THERAPEUTIQUE La présente invention se rapporte à des conjugués de cryptophycines, les compositions les contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation de ces composés ainsi qu'aux dérivés de cryptophycines eux-mêmes. [Domaine technique]

Les cryptophycines sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des macrocycles depsipeptidiques produits par les cyanobactéries du genre Nostoc. Leur nom se réfère au fait qu'elles sont hautement cytotoxiques vis-à-vis des levures du genre cryptococcus. Le premier représentant de cette classe de molécules, la cryptophycine-1 (C-1), a été isolé en 1990 de cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (voir Eiβler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789). La structure, la formule générale ainsi que la numérotation des atomes de carbone de ces composés, telle que décrite dans WO 98/08505, sont rappelées ci-dessous :

Les cryptophycines C-1 et C-52, qui se caractérisent par une fonction époxyde représentée ci- dessous, ont des propriétés anticancéreuses. Des essais cliniques de phase II dans le cancer du poumon ont été conduits avec C-52 (LY 355073) : voir Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003,

39, 197-199 ; Sessa C, et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. La cryptophycine C-55, prodrogue de C-52, se caractérise quant à elle par une fonction chlorhydrine en lieu et place de la fonction époxyde (Bionpally R. R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). C-55 s'est avérée très active mais n'est pas stable en solution. Des dérivés de type glycinate de chlorhydrine tel que le composé C-55 Gly ont également été décrits pour gagner en stabilité

(Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224).

[Problème technique]

La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été appliquée à plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansinoïdes (WO 04103272), les taxanes (WO 06061258), les tomaymycines (WO 09016516), les leptomycines (WO 07144709), le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des conjugués, Monneret C, et al., Bulletin du Cancer. 2000, 87(1 1 ), 829-38 ; Ricart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. Cependant, elle n'a pas été appliquée aux dérivés de cryptophycine conjugués à des anticorps ou à d'autres agents de ciblage.

Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer de nouveaux conjugués à base de dérivés de cryptophycine, ainsi que de nouveaux dérivés de cryptophycine aptes à être conjugués.

[Art antérieur]

EP 0830136 et WO 98/08505 décrivent des dérivés de cryptophycines mais ne décrivent pas de conjugués de cryptophycines. WO 98/08505 décrit des dérivés de cryptophycines de formule

(A) : dans laquelle Ar peut représenter un groupe Ar' de

formu : dans laquelle R ₅₄ représente H, un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, (C ₁ ;

Cfi)alkyle(R57,R57',R57"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR ₅₇ , PO ₃ H, SO ₃ H, SO ₂ R ₅₈ , NR ₅₉ R ₆₀ , NHOR ₆ -I, NHOR ₆ -T, CN, NO ₂ , OR ₆₂ , CH ₉ OR ₆ ?', CH ₉ NRg ₆ Rg ₆ ', (C ₁ ;

ÇβJaJkyJeORiQQ, SR ₆₃ ; R ₅₅ et R ₅₆ représentent H, un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle,

C(R ₅₁₁ R ₅ ?', R ₅ ?"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR ₅₇ , PO ₃ H, SO ₃ H, SO ₂ R ₅₈ , NR _S gRg ₂ , NHOR _6I , NHCHR ₆₁ ', CN, NO ₂ , OR ₆₂ , CH ₉ OR ₆₉ ', CH ₉ OCORg ₅ , CH ₉ NRg ₆ Rg ₆ ', (C ₁ -C ₆ )BIkVIeORi ₀₀ , (C ₁ -C ₆ JaIkVIeN RMR ₆₀ . WO 98/08505 décrit notamment les composés suivants : (∞mposé 24, schéma 4)

(ex.74)

qui se caractérisent pas le groupe terminal -NHC(=O)Ot-Bu. WO 98/08505 ne précise pas que ces composés sont aptes ou destinés à être conjugués. US 2007/0213511 décrit des immunoconjugués de calichéamicine. Parmi ceux-ci, mention est faite du MYLOTARG ^® (ou CMA-676) qui est un immunoconjugué de calichéamicine utilisé dans le traitement de l'AML (anti-CD33-calichéamicine). Voir aussi à propos des conjugués : WO 2006/042240. Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46(14), 2985-3007 et Al-awar R.S., et al., Mol.Cancer Ther. 2004, 3(9), 1061-1067 décrivent des dérivés de cryptophycine, ainsi que leurs évaluations in vivo.

WO 08010101 décrit un anticorps monoclonal anti-EphA2 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. WO 08047242 décrit un anticorps monoclonal anti-CD38 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. Le composé cytotoxique peut être choisi parmi les maytansinoïdes, les taxanes, les tomaymycines, les leptomycines, le CC-1065 et ses analogues.

WO 2009/126934 décrit des anticorps anti-CD70 et leurs conjugués avec des composés cytotoxiques ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. WO 2009/134976 décrit des conjugués avec un taux de subsitution optimisé pour délivrer la quantité nécessaire de cytotoxique dans la cellule ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques.

WO 2005/116255 décrit des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique pouvant être une cryptophycine (voir [0037] et Tableau 2), le linker pouvant comprendre une chaîne PEG ([0038]). Plus particulièrement, la cryptophycine Cryp-NH ₂ est décrite :

ainsi que ses conjugués d'aptamères avec les linkers suivants : NHS-PEG-erythritol, pNP-PEG- erythritol, NHS-PEG-octaPEG, pNP-PEG-octaPEG et PEG-comb (Tableaux 3 et 4). La nature de l'enchaînement sur le cycle phényle (-CH ₂ θ-C(=O)-CMe ₂ -CH ₂ NH-...) est différent de ce qui est envisagé dans la présente invention. WO 2006/096754 décrit également des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique qui peut être aussi une cryptophycine.

WO 2009/002993 décrit des conjugués de cytotoxique de formule B-L-A comprenant des linkers hydrophiles, par exemple le linker de formule :

Le cytotoxique peut être une cryptophycine (page 46) mais sans préciser le point d'attachement du linker. Un exemple de conjugué est le EC0262 :

dont le linker et le point d'ancrage sont différents de ce qui est envisagé dans la présente invention.

[Définitions]

On entend par :

• conjugué : un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon covalente au moins une molécule d'un composé cytotoxique ;

• agent de ciblage cellulaire (ou « cell binding agent » en anglais) : une molécule ayant une affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand, d'une protéine, d'un anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou d'anticorps, d'un peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour fonction de diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible biologique. De préférence, l'agent de ciblage n'est pas un aptamère ;

• cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé préférentiellement à la surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette tumeur; ces antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un produit d'oncogène ou de gène « suppresseur de tumeur » muté, une molécule liée à l'angiogénèse, une molécule d'adhésion ;

• linker : un ensemble d'atomes permettant d'attacher de façon covalente un composé cytotoxique à l'agent de ciblage ;

• groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en enlevant un atome d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-butyle, tertio-butyle, pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ;

• groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ;

• groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un hétéroatome (O, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ;

• groupe alcoxy : un groupe -O-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ;

• groupe alcanoyloxy : un groupe -O-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci- dessus ;

• groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute -C _n H _2n -, obtenu en enlevant deux atomes d'hydrogène d'un alcane. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthylène (-CH ₂ -), éthylène (-CH ₂ CH ₂ -), propylène (-CH ₂ CH ₂ CH ₂ -), butylène (-CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ -),

A A ' hexylène (-CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ -) ou les groupes ramifiés suivants ⁿ , ^{/ x} ;

« de préférence, le groupe alkylène est de formule -(CH ₂ ) _n -, n représentant un nombre entier ;

• dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage du type « n allant de 1 à 6 » ou bien « compris entre 1 et 6 » inclut les bornes 1 et 6).

Abréviations utilisées

AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C ₁ -Ci ₂ )alkylène, plus particulièrement (C ₁ -CβJalkylène, plus particulièrement de la forme -(CH ₂ ) _n - n étant un entier de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; aq. : aqueuse ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; CMS : chlorure de

méthanesulfonyle ; crypto désigne le motif de crypto désigne notamment l'un des dérivés de cryptophycine D ₁ -D ₈ décrits plus loin ou un dérivé de cryptophycine d'un exemple ; Rf : facteur de rétention ; DAR : taux de substitution (drug-antibody ratio) ; DBU : 1 ,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ; DCM : dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide ; DIPEA : N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-diméthylaminopyridine ; DME : diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; EEDQ : 2-éthoxy-1- éthoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide ; EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; éq. : équivalent ; Fmoc : fluorénylméthoxycarbonyl ; HOBt : 1-hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazineéthanesulfonique ; mCPBA : acide m-chloroperbenzoïque ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; PA : pression atmosphérique ; PABAC : « para-aminobenzylic alcohol carbonate » ; PR : pression réduite ; SEC : chromatographie d'exclusion stérique ; SPE : extraction sur phase solide ; TA : température ambiante ; TBDMS : tert-butyldiméthylsilyl ; TCEP : chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)-phosphine ; TEA : triéthylamine ; TFA : acide trifluoroacétique ; TIPS : triisopropylsilyl ; THF : tétrahydrofurane ; t _R : temps de rétention.

[Description détaillée de l'invention]

L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) :

dans laquelle :

• Ri représente un atome d'halogène et R ₂ représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C ₁ -C ₄ )alcanoyloxy ;

ou bien R ₁ et R ₂ forment ensemble un motif époxyde ;

• AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;

• R3 représente un groupe (C ₁ -CβJalkyle ;

• R ₄ et R ₅ représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ;

• Rβ et R ₇ représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle ;

• Rs et R ₉ représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle ;

• R ₁ 0 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe -OH, (C ₁ -C ₄ )alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH ₂ , -NH(d-C6)alkyle ou -N(Cr C ₆ )alkyle ₂ ;

• Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (Cr C ₄ )alkyle ;

l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi. positions ortho (o), meta (m) ou para( p) :

Ri représente un atome d'halogène, plus particulièrement Cl. R3 représente un groupe (Cr Cβjalkyle, plus particulièrement Me. Re et R ₇ représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle ; plus particulièrement ils représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe Me. Rs et R ₉ représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Cr Cβjalkyle ; plus particulièrement R ₈ représente H et R ₉ représente isobutyle.

Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H, un groupe OH, (Cr C ₄ )alcoxy, un atome d'halogène. Il peut s'agir aussi d'un groupe -NH ₂ , -NH(C ₁ -C ₆ )alkyle ou - N(C ₁ -C ₆ )alkyle ₂ tel que par exemple -NH ₂ ou -NMe ₂ , de préférence en position 3 ou 4 sur le noyau phényle. Plus particulièrement, le noyau phényle comprend deux substituants en position 3 et 4 sur le noyau phényle. De préférence, il s'agit de 3-CI et 4-méthoxy. Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C ₁ -C ₄ )alkyle ; plus particulièrement H.

Plus particulièrement, on pourra choisir l'un des substituants Ri à Rn parmi ceux décrits dans les exemples. Chaque substituant R ₁ à Rn pourra aussi adopter une des configurations spatiales (par ex. R ou S ou bien Z ou E) telle que décrite dans les exemples.

AA représente un acide aminé naturel ou non naturel. Il peut s'agir d'un acide aminé α, β ou γ. On peut citer notamment les acides aminés suivants : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2- cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), praline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ-aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit) ainsi que les formes protégées desdits acides aminés (par ex. par acétyl, formyl, tosyl, nitro). De préférence, il s'agit d'un acide aminé naturel. Plus particulièrement, il s'agit de la glycine.

Ri et R ₂ peuvent aussi former ensemble un motif époxyde.

L'attachement entre le dérivé de cryptophycine et l'agent de ciblage est réalisé par l'intermédiaire d'un linker L positionné en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR-i; ainsi, le dérivé de cryptophycine apte à la conjugaison a pour formule (II) :

(H) L'attachement au niveau de l'agent de ciblage se situe à l'autre extrémité du linker L au niveau d'un groupe réactif présent sur l'agent de ciblage. Ainsi, L comprend au moins un groupe chimique réactif (GCR1 ) vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent sur l'agent de ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé de formule (II) sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le dérivé de cryptophycine de formule (II) est apte à être conjugué à un agent de ciblage.

Les dérivés de cryptophycine de la présente invention, y compris ceux exemplifiés, peuvent exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides, notamment des acides pharmaceutiquement acceptables.

A titre d'exemples de GCR1 , on peut citer :

(i) le groupe réactif -SZ _a pour lequel Z ₃ représente H ou le groupe -SR ₃ et R ₃ représentant un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, (C ₃ -C ₇ )cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C ₃ -C ₇ )hétérocycloalkyle ;

(ii) le groupe réactif -C(=O)-Z _b R _b pour lequel Z _b représente une liaison simple, -O- ou -NH-, plus particulièrement -O-, et R _b représentant H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle, (C ₃ -C ₇ )cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C ₃ -C ₇ )hétérocycloalkyle ;

(iii) l'un des groupes réactifs suivants : -Cl, -N ₃ , -OH, -NH ₂ , le groupe réactif maléimido ou haloacétamido. avec R ₁₂ représentant H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle, plus particulièrement Me dans le cas des composés de formule (III) :

I

comprenant le groupe G= -(CH ₂ ) _n Y avec Y= -Cl, -N ₃ , -OH, -NH ₂ , avec

Ri ₂ représentant H ou un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, plus particulièrement Me ; ou l

(iv) le groupe réactif maléimido avec Ri ₂ représentant H ou un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, plus particulièrement Me. Plus particulièrement, -SZ _a peut représenter -SH ou -SS(C ₁ -C ₆ )alkyle, notamment -SSMe, ou -

SS-hétéroaryle, notamment ou

(Xi et X ₂ étant définis plus bas). Plus particulièrement, -Z _b R _b peut représenter -OH, -OCH ₃ , -OCH ₂ CH=CH ₂ , //

— ' dans lequel Gl représente au moins un groupe électroinductif tel que -NO ₂ ou -HaI, notamment -F. Il peut s'agir par exemple

des groupes suivants : ^x — ' ou . Un autre type de groupe -C(=O)Z _b R _b est

le suivant : présentent une bonne réactivité.

Plus particulièrement, GCR1 pourra être choisi parmi l'un de ceux décrits dans les exemples. A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes ε-amino des lysines portés par les chaînes latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps, les groupes saccharides de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons disulfures intra-chaînes (Garnett M. C, et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001 , 53, 171-216). Plus récemment d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par mutation (Junutula J. R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou l'introduction d'acides aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf AJ. , et al., Bioconjugate Chem. 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a ; WO 2006/069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (technologie ReCode ^® )). Ces modes d'attachement utilisés avec les anticorps sont applicables à l'ensemble des agents de ciblage connus en fonction de leur structure.

Il est également possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage de façon à introduire de nouveaux groupes chimiques réactifs GCR2. Ainsi, il est bien connu de l'homme du métier comment modifier un anticorps à l'aide d'un agent de modification (voir notamment WO 2005/077090 page 14). La modification permet d'améliorer la réaction de conjugaison et d'utiliser une plus grande variété de groupes GCR1.

Agents de modification permettant d'introduire des groupes disulfures

L'agent de modification peut être un ester activé NHS de formule dans laquelle R représente un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, aryle, hétéroaryle, (C ₃ -C ₇ )cycloalkyle, (C ₃ - C ₇ )hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C ₁ -CβJalkylène ; par exemple, on peut utiliser le N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou le N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB ou ester N-hydroxy-succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque) de façon à introduire des groupes réactifs GCR2 dithiopyridyl (voir Bourdon M.A., et al., Biochem. J. 1978, 173, 723- 737 ; US 5208020) lesquels peuvent ensuite réagir avec un groupe chimique réactif GCR1 de type -SH présent sur le linker du dérivé de cryptophycine afin de former une nouvelle liaison -S- S- (voir ex.9 pour un conjugué présentant une liaison disulfure). Le groupe N-hydroxysuccinimide réagit préférentiellement sur les groupes amino présents sur l'anticorps de façon à former des liaisons amides. Un autre exemple d'agent de modification est décrit dans WO 2004/016801 de

formule ou un analogue pegylé de formule

dans WO 2009/134976 ou un analogue sulfonique

de formule dans WO 2009/134977 dans lesquelles :

- X ₃ , X ₄ , X ₅ , Xe représentent H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle,

- Xi et X ₂ représentent -H, -CONX ₈ Xg, -NO ₂ , Xs et X ₉ représentant H ou un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, - X ₇ représente -Sθ ₃ -M ⁺ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire

- a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à 2000, de préférence entre 1 et 200 ; a et b peuvent prendre toutes les valeurs entre respectivement 0 et 4 ou entre 0 et 2000. Agents de modification permettant d'introduire des groupes maléimido

Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane- 1-carboxylate (SMCC), un composé similaire décrit dans EP 0306943 ou un sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate). On peut citer comme

autres exemples : comme le 3-maléimido-propanoate de N-succinimidyle ; comme le 6-(3-maléimidopropionamido)hexanoate de N-succinimidyle ; b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000, de préférence entre 1 et 200 (b peut prendre toutes les valeurs entre 0 et 2000), comme le 3-(2-{2-[3- maléimido-propionylamino]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-succinimidyle ou SM(PEG) ₂ ; comme le succinate de maléimidoéthyle et de N-succinimidyle ;

comme le 4-(4-maléimidophényl)butanoate de N-succinimidyle ou comme le 3-maléimidobenzoate de N-succinimidyle.

Agents de modification permettant d'introduire des groupes thiols

Un autre exemple d'agent de modification décrit dans WO 90/06774 est de formule dans laquelle :

- HaI représente un atome d'halogène ;

- X ₁₀ représente un atome d'halogène ou le groupe COOXi ₄ , nitro, (C ₁ -C ₈ )alkyle non substitué ou halogène, (C ₁ -C ₈ )alkoxy non substitué ou halogène, (C ₂ -C ₈ )alkényle non substitué ou halogène, (C ₂ -C ₈ ) alkynyle non substitué ou halogène, (C ₃ -C ₈ )cycloalkyle non substitué, aryle non substitué ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome d'halogène, groupe (C ₁ - C ₈ )alkyle non substitué ou halogène, (C ₁ -C ₈ )alkoxy non substitué ou halogène ;

- chacun des Xn, X ₁₂ , X ₁₃ représente indépendamment un atome d'hydrogène ou bien peut représenter X ₃ ;

ou X ₁₀ et X ₁₁ forment ensemble un cycle (C ₂ -C ₅ )alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupe(s) (C ₁ -C ₄ )alkyle ;

ou X _1O ou X ₁₁ forment ensemble avec X- ₁₂ un cycle (C ₁ -C ₅ )alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupes (C ₁ -C ₄ ) alkyle

et X ₁₄ est -H ou un groupe (C ₁ -C ₈ )alkyle. De préférence, HaI représente un atome de chlore ou de brome. On trouvera dans le tableau ci- dessous des possibilités pour X-10-X13 :

Un exemple d'iminothiolane préféré est le suivant :

Agents de modification permettant d'introduire des groupes haloacétamido

Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-iodoacétyl)-aminobenzoate

O

,.0_

/ ^{^} N'

\ 1 "

(SIAB) ^X ° ° , ou des composés similaires parmi lesquels le succinimidyl-N-

O

/— r °

Y °

iodoacétate (SIA) ° , le succinimidyl-N-bromoacétate (SBA), ou le succinimidyl-3-(N- bromoacétamido)propionate (SBAP) ou un composé pegylé similaire décrit dans WO

I il H

7 O Ofb ^

2009/134976 ° ° , b étant tel que décrit précédemment. Les figures 1 et 2 illustrent la modification d'un groupe amino d'un agent de ciblage par le SPDP ou bien par l'iminothiolane préféré ci-dessus.

Ainsi, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 disulfures (-SSR), notamment

— S _^ . — s _^

de type pyridyldisulfures ^{s N} ou ^{s N} , dans le cas où GCR1 représente -SH. De même, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente disulfure (c'est-à-dire GCRI = -SZ _a avec Z _a ≠H, par exemple Dans les deux cas, la liaison covalente qui se forme par

réaction entre GCR1 et GCR2 est une liaison disulfure clivable.

Il est également possible, dans le cas où GCR1 représente -SH, d'introduire à la surface de

l'agent de ciblage des groupes GCR2 de type maléimido ( ) ou haloacétamido (par ex. bromo- ou iodoacétamido Réciproquement, on peut introduire sur l'agent de ciblage

des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente I

. Dans ce cas, la liaison covalente qui se forme par réaction entre GCR1 et

GCR2 est une liaison sulfure non-clivable.

Plus particulièrement dans le cas où GCR1 est du type (iii) ci-dessus, il est possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification adéquat ou d'introduire un/des acide(s) aminé(s) non-naturel(s) afin d'introduire les fonctions GCR2 adéquates. Par exemple,

- avec une fonction -N ₃ : GCR2 peut être un groupe -C≡CH ;

- avec une fonction -OH ou -NH ₂ : GCR2 peut être une fonction acide carboxylique ;

- avec une fonction -Cl : GCR2 peut être un groupe -SH.

Dans le cas où GCR1 représente un groupe réactif maléimido ou haloacétamido avec Ri ₂ représentant H ou (C ₁ -C ₆ )alkyle, plus particulièrement Me, le dérivé de cryptophycine peut être représenté par la formule (lia) ou (Nb) ci-dessous :

(L ^* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L ^* -maléimido ou bien L= -L ^* -haloacétamido) Le dérivé de cryptophycine pourra être, en série C-52 et C-1 , l'un des suivants D ₁ -D ₈ :

ou un motif équivalent décrit dans l'un des exemples. Plus particulièrement, L est en position para du motif CR-i.

Procédé de préparation des dérivés de cryptophycine

Les composés de formule (II) sont préparés selon le Schéma 1 à partir d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) et d'un précurseur de linker (PL) :

Schéma 1

G représente le groupe -CH=CH ₂ , -(CH ₂ ) _n Y ou bien -(C ₁ -Cβjalkylène-Y avec n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant -OH, -SH, -Cl, -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant tel que par exemple le groupe mésylate (OMs) ou tosylate, ou bien Y représentant -N ₃ , -NH ₂ , - COOH, -NR ₁₂ -CH ₂ -C=CH dans lequel Ri ₂ représente H ou un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. Le précurseur de linker PL a pour fonction d'introduire le linker L au niveau du dérivé de cryptophycine après réaction entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL.

HS- ( v ^y K (CH ) > _?

G peut aussi représenter le groupe ^{2 n <} (c'est-à-dire que Y représente le groupe

^~ -^< ) choisi parmi l'un des 9 groupes suivants (R ₁₂ et R' ₁₂ représentent H ou un groupe (C ₁ -C ₆ )alkyle) : (CH ₂ )^ . HS-ALKf

ou -(CH ₂ ) _n -SH

Sur le Schéma 1 , plusieurs étapes et/ou réactions peuvent être nécessaires pour aboutir au dérivé de cryptophycine (II) à partir du dérivé de cryptophycine (III). Ainsi, par exemple, dans le cas où Z ₃ =H, on préfère introduire un linker L pour lequel Z _a =-S(C ₁ -C ₆ )alkyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis à réduire la fonction disulfure -SS(C ₁ -C ₆ )alkyle en fonction thiol -SH. On peut utiliser pour cela par exemple le TCEP : voir à ce propos Burns J.A., et al., J.Org.Chem. 1991 , 56(8), 2648-2650. Cette transformation -SS(C ₁ -C ₆ )alkyle * -SH peut s'appliquer par exemple aux linkers L _1-4 et L ₂ i- ₂₃ du Tableau II.

De même, dans le cas où Z _b R _b = , on peut introduire un linker L pour lequel Z _b R _b =-O- allyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis déprotéger la fonction -COOH et

introduire . La déprotection peut être réalisée par un traitement avec un catalyseur au palladium, par exemple Pd(PPh ₃ ) ₄ en présence d'une aminé « scavenger », par exemple la morpholine ; l'activation peut être réalisée avec le carbonate de N-N'-disuccinimidyle en présence d'une base, par exemple la DIPEA ou avec le NHS en présence d'un agent de couplage, par exemple le DCC. Cette transformation d'un groupe Z _b R _b à un autre groupe Z _b R _b (par ex. -O-allyle

•* ) peut s'appliquer pour obtenir d'autres groupes Z _b R _b , notamment ceux décrits plus haut.

Dans le cas où Ri représente un atome d'halogène et R ₂ un groupe acyle, on préfère préparer d'abord un composé de formule (II) pour lequel R ₂ représente un groupe -OH (une fois le linker introduit), et introduire ensuite le groupe acyle à l'aide du composé acylant correspondant. Les Schémas l' et 1 " illustrent de même la préparation d'un dérivé de cryptophycine comprenant un linker comprenant respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido (L ^* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L ^* -maléimido ou bien L= -L ^* -haloacétamido). ¹ - -Crypto

(Ma)

Schéma 1'

L'— Crypto

(Mb)

Schéma 1" Ces dérivés sont obtenus par réaction entre un dérivé de cryptophycine∞mprenant un linker L' comprenant un groupe amino ou thiol et un agent de modification permettant d'introduire respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido.

Exemples de réactions entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL

• substitution nucléophile entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- (un sel d'aminé peut également convenir) et G=-(CH ₂ ) _n CI ou -(CH ₂ ) _n OMs (voir par ex. Tableau II, PL _1-4 , PL _7a , PL _8- IO, PL21-23) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base, comme par exemple la TEA ou la DIPEA. Voir ex.1 , composé 7 ou ex.15, composé 48 ;

• acylation entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction halogénure de carbamoyle et G=-(CH ₂ ) _n OH (voir par ex. Tableau II, PL ₅ ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la TEA.

Selon une variante, on peut également faire réagir un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- et G=-(CH ₂ ) _n O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) obtenu à partir de G=-(CH ₂ ) _n OH et de p-nitrophénylchloroformate (activation de l'alcool sous forme de carbonate) selon le schéma ci-dessous (Ri ₂ = H ou (C ₁ -C ₆ )alkyle) :

-NHR ₁₂ + crypto-(CH ₂ ) _n O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) -> crypto-(CH ₂ ) _n O-C(=O)-NR ₁₂ -

• l'activation d'un alcool sous forme de carbonate peut aussi être utilisée pour faire réagir un précurseur de linker porteur d'une fonction -OH et G=-(CH ₂ ) _n NH ₂ ou -(CH ₂ ) _n OH pour obtenir respectivement une fonction carbamate (-O-C(=O)-NH-) ou carbonate (-O-C(=O)-O-) selon les schémas respectifs suivants :

-O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) + crypto-(CH ₂ ) _n NH ₂ -> crypto-(CH ₂ ) _n NH-C(=O)-O- -OH + crypto-(CH ₂ ) _n O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) ^ crypto-(CH ₂ ) _n O-C(=O)-O-. (voir par ex. Tableau II, PL _6a- 6b, PL _24-25 )

• estérification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH ₂ ) _n OH (voir par ex. Tableau II, PL _14b ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la DMAP et d'un agent de couplage, par exemple le DCC ;

• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH ₂ ) _n NH ₂ (voir par ex. Tableau II, PL _14a ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ;

• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction -NH ₂ et G=- (CH ₂ ) _n COOH (voir par ex. Tableau II, PL _7c ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; • cycloaddition 1 ,3-dipolaire (appelée aussi chimie « click ») entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction alcyne terminale et G=-(CH ₂ ) _n N ₃ ou bien entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction azide et G=-(CH ₂ ) _n N R ₁₂ -CH ₂ C=CH (voir par ex. Tableau II, PL _15-18 ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire en présence de Cu(I) comme catalyseur (voir à ce propos, sur la cycloaddition de Huisgen : Rostovtsev V.V., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599 ; Tornoe C.W., et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057- 3064) ;

• métathèse entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction éthylénique terminale et G-CH=CH ₂ (voir Tableau II, PL ₁₉ , PL ₂₀ ) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence du catalyseur de Grubbs de 2 ^eme génération (CAS N°246047-72- 3, voir à ce propos, Poeylaut-Palena A.A., et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 2024-2027.

A propos du linker L

Le linker L pourra être choisi parmi l'un des suivants :

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ ) _t (OCH ₂ CH ₂ ) _y (CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Q GCR ₁ ,

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ MOCH ₂ CH ₂ VV-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _U Q GCR ₁ ;

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ ) _t (CR ₁₇ =CR ₁₈ )(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u (OCH ₂ CH ₂ ) _y Q GCR _{1 ,}

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ MOCH ₂ CH ₂ ) _y (CR ₁₇ =CR ₁₈ )(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Q GCR ₁ ,

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-phényl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-furyl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-oxazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-thiazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-thiényl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-imidazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipérazinyl-CO(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ ) _t -pipéridinyl- méthyl-NR ₁₂ -CO(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipéridinyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ , -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipéridinyl-NR ₁₂ -(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ,-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-triazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ , -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-triazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Y' Q GCR ₁ ,

-G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-phényl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-furyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ , -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-oxazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-thiazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-thiényl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-imidazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipérazinyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipéridinyl-(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-pipéridinyl-méthyl-NR ₁₂ -(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ; -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ ) _t -pipéridinyl-NR ₁₂ - (CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ , -G' X (CR ₁₃ R ₁₄ )t-triazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Q GCR ₁ ;

ou

-G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t(OCH ₂ CH ₂ ) _y (CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Q GCR ₁ ,

-G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ MOCH ₂ CH ₂ Vr-(CR ₁₅ R ₁₆ )U Q GCR ₁ ;

-G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ ) _t (CR ₁₇ =CR ₁₈ )(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u (OCH ₂ CH ₂ ) _y Q GCR _{1 ,}

-G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t(OCH ₂ CH ₂ ) _y (CR ₁₇ =CR ₁₈ )(CR ₁₅ R ₁₆ )u Q GCR ₁ ,

-G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t-phényl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; -G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t-furyl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; -G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t-oxazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; -G" Y (CR ₁₃ R ₁₄ )t-thiazolyl-(CR ₁₅ R ₁₆ ) _u Y' Q GCR ₁ ; - G" Y (CRi ₃ Ri4)t-thiényl-(CRi ₅ Ri6)u Y' Q GCRi; -G" Y (CRi ₃ Ri4)t-imidazolyl-(CRi ₅ Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri4)t-pipérazinyl-CO(CR ₁₅ Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ ) _t -pipéιïdinyl-méthyl- NR ₁₂ -CO(CRi ₅ Ri ₆ )U Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri4)t-pipéridinyl-(CRi ₅ Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri4)t-pipéridinyl-NR ₁₂ -(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t~triazolyl-(CRi ₅ Ri6)u Y' Q GCRi _,

-G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-phényl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-furyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi, -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-oxazolyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-thiazolyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-thiényl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri4)t-imidazolyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-pipérazinyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-pipérazinyl-(CRi ₅ Ri6)u Q CCRi ; G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-pipéridinyl-(CRi ₅ Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-pipéridinyl-méthyl-NR ₁₂ -(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )t-pipéridinyl-NR ₁₂ -(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ ) _t -tιïazolyl-

G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH ₂ ) _n - ;

G" représente un groupe -(CH ₂ ) _n - ;

n représente un entier allant de 1 à 6 ;

X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR ₁₂ -, le groupe CO étant attaché à G' ;

Y représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR ₁₂ -, -NR ₁₂ -, -NR ₁₂ CO-, -NR ₁₂ CONR' ₁₂ -, - NR ₁₂ COO- ou -S(0) _q -, l'atome O ou le groupe NR ₁₂ étant attachés à G" ;

Y' représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR ₁₂ -, -NR ₁₂ -, -NR ₁₂ CO-, -NR ₁₂ CONR' ₁₂ -, -

NR ₁₂ COO-, -S(0) _q -, -CO-, -COO-, ou -CONR ₁₂ - ;

R12, R'i2, R13, Ru, R15 et R ₁₆ , R17 et R ₁₈ représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle ;

t, u et y représentent des nombres entiers pouvant aller de O (cas du groupe absent) à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ;

q représente un entier pouvant valoir O, 1 ou 2 ;

Q représente une liaison simple, un groupe (C ₁ -C-ιo)alkylène ou un groupe (OCH ₂ CH ₂ ),, i étant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5.

Dans le cas du linker de formule -G" Y (CRi ₃ Ri ₄ )I(OCH ₂ CH ₂ V Y'-(CRi ₅ Ri ₆ )u Q GCRi, si y vaut O (pas de groupe PEG) et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir O. Plus particulièrement, on exclut les linkers comprenant le motif terminal -NR ₁₂ -C(=O)-O- (Y'=NR ₁₂ ; u=0 ; Q=liaison simple et GCRi=-C(=O)Z _b R _b ). y représente un entier allant de 0 à 20, plus particulièrement de 1 à 20, plus particulièrement encore de 1 à 10, de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. y peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Certains de ces linkers ont été décrits dans les demandes WO 07085930 et WO 09016516.

Le linker L pourra être choisi parmi l'un de ceux de formule (IV) :

dans laquelle :

• (AA) _W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ;

• w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ;

• n représente un entier allant de 1 à 6 ;

• D représente l'un des motifs suivants :

pour lesquels :

R ₁₂ représente H ou un groupe (C ₁ -CβJalkyle ;

R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome

d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C ₁ -C ₄ )alkyle ;

T rattaché à (CH ₂ ) _n représente NR ₁₂ OU O ;

V ₁ représente O, S, NR ₁₂ ;

V ₂ représente CR ₂₂ ou N ;

V ₃ , V ₄ , V ₅ sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR ₂₂ ou N.

Un exemple de D2 est le suivant : AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel, plus particulièrement choisi parmi : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ- aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit).

L'enchaînement (AA) _W a pour formule : dans laquelle R ₂₃ représente un résidu d'un des acides aminés décrits ci- dessus. Des exemples d'enchaînements sont les suivants : Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala- Leu-Ala-Leu.

Les précurseurs de linkers sont ceux comprenant les motifs -OH correspondants :

WO 2005/082023 (voir notamment pages 61-64) décrit comment obtenir certains précurseurs de linkers. Les préparations des précurseurs de linkers PL25 et PL26 décrites ci-après peuvent également être utilisées pour obtenir d'autres précurseurs de linkers similaires comprenant un autre enchaînement (AA) _W .

Le linker L pourra être choisi également parmi l'un de ceux décrits dans le Tableau II ou parmi les composés exemplifiés. Dans toutes les formules de linkers, NR ₁₂ ou NR' ₁₂ représente plus particulièrement NH ou NMe.

Préparation des composés de formule (III)

cas où G=-(CH,) _n QH ou -CH=CH, Br-

P ₇ = co P ₈ = compose de fomule (III) avec

G-CH ₂ CH ₂ OH

Schéma 2

Pi est préparé selon renseignement des demandes WO 98/08505, WO 00/23429 ou WO 00/34252 ainsi que des publications suivantes Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 ; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 ou J. Med. Cftem.1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporées ici par référence). Dans les pages 158-159 de « The isolation, characterization and development of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides : the cryptophycins », Chap.9, in « Anticancer agents from natural products », Taylor&Francis, CRC press book, isbn=0-8493-1863-7 sont donnés les schémas de synthèse permettant de préparer les différents fragments (A, B, C et D) de cryptophycine et d'aboutir à Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 décrit sur les schémas 1-6 la voie d'accès à l'un des dérivés de cryptophycine de la Figure 1 mais ces schémas peuvent s'appliquer à la préparation de Pi en utilisant les réactifs de départ idoines.

Pi permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine à l'aide des étapes détaillées ci-après : Etape (i) : ouverture du cycle époxyde de Pi en milieu acide permettant d'obtenir la fonction diol. On peut utiliser par exemple l'acide perchlorique concentré ;

Etape (ii) : coupure oxydante du diol à l'aide par exemple du periodate de sodium ;

Etape (iii) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;

Etape (iv) : réaction d'époxydation de Corey-Chaykovsky faisant intervenir un sel de sulfonium chiral, par exemple un triflate, en présence d'une base telle que par exemple KOH.

Etape (v) : déprotection de l'éther silylé en utilisant par exemple une solution de fluorure de tétrabutylammonium. Le bromure de 4-(triisopropylsiloxyméthyl)benzyltriphénylphosphonium est obtenu partir du 1- (bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N° 934667-38-6) dont la préparation à partir de 1 ,4-benzènediméthanol (CAS N° 589-29-7, produit commercial) est décrite par Potîer R. G , et ai., Organic Letters 2007, 9(7), 1187-1190. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (C ₁ -C ₄ )alkyle sont obtenus de façon semblable à partir du diol correspondant qui est soit un produit commercial soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir du 1 ,4- benzènediméthanol.

A partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N°135408-73-0), dont la préparation est décrite sur le schéma 4a de EP 0496548 ou en page 83 de l'article de Nevill CR.

Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86, on peut obtenir le bromure de phosphonium correspondant. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (d-

C ₄ )alkyle sont obtenus de façon semblable à partir d'un composé équivalent au composé 1 décrit en page 83 de l'article de Nevill CR. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86 qui est soit un produit commercial, soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir de l'acide p-tolylacétique.

Le trifluorométhanesulfonate de (1 R,4R,5R,6R)-4,7,7-triméthyl-6-(4-vinyl-benzyl)-6-thionia- bicyclo[3.2.1]octane utilisé à l'étape (iv) est obtenu à partir du (1 R,4R,5R)-isothiocineole (voir Aggarwal V. et al., JACS 2010, 732, 1828-1830) dont la préparation à partir du (R)-limonène (CAS N°95327-98-3, produit commercial) est décrite dans cette même référence.

Le bromure de triphényl(p-vinylbenzyl)phosphonium (CAS N°1 18766-51-1 ) est obtenu à partir du dérivé brome correspondant (voir Drefahl G., et al., Chem.Ber. 1961 , 94(8), 2002-2010) dont la préparation à partir de l'alcool 4-vinylbenzylique (CAS N°1074-61-9, produit commercial) est décrite dans l'article de Shimomura O. , ét al., Tetrahedron 2005, 61, 12160-12167.

A partir de P ₇ ou de P ₈ qui sont des composés de formule (III) pour lesquels G=-(CH ₂ ) _n OH, on peut obtenir d'autres composés de formule (III) ayant d'autres groupes G.

Schéma 3

A partir du groupe G-CH ₂ OH, on peut obtenir les groupes G-CH ₂ CI ou -CH ₂ N ₃ : - l'introduction de -Cl peut être réalisée en présence de CMS : voir ex.1 -composé 2 ;

- l'azidation peut être réalisée en présence du diphénylphosphorazide (PhO) ₂ P(=O)N ₃ et d'une base, par exemple le DBU. Le Schéma 3 décrit ces réactions pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. cas où G-(CH ₇ )XOOH

Schéma 4 A partir du groupe G-(CH ₂ ^OH, on peut obtenir le groupe G=-CH ₂ COOH par une oxydation. Le Schéma 4 décrit une double oxydation : 1 ^ere oxydation à l'aide du réactif de Dess-Martin (voir "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; Paquette L. A., Ed.; Wiley: Chichester, UK, 1995, Vol. 7, 4982-4987 ou Boeckman R.K. Jr., et al., JJ. "The Dess-Martin Periodinane" Org. Synth. 2004, 10, 696-702) suivie d'une 2 ^ème oxydation de type Pinnick en présence de 2-méthyl- 2-butène (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981 , 37, 2091-2096). Le Schéma 4 décrit ces réactions pour le cas d'un composé de départ pour lequel n=2 mais il peut s'appliquer également pour n>2.

Schéma 5

A partir du groupe G-CH ₂ N ₃ dont la préparation est décrite dans le Schéma 3, on peut obtenir le groupe G -CH ₂ NH ₂ à l'aide d'une réaction de réduction utilisant une phosphine comme le TCEP. A ce propos, voir : Faucher A.-M. et al., Synthetic Comm 2003, 33, 3503-3511 :

Schéma 5' Selon une variante, à partir du groupe G-CH ₂ OH, on peut obtenir le groupe G-CH ₂ NH ₂ à l'aide d'une réaction de Mitsunobu utilisant la triphénylphosphine et le DEAD. A ce propos, voir : Mitsunobu O., Synthesis 1981 , 1-28 ; Hughes D. L., Org. Reactions 1992, 42, 335-656 ; Hughes D. L., Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Les Schémas 5 et 5' décrivent le cas n=1 mais ils peuvent s'appliquer également pour n>1.

Cas où G≈-fCHpïn-NRip-CHpC≡CH

A partir du groupe G— (CH ₂ ) _n CI, on peut obtenir le groupe G=- (CH ₂ ) _n -NR ₁₂ -CH ₂ -C≡CH à l'aide d'une substitution nucléophile utilisant le composé de formule NHR ₁₂ -CH ₂ -C=CH (Ri ₂ =H : propargylamine ; Ri ₂ =(C ₁ -C ₆ )alkyle : préparé selon Mock W. L., et al., J. Org. Chem. 1989, 54 (22), 5302-8).

Cas où G=-(CH?) _n -SH

Schéma 6

A partir du groupe G=- (CH ₂ ) _n CI, on peut obtenir le groupe G=-(CH ₂ ) _n SH par une fonctionnalisation directe à l'aide de triméthylsilylthiolate de tétrabutylammonium préparé in situ à partir de fluorure de tétrabutylammonium et d'hexaméthyldisilathiane selon Hu J. et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-4961 (voir ex.8). Le Schéma 6 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Au cours de cette réaction, il peut se former le dimère intermédiaire de formule :

Cas où G=-ALK-SH

Schéma 7 P ₃ permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine selon le Schéma 7 :

Etape (i) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;

Etape (ii) : couplage de Kumada utilisant un réactif de Grignard adéquat, par exemple un bromure d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé, en présence d'un catalyseur au palladium ou au nickel (voir par exemple Organic Letters 2009, 11, 5686-5689 ou Synthesis 2009, -/47, 2408-2412).

Les étapes (iii) à (v) sont décrites sur le Schéma 2 et l'étape (vi) sur le Schéma 6.

Le bromure de (4-bromobenzyl)triphénylphosphonium est un produit commercial (CAS N° 51044- 13-4). Les bromures d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé peuvent être préparés à partir des bromoalcools correspondants par protection de la fonction alcool avec le chlorosilane adéquat puis par formation de l'organomagnésien en présence de magnésium dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF (voir par exemple Organic Letters 2005, 7, 183-186). Les bromoalcools, linéaires ou ramifiés comportant 1 à 6 atomes de carbone, sont commercialement disponibles, comme le 3-bromo-1-propanol (CAS N° 627-18-9) ou le 1-bromo- 2-propanol (CAS N° 19686-73-8) ou peuvent être préparés à partir des bromoesters ou bromocétones correspondantes selon des méthodes décrites dans la littérature. Le chlorosilane peut, par exemple, être le tert-butyldiméthylchlorosilane (CAS N°18162-48-6) ou le triisopropyl- chlorosilane (CAS N°13154-24-0).

Cas où G=-(CH2)n-maléimido

Schéma 8

En complément du schéma l' qui décrit une méthode de préparation de dérivés de cryptophycine comprenant un motif maléimido, à partir du groupe G-CH ₂ OH, on peut obtenir le groupe par une réaction de Mitsunobu en présence de triphéhylphosphine et de DEAD selon Matuszak N. et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 7410-7420. Le Schéma 8 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Les Schémas 1-8 ci-dessus sont données pour un linker en position para mais pourraient s'appliquer identiquement pour les positions ortho ou meta. De même, ils sont donnés pour un dérivé de cryptophycine mais pourraient s'appliquer à la préparation d'autres dérivés de formule (II), notamment D ₁ -D ₈ .

Plus particulièrement, dans le cas de la C-52, on pourra utiliser les composés suivants dont les préparations sont décrites dans Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 ou dans WO 9808505 :

5

9 9

D'autre part, à partir du composé 31 b pour lequel G-CH ₂ OH, il est possible d'obtenir les composés pour lesquels G-CH ₂ CI ou -CH ₂ N ₃ :

• G-CH ₂ CI : voir exemple 1 , composé 2 ;

• G-CH ₂ N ₃ : la conversion de -CH ₂ OH en -CH ₂ N ₃ peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de diphénylphosphorazide et d'une base comme le DBU, voir exemple 19, composé 60.

• G=- CH ₂ maléimido : la conversion de -CH ₂ OH en -CH ₂ maléimido peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de maléimide, de triphénylphosphine et de DEAD. L'enseignement de J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 pourrait s'appliquer à d'autres dérivés de cryptophycine comprenant d'autres substituants Rβ-Rg. Préparation des précurseurs de linker PL

PL pourra être l'un des suivants :

Za S ALK N

PL ₁ ^ ^NH préparé selon le schéma ci-dessous :

Etape (i) : activation de l'acide à l'aide de NHS ; l'activation est réalisée à TA en présence d'un agent de couplage comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en solution dans un solvant aprotique anhydre comme le DCM. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 4.

Etape (ii) : amidification avec la pipéridine N-Boc ; le couplage peptidique est réalisé dans un solvant polaire aprotique à TA en présence d'une base, qui peut être une aminé tertiaire comme la TEA ou la DIPEA. Le solvant peut être le DMF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 5.

Etape (iii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 6.

L'acide de départ, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. Voir aussi US 2719170.

PL ₂ préparé selon le schéma ci-dessous :

Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme par exemple le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17.

Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.

L'aldéhyde de départ, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, peut être commercial ou préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.

PL ₃ ^{ZaS ALK} - ^NHR _{12 pr} ép _ar é selon les schémas ci-dessous :

cas où Ri?=H

Etape (i) : formation d'une oxime ; l'aldéhyde précédemment décrit est mis en solution dans un solvant polaire protique comme l'éthanol puis traité par le chlorhydrate de O- méthylhydroxylamine au reflux en présence d'une base comme l'hydroxyde de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11.

Etape (ii) : réduction de l'oxime ; l'oxime est réduite par un traitement au reflux avec une solution de borane diméthylsulfure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 12. cas où R-ι?≠H

Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'un agent réducteur comme par exemple le triacétoxyborohydrure de sodium.

PL ₄ préparé selon le schéma ci-dessous

Ce linker est préparé de façon semblable à ce qui est présenté pour PL ₂ .

Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17. Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.

Etape (i) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.

Etape (ii) : transformation de l'alcool en bromure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le THF par traitement de la fonction alcool avec CBr ₄ en présence d'une phosphine par exemple la triphénylphosphine ; voir à ce propos Appel R. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 801-81 1 ou Desmaris N., ét al., Tetrahedron Letters 2003, 44(41 ), 7589-7591.

Etape (iii) : substitution du bromure par le thioacétate ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DMF en utilisant comme nucléophile le thioacétate de potassium.

Etape (iv) : formation de la liaison disulfure ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire protique anhydre comme le méthanol en présence d'une base comme par exemple le méthanolate de sodium et d'un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure.

Selon une variante :

Etape (v) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.

Etape (vi) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme NaOH.

Etape (vii) : activation du thiol sous forme de pyridyl-disulfure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire protique comme l'éthanol par traitement avec un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure en présence d'un acide comme l'acide acétique.

Etape (viii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane).

Etape (ix) : activation de l'aminé sous forme de chlorure de carbamoyle ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le diphosgène en présence d'une base comme la TEA. p _U RbZb-OC-ALK- (OCH ₂ CH ₂ ), -OH _{préparé se|on |e schéma c} j. _dessous ;

cas où ALK=CH ₉ CH?

voie A:

voie B:

Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.

Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium.

Etape (iii) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

cas où ALK≠CHpCH?

X

Etape (iv) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., ét al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. p _L7 RbZbOC-ALK- (OCH ₂ CH ₂ ),-NHR _{12 préparé se|on} ^ _{schémas ci} . _d esS0US !

cas où R-i? =H

cas où R-i? ≠H

cas où ALK≠CHpCH?

cas où R ₁₇ =H

Tr-^NHR ₁₂

Etape (i) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 42.

Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 43.

Etape (iii) : alkylation de l'atome d'azote ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 15, composé 46.

Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium comme décrit dans WO 2007/127440 ;

Etape (v) : saponification de l'ester ; la réaction est réalisée par réaction de l'ester avec de la lithine en présence d'eau.

Etape (vi) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.

Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3,5,6,10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant.

Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF ₃ .

PL ₈ préparé selon les schémas ci-dessous :

cas où ALK=CH ₉ CH 2

Etape (i) : déprotection du composé de départ à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 50.

Etape (ii) : protection de la fonction acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 51.

Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.

Etape (iv) : réaction entre la fonction mésylate et la fonction aminé du composé H ,

(alkylation) ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 52.

cas où ALK≠ CHpCH?

<" ⁾ ^ ^^ / _^ O X ALK^/^OH

Etape (v) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i= 3 à 12.

PL ₉ préparé selon le schéma ci-dessous :

Etape (i) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme l'acétonitrile avec un halogénoalkylcarboxylate d'allyle comme le bromoacétate d'allyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 38.

Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 39.

L'halogénoalkylcarboxylate d'allyle peut être obtenu à partir de l'alcool allylique et de l'halogénure d'halogénoacyle correspondant et commercialement disponible pour ALK=-(CH ₂ )i- ₆ - (comme le bromure de bromoacétyle ou le chlorure de 4-butanoyle).

PL ₁₀ préparé selon les schémas ci-dessous :

cas où ALK≠ CHpCH?

Etape (i) : ouverture de l'anhydride cyclique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydride comme le DCM en présence d'une base comme la TEA.

Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.

Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane).

Etape (iv) : couplage peptique ; la réaction entre l'acide carboxylique et l'aminé est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'un agent de couplage comme le système DIC / HOBt.

Etape (v) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.

Les diacides monoprotégés sous forme d'ester méthylique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH ₂ )i-6- (comme l'ester monométhylique de l'acide 1 ,6-hexanedioïque).

PL ₁₁ préparé selon les schémas ci-dessous :

cas où ALK=CH ₉ CH?

Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes sont réalisées successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre la fonction aminé et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ d'un agent de couplage comme le DIC. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 17, composé 56.

Etape (ii) : protections de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique et de l'aminé sous forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA.

Etape (iii) : alkylation de l'aminé et saponification de l'ester ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF : alkylation de l'aminé par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle R ₁₂ HaI puis addition de lithine et d'eau. Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i) pour le cas R ₁₂ =H. cas où ALK≠CHpCH?

cas où R ₁₂ =H

HO ΛALK- OV J^^ OJ Tr^ NH,

cas où R ₁₂ ≠H

Z=Br ou I

Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium (cf. WO 2007/127440) ;

Etape (v) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de palladium sur charbon (cf. Wessjohann, L. ét al., Synthesis 1989, 5, 359-63) ; Etape (vi) : protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base∞mme la TEA.

Les amino-PEG-acides sont∞mmercialement disponibles pour i=3, 5, 6, 10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant.

Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF ₃ .

PL ₁₂ ^{z= Br ou} ' préparé selon les schémas ci-dessous :

Voie A :

Voie B :

V- Η: ^z

cas où ALK≠ CH ₇ CH ₇

r O ^ _\ ^>^z

Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.

Etape (ii) : échange mésylate / halogène ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire aprotique comme l'acétone avec un halogénure de sodium comme l'iodure de sodium.

Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.

Etape (iv) : activation de l'acide ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. L'intermédiare formé est hydrolyse sélectivement à pH 5 en hydroxy ester.

Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.

PL _{13 préparé se} | _on \ _{es schém} as ci-dessous :

Voie A :

Voie B :

cas où ALK≠CH?CH ₂

Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction hydroxy peut se former. Il est clivé lors de l'étape suivante (ii).

Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.

Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.

Etape (iv) : formation du thiol libre et saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.

Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol

PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.

Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Le linker avec n = 8 (l'acide 3-[2-mercaptoéthoxy-hepta-(éthylèneoxy)]propionique) est disponible commercialement. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10- trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol

PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.

PL ₁₄ préparé selon le schéma ci-dessous :

cas où ALK=CH ₇ CH ₇

cas où ALK≠CHpCH?

Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction alcool éventuellement présente sur la structure peut se former. Ce trifluoroacétate est clivé lors de l'étape suivante (iii).

Etape (iii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.

Etape (iv) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.

Etape (v) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.

Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol

PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.

Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. ,

PL ₁₅ prépare selon les schémas ci-dessous :

Voie A :

Voie B :

cas ou ALK≠CH _? CH _?

Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkynyle comme le bromure de propargyle ou le 4-bromo-1-butyne. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 63. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 65.

Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 64.

Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.

PL ₁₆ RbZbOc-ALK-(OCH ₂ CH ₂ ), ^{' 3} préparé selon les schémas ci-dessous

cas où ALK≠CHpCH?

Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.

Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à

TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Etape (iv) : élongation de la chaîne hydroxy azido PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate de l'hydroxy azido PEG. Les alcools azido PEG sont commercialement disponibles ou peuvent être préparés à partir des diols PEG correspondants commercialement disponibles pour i=3 à 12. ₁₇ préparé selon le schéma ci-dessous :

Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Les acides porteurs d'un groupement acétylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH ₂ ) _m - avec m=1 à 10 (comme l'acide 3-butynoïque).

PL •18 R ^b z ^b -co-ALK ^' 'préparé selon le schéma ci-dessous

Etape (i) : substitution nucléophile de l'halogénure par l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétone en présence d'azoture de sodium.

Etape (ii) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.

Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à

TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Les esters méthyliques porteurs d'un motif halogénoalkyle sont commercialement disponibles pour ALK = -(CH ₂ J _m - avec m=1 à 6 (comme le bromoacétate de méthyle).

PL ₁₉ prépare selon les schémas ci-dessous :

cas où ALK=CH ₇ CH?

voie A :

voie B :

cas où ALK≠CH _? CH _{? |}

Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkènyle comme le bromure d'allyle ou le 4-bromo-1 -butène.

Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.

Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à

TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.

Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol

PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.

Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.

PL ₂₀ préparé selon le schéma ci-dessous :

Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à

TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Les acides porteurs d'un groupement éthylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-

(CH ₂ Jm- avec m= 1 à 10 (comme l'acide 3-butènoïque).

PL _{21 préparé se|on |es schémas c} i_ _de sS0US :

cas où Ri ? et R'-i ₂ = H Boc Boc

, ₂ ,BBoo i ^, NR' _<9 Boc

I" ¹ " _j .N ^' R' Boo

Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde0 d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé

23.

Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24.

5 Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26.

Etape (iv) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le0 triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 27.

Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 29.

Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.

Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.

Etape (viii) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.

Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'aldéhyde ZaSS-ALK- CHO, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, est commercial ou peut être préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. _{préparé se} | _on , _{es schémas c} i_ _de sS0US :

cas où Ri ?=H et R'i ₂ ≠ H

Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé

23.

Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24.

Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26.

Etape (iv) : couplage peptidique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le diméthylformamide en présence d'agents de couplage comme le système N, N'- diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole et d'une base comme la TEA.

Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 7, composé 32.

Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.

Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.

Etape (viii) : alkylation de l'aminé par amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur.

Etape (ix) : alkylation du groupe NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.

Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'acide carboxylique

ZaS-ALK-C0 ₂ H, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.

PL ₂₃ ZaS-(CH ₂ CH ₂ O) ₁ -CH ₂ CH ₂ -NHR _{12 pr} é _pa ré selon les schémas ci-dessous

Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.

Etape (ii) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.

Etape (iii) : protection du thiol ; la réaction est réalisée dans un mélange de solvants polaires comme un mélange éthanol/eau avec un réactif comportant une fonction méthanethiosulfonate comme le méthyl-méthanethiosulfonate en présence d'une base comme le carbonate de sodium.

Etape (iv) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.

Etape (v) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge∞mme un halogénure d'alkyle.

Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101.

Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.

Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange diméthoxyéthane/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.

Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.

Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.

Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le chlorhydrate d'EDCI.

Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.

Les diacides monoprotégés sous forme d'ester allylique sont commercialement disponibles pour n=2 (succinate de monoallyle) ou peuvent être préparés par transestérification des monoesters méthyliques ou tert-butyliques qui sont commercialement disponibles pour n = 2 à 6.

Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.

Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DME/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.

Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.

Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.

Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à

TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.

Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.

Les diacides PEG monoprotégés sous forme allyle sont préparés selon la description de préparation du linker L ₁₄ .

Le bromoacétate et l'iodoacétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle sont des produits commerciaux dont les numéros CAS sont respectivement 42014-51-7 et 39028-27-8. Tableau

κ>

Procédé de préparation du conjugué

Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à :

(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine de formule (II) ;

(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés.

Plus particulièrement, on ne sépare à l'étape (ii) le conjugué de l'étape (i) que du dérivé de cryptophycine n'ayant pas réagi et des agrégats qui se seraient formés et on laisse dans la solution l'agent de ciblage qui n'aurait éventuellement pas réagi.

La mise en contact a pour fonction de laisser réagir les groupes chimiques GCR1 et GCR2 afin d'assurer l'attachement du dérivé de cryptophycine sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente ; de préférence,

• lorsque GCR1 représente -SZ _a : on modifie l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification de façon à introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 adaptés, notamment ceux décrits dans la 2 ^eme colonne du Tableau I :

o des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente -SH ;

o des groupes chimiques thiol dans le cas où GCR1 représente -SZ _a avec Z _a ≠H ; o des groupes chimiques maléimido ou iodoacétamido dans le cas où GCR1 représente -SH ;

Dans le cas d'un anticorps (MAb), on trouve les formules des conjugués dans la 4 ^eme colonne du Tableau I ;

• lorsque GCR1 représente -C(=O)-Z _b Rb : la réaction a lieu préférentiellement sur les fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes ε-amino portés par les chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps. Dans le cas d'un anticorps (MAb), on obtient dans ce cas un conjugué de formule : MAb-[N H-C(=O)-L ^* -Crypto]d avec L* = fragment d'un linker L comprenant GCR1=-C(=O)-Z _b R _b et tel que L= -L*C(=O)-Z _b R _b ;

• en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -(CH ₂ ) _n Y, l'agent de ciblage comprend des groupes -SH lorsque Y= -Cl, des groupes -C≡CH lorsque Y= -N ₃ ou des groupes acide carboxylique lorsque Y= -OH ou -NH ₂ ;

• en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes chimiques thiols.

On entend par « agrégats » les associations qui peuvent se former entre deux agents de ciblage ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les agrégats sont susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres tels qu'une concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la solution, des forces de cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère hydrophobe, la température (voir les références citées dans l'introduction de J. Membrane Sci. 2008, 318, 31 1-316), l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec précision. Dans le cas des protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, « Protein Aggregation and Bioprocessing » 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être déterminée à l'aide de techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480). La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par exemple de tampons tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2- éthanesulfonique (tampon HEPES) ou un mélange de tampons tel que le tampon A décrit plus loin. Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le dérivé de cryptophycine est mis en solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA.

La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40°C. La durée de la réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'anticorps et le dérivé de cryptophycine peut être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin d'en déterminer l'état d'avancement. Si le taux de substitution est insuffisant, on peut laisser réagir plus longtemps et/ou ajouter du dérivé de cryptophycine. On pourra se reporter à la méthode générale donnée dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières. Des modes particuliers sont décrits dans les exemples 9, 10, 1 1 , 25, 26 ou 27.

L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la séparation de l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie d'affinité, par chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou par HPLC. La purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée.

Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution aqueuse.

Anticorps

L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. « Immunobiology », 5 ^eme édition, 2001 , Garland Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans WO 04043344, WO 08010101 , WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6) ou WO 2010014812. L'anticorps peut être éventuellement modifié à l'aide d'un agent de modification afin de favoriser l'attachement du dérivé de cryptophycine (voir ci-dessus). L'anticorps peut être notamment monoclonal, polyclonal ou multispécifique. Il peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. Il peut s'agir aussi d'un anticorps murin, humain, humanisé ou chimérique. Conjugué

Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dérivés de cryptophycine attachés de façon covalente à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de greffage ou "drug-to- antibody ratio" ou "DAR" en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine ainsi que des conditions opératoires utilisées dans le procédé de conjugaison (par exemple nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine par rapport à l'agent de ciblage, temps de réaction, nature du solvant et de l'éventuel cosolvant). La mise en contact de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine conduit à un mélange comprenant plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des autres par des DAR différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi ; éventuellement des agrégats. Le DAR qui est déterminé sur la solution finale correspond donc à un DAR moyen.

Dans le cas où l'agent de ciblage est un anticorps, la spectroscopie UV peut être une méthode utilisée pour déterminer le DAR. Cette méthode s'inspire de celle présentée dans Antony S.

Dimitrov (ed), LLC, 2009, « Therapeutic Antibodies and Protocols », vol. 525, 445, Springer Science. Elle consiste à mesurer l'absorbance d'une solution de conjugué après l'étape de séparation (ii) à deux longueurs d'onde notées λ1 et λ2. On utilise les coefficients d'extinction molaires suivants de l'anticorps nu et du dérivé de cryptophycine mesurés préalablement à la conjugaison.

Les absorbances de la solution de conjugué à λ1 et λ2 (A _λ1 ) et (A _λ2 ) sont mesurées soit sur le pic correspondant du spectre SEC (ceci permet de calculer un "DAR(SEC)") ou en utilisant un spectrophotomètre UV classique (ceci permet de calculer un "DAR(UV)"). Les absorbances peuvent être exprimées sous la forme :

A _λ1 = (CD x ε _{D λ1} ) + (c _A x ε _{A λ} i)

A _λ2 = (c _D X ε _{D λ2} ) + (c _A X ε _{A λ2} )

équations pour lesquelles :

• CD et CA désignent respectivement les concentrations dans la solution de la partie du conjugué relative au dérivé de cryptophycine et la partie du conjugué relative à l'anticorps ;

• ε _{D λ} i et ε _{D λ2} désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2, coefficients mesurés sur les composés de formule (II) de type SZ _a avec Z _a =-SMe ou de type -C(=O)- Z _b R _b avec Z _b R _b = OMe ou OCH ₂ -CH=CH ₂ ; • ε _{A λ} i et ε _{A %2} désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2.

On entend par anticorps nu, l'anticorps auquel n'est attaché aucun dérivé de cryptophycine, c'est-à-dire l'anticorps avant l'étape de conjugaison.

La résolution de ces deux équations conduit à :

CD = [(ε _{A λ} i x A _λ2 ) - (ε _A χ ₂ x A _λ1 )] / [(ε _{D λ2} x ε _{A λ1} ) - (ε _{A λ2} x ε _{D λ1} )]

c _A = [A _λ i - (c _D x ε _{D λ1} )] / ε _{A λ1}

Le DAR moyen correspond alors à c _D / c _A . Dans le cas des dérivés de cryptophycine, on peut considérer la longueur d'onde λ1= 280 nm et selon la nature du dérivé de cryptophycine, λ2 est choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm. Le DAR(UV) est de préférence supérieur à 0,5, plus particulièrement compris entre 1 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7.

Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de l'agent de ciblage, le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt que des cellules saines.

Ceci permet de diriger le dérivé de cryptophycine dans un environnement proche de celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les publications suivantes qui décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le traitement de cancers : « Antibody- drug conjugates for cancer therapy » Carter PJ. , et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169 ;

« Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs » Chari R., Ace. Chem. Res.

2008, 41, 98-107). Il est possible de traiter des cancers solides ou liquides. Le conjugué peut être utilisé seul ou en combinaison avec au moins un autre anticancéreux.

Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une concentration généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée sous forme de perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de perfusion.

[Exemples]

Méthodes analytiques utilisées

Chromatographie liquide haute pression - Spectrométrie de masse (LCMS)

Méthode A1

L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne XBridge C-is 2,5 μm (3x50 mm) à 70°C avec un débit de 0,9 ml/min, un gradient d'élution (7 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 100% B en 5,3 min ; 5,5 min : 100% B ; 6,3 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Méthode A2

L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ci ₈ 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 50°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 0,8 min ; 1 ,2 min : 100% B ; 1 ,85 min : 100% B ; 1 ,95 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.

Méthode A3

L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ciβ 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 70°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau / 0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile / 0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 1 min ; 1 ,3 min : 100% B ; 1 ,45 min : 100% B ; 1 ,75 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.

Méthode A4

L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 100A 2,6 μm (3 ^χ 50mm) à 45°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (6 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 6% B : 0,8 min ; de 6% à 100% B en 4,1 min ; 4,8 min : 100% B ; 5,0-6,0 min : 6% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.

Méthode A5

L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 2,6 μm (3 ^χ 1000mm) à 50°C avec un débit de 0,8 ml/min, un gradient d'élution (8 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 4% B : 0,15 min ; de 4% à 100% B en 6,85 min ; 7,1 min : 100% B ; 7,4-8,2 min : 4% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Spectrométrie de masse (MS)

Les spectres ont été réalisés par introduction directe sur un appareil WATERS GCTof (introduction directe sans LC).

Chromatographie d'exclusion stérique - Spectrométrie de masse haute résolution (SEC-HRMS) L'analyse peut nécessiter une étape préalable de déglycosylation du conjugué. Celle-ci est réalisée en ajoutant à la solution de conjugué 2% en volume d'une solution d'enzyme PNGase F (préparée en complétant à 100 ml un flacon de 100 unités de lyophilisât d'enzyme N-glycanase avec de l'eau milliQ). La solution est homogénéisée à l'aide du vortex et incubée à 37°C pendant 19 h. L'échantillon dégly∞sylé est prêt à être analysé par SEC-HRMS. L'analyse chromatographique est réalisée sur un appareil Agilent HP1100 et une colonne Waters Biosuite 250 HR SEC 4 μm (4,6x300 mm) à 30°C avec un débit de 0,4 ml/min et une élution isocratique de (A) formiate d'ammonium 25 mM pH=7 / (B) acétonitrile 70/30 de 15 min. La spectrométrie de masse est réalisée sur un appareil Waters QTOF II avec une ionisation électrospray en mode positif. Les spectres de masse sont déconvolués avec le logiciel Waters MaxEnti .

Chromatographie d'exclusion stérique (SEC HPLC)

L'analyse est réalisée sur un appareil Merck Lachrom Elite HPLC avec un détecteur spectrophotométrique L2455 DAD et une colonne Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5μm (7,8x300 mm) avec un débit de 0,5 ml/min et une élution isocratique de 30 min avec un tampon pH=7 contenant 0,2 M de KCI, 0,052 M de KH ₂ PO ₄ , 0,107 M de K ₂ HPO ₄ et 20% en volume d'isopropanol. Résonance magnétique nucléaire ¹ H (RMN)

Les spectres RMN ¹ H ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avance soit DRX-300, DRX- 400, DRX-500 ou DMX-600. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm.

Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas des dérivés de crvptophvcine comprenant un linker L terminé par -SZ ₃

Méthode en deux étapes successives

1 ^èrθ étape

L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl (désigné par tampon A) est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est déposé sur une colonne de filtration sur gel (matrice Sephadexâ„¢ G25, GE Healthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA. L'anticorps modifié est élue avec le tampon HEPES pH=8, collecté puis dosé par spectrométrie UV afin de déterminer la concentration en anticorps de l'échantillon ainsi que le nombre de groupements pyridyldisulfures. Un prélèvement de l'anticorps modifié est traité avec le dithiothréitol afin de réduire la liaison disulfure, la pyridine-2-thione libérée est dosée par spectrométrie (coefficients d'extinction : ε _{343 nm} : 8080 M ^-1 cm ^-1 , ε ₂₈ o _nm : 5100 M ^-1 crτï ¹ pour la pyridine-2-thione, et ε ₂₈ o _nm : 208380 M ^-1 cm ^-1 pour l'anticorps). En moyenne, de 3 à 6 groupements pyridyldisulfures sont greffés par molécule d'anticorps.

2 ^èmθ étape La solution d'anticorps modifié de la 1 ^ere étape est diluée dans le tampon aqueux pH=8 décrit ci- dessus puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (5 éq.) de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre de molécules de pyridyldisulfures introduites lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, - 10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.

Méthode en deux étapes « one-pot »

L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl est diluée avec le tampon phosphate pH=6,5 et une solution aq. d'HEPES 1 N de telle sorte que la proportion finale de tampon phosphate initial pH=6,5 et d'HEPES soit de 96/4 afin d'obtenir un pH≈7,5-8. Cette solution d'anticorps est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. La solution d'anticorps ainsi modifié est directement diluée avec un mélange 96/4 de tampon phosphate pH=6,5 et d'HEPES puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (4 éq.) dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre d'équivalents d'ester activé NHS introduits lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.

Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas de dérivés de crvptophvcine comprenant un linker terminé par -C(=O)Z _h R _h

Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA ou étant composé d'un mélange 96/4 d'un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl / HEPES 1 N est traitée avec un excès d'une solution dans le DMA du dérivé de cryptophycine de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20%. La réaction est poursuivie pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage de cytotoxique sur la population d'anticorps monomériques. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice SephadexTM G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10 ou colonne Hiprep 26/10 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le taux de greffage. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.

Les méthodes décrites pour le cas de l'anticorps hu2H11 pourraient s'appliquer aussi de façon semblable à d'autres anticorps, ainsi qu'à d'autres agents de ciblage.

Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylmét hyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

Composé 2 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[ (R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranylj-éthylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl -i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS- ène-2,5,9,12-tétraone

1 2

Le composé 1 (30 mg ; 42,9 μmol, préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DMF anhydre (2 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la TEA (107 μmol) puis du CMS (64,6 μmol). Après 15 min, le bain est retiré et l'agitation est poursuivie 12 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (2 ml) et la phase organique est lavée par de l'eau (2x1 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO ₃ (1 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (1 ml). La phase organique est séchée sur MgSO ₄ et, après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 2 est obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise (25 mg ; 81 %). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,77 - 0,83 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,04 - 1 ,07 (m, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,29 - 1 ,36 (m, 1 H) ; 1 ,54 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 - 1 ,87 (m, 1 H) ; 2,24 - 2,33 (m, 1 H) ; 2,63 - 2,73 (m, 2 H) ; 2,96 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,28 - 3,32 (m, 1 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,93 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=11 ,3, 8,0, 3,6 Hz, 1 H) ; 4,78 (s, 2 H) ; 4,93 (dd, J=9,6, 3,6 Hz, 1 H) ; 5,13 (dd, J=10,8, 5,1 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,8 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=15,0, 11 ,2, 3,7 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8.5, 1 ,9 Hz, 1 H) ; 7.23 (d, J=9,6 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,47 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 713 [M + H] ⁺ ; m/z = 715 [M - H] ^" ; t _R = 5, 17 min.

Composé 4 : 4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

3 4

A une solution, purgée à l'argon, du composé 3 (3,05 g, 15,7 mmol, préparé selon WO 2007085930) dans le DCM (30 ml) sont successivement ajoutés le NHS (17,3 mmol) et le chlorure d'EDCI (17,3 mmol). Le mélange est agité 3 h à TA avant d'être lavé avec un tampon phosphate pH=6 (2x30 ml) puis avec une solution saturée de NaCl (30 ml), séché sur MgSO ₄ et concentré à sec. L'huile ambrée obtenue qui cristallise est lavée par un mélange heptane/AcOEt

75/25 et filtrée sur un verre fritte pour donner le composé 4 sous la forme d'un solide blanc (2,08 g, 45%). Le filtrat est concentré à sec et le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 50/50 à 0/100. Les fractions contenant le produit attendu sont concentrées à sec et reprises dans de l'éther isopropylique (5 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 4 attendu (1 g, 22%). RMN ¹ H (400

MHz, DMSO-d6): 1 ,29 (s, 6 H) ; 1 ,92 à 1 ,98 (m, 2 H) ; 2,41 (s, 3 H) ; 2,72 à 2,78 (m, 2 H) ; 2,81 (s, 4 H). LCMS (A4) : El, m/z = 291 [M + H] ⁺ .

Composé 5 : 4-(4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-piperazine-1-car boxylate de fert-butyle

Dans un tube Wheatton sont chargés le composé 4 (200 mg, 686 μmol), la 1-Boc-pipérazine (686 μmol), la TEA (755 μmol) et le DMF (1 ,6 ml). Le mélange est agité à TA pendant la nuit puis dilué avec de TAcOEt (5 ml), lavé avec de l'eau (2x5 ml), séché sur MgSO ₄ et concentré à sec. Le brut est repris dans de l'éther isopropylique (3 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 5 (213 g, 86%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,41 (s, 9 H) ; 1 ,73 à 1 ,87

(m, 2 H) ; 2,34 à 2,41 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 3,23 à 3,36 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,39 à 3,45 (m, 4 H). LCMS (A2) : ES m/z = 363 [M + H] ⁺ ; m/z = 307 [M + H - C ₄ H ₈ ] ^" ; t _R = 1 ,08 min.

Composé 6 : Chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one

A une solution du composé 5 (213 mg, 588 μmol) dans le dioxane (4,4 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (4,4 ml). L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane (2 ml) puis de l'éther isopropylique (2 ml) pour donner le composé 6 (132 mg, 75%) sous la forme d'un solide crème. RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,73 à 1 ,85 (m, 2 H) ; 2,37 à 2,45 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3H) ; 2,98 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,62 à 3,73 (m, 4H) ; 9,39 (m étalé, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 263 [M + H] ⁺ ; t _R = 2,40 min.

Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16-[(S)-1-

((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl )-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

Le composé 1 (20,3 mg ; 29,0 μmol) est placé en solution dans le DMF anhydre (0,77 ml) et la TEA (72,6 μmol) puis le CMS (43,6 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé et la TEA (58,0 μmol) puis le chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin- 1-yl-pentan-1-one 6 (34,8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant d'être dilué par de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO ₃ (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 98/2. Un solide blanc, 7, est obtenu (5,7 mg ; 21 %). CCM (DCM 90/MeOH 10): Rf=0,6 ; RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5,15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 11 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) ; LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H] ⁺ ; m/z = 941 [M - H] ^" ; t _R = 4,03 min.

Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin -1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

Le produit 7 (9,6 mg ; 10,2 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,2 ml) / eau (1 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (25,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 5 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (1 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit final, Ex1 , est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,5 mg ; 71 %). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 1 H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; LCMS (A2) : ES m/z = 897 [M + H] ⁺ ; m/z = 895 [M - H] ^" ; t _R = 0,97 min.

Exemple 2 : (E)-(3S,6R,1 OR, 16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 - ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin -1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-6-méthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9,12-tétraone

Composé 9 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)- 1-[(R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranyll-éthylJ-S-isobutyl-δ-méthyl-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-ène- 2,5,9, 12-tétraone

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Le composé 8 (49 mg ; 71 ,4 μmol, qui peut être préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem.

2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (5 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la DIPEA (428 μmol) puis du CMS (214 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie 40 h à TA. Le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau, la phase aq. extraite par du DCM (3*5 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 100/0 à 90/10. Le composé 9 est obtenu sous forme d'un solide blanc (37 mg ; 79%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO- d ₆ ): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,54 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,78 (m, 3 H) ; 2,97 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 8,2 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,77 (s, 2 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,7 et 9,1 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,45 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 703 [M + H] ⁺ ; m/z = 701 [M - H] ^" ; m/z = 747 [M - H + HCO ₂ H] ^" pic de base ; t _R = 1 ,17 min. Composé 10 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobut yl-6-méthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl) -pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

Le composé 9 (36,6 mg ; 52 μmol) est placé en solution dans l'acétonitrile anhydre (3 ml) puis sont successivement ajoutés la DIPEA (260 μmol) et le composé 6 (156 μmol). Le milieu réactionnel est agité 20 h à TA puis hydrolyse par addition de 4 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec de TAcOEt (3*4 ml), les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCO ₃ (5 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 10 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (39 mg ; 80%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,75 à 1 ,84 (m, 3 H) ; 2,26 à 2,37 (m, 7 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,61 à 2,77 (m, 3 H) ; 2,96 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=4,0 et 8,1 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,6 et 5,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,6 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,2 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 929 [M + H] ⁺ ; m/z = 927 [M - H] ^" ; m/z = 973 [M - H + HCO ₂ H]- pic de base ; t _R = 0,99 min. Exemple 2 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobut yl-6-méthyl-16-[(S)-1-

((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipéra zin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-

1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone

Le produit 10 (34 mg ; 36,6 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (4,3 ml) / eau (3,6 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (146 μmol) est ensuite additionné, le mélange devient incolore et est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (20 ml). La phase aq. est extraite par 2x20 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées et lavées avec une solution saturée de NaCl (20 ml). Après séchage sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 98/2 à 90/10. Le composé Ex2 est obtenu sous forme d'un solide blanc (28,2 mg ; 87%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,79 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,27 (m, 1 H) ; 1 ,31 (s, 6 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,59 (m, 1 H) ; 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,24 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,34 à 2,44 (m, 4 H) ; 2,62 à 2,76 (m, 4 H) ; 2,98 à 3,04 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,46 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,7 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=2,0 et 5,3 et 11 ,1 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=2,0 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,9 et 9,3 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 883 [M + H] ⁺ ; m/z = 881 [M - H] ^" ; t _R = 0,92 min. Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)- 3-{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-o xiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

Composé 11 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propionaldéhyde O-méthyl-oxime

5 g (33,3 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 50 ml d'éthanol, sous atmosphère inerte. Sont successivement ajoutés une suspension de 5,56 g (66,54 mmol) de chlorure d'O-méthylhydroxylamine dans 50 ml d'éthanol puis 6,65 ml (66,54 mmol) de NaOH. Le mélange, blanc trouble, est chauffé au reflux pendant la nuit. Après retour à TA, le mélange est versé dans 500 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec l'AcOEt (3x175 ml), les phases organiques rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (200 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le composé 11 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (5,89 g, 32,9 mmol).

Composé 12 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine

Dans un ballon purgé à l'argon, sont successivement introduits, à TA, 1 ,78 g (9,9 mmol) d'éther d'oxime 11 , 19 ml de THF anhydre et 99,5 ml d'une solution 2M de borane méthylsulfure dans le THF. Le mélange est chauffé 16 h au reflux. La réaction est ensuite arrêtée, le mélange laissé revenir à TA avant que 100 ml de MeOH soient ajoutés goutte à goutte prudemment, à 0°C tant que la mousse se forme puis à TA. Le mélange est évaporé sous PR pour donner environ 2,8 g d'une huile jaune qui est reprise dans 30 ml d'une solution HCl 5 à 6N dans l'isopropanol. Le mélange est porté au reflux 1 h puis laissé à TA pendant la nuit. Après évaporation sous PR, le résidu obtenu est repris avec 80 ml de HCl 1 N puis extrait avec le diéthyle éther (3*20 ml). La phase aq. est traitée avec de l'ammoniaque aqueux à 30% jusqu'à obtention d'un pH de 12,5-13, ie 12 ml (phase aq. violet pâle) puis à nouveau extraite avec 3*20 ml d'éther. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO ₄ , filtrées et évaporées à sec sous PR pour donner 760 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 12 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (301 mg, 20%). LCMS (A2) : ES m/z = 152 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,27 min. Composé 13 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R, 3R)- 3-{4-[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-méthyl]-p henyl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone

A une solution, purgée à l'argon, de 25 mg (35 μmol) du composé 2 dans 3,1 ml de DMF anhydre sont successivement ajoutés, à TA, 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) du composé 12. L'agitation est poursuivie sous agitation à 40°C. Après 72 h de réaction, il reste du composé 2 de départ, sont alors ajoutés 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12. Après 72h supplémentaires à 40°C, il reste encore du composé 2 : 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12 sont ajoutés et l'agitation poursuivie à 40°C. Un jour plus tard, la réaction est complète. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 2x10 ml d'eau, 10 ml d'une solution saturée de NaHCOs et 10 ml d'une solution saturée de NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , celle- ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 30 mg de brut. Ce résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 93/7. Le composé 13 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (23,3 mg, 81 %). CCM (DCM 90/ MeOH 10) : Rf=0,55 ; RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 à 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,07 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 7 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,06 (s large, 1 H) ; 2,25 à 2,34 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 3 H) ; 2,57 (s, 2 H) ; 2,66 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,97 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,33 à 3,38 (m, 1 H) ; 3,75 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,82 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,30 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,35 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 832 [M + H] ⁺ ; m/z = 830 [M - H] ^" ; t _R = 0,96 min.

Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxi ranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa- 8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone

Le produit 13 (10,6 mg ; 12,8 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,5 ml) / eau (1 ,26 ml). Le TCEP (9,1 mg, 31 ,9 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h 30 à TA. Le mélange est dilué dans 15 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (5 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 92/8. Le composé Ex3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,4 mg ; 63%). CCM (DCM 90/MeOH 10) : Rf=0,47 ; RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,80 à 0,86 (m, 6 H) ; 1 ,06 (s, 3 H) ; 1 ,1 1 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,18 (s, 3 H) ; 1 ,31 à 1 ,38 (m, 7 H) ; 1 ,57 à 1 ,67 (m, 2 H) ; 1 ,87 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,29 à 2,38 (m, 1 H) ; 2,56 (s, 2 H) ; 2,70 à 2,80 (m, 2 H) ; 3,00 à 3,1 1 (m, 3 H) ; 3,39 à 3,43 (m, 1 H) ; 3,82 (s, 2 H) ; 3,87 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,31 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,97 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,17 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,86 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,54 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,1 1 (d, J=8,7 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=1 ,9 et 8,7 Hz, 1 H) ; 7,27 (dd, J=2,7 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 7,34 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,42 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 786 [M + H] ⁺ ; m/z = 784 [M - Hf ; t _R = 0,92 min. Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[({2-mercapto-2-méthyl-propyl}-méthyl-amino)-méthyl] -phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

Composé 14 : Méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-prop-(E)-ylidène]-am ine

1 g (6,66 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 10 ml de THF anhydre, sous atmosphère inerte. La solution de méthylamine 2M dans le THF (33,3 ml, 66,6 mmol) est ajoutée puis le mélange est agité 5 h à TA. Il est dilué dans 50 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le composé 14 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (1 ,01 g, 93%). RMN ¹ H (400 MHz, chloroforme-d): 1 ,46 (s, 6 H) ; 2,36 (s, 3 H) ; 3,32 (s, 3 H) ; 7,52 (s, 1 H).

Composé 15 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine

Une solution du composé 14 (1 ,01 g, 6,185 mmol) dans 30 ml de THF est purgée à l'argon et refroidie à 0°C avant que soit ajouté, à 0°C, 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 15 h à TA: il reste de l'imine de départ ; 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 354 μl (6,185 mmol) d'acide acétique sont ajoutés à 0°C puis l'agitation poursuivie à TA pendant 3 h. Le mélange est dilué dans 50 ml d'AcOEt et lavé avec de l'eau (50 ml). Le pH de la phase aq. est ajusté à 12 environ par ajout de 14 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis elle est extraite avec de l'éther diéthylique (3 ^χ 50 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (50 ml), séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le composé 15 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (695 mg, 68%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,47 (m étalé, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 166 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,28 min. Composé 16 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-{(S)-1-[(2R,3R)- 3-(4-{[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-méthyl-amino] -méthyl}-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

Le∞mposé 16 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 15 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30.

Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-

(4-{[(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyl }-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-

1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

L'exemple 4 peut être obtenu en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6 au composé 16.

Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl ]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

Composé 17 : 4-(2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine-1-carbo xylate de fert-butyle

A une solution, purgée à l'argon, de 1-Boc-pipérazine (1 ,0 g, 5,37 mmol) dans le THF anhydre (20 ml) sont ajoutés le 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol). Le mélange est agité 20 min à TA puis un nouvel ajout de 2-(méthyldithio)- isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol) est réalisé. L'agitation est poursuivie 2 h puis 12 ml d'éthanol sont ajoutés et l'agitation poursuivie 5 min. Sont ajoutés du cyanoborohydrure de sodium (5,37 mmol), le mélange est agité 1 h avant que soient ajoutées 5,37 mmoles supplémentaires de cyanoborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 1 h. Le mélange est concentré à sec puis repris dans TAcOEt. De l'eau est ajoutée entraînant la formation d'un précipité qui est filtré sur verre fritte, rincé avec de TAcOEt et de l'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans une solution aq. HCl 1 N (50 ml), le milieu est neutralisé avec une solution aq. NaOH 5N puis extrait au DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO ₄ , filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Le composé 17 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (650 mg ; 40%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,42 (s, 2H) ; 2,44 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,27 (m partiellement masqué, 4 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 321 [M + H] ⁺ ; m/z = 265 pic de base ; t _R = 3,02 min.

Composé 18 : Chlorhydrate de 1-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine

A une solution du composé 17 (322 mg, 1 ,01 mmol) dans le dioxane (13 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (5 ml). L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane pour donner le composé 18 (231 mg, 90%) sous la forme d'une poudre blanche. RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,31 (s large, 6 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 2,59 à 3,38 (m très étalé, 10 H) ; 8,78 (m étalé, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 221 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,46 min.

Composé 19 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pi pérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (15,02 mg, 20,93 μmol) dans le DMF anhydre (0,9 ml) est ajoutée une solution du composé 18 (25,12 μmol) et de TEA (52,3 μmol) dans le DMF (1 ml). Le mélange est agité à 40°C sous argon. Après 24 h, 25,12 μmol du composé 18 et 31 ,4 μmol de TEA sont ajoutés. Après 24 h supplémentaires à 40°C, la réaction est terminée. Le mélange est dilué avec de TAcOEt (6 ml) et lavée avec de l'eau (2x6 ml), une solution saturée de NaHCO ₃ (6 ml) et une solution saturée de NaCl (6 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 46 mg de brut. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 19 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (5,2 mg, 28%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 1 H) ; 2,23 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,41 (s, 2 H) ; 2,53 à 2,56 (m, 4 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 7,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,8 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,07 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 901 [M + H] ⁺ ; m/z = 451 pic de base ; t _R = 4,33 min.

Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]- phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone

Le produit 19 (5,7 mg ; 6,3 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (0,8 ml) / eau (0,5 ml). Le TCEP (4,54 mg, 15,83 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 1 h à TA. Le mélange est dilué dans 7 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (7 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé Ex5 est obtenu sous forme d'un solide blanc (2,95 mg ; 55%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,29 à 1 ,34 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 2 H) ; 2,39 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,57 à 2,62 (m, 4 H) ; 2,65 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,96 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m, partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,36 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 855 [M + H] ⁺ ; m/z = 428 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; t _R = 4, 13 min.

Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]am ino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6 -diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

Composé 20 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyle

A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 5 g (25,74 mmol) de tetraéthylèneglycol dans 68,7 ml de DCM sont successivement ajoutés, par portion afin de maintenir une agitation convenable, 8,95 g (38,61 mmol) d'oxyde d'argent et 5,40 g (28,31 mmol) de chlorure de tosyle. 855 mg (5,15 mmol) de Kl sont ajoutés par petites portions afin de maintenir la température du mélange inférieure à 5°C. L'agitation est poursuivie 1 h en maintenant la température inférieure à 5°C. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel, le résidu est rincé au DCM puis le filtrat concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé 20 est obtenu sous forme d'une huile incolore (5,4 g, 60%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 2,43 (s, 3 H) ; 3,40 (m, 2 H) ; 3,44 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,11 (m, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=8,3 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 349 [M + H] ⁺ ; m/z = 371 [M + Na] ⁺ ; t _R = 0,69 min. Composé 21 : 1-Azido-3,6-9-trioxaundecane-11-ol

A une solution de 5,4 g (15,51 mmol) du composé 20 dans 40,6 ml d'acétonitrile anhydre sont ajoutés 1 ,34 g (20,63 mmol) deNaN ₃ puis le mélange est chauffé 6 h 30 au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Il reste du composé 20 de départ : le brut est repris dans 25 ml d'acétonitrile anhydre et 230 mg (3,5 mmol) de NaN ₃ sont ajoutés. Le mélange est chauffé au reflux pendant 5 h. Après retour à TA, il est filtré sur Clarcel et concentré à sec sous PR pour donner le composé 21 sous la forme d'une huile jaune pâle (3,37 g, 99%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 3,37 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,45 à 3,58 (m, 10 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 4,54 (t, J=5,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 220 [M + H] ⁺ ; m/z = 242 [M + Na] ⁺ pic de base ; t _R = 0,39 min.

Composé 22 : N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthoxy-éthanol

A une solution, inertée à l'argon, de 320 mg de palladium sur charbon 10% dans 5 ml d'AcOEt est ajoutée une solution de 3,25 g (14,8 mmol) du composé 21 , 6,46 g (29,6 mmol) de dicarbonate de fert-butyle et 4,13 ml (29,6 mmol) de TEA dans 45 ml d'AcOEt. La réaction est réalisée 17 h à 30°C sous une pression d'hydrogène de 2 bars. Après retour à TA et PA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 22 est obtenu sous forme d'une huile incolore (2,92 g, 67%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,42 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,53 (m, 10 H) ; 4,54 (t large, J=5,1 Hz, 1 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 316 [M + Na] ⁺ ; m/z = 194 pic de base ; t _R = 2,81 min.

Composé 23 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]- éthoxy}-éthyle

A une solution, purgée à l'argon, de 3,06 g (10,42 mmol) du composé 22 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 2,53 ml (31 ,26 mmol) de pyridine. Le mélange est refroidi à 0°C puis une solution de 2,98 g (15,63 mmol) de chlorure de tosyle dans 10 ml de DCM est ajoutée goutte à goutte. L'agitation est poursuivie 15 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml de DCM, lavé avec une solution saturée de NaHCOβ (30 ml), de l'eau (2x30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 23 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (4,38 g, 94%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 3,05 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,46 (m, 8 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,10 (m, 2 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=7,8 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 448 [M + H] ⁺ ; m/z = 470 [M + Na] ⁺ ; m/z = 348 pic de base ; m/z = 492 [M - H + HCO ₂ H]- ; t _R = 1 ,00 min.

Composé 24 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-carbama te de fert-butyle

A une solution de 4,38 g (9,79 mmol) du composé 23 dans 25 ml d'acétonitrile sont ajoutés 846 mg (13,02 mmol) d'azoture de sodium puis le mélange est chauffé 6 h au reflux. Il reste du composé de départ en proportion importante : après retour à TA, 1 ,7 g (26,13 mmol) sont ajoutés au mélange. L'agitation est maintenue 24 h au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 24 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (2,16 g, 69%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,34 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,46 à 3,58 (m, 8 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 341 [M + Na] ⁺ ; t _R = 0,81 min. Composé 25 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl -carbamate de tert-butyle

A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 2,06 g (6,47 mmol) du composé 24 dans

25 ml de THF anhydre sont successivement ajoutés, à 0°C, 854 mg (21 ,35 mmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale (par portion) et 886 μl (14,23 mmol) d'iodure de méthyle.

L'agitation est poursuivie 1 h à 0°C puis 16 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel, lavé avec du

THF et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 25 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,67 g, 78%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t partiellement masqué,J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,38 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 10 H) ;

3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H).

Composé 26 : (2-{2-[2-(2-Amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl -carbamate de fert-butyle

A une solution, purgée à l'argon, de 1 ,66 g (4,99 mmol) du composé 25 dans 20 ml de THF sont successivement ajoutés 1 ,31 g (4,994 mmol) de triphénylphosphine et 108 μl (5,99 mmol) d'eau. L'agitation est poursuivie 25h30 puis le mélange est concentré à sec et purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 26 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,23 g, 80%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,65 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,56 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 307 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,49 min.

Composé 27 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylami no)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de fert-butyle

A une solution, purgée à l'argon, de 131 mg (426 μmol) du composé 26 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 64 mg (426 μmol) de 2-méthyldithio-isobutyraldéhyde, 126 mg (596 μmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 24,4 μl (426 μmol) d'acide acétique. L'agitation est poursuivie 6 h à TA sous Ar, la réaction est quenchée par addition de 1 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis le mélange est extrait avec 10 ml d'éther diéthylique. Après concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/isopropanol 90/10 qui ne permet pas de séparer l'attendu de l'aminé résiduelle de départ. Le produit obtenu est à nouveau purifié par chromatographie sur phase inverse RP18 en utilisant comme éluant un mélange eau/acétonitrile 95/5 à 5/95. le composé 27 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (67 mg, 36%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,58 (m étalé, 1 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,59 (s, 2 H) ; 2,68 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,46 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,54 (m, 12 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 441 [M + H] ⁺ ; t _R = 3,29 min. Composé 28 : Méthyl-{2-[2-(2-{2-[méthyl-(2-méhyl-2-méthyldisulfanyl-p ropyl)-amino]-éthoxy}- éthoxy)-éthoxy]-éthyl}-carbamate de fert-butyle

A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 65 mg (148 μmol) du composé 27 dans 1 ml de DCM sont successivement ajoutés 19,5 mg (487 μmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale et 20 μl (325 μmol) d'iodure de méthyle. L'agitation est poursuivie 45 min à 0°C puis 72 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel puis concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluent un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (43 mg, 64%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,54 (m, 2 H) ; 2,61 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,42 à 3,54 (m, 14 H). LCMS (A2) : ES m/z = 455 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,77 min.

Composé 29 : Méthyl-(2-{2-[2-(2-méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}- éthyl)-(2-méthyl-2-méthyl- disulfanyl-propyl)-amine

A une solution de 43 mg (95 μmol) du composé 28 dans 1 ,5 ml de DCM sont ajoutés 351 μl de TFA. L'agitation est poursuivie 5 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 29 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (25 mg, 75%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,75 (m étalé, 1 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H) ; 2,57 à 2,64 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,46 à 3,55 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 355 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,30 min.

Composé 30 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-pr opyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6 -diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

A une solution, purgée à l'argon, de 15,3 mg (21 ,3 μmol) de composé 2 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 18,6 μl (106,6 μmol) de DIPEA et une solution de 22,7 mg (64 μmol) du composé 29 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre. L'agitation est poursuivie 24 h sous Ar à 40°C. Après retour à TA, le mélange est dilué avec 7 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2 x 3 ml), une solution saturée de NaHCOs (3 ml), une solution saturée de NaCl (3 ml) et séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 90/10. Le composé 30 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (14,6 mg, 66%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,45 à 2,54 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,60 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 11 ,7 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 , 5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,5 et 1 1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,33 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1035 [M + H] ⁺ ; m/z = 518 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; t _R = 0,86 min.

Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amin o-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6 -diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

A une solution de 10,9 mg (10,5 μmol) du composé 30 dans 1 ,24 ml d'éthanol est ajoutée une solution de 12,06 mg (42,1 μmol) de TCEP dans 1 ,04 ml d'eau. L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est dilué avec 6 ml d'AcOEt, lavé avec un mélange 1/1 eau/NH ₄ Cl _sat (6 ml), une solution saturée de NaCl (6 ml) et séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utlisant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé Ex6 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (7,36 mg, 71 %). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,34 (s, 3 H) ; 2,44 (s, 2 H) ; 2,51 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,60 (s, 1 H) ; 2,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,66 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,55 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,6 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 989 [M + H] ⁺ ; m/z = 495 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; t _R = 3,24 min.

Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylam ino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6 -diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

H

.-CL _/ N _^ I ^ ⁾ O^ O„ HN^

HS O

y N N O

/ H

Composé 31 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl amino)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de tert-butyle

270 mg (649 μmol) du composé 4, 199 mg (649 μmol) du composé 26 sont dissous dans 1 ,5 ml de DMF puis 100 μl (714 μmol) de TEA sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est dilué avec 10 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2x5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 31 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (251 mg, 80%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,16 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,18 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,54 (m, 12 H) ; 7,88 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H] ⁺ ; m/z = 505 [M + Na] ⁺ ; m/z = 527 [M - H + HCO ₂ H]- ; t _R = 1 ,04 min.

Composé 32 : N-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl )-4-méthyl-4-méthyl- disulfanyl-pentamide O 31 O 32 °

A une solution de 251 mg (520 μmol) du composé 31 dans 8 ml de DCM sont ajoutés 1 ,93 ml (26 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est dissout dans le minimum de DCM puis plusieurs entraînements au toluène sont réalisés. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 32 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (159 mg, 80%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-Cy ₆ ): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,15 (m, 2 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,58 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,18 (q, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,54 (m, 8 H) ; 7,89 (t large, J=5,7 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 383 [M + H] ⁺ ; t _R = 2,68 min. Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamin o-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6 -diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone

L'exemple 7 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 32 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30 puis par réduction du disulfure en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6.

Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-{(S)-1 -[(2R,3R)- 3-(4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthy l-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone

Composé 33 : dimère de l'exemple 8

Le composé 2 (24,5 mg ; 34,1 μmol) est placé en solution dans le THF anhydre (2,5 ml) et le mélange est refroidi à -10°C avant ajout d'hexaméthyldisilathiane (44,3 μmol) puis d'une solution de fluorure de tétrabutylammonium 1 M dans le THF (40,9 μmol). Le mélange est ramené à TA et l'agitation est poursuivie 1 h30. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (5 ml) et la phase organique est lavée par une solution aq. saturée de NH ₄ CI (5 ml). La phase aq. est extraite par de TAcOEt (2x5 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Un solide blanc, le composé 33, est obtenu (19 mg ; 78%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 0,78 (m, 12 H) ; 1 ,00 (s, 6 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 6 H) ; 1 ,11 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 2 H) ; 1 ,49 - 1 ,63 (m, 4 H) ; 1 ,82 (m, 2 H) ; 2,26 (m, 2 H) ; 2,63 - 2,72 (m, 4 H) ; 2,93 - 3,05 (m, 6 H) ; 3,25 - 3,37 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,81 (s, 6 H) ; 3,82 (s, 4 H) ; 3,89 (d, J=2,0 Hz, 2 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 1 1 ,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7, 9,6 Hz, 2 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 10,8 Hz, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,3 Hz, 2 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7, 10,8 et 15,3 Hz, 2 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,17 (dd, J=2,0, 8,6 Hz, 2 H) ; 7,22 (dd, J=2,5, 9,3 Hz, 2 H) ; 7,26 - 7,32 (m, 10 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1427 [M + H] ⁺ ; t _R = 1 ,31 min.

Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-{(S)-1-[(2R,3R)-3- (4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthyl- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13- ène-2,5,9,12-tétraone

Le composé 33 (11 mg ; 7,7 μmol) est placé en solution dans le méthanol (8,8 ml). Le TCEP (76,7 μmol) en solution dans 2,2 ml d'eau est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (20 ml). La phase aq. est extraite par de l'AcOEt (2x15 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (15 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Un solide blanc, Ex8, est obtenu (4,7 mg ; 31 %). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 0,79 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,62 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,84 (t large, J=6,5 Hz, 1 H) ; 2,93 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,73 (d large, J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,81 (s., 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,6, 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,4, 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9, 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3, 9,5 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 2 H) ; 7,35 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 715 [M + H] ⁺ ; m/z = 713 [M - H]-; t _R = 1 ,18 min. Exemple 9 : hu2H11 -SPDB-ExI

Selon la méthode générale en deux étapes, 10,4 mg (0,071 μmol, 1 ,174 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 8,86 mg/ml sont traités par 7 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,16 mg, 0,496 μmol) en solution dans 34,2 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 8 mg/ml dans le mélange. Après purification, on obtient 2,2 ml d'anticorps hu2H11 modifiés à une concentration de 4,28 mg/ml (9,42 mg, 91 %) avec en moyenne 4,68 molécules de pyridyldisulfures par anticorps. 1 ,68 ml (7,2 mg, 0,049 μmol) d'anticorps hu2H11 modifié sont traités avec 1 ,03 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4- mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phény l}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex1 , 1 ,148 μmol) en solution dans 101 ,2 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 10% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl. On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex9 à une concentration de 1 ,1 mg/ml avec en moyenne 3 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 10 : hu2H11-SPDB-Ex2

Selon la méthode générale en une étape, 13,5 mg (0,092 μmol, 1 ,318 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,18 mg, 0,551 μmol) en solution dans 38,4 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,333 ml (12,0 mg, 0,081 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,760 ml de tampon pH≈7,5-8, 543 μl de DMA puis 1 ,73 mg de (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobut yl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)- pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6-méthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex2, 1 ,958 μmol) en solution dans 182 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex10 à une concentration de 2,83 mg/ml avec en moyenne 3,7 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 98,8%.

Exemple 11 : hu2H11-SPDB-Ex5

Selon la méthode générale en une étape, 9,45 mg (0,064 μmol, 0,923 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,13 mg, 0,398 μmol) en solution dans 26,88 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,0 ml (9,0 mg, 0,061 μmol) du milieu réactionnel d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,45 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 265 μl de DMA puis 1 ,26 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3- isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-pr opyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex5, 1 ,472 μmol) en solution dans 285 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 2,5 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,70 mg/ml avec en moyenne 3,7 / 3,1 dérivés de cryptophycine (UV / HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 98,0%.

Exemple 12 : hu2H11-SPDB-Ex6

Selon la méthode générale en une étape, 10,31 mg (0,070 μmol, 1 ,006 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,14 mg, 0,429 μmol) en solution dans 29,32 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,1 ml (9,9 mg, 0,067 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,595 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 291 μl de DMA puis 1 ,60 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-m éthyl-propyl]amino-éthoxy} -éthoxy)- éthoxy]-éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-é thyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex6, 1 ,617 μmol) en solution dans 314 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 3 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,97 mg/ml avec en moyenne 3,4 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,8%. Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle Composé 34 : 4-Méthoxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle

200 mg (1 ,07 mmol) de pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle sont placés en solution dans l'acétonitrile anhydre (10 ml). La TEA (1 ,07 mmol) puis le bromoacétate de méthyle (1 ,61 mmol) sont ensuite ajoutés. La suspension blanche est agitée 48 h à TA avant ajout d'une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml). La phase aq. est extraite par du DCM (3x10 ml), les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit brut est obtenu. Ce brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit attendu 34, une huile incolore est alors obtenu (174,8 mg ; 63%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,66 ; RMN ¹ H (300 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,40 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,28 à 3,33 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,61 (s, 3 H).

Composé 35 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle

Le composé 34 (174 mg ; 0,67 mmol) est placé en solution dans le dioxane anhydre (5 ml) et une solution HCl 4 M dans le dioxane (0,02 mmol) est ajoutée. Le mélange est agité 5 h à TA puis la suspension est filtrée sur verre fritte. Le solide ainsi obtenu est lavé par du dioxane (2 ml) puis par de l'éther isopropylique (2 ml) avant d'être séché sous vide. Un solide beige, 35, est obtenu (131 mg ; 100%). RMN ¹ H (300 MHz, DMSO-cfe): 2,88 à 2,97 (m, 4 H) ; 3,09 à 3,19 (m, 4 H) ; 3,53 à 3,59 (m, 2 H) ; 3,65 (s, 3 H) ; 8,65 à 9,22 (m étalé, 2 H).

Composé 36 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de méthyle

Le dérivé 1 (20 mg ; 28,6 μmol) est placé en solution dans le DCM anhydre (1 ml) et la TEA (71 ,5 μmol) puis le CMS (45,8 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé. La TEA (85,7 μmol) puis le chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle 35 (42.8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant que du DMF anhydre (1 ml) et NaI (30 μmol) ne soient ajoutés. Le mélange est agité 48 h à 45°C avant d'être dilué par de TAcOEt (5 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO ₃ (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 98/2. Le composé 36 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (8,2 mg ; 34%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,45 ; RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,77 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,32 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,30 (m, 1 H) ; 2,37 (s large, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,18 à 3,52 (m, partiellement masqué, 9 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,31 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,8 et 9,9 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 839 [M + H] ⁺ ; m/z = 420 [M + 2H] ²⁺ (pic de base) ; m/z = 837 [M - H] ^" ; m/z = 883 [M + HCO2H - H] ^" (pic de base) ; t _R = 3,57 min.

Composé 37 : Bromoacétate d'allyle

288 mg (4,95 mmol) d'alcool allylique sont mis en solution dans 25 ml de DCM. La solution est refroidie à 0°C puis 760 μl (5,45 mmol) de TEA et 3,03 mg (24,8 μmol) de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité à 0°C puis 1 ,0 g (4,95 mmol) de bromure de bromoacétyle sont ajoutés. La réaction est poursuivie pendant la nuit à TA. On ajoute de l'eau au mélange ; la phase aq. est lavée avec du DCM. Les fractions organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau et une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 37 est obtenu (747 mg, 84%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 4,18 (s, 2 H) ; 4,64 (td, J=1 ,5 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,25 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,35 (qd, J=1 ,5 et 17,2 Hz, 1 H) ; 5,92 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,2 Hz, 1 H).

Composé 38 : 4-Allyloxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de fert-butyle

A une solution de 200 mg (1 ,07 mmol) de 1-Boc-pipérazine dans 8 ml d'acétonitrile sont ajoutés 150 μl (1 ,07 mmol) de TEA et 250 mg (1 ,40 mmol) de bromoacétate d'allyle 37. Le mélange est agité à TA pendant la nuit. La réaction est arrêtée par ajout d'une solution saturée de NaHCOs. Le mélange est extrait avec TAcOEt (3 fois) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et évaporation du solvant sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le produit attendu 38 est obtenu sous la forme d'une huile jaune (314 mg ; 100%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,45 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 à 3,34 (m partiellement masqué, 6 H) ; 4,57 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,22 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,1 Hz, 1 H) ; 5,83 à 5,98 (m, 1 H). LCMS (A2):ES m/z = 285 [M + H] ⁺ ; m/z = 229 pic de base ; t _R = 0,51 min.

Composé 39 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate d'allyle

314 mg (1 ,10 mmol) du composé 38 sont dissous dans 12,6 ml de dioxane puis 5,5 ml (22,0 mmol) d'une solution HCl 4M dans le dioxane sont ajoutés. L'agitation est poursuivie pendant la nuit à TA. Le mélange est concentré à sec pour donner le composé attendu 39 sous la forme d'une huile jaune (260 mg ; 100%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 2,79 à 2,88 (m, 4 H) ; 3,07 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,48 à 3,51 (m, 2 H) ; 4,60 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,23 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,32 (qd, J=1 ,5 et 7,4 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,98 (m, 1 H) ; 8,74 (s large, 2 H). LCMS (A2): ES m/z = 185 [M + H] ⁺ ; t _R = 0, 19 min. Composé 40 (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate d'allyle

A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (28,3 mg, 39,5 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) est ajoutée une solution du composé 39 (1 18,5 μmol) et de TEA (198 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ml). L'agitation est poursuivie 24 h à 40°C. Le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO ₃ (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 40 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,2 mg ; 56%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,27 (dt, J=11 ,3 et 14,2 Hz, 1 H) ; 2,32 à 2,42 (m, 4 H) ; 2,52 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,32 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 1 1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,56 (td, J=1 ,5 et 5,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=16,2 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,95 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,8 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 865 [M + H] ⁺ ; m/z = 433,5 [M + 2H] ²⁺ (pic de base) ; m/z = 863 [M - H] ^" ; m/z = 909 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 0,92 min.

Composé 41 : Acide (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétique

A une solution sous argon du composé 40 (12,8 mg, 14,8 μmol) dans le THF anhydre sont ajoutés le tétrakis(triphénylphospine)palladium (1 ,48 μmol) et la morpholine (148 μmol). Après 3 h de réaction, le mélange est concentré à sec et repris dans 5 ml de DCM. La phase organique est lavée par une solution de 1 ml HCl 0,1 N dans 3 ml d'eau (pH≈5), séchée sur MgSO ₄ , filtrée et évaporée pour donner le composé 41 (6,7 mg, 55%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,42 (d, J=6,6 Hz, 4 H) ; 2,58 à 2,76 (m, 6 H) ; 2,97 à 3,09 (m, 3 H) ; 3,14 (s large, 2 H) ; 3,33 (m masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,29 (m, 1 H) ; 4,89 à 4,93 (m, 1 H) ; 5,06 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,43 à 6,50 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 825 [M + H] ⁺ ; m/z = 413 [M + 2H] ²⁺ (pic de base) ; m/z = 823 [M - H] ^" ; t _R = 0,86 min.

Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

L'exemple 13 peut être obtenu en activant l'acide 41 selon la méthode décrite pour l'exemple 18.

Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa -8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éth oxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle Composé 42 : 3-(2-{2-[2-(2-tert-Butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]-ét hoxy}-éthoxy)- propanoate d'allyle

A une solution d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque (50 mg, 137 μmol) dans 1 ,25 ml de DCM sont successivement ajoutés le chlorhydrate d'EDCI (164,2 μmol), la DMAP (13,7 μmol) et l'alcool allylique (164,2 μmol). Le mélange est agité à TA pendant 16 h puis évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 42 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (37,5 mg ; 67%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,44 à 3,53 (m, 12 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (qd, J=1 , 6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,90 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) ES m/z = 406 [M + H] ⁺ ; m/z = 428 [M + Na] ⁺ ; m/z = 306 pic de base ; t _R = 0,91 min. Composé 43 : Chlorhydrate du 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-prop anoate d'allyle

A une solution du composé 42 (37,5 mg, 92,5 μmol) dans 2 ml de dioxane sont ajoutés 460 μl (1 ,85 mmol) d'une solution d'acide chlorhydrique 4M dans le dioxane. L'agitation est poursuivie à TA pendant la nuit puis le milieu réactionnel est évaporé à sec pour donner le composé 43 sous la forme d'une huile incolore (31 mg, quantitatif). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,96 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 8 H) ; 3,55 à 3,58 (m, 4 H) ; 3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,65 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,56 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,91 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 7,91 (m étalé, 3 H). LCMS (A2) : ES m/z = 306 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,42 min.

Composé 44 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chl oro-4-méthoxy-benzyl] -S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-i δ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-p ropanoate d'allyle

A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (12,7 mg, 17,7 μmol) dans 1 ,48 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h : il reste du composé 2 de départ ; 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol) sont à nouveau ajoutés au mélange et l'agitation poursuivie à 40°C pendant 48 h supplémentaires. 2 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (2 ml), une solution saturée de chlorure de sodium (2 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 44 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (4,8 mg ; 27%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,77 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,56 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,61 à 2,73 (m, 4 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 14 H) ; 3,63 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ;3,72 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (s large, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,2 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,55 (dm, J=5,4 Hz, 2 H) ; 4,90 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J= 1 ,4 et 5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,8 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,21 (m, 1 H) ; 7,24 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 986 [M + H] ⁺ ; m/z = 493,5 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; m/z = 984 [M - H]- ; m/z = 1030 [M - H + HCO ₂ H]- pic de base ; t _R = 0,95 min. Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chl oro-4-méthoxy-benzyl]- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-p ropanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

L'exemple 14 peut être obtenu en déprotégeant le composé 44 selon la méthode décrite pour le composé 41 et en activant l'acide obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18.

Exemple 15 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa -δ,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl-méthyl-amino}-éthoxy)-éth oxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

Composé 45 : Acide 3-[2-(2-{2-[2-(fert-butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-à ©thoxy}-éthoxy)- éthoxy]-propanoïque ,N. ,-0

520 mg (1 ,423 mmol) d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque sont mis en solution dans 14 ml de THF anhydre puis le mélange est refroidi à 0°C avant que soient ajoutés, par spatulées, 85,4 mg (2,135 mmol) d'hydrure de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 10 min à 0°C puis 150,6 μl (2,419 mmol) d'iodure de méthyle sont ajoutés à 0°C. La température est laissée revenir à TA et l'agitation poursuivie 2 h. 8 ml d'eau sont ajoutés au mélange dont le pH est ensuite acidifié par addition d'acide acétique pour obtenir pH≈4. Il est extrait par 3*10 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO ₄ . Après filration et concentration à sec sous PR, le composé 45 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (414 mg, 77%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,43 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,52 (m, 14 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 12,01 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 402 [M + Na] ⁺ ; m/z = 378 [M - H]- ; m/z = 280 pic de base ; t _R = 0,95 min. Composé 46 : 3-[2-(2-{2-[2-(fert-Butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-à ©thoxy}-éthoxy)-éthoxy]- propanoate d'allyle

A une solution de 540 mg (1 ,423 mmol) du composé 45 dans 15 ml de DCM anhydre sont successivement ajoutés 327 mg (1 ,71 mmol) d'EDCI, 17,4 mg (142 μmol) de DMAP et 116 μl (1 ,71 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie 15 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 46 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (337 mg ; 56%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,22 à 3,33 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (d large, J=4,9 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,1 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 442 [M + Na] ⁺ ; m/z = 320 pic de base ; t _R = 0,98 min.

Composé 47 : 3-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthox y)-propanoate d'allyle

A une solution de 337 mg (0,802 mmol) du composé 46 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 1 ,19 ml (16,04 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie pendant 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 47 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (208 mg, 81 %). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-de): 2,27 (s, 3 H) ; 2,54 à 2,61 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,52 (m, 12 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,56 (d large, J=5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 320 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,42 min.

Composé 48 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chl oro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy }-éthoxy)-propanoate d'allyle

A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (40 mg, 55,7 μmol) dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl de DIPEA (279 μmol) et 53 mg du composé 47 (167 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 15 h ; 5 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 4x5 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOβ (5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 48 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (45,3 mg ; 80%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,56 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,49 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,55 (d large, J=5,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,6 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,30 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1000 [M + H] ⁺ ; m/z = 500,5 [M + 2H] ²⁺ ; m/z = 1044 [M - H + HCO ₂ H]- ; t _R = 1 ,01 min.

Composé 49 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chl oro-4-méthoxy- benzylj-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy }-éthoxy)-propanoïque 19 mg (18,9 μmol) du composé 48 sont mis en solution dans 3,8 ml de THF anhydre et purgés à l'argon. 6 μl (18,9 μmol) de diéthylamine sont ajoutés au mélange qui est agité 15 min à TA avant que soient ajoutés 4,45 mg (19,8 μmol) d'acétate de palladium (II) et 18,89 mg de triphénylphosphine supportée. L'agitation est poursuivie 6 jours à TA: il reste du départ mais la réaction n'évolue plus. Le mélange est filtré, concentré à sec, repris dans 2 ml de THF anhydre et traité avec 10 μl (31 ,5 μmol) de diéthylamine et 10 mg de tétrakis(triphényl-phospine)palladium pendant 1 h. Le mélange est hydrolyse avec 2 ml d'une solution aq. d'hydrogénosulfate de sodium 2M et extrait avec 3 * 2 ml de DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 49 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (5,4 mg ; 30%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,76 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,42 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,64 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,44 (m partiellement masqué, 3 H) ; 3,45 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,53 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,59 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=4,2 et 7,8 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (dd, J=5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,27 (m, 3 H) ; 7,28 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,38 (d large, J=7,8 Hz, 1 H) ; 11 ,22 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 960 [M + H] ⁺ ; m/z = 480,5 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; m/z = 958 [M - H]- ; t _R = 0,90 min.

Exemple 15 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{€-(3S,10R,16S)-10-[3-chl oro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy }-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle

L'exemple 15 peut être préparé en activant l'acide 49 selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro -4-méthoxy-benzyl}- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1 -yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle Composé 50 : Acide 3-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoïque

A une solution de 300 mg (1 ,08 mmol) de 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle dans 6 ml de DCM sont ajoutés 1 ,6 ml (21 ,56 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie à TA pendant 3h. Le mélange est concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués pour donner le composé 50 sous la forme d'une huile jaune pâle (240 mg, quantitatif).

Composé 51 : 3-{2-[2-(2-Hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate d'allyle

A une solution de 240 mg (1 ,08 mmol) du composé 50 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 248 mg (1 ,29 mmol) d'EDCI, 13,2 mg (1 ,29 mmol) de DMAP et 88 μl (1 ,29 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h puis le mélange est concentré à sec sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 51 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (144 mg, 51 %). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,41 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,52 (t, J=5,5 Hz, 1 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,50 (dm, J=17,4 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 52 : 4-(2-{2-[2-(2-Allyloxycarbonyl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-é thyl)-piperazine-1- carboxylate de fert-butyle

A une solution, refroidie à 0°C, de 94 mg (357 μmol) du composé 51 dans 3,7 ml de DCM sont successivement ajoutés 125 μl (893 μmol) de TEA et 30,4 μl (393 μmol) de chlorure de mésyle, l'agitation est poursuivie à TA pendant 1 h. Le mélange est concentré à sec sous PR puis repris dans 5 ml d'acétonitrile. 249 μl (1 ,785 mmol) de TEA et 200 mg (1 ,071 mmol) de Boc-pipérazine sont ajoutés à la solution et le mélange est agité et chauffé 15 h à 40°C. Après retour à TA, le mélange est concentré à sec et purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 52 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (69 mg, 45%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,33 (m, 4 H) ; 2,46 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,28 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 10 H) ; 3,64 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,55 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 53 : 3-{2-[2-(2-Piperazin-1-yl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propano ate d'allyle

A une solution de 110 mg (256 μmol) du composé 52 dans 10 ml de DCM sont ajoutés 380 μl (5,11 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 24 h à TA. Le mélange est∞ncentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 53 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (47 mg, 55%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,10 à 3,36 (m large, 6 H) ; 3,45 à 3,78 (m partiellement masqué, 16 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 9,00 (m étalé, 1 H).

Composé 54 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro -4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate d'allyle

Le composé 54 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 53 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30.

Composé 55 : Acide (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro -4-méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthox y}-éthoxy)-propanoïque

Le composé 55 peut être obtenu selon la méthode décrite pour le composé 41.

Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro -4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

L'exemple 16 peut être obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-1 0-(3-Chloro-4- méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo- 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-èn-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-1 ,1 -diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]- acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle

Composé 56 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-Bromo-acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-étho xy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

A une solution d'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-prop ionique (671 mg, 2,53 mmol) dans le DCM (10 ml) est ajoutée une solution du bromoacétate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle (2,53 mmol) dans 4,7 ml de DCM. L'agitation est poursuivie 15 min à TA puis le DCC est ajouté au mélange. Après 4 h de réaction, le mélange est filtré sur verre fritte puis le filtrat est évaporé et purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 94/6. L'huile obtenue (800 mg) est à nouveau purifiée par chromatographie sur gel de silice greffée cyano, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1. On obtient le composé 56 sous la forme d'une huile incolore (611 mg, 50%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 2,81 (s, 4 H) ; 2,92 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,23 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,55 (m, 12 H) ; 3,72 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,85 (s, 2 H) ; 8,30 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H] ⁺ ; m/z = 481 [M - H] ^" ; t _R = 0,51 min.

Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-p ipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,1 1-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone

A une solution purgée à l'argon du composé 2 (19,8 mg, 27,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) sont successivement ajoutés la TEA (138 μmol) et le chlorhydrate de la 4-méthyl-4- méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h puis le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCU ₃ (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO ₄ et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Une poudre blanche, 7, est obtenue (19,4 mg ; 75%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,6 ; RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 , 12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5, 15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 1 1 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H] ⁺ ; m/z = 941 [M - H] ^" ; t _R = 4,03 min.

Nota : le composé 7 peut être préparé également à partir de G=OMs (voir exemple 1) Composé Ex1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pip érazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone

Le composé 7 (17,9 mg ; 18,97 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (2,2 ml) / eau (1 ,8 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (47,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 3 h à TA, puis dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH ₄ CI (20 ml) puis par 20 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit Ex1 est obtenu sous forme d'un solide blanc (15,6 mg ; 92%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3

H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2

H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95

- 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 -

4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 1

H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z =

897 [M + H] ⁺ ; m/z = 895 [M - H] ^" ; t _R = 0,97 min.

Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-1 0-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-1 ,1-diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]-acétylamino}-éthoxy)- éthoxy]-éthoxy}-éthoxy )-propa noate de 2 , 5-d ioxo-py rrol id i n- 1 -y le A une solution, purgée à l'argon, du composé Ex1 (15,6 mg, 17,8 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,0 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (19,12 μmol) et le composé 56 (19,12 μmol). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h puis 29,5 μmol supplémentaires de DIPEA sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 16 h. Le lendemain, sont ajoutés 29,5 μmol supplémentaires de composé 56 et de DIPEA et le mélange est chauffé à 50°C. Après 24 h supplémentaires de réaction, 22,6 μmol de composé 56 et 29,5 μmol de DIPEA sont ajoutés et le mélange chauffé à 60°C pendant 24 h supplémentaires. Le chauffage est alors arrêté et l'agitation poursuivie à TA pendant 64 h. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par 2x10 ml d'eau puis par 10 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO ₄ , filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide incolore (9,2 mg ; 41 %). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 à 0,82 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,23 (s, 6 H) ; 1 ,26 à 1 ,35 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,68 à 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,78 à 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,26 à 2,33 (m, 3 H) ; 2,35 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,68 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,82 (s, 4 H) ; 2,93 (t, J=6.0 Hz, 2 H) ; 2,96 à 3,07 (m, 4 H) ; 3,13 (s, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,33 (m, 1 H) ; 3,38 à 3,57 (m, 18 H) ; 3,73 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 2 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,8 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,13 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,1 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,37 (m, 7 H) ; 8,01 (t, J=5,8 Hz, 1 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1299 [M + H] ⁺ ; m/z = 650 [M + 2H] ²⁺ ; m/z = 1297 [M - H] ^" ; t _R = 0,92 min.

Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa -δ,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-é thoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

Composé 58 : Carbonate de 4-((2S,3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthox y- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle et de 4-nitrophényle

Le dérivé 57 (20 mg ; 28,6 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (0,3 ml), la solution est purgée à l'argon avant que soient ajoutés la TEA (40 μmol) puis le chloroformate de 4-nitrophényle (32,32 μmol). Après 3h30 d'agitation à TA, le mélange est hydrolyse et dilué dans 7 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO ₄ , filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 58 sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 93%). LCMS (A3) : ES m/z = 864 [M + H] ⁺ ; m/z = 908 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 1 ,43 min.

Composé 59 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-c hloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-étho xy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque fj η o i o i

Y

₅ ° ₈ J T^ i / " Hx TT l— ^" ° ° ₅₉ ° ^~ V ° J Y^ i / " H":ι ÎŒ:°

A une solution, purgée à l'argon, du composé 58 (23 mg, 26,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,6 ml) sont successivement ajoutés l'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propionique (39,9 μmol) et la TEA (53,2 μmol). Après 24 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec 10 ml d'eau contenant 250 μl d'HCl 0,1 N (pH≈4). La phase aq. est extraite avec 10 ml d'AcOEt (2x) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'eau puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO ₄ , filtrées et évaporées à sec pour donner le composé 59 sous la forme d'un solide jaune très pâle (18,5 mg, 70%). LCMS (A3) : ES m/z = 990 [M + H] ⁺ ; m/z = 988 [M - H] ^" ; t _R = 1 ,32 min.

Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-C hloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-étho xy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle

A une solution, purgée à l'argon, du composé 59 (18,5 mg, 18,6 μmol) dans le THF (1 ,5 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (55,8 μmol) et le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (37,2 μmol). Après 19 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 10 ml d'eau (2 fois) puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séché sur MgSO ₄ et évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 100/0 à 0/100 contenant 10% d'isopropanol. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,08 mg ; 30%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,83 à 0,88 (m, 6 H) ; 0,97 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,47 à 1 ,56 (m, 1 H) ; 1 ,58 à 1 ,68 (m, 2 H) ; 1 ,82 à 1 ,90 (m, 1 H) ; 2,39 à 2,47 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,66 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,4 Hz, 1 H) ; 2,80 (s, 4 H) ;

2.91 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 2,94 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,14 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,37 à 3,56 (m partiellement masqué, 15 H) ; 3,71 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,79 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,8 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,96 à 5,05 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,88 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,14 à 7,39 (m, 8 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1087 [M + H] ⁺ ; m/z = 1085 [M - H] ^" ; t _R = 1 ,09 min.

Exemple 19 : (1-{4-r(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-r3-Chloro-4-mé thoxy-benzvn-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

Composé 60 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Azidométhyl-phény l)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tetraone

A une solution, purgée à l'argon, de 60 mg (85,8 μmol) de composé 1 dans 9 ml de THF anhydre sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide. Le mélange est agité à TA pendant

10 min puis refroidi à 0°C avant que soient ajoutés 18,0 μl (120 μmol) de DBU. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. La réaction n'est pas complète : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h.

11 reste encore du composé 1 de départ : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h. Le milieu réactionnel est hydrolyse par addition de 6 ml d'eau puis extrait avec du DCM (3*6 ml). Les phase organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (8 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 60 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (46 mg, 74%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;

3.92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,46 (s, 2 H) ; 4,92 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,38 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 724 [M + H] ⁺ ; m/z = 722 [M - H] ^" ; m/z = 768 [M - H + HCO ₂ H] ^" pic de base ; t _R = 1 ,18 min.

Composé 61 : Acide (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoïque

A une suspension de 22 mg (30,4 μmol) du composé 60 dans 500 μl d'eau est ajoutée une solution de 6,8 mg (60,8 μmol) d'acide 5-hexynoïque dans 500 μl de THF. Sont ensuite ajoutés 122 μl (12,2 μmol) d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 122 μl (24,3 μmol) d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec de TAcOEt (3 * 2 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (3 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 61 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,4 mg, 76%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de): 0,73 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,20 à 2,30 (m, 3 H) ; 2,62 (t, J=7,7 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,6 et 5,2 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H) ; 5,78 (dd, J=1 ,6 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,37 (d large, J=8,0 Hz, 1 H) ; 12,03 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 836 [M + H] ⁺ ; m/z = 418,5 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; m/z = 834 [M - H] ^" ; t _R = 1 ,04 min. Composé 62 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de méthyle A une solution de 5 mg (6 μmol) du composé 61 dans 500 μl de DCM et 200 μl de méthanol sont ajoutés 4,5 μl (9,0 μmol) d'une solution de triméthylsilyldiazométhane 2M dans l'hexane. L'agitation est poursuivie 30 min. Le mélange est concentré sous PR et purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 62 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (5 mg, 98%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,72 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,99 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,25 (m, 1 H) ; 2,35 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,62 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,57 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,3 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,89 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,5 et 5,4 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H); 5,78 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,4 et 11 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 850 [M + H] ⁺ ; m/z = 425,5 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; m/z = 848 [M - H] ^" ; m/z = 894 [M - H + HCO ₂ H] ^" pic de base ; t _R = 1 ,11 min.

Exemple 19 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-mé thoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

A une solution, purgée à l'argon, de 13,4 mg (16 μmol) du composé 61 dans 1 ,2 ml de THF sont successivement ajoutés 8,4 μl (48,1 μmol) de DIPEA et 8,21 mg (32,04 μmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle. L'agitation est poursuivie à TA pendant 26 h. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit obtenu contient 0,15 mol de NHS. Il est repris dans 2 ml de DCM et lavé avec de l'eau (2x3 ml) puis séché sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration à sec, on obtient le composé Ex19 sous la forme d'un solide blanc (12,56 mg, 84%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,73 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,95 (quin, J=7,5 Hz, 2 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,65 à 2,77 (m, 6 H) ; 2,81 (s large, 4 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,1 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,4 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,54 (s, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 (dd, J=2,5 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,95 (s, 1 H) ; 8,33 (d, JJ==88,,11 HHzz,, 11 HH)).. LLCCMMSS ((AA22)) :: EESS mm//zz == 993333 [[MM ++ H] ⁺ ; m/z = 467 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; m/z = 977 [M - H + HCO ₂ H] ^" pic de base ; t _R = 1 ,08 min.

Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1 -[1 -(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa -8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1,2,3-triazol-1-yl]-méthox y}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle

Composé 63 : 2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthano l

A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 1 g (5,15 mmol) de tetraethylèneglycol dans 25 ml de THF anhydre sont ajoutés 144 mg (3,60 mmol) de NaH à 60% en dispersion dans une huile minérale. L'agitation est poursuivie 30 min à 0°C puis 194 μl (2,58 mmol) de bromure de propargyle sont ajoutés. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. Le mélange est concentré sous PR puis le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 63 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (789 mg, 65%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 3,40 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,42 (t, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,48 (q, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,51 à 3,58 (m, 12 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,5 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 233 [M + H] ⁺ ; t _R = 0,38 min.

Composé 64 : 3-(2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éth oxy)-propanoate de tert- butyle

A une solution, purgée à l'argon, de 790 mg (3,40 mmol) du composé 63 dans 8,8 ml de THF anhydre sont ajoutés 4,4 mg (190 μmol) de sodium. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 2 h pour le solubiliser entièrement ; après retour à TA, 740 μl (5,09 mmol) d'acrylate de fert-butyle sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie pendant 15 h à TA puis le mélange est concentré sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 64 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (944 mg, 77%). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-d ₆ ): 1 ,44 (s, 9 H) ; 2,41 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,38 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,62 (m, 16 H) ; 3,59 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 361 [M + H] ⁺ ; m/z = 383 [M + Na] ⁺ ; t _R = 3,79 min.

Composé 65 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éth oxy)-propanoïque

A une solution de 944 mg (2,62 mmol) de∞mposé 64 sont ajoutés 2 ml (52,4 mmol) de TFA. Le mélange est agité 6 h à TA puis concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le composé 65 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (722 mg, 91 %). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,44 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 16 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 7,44 à 9,73 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 305 [M + H] ⁺ ; m/z = 303 [M - H]-; t _R = 0,48 min.

Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R,16S)-10-( 3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1 ,2,3-triazol-1-yl]-méthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éth oxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle

L'exemple 20 peut être obtenu à partir des composés 60 et 65 selon la méthode décrite pour le composé 61 puis en activant l'acide selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 21 : (4-{1 -[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1,2,3-triaz ol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle

Composé 66 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[(méthyl-prop-2-ynyl-amino)-méthyl]-phény l}-oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone

A une solution, purgée à l'argon, de 40 mg (55,7 μmol) du composé 2 dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 15 h. Il reste du composé 2 de départ : sont à nouveau ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Après 24 h d'agitation à 40°C, le mélange est dilué avec 5 ml d'AcOEt puis lavé avec 5 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*5 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (10 ml), une solution saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 66 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (45 mg, quant.). RMN ¹ H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,20 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,17 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,27 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 3,33 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,50 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 7,8 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,5 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,1 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,1 et 9,4 Hz, 1 H) ; 7,25 à 7,33 (m, 5 H) ; 8,33 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 750 [M + H] ⁺ ; ES m/z = 375,5 [M + 2H] ²⁺ pic de base ; ES m/z = 748 [M - H]- ; m/z = 794 [M - H + HCO ₂ H]- ; t _R = 0,91 min.

Composé 67 : 4-Azido-butyrate d'éthyle

2,86 ml (20 mmol) de 4-bromo-butanoate d'éthyle et 2,6 g (40 mmol) de NaN ₃ sont mis en solution dans 30 ml d'un mélange acétone/eau 2/1. Le mélange est chauffé 7 h au reflux. Après retour à TA et concentration sous PR, le résidu est repris dans 50 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*30 ml de DCM. Les phases organiques sont réunies, séchées sur MgSO ₄ , filtrées et concentrées sous PR pour donner le composé 67 sous la forme d'une huile incolore (3 g, 95%). RMN ¹ H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,27 (t, J=7,2 Hz, 3 H) ; 1 ,92 (m, 2 H) ; 2,41 (t, J=7,2 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 4,15 (q, J=7,2 Hz, 2 H).

Composé 68 : Acide 4-azido-butanoïque

A une solution de 3 g (19,9 mmol) du composé 67 dans 47 ml de méthanol et 37 ml d'eau sont ajoutés, par petites fractions, 5,58 g (99,5 mmol) de potasse. Le mélange est agité à TA pendant 6 h puis concentré sous PR jusqu'à environ 28 ml. Le résidu est dilué avec 25 ml d'eau et extrait avec 2x20 ml de DCM. La phase aq. est acidifiée à pH≈1 par addition d'HCl concentré puis extraite avec 3*25 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (25 ml) et séchées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration à sec sous PR, le composé 68 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (2,05 g, 80%). RMN ¹ H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,93 (m, 2 H) ; 2,49 (t, J=7,1 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 11 ,24 (m étalé, 1 H). Composé 69 : Acide (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4 -méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoïque

A une solution de 24 mg (32 μmol) du composé 66 dans 545 μl de THF sont successivement ajoutés 8,3 mg (13 μmol) de composé 68, 545 μl d'eau, 128 μl d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 128 μl d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. Le mélange est 45 min agité à TA puis dilué avec 2 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et filtrées sur MgSO ₄ . Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 69 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (22,6 mg, 80%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,03 (m, 2 H) ; 2,10 (s, 3 H) ; 2,20 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,30 (m, 1 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,03 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 7,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,37 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,02 (s, 1 H) ; 8,39 (d large, J=7,7 Hz, 1 H) ; 12,14 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 879 [M + H] ⁺ ; m/z = 877 [M - H]- ; t _R = 0,86 min.

Composé 70 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4 -méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de méthyle

A une solution, purgée à l'argon, de 5,5 mg (6,2 μmol) du composé 69 dans 0,5 ml de DCM et 0,2 ml de méthanol sont ajoutés 4,7 μl (9,3 μmol) de triméthylsilyldiazométhane. Le mélange est agité 45 min à TA puis concentré à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 95/5. Le composé 70 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (3,4 mg, 62%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,1 1 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,07 (m, 2 H) ; 2,10 (m, 3 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,31 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,62 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,27 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,58 (s, 3 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,2 et 11 ,6 Hz, 1 H) ; 4,38 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,16 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 8,03 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 893 [M + H] ⁺ ; m/z = 447 [M + 2H] ²⁺ pic de base; m/z = 891 [M - H]- ; m/z = 937 [M -H + HCO ₂ H]- pic de base ; t _R = 0,90 min.

Exemple 21 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4 -méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle

L'exemple 21 peut être obtenu par activation de l'acide 69 selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 22

Composé 71 : (E)-(3S,10R,16S)-16-((S)-1-r(2S,3S)-3-(4-Azidométhvl-phénv l)-oxiranvll-éthyl)-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone

L'al∞ol 57 (36 mg ; 51 ,48 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985- 3007) est placé en solution dans le THF anhydre (2 ml). La solution est purgée à l'argon et refroidie avec un bain d'eau glacée avant d'additionner le DPPA (74 μmol) puis le DBU (80 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie toute la nuit. Le lendemain, la solution est de nouveau refroidie avec un bain d'eau glacée puis sont ajoutés 74 μmol de DPPA et 80 μmol de DBU supplémentaires. Après 2 h de réaction à 0°C et 2 h à TA, le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau puis est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et évaporées sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 57 est obtenu sous forme d'un solide incolore (24 mg ; 64%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,84 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;0,98 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,48 à 1 ,67 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,45 (m, 1 H) ;2,63 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,0 Hz, 1 H) ; 2,97 à 3,08 (m, 3 H) ; 3,36 (m partiellement masqué, 1 H); 3,82 (s large, 4 H) ; 4,28 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,44 (s, 2 H) ; 4,99 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,4 et 5,7 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 5,88 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,4 et15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,26 à 7,32 (m, 4 H) ; 7,36 (d,J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 722 [M - H]- ; m/z = 724 [M + H] ⁺ ; m/z = 768 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 1 , 19 min.

Composé 72 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2S,3S)-3-(4-Aminométhyl-phény l)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone

Le composé 71 (22 mg, 30,38 μmol) est mis en solution dans un mélange méthanol (1 ml) / eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,89 μmol). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOβ et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous PR. L'intermédiaire 72 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (21 mg, 99%) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 698 [M + H] ⁺ ; m/z = 742 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; fo = 3,19 min.

Composé 74 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72

Le composé 72 (21 mg, 30,08 μmol) est mis en solution dans un mélange acétonitrile (2 ml) / DMF anhydre (0,5 ml) avant l'addition d'une solution du composé 73 (23 mg, 30,1 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans l'acétonitrile (2 ml). Le mélange est laissé 22 h sous agitation à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs puis séché sur Na ₂ SO ₄ , fitré et concentré sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 74 est obtenu sous forme d'un solide blanc (22 mg) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H] ⁺ ; m/z = 1369 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 4,30 min.

Composé 75 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72

Le composé 74 (22 mg, 16,59 μmol) est mis en solution dans le DMF (3 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR ; le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et précipité avec de l'éther. Le composé 75 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (15 mg, 82%). LCMS (A5) : ES m/z = 1103 [M + H] ⁺ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 148 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 3,38 min.

Composé 76 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72

Une solution d'anhydride glutarique (8 mg, 70 μmol) dans le DMF anhydre (200 μl) est additionnée au composé 75 (15 mg, 13,59 μmol) conditionné sous argon. La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA avant addition d'une solution aq. saturée en NH ₄ CI et extraction 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous PR. Le résidu obtenu est repris dans le DCM et précipité à l'éther. Après filtration sur fritte et lavage à l'éther, le composé 76 est obtenu sous la forme d'un solide beige (8 mg, 48%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,80 à 0,92 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ;1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,30 à 1 ,72 (m, 9 H) ; 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,00 (m, 1 H) ; 2,11 à 2,26 (m, 4 H) ;2,42 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,91 à 3,1 1 (m, 5 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,76 (d,J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,17 (m, 3 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,37 (m, 1 H) ; 4,90 à 5,04 (m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,50 (m large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,20 (m étalé, 1 H) ; 6,48 (m, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,1 1 à 7,32 (m, 9 H) ; 7,60 (m, 2 H) ; 7,75 (m, 1 H) ; 7,89 (m, 1 H) ; 8,28 (m étalé, 1 H) ; 8,41 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 9,92 (s large, 1 H); 12,06 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H] ⁺ ; m/z = 1215 [M - H]- ; t _R = 1 ,05 min.

Exemple 22

Le∞mposé 76 (6 mg, 4,93 μmol) est mis en solution dans un mélange de DCM (0,5 ml) et de DMF (0,1 ml) puis sont successivement ajoutés le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (6 mg, 23,42 μmol) et la DIPEA (4 μl, 22,96 μmol). Après 3 h de réaction à TA, une solution aq. saturée en NH ₄ CI est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques reunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé Ex22 est obtenu sous forme d'un solide blanc (4 mg ; 61 %). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-de) δ (ppm) : 0,80 à 0,90 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,3 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,32 à 1 ,76 (m, 7 H) ; 1 ,80 à 1 ,89 (m, 3 H) ; 1 ,97 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 2 H) ; 2,44 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,75 (m, 4 H) ; 2,81 (s, 4 H) ; 2,89 à 3,08 (m, 5 H) ; 3,41 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,77 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,14 à 4,24 (m, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,93 à 5,03 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,39 (s large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 5,96 (t, J=5,9 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,16 à 7,36 (m, 9 H) ; 7,59 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,76 (t, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,88 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 8,10 (d, J=7,3 Hz, 1 H) ; 8,41 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 9,97 (s large, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1314 [M + H] ⁺ ; m/z = 1358 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 1 ,06 min.

Exemple 23

Composé 77: (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Aminométhyl-phény l)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone Le composé 60 (23 mg, 31 ,76 μmol) est mis en solution dans un mélange de méthanol (1 ml) et d'eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,90 μmol) et de DCM (la quantité suffisante pour solubiliser). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOs et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous pression réduite. Le brut est enfin purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 77 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (12 mg, 59%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,78 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,47 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 2,22 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement maqué, 1 H) ; 3,71 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,2 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,3 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 698 [M + H] ⁺ ; m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 742 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 0,87 min.

Composé 78 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77

Le composé 77 (10 mg, 14,32 μmol) est mis en solution dans le DMF anhydre (0,1 ml) avant l'addition d'une solution de l'intermédiaire 73 (1 1 mg, 14,35 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans un mélange d'acétonitrile (1 ml) et de DMF (0,1 ml). Le mélange est laissé sous agitation 3 h à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 78 est obtenu sous forme d'un solide blanc (18 mg, 95%). LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H] ⁺ ; m/z = 1369 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 4,32 min.

Composé 79 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77

Le composé 78 (42 mg, 31 ,68 μmol) est mis en solution dans le DMF (5 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR et le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et est précipité avec de l'éther. Le composé 79 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (21 mg, 60%). LCMS (A4) : ES m/z = 1103 [M + H] ⁺ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 147 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 3,67 min.

Composé 80 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77

Le composé 79 (20 mg, 18,12 μmol) est mis en solution dans un mélange de DMF (100 μl) et de DCM anhydre (500 μl) avant addition d'anhydride glutarique (4 mg, 35,06 μmol). La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est repris dans un minimum de DCM et de méthanol, précipité avec un mélange d'éther et de pentane et est filtré sur fritte. Le composé 80 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 104% brut) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (d, J=6,3 Hz, 6 H) ; 0,84 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,22 à 1 ,47 (m, 3 H) ; 1 ,51 à 1 ,64 (m, 3 H) ; 1 ,72 (m, 3 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 1 ,99 (m, 1 H) ; 2,20 (m, 4 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,59 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,90 à 3,07 (m, 5 H) ; 3,32 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (s large, 1 H) ; 4,19 (m, 3 H) ; 4,24 (m, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,3 et 9,6 Hz, 1 H) ; 4,97 (s large, 2 H) ; 5,10 (dd, J=4,4 et 10,7 Hz, 1 H) ; 5,40 (s large, 2 H) ; 5,79 (d large, J=15,1 Hz, 1 H) ; 5,99 (m large, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (d large, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,34 (m, 8 H) ; 7,60 (d large, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,76 (t large, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 8,09 (d large, J=7,1 Hz, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H) ; 9,95 (s large, 1 H) ; 1 1 ,98 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H] ⁺ ; m/z = 1215 [M - H]- ; t _R = 1 ,03 min.

Exemple 23

L'exemple 23 peut être obtenu en activant l'acide 80 selon la méthode décrite pour l'exemple 22.

Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbam ate de 4-((2S,3S)-3- {(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-i sobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12- tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle

Composé 81 : Méthyl-[2-méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-amine

A une solution de l'aminé 15 (478 mg, 2,90 mmol) dans le MeOH (35 ml) est additionné le TCEP (831 mg, 2,9 mmol). Après 2 h de réaction à TA la solution obtenue est additionnée goutte à goutte, sous atmosphère d'argon, à une solution de 2,2'-dipyridyldisulfide (960 mg, 4,36 mmol) dans l'éthanol (70 ml). Après en∞re 2 h de réaction à TA le mélange est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et est lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs. La phase organique est séparée puis la phase aq. extraite encore 2 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 85/15. Le composé 81 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (587 mg, 89%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,80 (m étalé, 1 H) ; 2,19 (s, 3 H) ; 2,45 (s, 2 H) ; 7,22 (ddd, J=1 ,5 et 5,0 et 7,0 Hz, 1 H) ; 7,74 à 7,85 (m, 2 H) ; 8,42 (ddd, J=1 ,1 et 1 ,5 et 5,0 Hz,1 H).

Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbam ate de 4-((2S,3S)-3-{(S)- 1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobut yl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxira nyl)-benzyle

A une solution de l'intermédiaire 58 (21 mg, 24,3 μmol) dans le DCM anhydre sont successivement ajoutés l'aminé 81 (10 mg, 43,79 μmol) et la DIPEA (8 μl, 45,43 μmol). Après 24 h à TA une solution aq. saturée en NaHCOs est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na ₂ S0 ₄ , filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé Ex24 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (7 mg, 30%). RMN ¹ H (500 MHz, DMSO-d ₆ ): 0,82 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,84 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,97 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s large, 6 H) ; 1 ,45 à 1 ,68 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,42 (m partiellement masqué, 1 H) ; 2,58 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,83 à 3,09 (m, 6 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s large, 4 H) ; 4,28 (m, 1 H) ; 4,91 à 5,17 (m, 4 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,38 (m, 8 H) ; 7,80 (m large, 2 H) ; 8,39 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 8,43 (d large, J=4,6 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 953 [M + H] ⁺ ; m/z = 477 [M + 2H] ²⁺ ; m/z = 997 [M + HCO ₂ H - H] ^" ; t _R = 1 ,23 min.

Exemple 25 : hu2H11-Ex17

Selon la méthode générale, 8,31 mg (0,057 μmol, 1 ,468 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 5,66 mg/ml sont traités par 5 éq. du composé Ex17 (0,442 mg, 0,340 μmol) en solution dans 37,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,15 ml de conjugué à une concentration de 2,48 mg/ml avec en moyenne 2,2 cytotoxiques par anticorps et une pureté monomérique de 99,7% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex25 à une concentration de 1 ,06 mg/ml avec en moyenne 2,8 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,7%. Exemple 26 : hu2H11-Ex18

Selon la méthode générale, 7,8 mg (0,053 μmol, 1 ,458 ml) d'anticorps nus hu2H11 à une concentration de 5,35 mg/ml sont traités par 6 éq. du composé Ex18 (0,578 mg, 0,531 μmol, pureté 60%) en solution dans 272 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,35 ml de conjugués à une concentration de 2,49 mg/ml avec en moyenne 2,5 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 100% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de chlorure de sodium sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml de d'une solution de conjugué Ex26 à une concentration de 0,84 mg/ml avec en moyenne 2,22 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 27 : hu2H11-Ex19

Selon la méthode générale, 12 mg (81 ,7 μmol, 1 ,172 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 10,24 mg/ml sont traités par 2 * 5 éq. du composé Ex19 (0,382 mg, 0,41 μmol) en solution dans 44,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le milieu réactionnel. Après purification sur Superdex 200 pg en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 1 ,04 ml de conjugués dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH = 6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex27 à une concentration de 2,66 mg/ml avec en moyenne 1 ,4 dérivés de cryptophycine (HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 99,8%.

Les exemples donnés ci-dessus ont été réalisés par un dérivé de cryptophycine particulier (souvent le dérivé D ₁ ) mais pourraient s'appliquer à un autre dérivé du groupe D ₁ -D ₈ ou au dérivé de cryptophycine de formule générale (II). De même, les exemples de conjugués des exemples 10, 1 1 , 12, 25, 26 et 27 pourraient s'appliquer à d'autres anticorps que hu2H11.

note : dans lesdits exemples, -Lys- signifie que l'attachement se fait sur les groupes ε-amino des lysines de l'anti∞rps.

Exemple 28 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les cytotoxiques, étude réalisée sur les composés de formule (II) de type SZ _a avec Z _a = SMe ou de type -C(=O)-Z _b R _b avec Z _b R _b = OMe ou OCH ₂ -CH=CH ₂ Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #11960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT116). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10 ^-7 à 10 ^-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées 3 jours à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO ₂ en présence des cytotoxiques. Le 4 ^e jour, 10 μl d'une solution de thymidine ¹⁴ C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine ¹⁴ C est mesurée 96 heures après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par le cytotoxique et celui obtenu avec les cellules des puits contrôlés (traitées par le milieu de culture seul).

Exemple 29 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les conjugués anticorps-cytotoxique

Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #1 1960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT1 16). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10 ^-7 à 10 ^-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO ₂ en présence des immunoconjugués anticorps-cytotoxique pendant 3 jours. Le 4 ^e jour, 10 μl d'une solution de thymidine ¹⁴ C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine ¹⁴ C est mesurée 96 h après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par l'immunoconjugué et celui obtenu avec les cellules des puits contrôles (traitées par le milieu de culture seul). Dans certaines expériences, l'anticorps nu hu2H11 a été ajouté dans les puits à une concentration de 1 μM au début de l'expérience et l'inhibition de la prolifération a été mesurée comme précédemment décrit.