， 0.018mol)， 室温搅拌 直至反应完全。 加水淬灭， EtOAc萃取（15mLx3次）， 有机相用饱和食盐水 洗涤， 无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 浓缩后得产物 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸叔丁 酯 (3.5g)c 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.31(t, J=8.4Hz, 2H), 7.14(d, J=8.4Hz, 2H), 7.0 l(t, J=8.7Hz, 2H), 6.56(d, J=9.0Hz, 2H), 6.22(s, 1H)， 4.27(s, 2H), 1.50(s, 9H)。 1.2、 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸甲酯 （K1 ) 的合成

将上步得到的 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯（100mg， 0.32mmol) 溶于 CH ₂ C1 ₂ (2mL) 中， 加入三氟醋酸 （TFA， 1.5mL)， 室温搅拌 lh后， 浓缩， 所得化合物溶于二氧六环 （10mL) 中， 加入二异丙基乙胺 （120mg， 1.18mmol)， 0°C下缓慢滴加入氯甲酸甲酯（45mg， 0.49mmol)，室温搅拌 lh， 加水稀释， EtOAc萃取（ 10mLx3次），有机相用饱和食盐水洗涤，无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 浓缩过柱 （PE/EtOAc=4:l ) 得产物 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸甲 酯 (Kl 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.13-7.26(m, 4Η)， 6.87-6.96(m, 4Η)， 6.61(s, 1Η)， 4.26(s, 2Η), 3.77(s, 3H)。

采用与制备实施例 1相似的操作， 制得下列化合物：

制备实施例 2: 4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸甲酯（K9) 的合成

2.1、 4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯的合成

将化合物 4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯 （316mg， lmmol) 溶于 DMF (N，N-二甲基甲酰胺） （5mL) 中， 滴加入炔丙基溴 （178mg， 1.5mmol) 以及二异丙基乙胺 (i-Pr ₂ NEt) (258mg, 2mmol) , 80°C下搅拌 2h， 冷却， 加 水稀释， EtOAc萃取（10mLx3次）， 有机相用饱和食盐水洗涤， 无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 浓缩过柱（PE/EtOAc的体积比 =8:1 ) 得产物 4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基 -胺基) -苯胺甲酸叔丁酯 ( 330mg, 93.2% ) o 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.21-7.30(m, 4H)， 7.00(t, J=8.4Hz, 2H), 6.86(d, J=9.0Hz, 2H), 6.32(s, 1H)， 4.42(s, 2H), 3.92(d, J=2.4Hz, 2H), 2.20(t, J=2.4Hz, 1H)， 1.50(s, 9H)。

2.2、

K9

将上步得到的 4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯（100mg， 0.282mmol) 溶于 CH ₂ C1 ₂ (2mL) 中， 加入三氟醋酸 （TFA， 1.5mL)， 室温 搅拌 lh后， 浓缩， 所得化合物溶于二氧六环 （10mL) 中， 加入二异丙基乙 胺（109mg， 0.846mmol) , 0°C下缓慢滴加入氯甲酸甲酯（40mg， 0.423mmol) , 室温搅拌 lh， 加水稀释， EtOAc萃取（10mLx3次）， 有机相用饱和食盐水洗 涤， 无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 浓缩过柱（PE/EtOAc=4:l )得产物 4-(N-对氟苄基 -N- 炔丙基-胺基)-苯胺甲酸甲酯（K9) (78mg， 88.6%)。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.23-7.28(m, 4H)， 6.99(t, J=8.4Hz, 2H), 6.83(d, J=8.7Hz, 2H), 4.41(s, 2H),

3.91(s, 2H), 3.72(s, 3H), 2.22(s, 1H)。

采用与制备实施例 2相似的方法， 制得下列化合物:

化

合 结构式 ¾ NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz)数据， δ

物

7.35-7.39(m, 4H)， 7.25-7.30(m,5H),7.03(d, J=8.7Hz,

K4 2H), 6.85(d， J=8.7Hz, 2H), 5.18(s， 2H), 4.44(s， 2H),

3.94(s, 2H), 2.22(s, 1H)

7.23-7.29(m, 4H)， 6.99(t， J=8.7Hz, 2H), 6.83 (d,

J=9.3Hz, 2H), 6.67(s, 1H)， 4.42(s, 2H), 3.93(s, 2H),

K5

3.91(d, J=4.2Hz, 2H), 2.2 l(s, 1H)， 1.92-1.97(m,

1H)， 0.94(d， J=6.6Hz， 6H)

7.30(d, J=8.7Hz, 2H),7.16(t,J=8.7Hz, 2H),6.97(d,

H ,、

J=8.4Hz， 3H), 6.74(s, 1H)， 4.76(s, 2H), 4.07-4.16(m,

K6 4H)， 1.64-1.68(m， 2H), 1.53-1.56(m, 2H),

1.33-1.35(m, 4H)， 1.23-1.27(m, 4H)， 0.9 l(t,

J=5.4Hz， 3H), 0.84(t， J=6.3Hz, 3H) 7.15-7.23(m, 4H)， 6.99(t， J=8.7Hz, 2H), 6.63 (d,

J=9.0Hz， 2H), 6.53(s,lH),5.80-5.89(m, 1H)， 5.18(d，

K7 J=1.5Hz， 1H)， 5.13(d, J=3.3Hz, 1H), 4.44(s， 2H),

4.18(q, J=6.6Hz， 2H), 3.93(d, J=4.8Hz， 2H), 1.26(t, J=6.6Hz， 3H)

7.23-7.29(m, 4H)， 7.00(t,J=8.4Hz,2H),

6.85(d，J=9.0Hz，2H)， 6.59(s， 1H)， 4.42(s,

K8

2H),4.18(q,J=7.2Hz, 2H),3.92(d,J=2.1 Hz,

2H),2.21(t,J=2.4Hz, lH),1.28(t,J=7.2Hz, 3H)

制备实施例 3: 2-氟 -5-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸甲酯（K10) 的合成

3.1、 2-氟 -5-硝基苯胺甲酸甲酯的合成

氮气保护下 2-氟 -3-硝基苯胺（156mg， lmmol)溶于干燥的 THF ( 5mL) 中， 冰浴冷却至 0°C， 加入氢化钠 （40mg， 60%, lmmol) , 升至室温下搅拌 60min， 降至 0°C， 加入氯甲酸甲酯（85.2 L， 1. lmmol) , 搅拌 lOmin后， 加 水 （10mL) 稀释， EtOAc ( 10mLx3次） 萃取， 合并有机相， 有机相饱和食 盐水（15mLx3 )， 无水硫酸钠干燥， 浓缩， 过柱 （PE/EtOAc =10: 1-5: 1 ) 得产 物 2-氟 -5-硝基苯胺甲酸甲酯 （245mg， 84.5%)。

3.2、 2-氟 -5-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基)-苯胺甲酸甲酯 （K10) 的合成

上步所得化合物 2-氟 -5-硝基苯胺甲酸甲酯 （95mg， 0.443mmol) 溶于乙 酸乙酯 （15mL) 中， N ₂ 置换， 快速加入 Pd-C ( 10%, 5mg)， H ₂ 置换， 室温 下反应 6h， 过滤， 浓缩后得无色油状物为化合物 2-氟 -5-氨基苯胺甲酸甲酯 ( 72.5mg, 89.1 %) , 直接用于下步反应；

氮气保护下化合物 2-氟 -5-氨基苯胺甲酸甲酯（72.5mg， 0.39mmol)溶于 干燥的 DMF (5mL)中，加入炔丙基溴（44 L， 0.59mmol), DIPEA ( Π0μL, 0.78mmol) c 60°C下搅拌 6小时， 加水 (lOmL) 稀释， EtOAc (10mLx3次) 萃取， 合并有机相， 有机相饱和食盐水（15mLx3)， 无水硫酸钠干燥， 浓缩， 过柱 （PE/EtOAc =6:1-4:1) 得产物 2-氟 -5-(N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸甲酯 (70.1mg, 81%)；

氮气保护下 2-氟 -5-(N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸甲酯 （70mg， 0.32 mmol) 溶于干燥的 DMF (5mL) 中， 加入对氟溴苄 （81μΙ^， 0.64mmol)， 二异丙基 乙基胺 (DIPEA) (n5μL, 0.64mmol)。 60°C下搅拌 6小时， 加水 (lOmL) 稀释， EtOAc (10mLx3次）萃取，合并有机相，有机相饱和食� �水（ 15mLx3)， 无水硫酸钠干燥， 浓缩， 过柱 （PE/EtOAc =6:1-4:1) 得产物 2-氟 -5-(N-对氟 苄基 -N-炔丙基-胺基)-苯胺甲酸甲酯（K10)(88.7mg，84%) 。1HNMR(300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.79(s, 1H), 7.30(m, 2H), 7.0 l(m, 2H), 6.93(dd, J=9.9 Hz, J=9.0 Hz, 2H), 6.83(s, 1H), 6.5 l(m, 1H), 7.0 l(m, 2H), 4.44(s, 2H), 3.94(d =2.4

Hz,2H),3.79(s, 3H), 2.24(t, J=2.4 Hz，lH)。

采用与制备实施例 3相似的方法， 制得下列化合物:

制备实施例 4: 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-烯丙基-胺基) -苯胺甲酸乙酯 (K20) 的合成

的合成

按照与制备实施例 1相似的操作， 以邻硝基对苯二胺和对氟苯甲醛为原 料， 制得中间体 2-硝基 -4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺。将 2-硝基 -4-(N-对氟苄基 -胺基) -苯胺 （2.61g， O.Olmol) 溶于 THF (30mL) 中， N ₂ 置换， 快速加入 Pd-C ( 10%, 261mg) , H ₂ 置换，加氢反应过夜，过滤，浓缩得产物 2-氨基 -4-(N- 对氟苄基-胺基) -苯胺 （2.3g， 99.6%， 无色油状物， 产物不稳定， 极易被氧化 变坏），迅速用于下步反应。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.32(t, J=8.7Hz, 2H), 7.02(t, J=8.7Hz, 2H), 6.58(d, J=8.7Hz, 1H)， 6.01-6.08(m, 2H), 4.22(s, 2H)。

上步产物 2-氨基 -4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺 （lg， 4.32mmol ) 溶于 THF/H ₂ O(40mL， 1 :1 )中，加入二叔丁氧基碳酸酐（Boc ₂ O) (2.83g， 12.96mmol) 以及碳酸氢钠（1.16g， 12.96mmol)，室温搅拌过夜。加水稀释， EtOAc( 30mLx3 次）萃取， 合并有机相， 有机相用无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 减压旋除溶剂后硅胶柱 层析纯化 （PE/EtOAc=5:l ) 得中间体 2- (叔丁氧基羰基胺基 )-4-(N-对氟苄基- 胺基) -苯胺甲酸叔丁酯 （1.67g， 89.5%, 无色油状物）。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.28(t, J=8.7Hz, 2H), 7.00(t, J=8.7Hz, 3H), 6.89(s, 1H)， 6.26(d, J=8.7Hz, 1H), 4.25(s, 2H), 1.48(s, 18H)。

4.2、 2- (叔丁氧基羰基胺基 )-4-(N-对氟苄基 -N-烯丙基-胺基) -苯胺甲酸叔 丁酯的合成

将中间体 2- (叔丁氧基羰基胺基 )-4-(N-对氟苄基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯 ( 150mg, 0.348mmol) 溶于 DMF ( 5mL) 中， 滴加入烯丙基溴 （55mg， 0.452mmol) 以及 i-Pr ₂ NEt (99mg， 0.766mmol) , 50°C下搅拌 2h， 冷却， 加 水 （10mL) 稀释， EtOAc ( 10mLx3次） 萃取， 有机相用饱和食盐水洗涤， 无水 Na ₂ SO ₄ 干燥， 浓缩过柱 （PE/EtOAc=4:l ) 得化合物 2- (叔丁氧基羰基胺 基) -4-(N-对氟苄基 -N-烯丙基-胺基) -苯胺甲酸叔丁酯 （143mg， 87.2%, 无色 油状物）。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.18(t, J=6.9Hz, 2H), 6.90-7.06(m, 4H)， 6.49(s, 1H)， 6.48(d, J=8.7Hz, 1H)， 5.79-5.88(m, 1H)， 5.18(s, 1H)， 5.13(s, 1H)， 4.44(s, 2H), 3.92(d, J=3.6Hz, 2H), 1.49(s, 腦）。 ¹³ C NM (75 MHz, CDC1 ₃ ): δ 163.5, 160.3, 154.9, 153.5, 147.5, 134.4, 134.3, 133.4, 128.4, 128.3, 127.0, 116.7, 115.5, 115.2, 80.4, 53.4, 53.1, 28.3 c (∑：∑：¾)驩 ώ缀 ώ瑚

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CZM00/Z10ZN3/X3d .60090/ClOZ OAV

按照制备实施例 4的相似操作制得化合物 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-炔丙 基-胺基) -苯胺甲酸甲酯。所得化合物（80mg，0.24mmol)溶� ��二氧六环（10mL) 中， 加入 DIPEA ( 100mg， 0.98mmol) , 0°C下缓慢滴加入氯甲酸甲酯（50mg， 0.53mmol) 的二氧六环 （2mL) 溶液， 室温搅拌直至原料反应完全。 加水稀 释， EtOAc ( 10mLx3次） 萃取， 有机相用饱和食盐水洗涤， 无水 Na ₂ SO ₄ 干 燥， 浓缩过柱（PE/EtOAc=4: 1-2:1 )得产物 2- (甲氧基羰基 -胺基 )-4-(N-对氟苄 基 -N-炔丙基-胺基)-苯胺甲酸甲酯 （K22) (68mg, 72%)。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.25(t, J=8.4Hz, 2H), 7.12(d, J=8.7Hz, 2H), 6.99(t, J=8.7Hz, 2H),

6.57(d, J=8.7Hz, 1H)， 4.45(s, 2H), 3.94(s, 2H), 3.71(s, 6H)， 2.22(s, 1H) 。

采用与制备实施例 5相似的方法， 制得下列化合物：

^

CZM00/Z10ZN3/X3d .60090/εΐΟΖ OAV 按照制备实施例 4的方法制得 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯 胺， 将该化合物 （27mg， O.lmmol) 溶于 THF ( 5mL) 中， 滴加入固体三光 气 （30mg， O.lmmol) 的 THF (2mL) 溶液以及 Et ₃ N (30mg, 0.3mmol) 室 温搅拌 2h， 浓缩， 过柱 (PE/EtOAc/MeOH=10: 10:1-5:5: 1 ) 得产物 5-(N-对氟 苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯并咪唑 -2-酮（K25 )(25mg， 84.5%)。 1H NM (300 MHz CD ₃ OD): δ 7.34(t, J=8.7Hz, 2H), 7.03 (t, J=8.7Hz, 2H), 6.89(d, J=8.7Hz, 1H)， 6.72(d, J=8.7Hz, 2H), 4.42(s, 2H), 3.95(s, 2H), 2.60(s, 1H)。

采用与制备实施例 6相似的方法， 制得化合物 5-(N-对氟苄基 -N-烯丙基- 胺基) -苯并咪唑 -2-酮（K34)。 1H NM (300 MHz, DMSO- ₆ ): δ 10.22 ( s， 1H)， 10.14 ( s， 1H)， 7.26 (t， J=7.8 Hz, 2H)， 7.13 (d， J=8.1 Hz, 1H)， 6.69 (d， J=8.4 Hz, 1H)， 6.32 (d， J= 8 ( s， 1H)。

K34

制备实施例 7： 2- (乙氧纖基-胺基) -4-[N-对氟苄基 -N-l-(6 基 -2-甲烯 基 -3-己烯基)

K32

按照制备实施例 5相似的方法制得化合物 2- (乙氧基羰基 -胺基 4-(N-对 氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸乙酯， 氩气保护下， 将该化合物 （15mg， 0.036mmol) 和烯丙醇 （21mg， 0.36mmol) 溶于无水二氯甲垸 （3ml)， 通氩 气除氧 15分钟。 快速加入 Grubbs II催化剂， 换气三次， 回流过夜。 减压旋 除溶剂后硅胶柱层析纯化 （PE/EtOAc=4: 1-2:1 ) 得产物 2- (乙氧基羰基-胺 基)— 4-[N-对氟苄基 -N-l-(6-羟基 -2-甲烯基 -3-己烯基) -胺基]-苯胺甲酸乙酯 K32

( 15mg, 85%) ,黑色油状物。 1H NM (300 MHz, CDC1 ₃ ): δ 7.18 (dd, J=8.7 Hz, J=8.4 Hz, 2H) ,7.07 -6.96 (m， 5H) ,6.40 (dd, J=8.7 Hz, J=2.7 Hz, 1H)， 6.36 ( s， 1H)， 5.88-5.79 (dt， J=16.2 Hz, J=5.15 Hz, 1H)， 5.03 ( s， 1H)， 4.52 ( s， 1H)， 4.18 (m， 4H)， 4.10 ( s， 2H)， 1.28 (m， 6H)。

采用与制备实施例 7相似的方法，制得化合物 2- (乙氧基羰基 -胺基 )-4-[N- 对氟苄基 -N-l-(6-氨基 -2-甲烯基 -3-己烯基) -胺基]-苯胺甲酸乙酯 （K39 )。 1H NM (CDC1 ₃ , 300 MHz): 5 7.17 (dd, J=8.4 Hz, J=5.4 Hz, 2H)， 7.07 (d, J=9.0 Hz, 2H)， 6.98 (t， J=8.7 Hz, 2H)， 6.59 ( s， 1H)， 6.35 (dd, J=9.0 Hz, J=2.7 Hz, 1H)， 6.29 (d， J=15.9 Hz, 1H)， 5.76 (d， j=15.9 Hz，lH)， 5.11

( s， 1H)， 4.99 ( s， 1H)， 4.49 ( s， 2H)， 4.17 (m， 4H)， 4.08 ( s， 2H)， 1.25 (m， 6H)。

K39

制备实施例 8: 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯胺甲酸乙酯二 盐酸

K21 K21 - 2HCI 取化合物 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基 -胺基 苯胺甲酸乙酯 （K21 ) 511mg( 1.5mmol)溶于二氯甲垸（5mL)，加入 5N盐酸的乙酸乙酯溶液（lmL)， 搅拌 10分钟， 旋去溶剂， 即得到 2-氨基 -4-(N-对氟苄基 -N-炔丙基-胺基) -苯 胺甲酸乙酯二盐酸盐 （K21 '2HC1) (624mg)。

采用与制备实施例 8相似的方法，分别得到化合物 K3的盐酸盐 Κ3·Ηα， K17的盐酸盐 K17_HC1， K18的盐酸盐 K18_HC1以及化合物 K20的二盐酸盐 K20-2HC1

二、 电生理实验实施例： 本发明的化合物在中国仓鼠卵母细胞（CHO) 上的电生理实验

1、 细胞培养与转染

中国仓鼠卵巢细胞 （CHO ) (中国科学院细胞库） 培养液配方： 50/50 DMEM/F-12 ( Cellgro, Mamassas, VA)， 加入 10%小牛血清 ( FBS ) (Gibco, 澳大利亚）， 2mM L-谷氨酸 （Invitrogen)。 表达 KCNQ通道及其突变： 转染 前 24小时， 用胰蛋白酶 （Sigma, 中国） 消化后铺于直径 60mm的皿中。 转 染使用 Lipofectamine2000 ^TM 试剂 （Invitrogen) , 根据其 protocol进行操作。 转染后 24小时， 细胞消化后重新铺于 poly-L-lysine ( Sigma)浸泡的玻片上。 共转染 GFP (绿色荧光蛋白）， 可在荧光显微镜下确认转染细胞。

2、 CHO细胞上的电生理记录：

在室温下， 采用 Axopatch-200B放大器 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA ) 进行全细胞式电压钳记录。 硼硅酸盐玻璃毛细管 （World Precision Instrunents, Sarasota, FL) 拉制成电极， 电极内填充细胞内液后的电阻应为 3-5ΜΩ。 细胞内液配方： 145mM KCl， 1 mM MgCl ₂ ， 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 5mM MgATP (KOH调至 pH=7.3 )。 记录期间， 通过 BPS灌流系统 (ALA Scientific Instruments, Westburg, NY)持续灌流细胞外液。细胞外液： 140 mM NaCl, 5mM KC1, 2 mM CaCl ₂ ， 1.5 mM MgCl ₂ ， 10 mM HEPES, 10 mM葡萄糖（NaOH调至 pH=7.4)。 电信号 1kHz滤波后用 DigiData 1322A在 pClamp 9.2软件 （Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 中转换为数字信号。 串联电阻补偿 60-80%目前的研究中采用多电压方案。 方案中钳制电压定为 -100mV。 细胞在一系列 2000ms剌激电压（从 -90mV到 +50mV， 间隔 10mV) 诱导电流。 3. 实验结果：

其中 V _1/2 为半数激活电压， Δν _1/2 为半数激活电压左移值， 负号 （-) 表 示电流激活曲线左移， 正号（+ )表示右移。 1/1。为激活倍数， 其中 为-1011 ¥ 测试电压剌激下产生的电流峰值的最大值， I是给药 （化合物浓度为 ΙΟμΜ) 后同样在 -10mV测试电压剌激下产生的电流峰值的最大值� �� 1/1。>1 表示激动 活性， 1/1。<1代表抑制活性。 N为所测细胞数。 NT表示未测。 化合物 AVi/2 (mV) V N

K1 -8.1±3.1 2.84±0.08 3

K2 -3.0±2.0 1.50±0.08 4

K3-HC1 -13.9±2.5 2.41±0.20 3

K4 -11.5±2.0 2.09±0.25 3

K5 -14.3士3.3 1.23士0.08 4

K6 -1.6±3.0 1.24±0.02 3

K7 -4.7±2.0 1.35±0.27 2

K8 -7.3±2.5 1.99±0.37 3

K9 -24.21士2.4 3.27±0.10 3

K10 -18.7±2.6 2.75±0.31 3

K11 -15.7±1.0 2.24±0.36 3

K12 -21.1士1.9 2.33±0.17 3

K13 -7.6士1.9 2.31±0.36 3

K14 -14.7±2.1 1.43±0.04 4

K15 -22.0±1.5 2.09±0.31 3

K16 -20.6±4.5 1.47±0.10 3

K17-HC1 -16.5士2.4 2.29±0.38 3

K18-HC1 -12.5士3.2 2.72士0.22 3

K19 -14.9±2.7 2.52±0.23 3

K20 -49.7±3.4 1.75±0.12 3

K21 -47.9士3.5 1.53士0.15 3

K22 -27.31±3.9 2.10±0.35 3

K23 -15.34士3.8 1.44士0.14 3

K24 -1.87±2.5 1.2士0.1 3

K25 -5.8士1.7 1.8士0.1 3

K26 NT 1.25士0.07 3

K27 NT 1.52±0.17 3

K28 NT 1.43±0.05 3

K29 NT 1.24士0.10 3

K30 NT 1.57士0.25 3

K31 NT 1.36士0.13 3

K32 -6.0±1.5 1.76士0.09 3 K33 -36.8±3.3 NT 3

K34 NT 1.44±0.16 3

K35 NT NT

K36 NT NT

K37 NT NT

K38 NT 0.16±0.02 3

K39 NT 1.03±0.11 3 三、 化合物的体内药效评价实施例

体内药效实施例 1: 化合物 K9和 K1对戊四唑（PTZ)诱导惊厥的治疗 作用

1、 实验目的：

比较本发明的化合物 K9、 Kl和 Retigabine (实验室参照 US5384330所 公开的方法自制得到抗惊厥作用。

2、 样品处理：

Retigabine: 淡灰色粉末， 易溶于水。 呈无色、 透明液体。

化合物 K9:黄色颗粒，不易溶于水。加入 0.2%CMC溶液，然后超声 30min 后， 呈均匀悬浊液。

化合物 K1 : 淡黄色颗粒， 不易溶于水。 加入 0.2%CMC溶液， 然后超声

30min后， 呈均匀悬浊液。

3、 实验动物：

C57BL/6J小鼠 （购自中科院实验动物中心）： 16-18克。

4、 实验步骤：

灌胃给予受试药物 （30mg/kg ) ; —小时后， 皮下注射戊四唑 （PTZ 80mg/kg) _; 立即观察动物在 60min以内的反应。

5、 实验结果：

剂量、 给药途 N 惊厥发 阵挛潜 全身强直性发 化合物 死亡率 径、 观察时间 （只） 生率 伏期 (秒) 作潜伏期 (秒)

K9 10 4/10 351±84.3 1382±339 4/10 K1 30mg/kg，灌胃 10 4/10 250士114 1785士408 3/10 给药后 lh

无典型阵挛

Retigabine 10 5/10 1472±961 4/10 发作 PTZ对照 10 9/10 134士 51.5 921士 248 8/10 动物接受 Retigabine处理后， 安静， 运动减少， 20min后， 逐渐恢复， lh后， 未见明显异常。 动物分别接受 K9和 K1处理后， 能明显降低惊厥发 生率， 表现为延长 PTZ急性惊厥小鼠发作性阵挛潜伏期， 延长全身强直性发 作潜伏期以及降低死给径察亡率。 结果显示， 三者具有效果相当的抗惊厥作用。

药、时

体内药效实施例 2：途观间腹腔注射化合物 K21对 PTZ (戊四唑）和 MES (最 大电流剌激）诱导的动物模型治疗作用的测试 实验

1、 实验目的：

比较 K21和阳性化合物 Retigabine的抗惊厥作用。

2、 样品处理：

Retigabine: 淡灰色粉末， 易溶于水。 呈无色、 透明液体。

前强发

K21 : 茶青色片状颗粒， 不易溶于水。 先用 5肢直生0ul的 DMSO溶解， 再加入 0.5% HEC溶液， 呈均匀悬浊液。 后强发

肢直生

3、 实验动物：

雄性 KM小鼠 （购自中科院实验动物中心）： (22±2) 克。

4、 实验步骤：

( 1 ) PTZ测试： 腹腔注射 （10 mg/kg、 5mg/kg、 2.5mg/kg, 0.1ml/10g) 各种受试药物； 30min后皮下注射戊四唑 （PTZ， 100mg/kg) ; 立即观察并记 录动物在 lh内的反应情况。

(2) MES测试： YLS-9A型生理药理电子剌激仪， 采用配置 8， 设置 剌激电压 160V、 波数 90个 （即剌激时间 5.4 sec)。 耳夹电极给予电剌激 1 次， 以后肢强直性伸直为惊厥指标， 实验前一天进行筛选。 实验时， 先腹腔 注射 （10 mg/kg, O.lml/lOg) 各种受试药物， 30min后按照前一天设置的参 数进行 MES测试， 立即观察并记录动物的反应情况。

5、 实验结果：

( 1 ) PTZ测试结果

化合物 剂量 阵挛 阵挛潜伏 后肢强直

发生 期 （sec ) 潜伏期 率 ( sec ) K21 10mg/kg 12/12 226±51 0/12*** 0/12***

K21 5mg/kg 10/10 238士54*** 3/10 0/1(Τ ι/ΐ(

K21 2.5mg/kg 腹腔注 9/10 184士42 2/10 ο/ΐ(Γ* ι/ΐ(

Retigabi 射、 观

lOmg/kg 10/10 239±113 4/12* 1100±319 2/12 ne 察 lh

Retigabi

5mg/kg 10/10 184士40 4/10 2/10* 883±151 5/10 ne

Retigabi

2.5mg/kg 10/10 179士60 5/10 1/1( 827 7/10 ne

生理盐

0.2ml 11/11 137±24 3/11 8/11 1033±364 9/11 水

*ρ<0.05 , **^<0.01, ***^<0.001

(2) MES测试结果

剂量、给药

化合物 惊厥发生率 死亡率

途径

K21 10mg/kg, 2/10*** 0

Retigabine 腹腔注射 4/1广 0

给药

生理盐水 10/10 10%

*p<0.05 , **^<0.01, ***^<0.001

6、 实验结论：

化合物 K21在 MES测试中完全抑制大发作的发生， 在 PTZ测试中， 能 明显降低动物惊厥发生率和死亡率，延长 PTZ诱导的急性惊厥小鼠阵挛性发 作潜伏期且存在一定的剂量效应关系。化合物 化合物 K21的抗惊厥效果在相 同给药剂量下稍强于阳性化合物 Retigabine。 二者均显示一定镇静的作用。

体内药效实施例 3： K21口服给药对 PTZ和 MES诱导的动物模型的治 疗作用

1、 实验目的：

比较 K21和阳性化合物 Retigabine口服给给药的抗惊厥作用。

2、 样品处理：

Retigabine: 淡灰色粉末， 易溶于水。 呈无色、 透明液体。 K21 : 茶青色片状颗粒， 不易溶于水。 先用 5(^L的 DMSO溶解， 再加 入 0.2% CMC溶液， 超声 20 min后， 呈均匀悬浊液。

3、 实验动物：

雄性 KM小鼠 (购自中科院实验动物中心)， PTZ实验中，动物体重（22±2) 给径察

克； MES实验中， 动药、时物体重 18 g。

途观间

4、 实验步骤：

( 1 ) PTZ测试

动物禁食 12h， 灌胃给予受试化合物 CF341 和 retigabine ( 30 mg/kg, 0.2ml/10g), lh后皮下注射戊四唑 （PTZ， 100mg/kg) , 立即观察并记录动物 在 lh内的反应情况。

前直

(2) MES测试 肢发率

强生

YLS-9A型生理药理电子剌激仪， 采用配置 8， 设置剌激电压 160 V、 波数 90个 （即剌激时间 5.4 sec)。 耳夹电极给予电剌后直激肢发率 1次， 以后肢强直性 强生

伸直为惊厥指标， 实验前一天进行筛选。

动物禁食 12h， 灌胃给予 （30 mg/kg， 0.2 ml/lOg) 各种受试药物， lh后 按照前一天设置的参数进行 MES测试， 立即观察并记录动物的反应情况。

5、 实验结果：

( 1 ) PTZ测试结果 阵挛 阵挛潜伏 前肢强直 化合物 剂量 发生 期 （sec) 潜伏期

率 (sec)

K21 30mg/kg 灌胃给 12/12 148±37 5/12 0/12 1561士690 3/12

Retigabi 30mg/kg 药、 观 12/12 177士70 1063±284 _0/12 **

3/12** 0/12

ne 察 ^{1 h}

生理盐 0.4ml 12/12 104士18 ，, 964士174 ，,

9/12 7/12 7/12 水

与阴性对照组相比， * <0.05，

(2 ) MES测试结果

化合物 剂量、给药途径 惊厥发生率 药物保护率

K21 30mg/kg, 灌胃 2/13 84.6%' Retigabine 给药 5/13 61.5%

NS 13/13 0%

与阴性对照组相比， *** <0.001.

7、 实验结论：

化合物 K21和 retigabine在 MES测试中均明显抑制大发作的发生， 且效 果相当； 在 PTZ测试中， retigabine能明显降低动物惊厥发生率和死亡率� � 而化合物 K21能明显抑制动物的强直发作， 死亡率虽较对照组的有所降低， 但无显著性差异。

四、 化合物的药代动力学研究实施例

药代动力学研究实施例 1: K9和 Retigabine在小鼠脑组织分布试验研究

1、 给药方案

健康 KM小鼠 108只，雄性，体重 18-20 g，试验前禁食 12 h， 自由饮水。 给药后 2 h统一进食。 具体安排见下表：

试验前禁食 12 h， 自由饮水。 给药后 2 h统一进食。

小鼠灌胃和静脉给药后在以上设定时间点， 腹主动脉放血处死， 每个时 间点 3只小鼠。 每只动物收集 0.5 ml全血， 置肝素化试管中， 3000 rpm离心 10 min, 分离血浆， 于 -20°C冰箱中冷冻保存。 动物处死后， 解剖摘取全脑， 用冰生理盐水冲洗残留血液， 吸干后， 贴好标签， -20°C冰箱中冷冻保存。

2、 试验结果

以液相色谱 -串联质谱法测定血浆和脑组织中 K9和 Retigabine的浓度。 2.1、 K9

小鼠灌胃给予 20 mg/kg 化合物 K9后，在血浆和脑组织中达峰浓度 C _max 分别为 2197 ng/ml和 4421 ng/g;药时曲线下面积 AUQu分别为 1865 ng-h/ml 和 3565 ng.h/g。 脑组织中的暴露量约相当于血浆的 1.9倍。 消除半衰期约为 1.2h。

小鼠静脉注射 20 mg/kg化合物 K9后， 在血浆和脑组织中的药时曲线下 面积 AUCtu分别为 7185 ng.h/ml禾卩 10694 ng-h/g,血浆清除率为 2.78 L/ ¾。 化合物 K9在脑中的暴露量相当于血浆的 1.5倍。

经剂量校正后， 按血浆 AUC。_ _t 计， 小鼠灌胃给予 20 mg/kg化合物 K9后 的绝对生物利用度为 26%。

2.2 etigabine

小鼠灌胃给予 20 mg/kg Retigabine后， 在血浆和脑组织中达峰浓度 C _max 分别为 2788 ng/ml和 849 ng/g;药时曲线下面积 AUC。 ₄ 分别为 21088 ng-h/ml 和 3460 ng.h/g。 脑组织中的暴露量约相当于血浆的 16%。 消除半衰期约为 7h。

小鼠静脉注射 20 mg/kg Retigabine后， 在血浆和脑组织中的药时曲线下 面积 AUCV _t 分别为 59987 ng-h/ml 和 8661 ng-h/g, 血浆清除率为 0.322 L/h/kg。 Retigabine在脑中的暴露量相当于血浆的 14%。

经剂量校正后， 按血浆 AUQu计， 小鼠灌胃给予 20 mg/kg Retigabine后 的绝对生物利用度为 35.2%。

药代动力学研究实施例 2： K20-2HC1和 K21*2HC1在小鼠脑组织的分布 试验研究

1、 给药方案

KM小鼠 54只， 雄性， 体重 18-20 g， 试验前禁食 12 h， 自由饮水。 给 药后 2 h统一进食。 具体安排见下表：

组 动物 给药剂量 给药体积

化合物 给药方式 采样时间点 （h) 别 (mg/kg) (ml/kg)

0.25, 0.5， 1， 2, 3, 5，

1 27 K20-2HC1 灌胃 20 10

7, 9禾口 24 h 0.5， 1， 2, 3 , 5，

2 iip 0.25 ,

27 K21-2HC1 m冃 5* 10

7 , 9禾口 24 h 小鼠灌胃给予 20 mg/kg化合物 K21_2HC1后， 出现明显的躁动不安症状， 1只死 亡。 故剂量降低为 5 mg/kg。 试验前禁食 12 h， 自由饮水。 给药后 2 h统一进食。

小鼠灌胃给药后在以上设定时间点， 腹主动脉放血处死， 每个时间点 3 只小鼠。每只动物收集 0.5 ml全血，置肝素化试管中， 1 1000 rpm离心 10 min， 分离血浆， 于 -20°C冰箱中冷冻保存。 动物处死后， 解剖摘取全脑， 用冰生 理盐水冲洗残留血液， 吸干后， 贴好标签， -20°C冰箱中冷冻保存。

2、 试验结果

2.1、 K20-2HC1

小鼠灌胃给予 20 mg/kg化合物 K202HC1后， 血浆和脑组织中原形药物 K20-2HC1 和代谢物 retigabine 的浓度达峰时间 T _max 均为 0.25 h， 代谢物 retigabine在血浆和脑组织中的暴露量分别为原� �药物 K202HC1 的 2.9%和 1 .8%； 原形药物 K202HC1在脑组织中的浓度为血浆浓度的 2.3倍， 代谢物 retigabine为 1.4倍。

12、 K21 -2HC1

小鼠灌胃给予 5 mg/kg化合物 Κ21·2Ηα后， 血浆和脑组织中原形药物 K21 -2HC1 和代谢物 retigabine 的浓度达峰时间 T _max 均为 0.25 h， 代谢物 retigabine在血浆和脑组织中的暴露量分别为原� �药物 Κ21 ·2Η(31 的 5.4%和 4.6%； 原形药物 Κ21 ·2Η(31在脑组织中的浓度为血浆浓度的 2.4倍， 代谢物 retigabine为 2.0倍。

从上述试验结果可以看出，本发明所提供的化 合物不仅保持了 Retigabine 的钾通道激动活性， 且体内抗癫痫效应显著：

1、 在雄性 KM小鼠模型上腹腔注射给药， 化合物 K21 _2HC1的抗惊厥效 果优于阳性化合物 Retigabine;

2、 同样在雄性 KM 小鼠模型上按剂量 10mg/kg 灌胃给药， 化合物 K21 _2HC1和 Retigabine在 MES测试中效果相当，能明显抑制大发作的发生 ； 在 PTZ 测试中， Retigabine 能明显降低动物惊厥发生率和死亡率， 化合物 K21 -2HC1能明显抑制动物的强直发作。

药代动力学研究显示： 该类化合物相较于 Retigabine, 具有更好的脑组 织浓度分布：

1、 小鼠灌胃给予 20 mg/kg 化合物 K9后， 化合物在脑组织中的暴露量 约相当于血浆的 1.9倍； 小鼠静脉注射 20 mg/kg化合物 K9后， 化合物在脑 中的暴露量相当于血浆的 1.5倍。 同样条件下， Retigabine灌胃以及静脉注射 给药， 其在小鼠脑中的暴露量分别为血浆的 16%和 14%;

2、 小鼠灌胃给予 20 mg/kg化合物 K20后， 化合物在脑组织中的浓度为 血浆浓度的 2.3倍；

3、 小鼠灌胃给予 5 11¾/]¾化合物^1 _211(：1后， 化合物在脑组织中的浓 度为血浆浓度的 2.4倍。