Enzyme mit neuartigen Funktionen und Eigenschaften können entwe- der durch Screening natürlicher Proben oder durch Protein Engi- neering bekannter Enzyme bereitgestellt werden. Die letztgenannte Methode kann unter Umständen die geeignetere sein, um Eigenschaf- ten zu induzieren, deren Generierung auf dem Wege natürlicher Selektion unwahrscheinlich ist. Trotz zahlreicher Anstrengungen zum Engineering von Enzymen gibt es bisher nur wenige erfolgrei- che Studien zur Förderung der katalytischen Aktivität von Enzym- mutanten bezüglich eines bestimmten Substrates (1-10). In diesen bekannten Fällen sind die Substrate strukturell eng verwandt mit dem nativen Substrat des jeweiligen Enzyms. Bisher gibt es keine Berichte über ein erfolgreiches Engineering von Enzymen, welche nach der Modifikation die Umsetzung einer Verbindung katalysie- ren, welche strukturell völlig verschieden vom nativen Substrat des Enzyms ist.

Die aus dem Bakterium Bacillus megaterium isolierbare Cytochrom P450-Monooxygenase katalysiert gewöhnlich die subterminale Hydro- xylierung langkettiger, gesättigter Säuren und der entsprechenden Amide und Alkohole davon oder die Epoxydation ungesättigter lang- kettiger Fettsäuren oder gesättigter Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge (11-13). Die optimale Kettenlänge gesättigter Fett- säuren beträgt 14 bis 16 Kohlenstoffatome. Fettsäuren mit einer Kettenlänge von weniger als 12 werden nicht hydroxyliert (11).

Die Struktur der Häm-Domäne von P450 BM-3 wurde durch Röntgen- strukturanalyse bestimmt (14-16). Die Substratbindungsstelle liegt in Form einer langen tunnelartigen Öffnung vor, welche von der Moleküloberfläche bis hin zum Häm-Molekül reicht und wird fast ausschließlich von hydrophoben Aminosäureresten begrenzt.

Die einzigen geladenen Reste an der Oberfläche der Häm-Domäne sind die Reste Arg47 und Tyr51. Man nimmt an, daß diese an der

Bindung der Carboxylatgruppe des Substrates durch Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind (14). Die Mutation von Arg47 zu Glu bewirkt eine Inaktivierung des Enzyms für Arachidon- säure (13), erhöht jedoch dessen Aktivität gegenüber C12-Cl4-Al- kyltrimethylammonium-Verbindungen (17). Eine Substratnutzung für aromatische Verbindungen, insbesondere ein-, zwei-oder mehrker- nige, gegebenenfalls heterocyclische, Aromaten, Alkane, Alkene, Cycloalkane und-alkene, wurde für dieses Enzym nicht beschrie- ben. Es wurde deshalb bisher in der Fachwelt angenommen, daß an- dere als die bisher beschriebenen organischen Substrate, wie z. B.

Indol, aufgrund der deutlichen strukturellen Unterschiede zu den nativen Substraten von P450 BM-3, insbesondere aufgrund des Feh- lens funktioneller Gruppen, welche an die oben erwähnten Reste in der Substrattasche binden könnten, keine Substrat darstellen.

Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Cytochrom P450 Monooxygenasen mit veränderter Substratspezifität oder ver- ändertem Substratprofil bereit zu stellen. Insbesondere sollten Monooxygenase-Mutanten bereitgestellt werden, welche im Vergleich zu dem nichtmutierten Wildtyp-Enzym mit strukturell deutlich an- deren Substraten enzymatisch aktiv sind.

Ein"verändertes Substratprofil"ist für die erfindungsgemäßen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zu beobachten. Man be- obachtet für die jeweilige Mutante insbesondere eine Verbesserung der Reaktivität, wie z. B. eine Erhöhung der spezifischen Aktivi- tät (ausgedrückt als nmol umgesetztes Substrat/Minute/nmol P450-Enzym), und/oder wenigstens eines kinetischen Parameters, ausgewählt unter Kcat, Km und Kcat/Km (z. B. um mindestens 1 %, wie etwa 10 bis 1000 %, 10 bis 500 %, oder 10 bis 100 %) bei Umsetzung zumindest einer der in den Gruppen a) bis d) definier- ten oxidierbaren Verbindungen. Die erfindungsgemäße Oxidations- reaktion umfasst die enzymkatalysierte Oxigenierung wenigstens eines exogenen (d. h. dem Reaktionsmedium zugesetzten) oder endo- genen (d. h. im Reaktionsmedium bereits vorhandenen) organischen Substrats. Insbesondere umfasst die erfindungsgemäße Oxidations- reaktion eine Mono-und oder Polyhydroxylierung, wie z. B. eine Mono-und/oder Dihydroxylierung, an einer aliphatischen oder aro- matischen C-H-Gruppe, oder eine Epoxidierung an einer vorzugs- weise nichtaromatischen C=C-Gruppe. Auch Kombinationen obiger Re- aktionen sind denkbar. Das unmittelbare Reaktionsprodukt kann au- ßerdem im Rahmen einer nichtenzymatischen Folge-oder Nebenreak- tion weiter umgewandelt werden. Derartige Kombinationen von enzy- matischen und nichtenzymatischen Prozessen sind ebenfalls Gegen- stand der Erfindung.

Die obige Aufgabe konnte überraschenderweise gelöst werden durch neuartige Cytochrom P450 Monooxygenasen, welche z. B. zur Oxida-

tion N-heterocyclischer zwei-oder mehrkerniger armotischer Ver- bindungen befähigt sind.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung solche Monooxygenasen, deren Substrat-bindender Bereich durch ortsspezifische Mutagenese zur funktionalen Aufnahme neuer, wie z. B. N-heterocyclischer Sub- strate, befähigt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die neuen Monooxygenase löslich, d. h. in nicht-membrangebundener Form exi- stent, und in dieser Form enzymatisch aktiv.

Die erfindungsgemäßen Monooxygenasen sind vorzugsweise abgeleitet von Cytochrom P450 Monooxygenasen bakteriellen Ursprungs, wie insbesondere abgeleitet von Cytochrom P450 Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, welche wenigstens eine funktionelle, d. h. die Oxidation neuer organischer Substrate (vgl. insbesondere die im Folgenden definierten Gruppen a) bis d) von Verbindungen), wie z. B. N-hete- rocyclischer ein-, zwei-oder mehrkerniger armotischer Verbindun- gen, fördernde Mutation, in einem der Aminosäuresequenzbereiche 172-224 (F/G-loop-Bereich), 39-43 (ß-strand 1), 48-52 (ß-strand 2), 67-70 (ß-strand 3), 330-335 (ß-strand 5), 352-356 (ß-strand 8), 73-82 (helix 5) und 86-88 (helix 6) aufweist.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Cytochrom P450 Monooxyge- nase-Mutanten, sind bevorzugt zu wenigstens einer der folgenden Reaktionen befähigt : a) Oxidation gegebenenfalls substituierter N-, O-oder S-hetero- cyclischer ein-, zwei-oder mehrkerniger armotischer Verbin- dungen ; b) Oxidation gegebenenfalls substituierter ein-oder mehrkerni- ger Aromaten ; c) Oxidation geradkettiger oder verzweigter Alkane und Alkene ; und d) Oxidation gegebenenfalls substituierter Cycloalkane und Cycloalkene Bevorzugte Monooxygenase-Mutanten weisen wenigstens eine funktio- nelle Mutation, insbesondere Aminosäuresubstitution, in wenig- stens einem der Sequenzbereiche 73-82,86-88 und 172-224 auf. So kann beispielsweise Phe87 ersetzt sein durch eine Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette, wie z. B. Ala, Val, Leu, insbesondere Val ; Leul88 kann ersetzt sein durch eine Aminosäure mit Amid-Sei- tenkette, wie z. B. Asn oder insbesondere Gln ; und Ala74 kann ersetzt sein durch eine andere Aminosäure mit aliphatischer Sei- tenkette, wie z. B. Val und insbesondere Gly.

Besonders bevorzugten Monooxygenase-Mutanten dieses Typs sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden ein-oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen aufweist : 1) Phe87Val ; 2) Phe87Val, Leul88Gln ; oder 3) Phe87Val, Leul88Gln, Ala74Gly ; sowie funktionale Äquivalente davon. Der Zahlenwert gibt dabei die Position der Mutation an ; vor dem Zahlenwert steht die ur- sprüngliche, hinter dem Zahlenwert die neu eingeführte Amino- saure.

"Funktionale Äquivalente"oder Analoga der konkret offenbarten Mutanten sind in diesem Zusammenhang davon verschiedene Mutanten, welche weiterhin die gewünschte Substratspezifität im Rahmen we- nigstens einer der oben bezeichneten Oxidationsreaktionen a) bis d), also beispielsweise gegenüber heterozyklischen Aromaten, be- sitzen und z. B. Indol hydroxylieren, oder weiterhin das ge- wünschte, im Vergleich zum Wildtyp-Enzym"veränderte Substratpro- fil"zeigen.

Unter"funktionalen Äquivalenten"versteht man erfindungsgemäß auch Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Se- quenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure- substitution aufweisen, aber trotzdem zu einer Mutante führen, die ebenso wie die konkret genannte Mutante ein gegenüber dem Wildtypenzym"verändertes Substratprofil"zeigen und wenigstens eine der oben genannten Oxidationsreaktionen katalysieren. Funk- tionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Veränderungen im Substratprofil qualitativ übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate aber mit unterschiedlicher Ge- schwindigkeit umgesetzt werden.

"Funktionale Äquivalente"umfassen natürlich auch P450-Monooxyge- nase-Mutanten, welche in gleicher Weise wie die konkret genannten P450 BM3-Mutanten durch Mutation von P450-Enzymen aus anderen Or- ganismen zugänglich sind. Beispielsweise lassen sich durch Se- quenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen. Mit den modernen Methoden des Molecular Modeling können dann in An- lehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente, das Reaktionsmuster beeinflussende Mutationen vorgenommen werden.

"Funktionale Äquivalente"umfassen ebenso die durch eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Additionen,-Substituenten,-Dele- tionen und/oder-Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die ge- nannten zusätzlichen Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit verändertem Substratprofil im obigen Sinne führen.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe a) sind gegebe- nenfalls substituierte heterocyclische ein-, zwei-oder mehrker- nigen armotischen Verbindungen ; insbesondere oxidierbare oder hy- droxylierbare N-, O-oder S-heterocyclische ein-, zwei-oder mehrkernige aromatische Verbindungen. Sie umfassen vorzugweise zwei oder drei, insbesondere zwei, vier-bis siebengliedrige, insbesondere sechs-oder fünfgliedrige, kondensierte Ringe, wobei wenigstens einer, vorzugsweise alle Ringe aromatischen Charakter besitzen und wobei wenigstens einer der aromatischen Ringe ein bis drei, vorzugsweise ein N-, O-oder S-Heteroatom im Ring trägt. In der gesamten Ringstruktur können gegebenenfalls ein oder zwei weitere gleiche oder verschiedene Heteroatome enthalten sein. Die aromatischen Verbindungen können weiterhin 1 bis 5 Sub- stituenten an den Ring-Kohlenstoff-oder an den Heteroatomen tra- gen. Beispiele für geeignete Substituenten sind Cl-bis C4-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyl oder n-, i-oder t-Butyl oder C2-bis C4-Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl oder 3-Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genannten Alkyl-oder Alkenylsubstituenten können gegebenenfalls auch eine Keto-oder Aldehydgruppe aufweisen ; Bei- spiele hierfür sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on-4-yl, 3-Bu- ten-2-on-4-yl. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete hetero- cyclische Substrate sind insbesondere zweikernige Heterocyclen, wie Indol, N-Methylindol und die mit ein bis drei der oben defi- nierten Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon, wie z. B. 5-Chlor-oder 5-Brom-indol ; sowie Chinolin und Chinolinderivate, wie z. B. 8-Methylchinolin, 6-Methylchinolin und Chinaldin ; und Benzothiophen und die mit ein bis drei der oben definierten Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon. Außerdem seien genannt dreikernige Heteroaromaten wie Acridin und die mit ein bis drei der oben definierten Substi- tuenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe b) sind gegebe- nenfalls substituierte ein-oder mehrkernige, insbesondere ein- oder zweikernige Aromaten, wie Benzol und Naphthalin. Die aroma- tischen Verbindungen können gegebenenfalls ein oder mehrfach sub- stituiert sein und z. B. 1 bis 5 Substituenten an den Ring-Kohlen- stoffatomen tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind C1 bis C4-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyl oder n-, i-oder t-Butyl, oder C2 bis C4-Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Pro- penyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl oder 3-Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genannten Alkyl-oder Alkenylsubstituenten können gegebenenfalls auch eine Keto-oder Aldehydgruppe aufwei- sen ; Beispiele hierfür sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on-4-yl, 3-Buten-2-on-4-yl. Der Aromat kann gegebenenfalls mit einem vier- bis siebengliedrigen, nichtaromatischen Ring kondensiert sein.

Der nichtaromatische Ring kann gegebenenfalls eine oder zwei C=C- Doppelbindungen aufweisen, ein-oder mehrfach mit oben genannten

Substituenten substituiert sein und gegebenenfalls ein oder zwei Ringheteroatome tragen. Beispiele für besonders brauchbare Aroma- ten sind einkernige Aromaten, wie Cumol, sowie zweikernige Sub- strate, wie Inden und Naphthalin, sowie die mit ein bis drei der oben definierten Substituenten an Kohlenstoffatomen substituier- ten Analoga davon.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe c) sind gerad- kettige oder verzweigte Alkane oder Alkene mit 4 bis 15, vorzugs- weise 6 bis 12 Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden n-Butan, n-Pentan, n-Hexan, n-Heptan-, n-Oktan, n-Nonan, n-Decan, n-Undecan und n-Dodecan, sowie die ein-oder mehrfach verzweigten Analoga dieser Verbindungen, wie z. B. analoge Verbin- dungen mit 1 bis 3 Methyl-Seitengruppen ; oder die ein-oder mehr- fach, beispielsweise einfach ungesättigten Analoga der oben ge- nannten Alkane.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe d) sind gegebe- nenfalls substituierte Cycloalkane und Cycloalkene mit 4 bis 8 Ring-C-Atomen. Beispiele hierfür sind Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Cyclohexen, Cycloheptan und Cyclohepten. Die Ring- struktur kann dabei ein-oder mehrfach, wie z. B. 1 bis 5 Substi- tuenten gemäß obiger Definition für Verbindungen der Gruppen a) und b) tragen. Nichtlimitierendes Beispiel hierfür sind Ionone, wie a-, ß-und y-Ionon, sowie die entsprechenden Methylionone und Isomethylionone. Besonders bevorzugt sind a-und ß-Ionon.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, kodie- rend für eine der erfindungsgemäßen Monooxygenasen. Bevorzugte Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO : 1, welche we- nigstens eine Nukleotidsubstitution aufweisen, die zu einer der oben beschriebenen funktionellen Aminosäuremutationen führt. Ge- genstand der Erfindung sich außerdem die durch Addition, Substi- tution, Insertion und/oder Deletion einzelner oder mehrerer Nu- kleotide erhaltenen funktionalen Analoga der Nukleinsäuren, wel- che weiterhin für eine Monooxygenase mit der gewünschten Sub- stratspezifität, wie z. B. mit Indol-oxidierender Aktivität, ko- dieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs-oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten davon. Erfindungsgemäß mit umfasst sind außerdem durch Degeneration des genetischen Co- des (d. h. ohne Veränderung der korrespondierenden Aminosäurese- quenz) oder konservative Nukleotidsubstitution (d. h. die korres- pondierende Aminosäure wird durch eine andere Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhaltene Abwandlungen der Nukleinsäuresequenzen, ebenso wie durch Nukleo-

tidaddition,-insertion,-inversion oder-deletion veränderte Se- quenzen, welche für eine erfindungsgemäße Monooxygenase mit ver- ändertem Substratprofil"kodieren, sowie die korrespondierenden komplemetären Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nuklein- säuresequenzen wenigstens eine für eine erfindungsgemäße Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz ; sowie Vektoren, umfassend wenig- stens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-strom- aufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regu- lativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestim- mungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Se- quenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regu- lative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssi- gnale, Replikationsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die na- türliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürli- che Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht ent- fernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mu- tiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind : cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR-oder im 1-PL-Promotor, die vorteilhafter- weise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden ; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin-oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung indu- zierbarer Promotoren, wie z. B. licht-und insbesondere temperatu- rinduztierbarer Promotoren, wie der PrP1-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula- tionssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch syn- thetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Ex- pression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression er- möglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus be- deuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überex- primiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexpri- miert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs- weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"En- hancer"verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase-Nu- kleotidsequenz sowie einem Terminator-oder Polyadenylierungssi- gnal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations-und Klonierungs- techniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecu- lar Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fach- mann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Trans- posons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirku- läre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsor- ganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikro- organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens ei- nem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produk- tion der Mutanten eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise

werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und expri- miert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs-und Transfektionsmethoden verwendet, um die genann- ten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate er- möglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Be- vorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomy- ces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tie- ren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organis- men wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere oder Pflanzen handeln, in denen das korrespondierende endo- gene Gen ausgeschaltet wurde, wie z. B. durch Mutation oder par- tielle oder vollständige Deletion.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expres- sionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farb- gebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformier- ten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zell- sortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor trans- formierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikare- sistenzgen (z. B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden se- lektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie bei- spielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen X, t oder andere temperente Phagen oder Transposons und/ oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff"Expres- sionssystem"die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen,

und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geei- gnet sind, zu verstehen.

Wie oben beschrieben, kann das Genprodukt vorteilhaft auch in transgenen Tieren, z. B. Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Ebenso ist es möglich, zellfreie Translationssysteme mit der von der Nukleinsäure abgeleiteten RNA zu programmieren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Monooxygenase, wobei man einen Monooxyge- nase-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Monooxygenase induziert und die Monooxygenase aus der Kultur isoliert. Die erfindungsgemäße Monooxygenase könne so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geei- gnete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniais, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Monooxygenase nicht in das Kul- turmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und die Monooxygenase nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewon- nen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultra- schall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen En- zymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufge- schlossen werden. Eine Aufreinigung der Monooxygenase kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Mo- lekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultra- filtration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gel- elektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Coo- per, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte"Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epi- tope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (be- schrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press).

Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem üb- liche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiologi- schen Oxidation organischer Verbindungen, wie z. B. N-heterocy- clischer ein-, zwei-oder mehrkerniger armotischer Verbindungen gemäß obiger Definition, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man al) einen rekombinanten Mikroorganismus gemäß obiger Definition in einem Kulturmedium in Gegenwart eines exogenen (von außen zugesetzten) oder intermediär gebildeten von der erfindungs- gemäßen Monooxygenase oxidierbaren Substrats, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff (d. h. aerob), kultiviert ; oder a2) ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium mit einem erfindungsge- mäßen Enzym, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff und ei- nem Elektronendonor, inkubiert ; und b) das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

Der für die Umsetzung erforderliche Sauerstoff gelangt entweder aus der Umgebungsluft in das Reaktionsmedium oder kann, falls erforderlich, in an sich bekannter Weise zugesetzt werden.

Bevorzugt ist das oxidierbare Substrat ausgewählt unter a) gegebenenfalls substituierten N-heterocyclischen ein-, zwei- oder mehrkernigen armotischen Verbindungen ;

b) gegebenenfalls substituierten ein-oder mehrkernigen Aroma- ten ; c) geradkettigen oder verzweigten Alkanen und Alkenen ; d) gegebenenfalls substituierten Cycloalkanen und Cycloalkenen.

Eine bevorzugte Verfahrensvariante ist auf die Bildung von In- digo/Indirubin gerichtet und dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat intermediär in Kultur gebildetes Indol ist und man aus dem Kulturmedium das anfallende Indigo und/oder Indirubin iso- liert, welches durch Oxidation von intermediär gebildete Hydro- xyindolen erzeugt wurde.

Wird die erfindungsgemäße Oxidation mit einem rekombinanten Mi- kroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z. B. TB-oder LB-Medium bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 bis 40 °C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist.

Die Zugabe von exogenem Indol ist gewöhnlich nicht erforderlich, da dieses vom Mikroorganismus intermediär gebildet wird. Bei Um- setzung anderer Substrate kann dagegen die Zugabe exogenen Sub- states erforderlich sein. Um die Oxidationsreaktion besser steu- ern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren, insbesondere temperaturinduzierbaren, Promotors. Man erhöht dabei die Temperatur auf die erforderliche Induktionstemperatur, z. B.

42 °C beim PrPl-Promotor, behält dies über einen ausreichenden Zeitraum, z. B. 1 bis 10 oder 5 bis 6 Stunden, zur Expression der Monooxygenase-Aktivität bei und verringert anschließend der Tem- peratur wieder einer Wert von etwa 30 bis 40 °C. Die Kultivierung wird dann in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fort- gesetzt. Insbesondere bei Indol-Oxidation kann der pH-Wert durch Zugabe von NaOH, z. B. auf 9 bis 10, erhöht werden, wodurch die Indigobildung bzw. Indirubinbildung durch Luftoxidation der enzy- matisch gebildeten Oxidationsprodukte 2-und 3-Hydroxyindol zu- sätzlich gefördert wird.

Die erfindungsgemäße Indigo/Indirubin-Bildung wird durch folgen- des Reaktionsschema veranschaulicht :

Indol H P450BM-3- Mutante LuftoxidationOh H i Dimerisierun H H H H OU Indigo Luftoxidation Dimerisierung 0 Hou HO Indirubin I : 2-Hydroxyindol (Oxindol) II : 3-Hydroxyindol (Indoxyl) Wird die erfindungsgemäße Oxidation dagegen mit gereinigten oder angereicherten Enzymmutanten durchgeführt so löst man das erfin- dungsgemäße Enzym in einem exogenes Substrat enthaltenden, wie z. B. Indol enthaltenden, Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umsetzung, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50 °C, wie z. B.

30 bis 40 °C, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 (wie z. B. einge- stellt mit 100 bis 200 mM Phosphat-oder Tris-Puffer), sowie in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch, wobei das Substrat-hal- tige Medium außerdem bezogen auf das zu oxidierende Substrat ei- nen etwa 1-bis 100-fachen oder 10-bis 100-fachen molaren Über- schuß an Reduktionsäquivalenten enthält. Bevorzugtes Reduktions-

mittel ist NADPH. Die Zugabe des Reduktionsmittels kann falls erforderlich portionsweise erfolgen.

In analoger Weise werden als oxidierbare Substrate bevorzugt ein- gesetzt : n-Hexan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, Cumol, 1-Methylin- dol, 5-C1-oder Br-Indol, Inden, Benzothiophen, a-,-und y-Io- non, Acridin, Naphthalin, 6-Methyl-oder 8-Methylchinolin, Chino- lin und Chinaldin.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße enzymatische Oxidations- reaktion unter folgenden Bedingungen durchgeführt werden : Substratkonzentration : 0,01 bis 20 mM Enzymkonzentration : 0,1 bis 10 mg/ml Reaktionstemperatur : 10 bis 50 OC pH : 6 bis 8 Puffer : 0,05 bis 0,2 M Kaliumphosphat, oder Tris/ HC1 Elektronendonor : wird bevorzugt portionsweise zu- gegeben (Anfangskonzentration etwa 0,1 bis 2 mg/ml) Vor dem Start der Reaktion, z. B. durch Zugabe der Elektronendo- nors (z. B. NADPH) kann kurzzeitig (1 bis 5 Minuten) vorinkubiert werden (bei etwa 20 bis 40 °C). Die Umsetzung erfolgt aeorb, gege- benenfalls bei zusätzlicher Einleitung von Sauerstoff.

Beim erfindungsgemäßen Substratoxidationsprozess wird im Reakti- onsmedium enthaltener oder zugesetzter Sauerstoff reduktiv enzy- matisch gespalten. Die erforderlichen Reduktionsäquivalente wer- den von dem zugesetzten Reduktionsmittel (Elektronendonor) zur Verfügung gestellt.

Das gebildete Oxidationsprodukt kann dann in herkömmlicher Weise, wie z. B. durch Extraktion oder Chromatographie, vom Medium abge- trennt und gereinigt werden.

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Bioreaktoren, umfas- send ein erfindungsgemäßes Enzym oder einen erfindungsgemäßen re- kombinanten Mikroorganismus in immobilisierter Form.

Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung ei- ner erfindungsgemäßen Cytochrom P450 Monooxygenase oder eines er- findungsgemäßen Vektors oder Mikroorganismus zur mikrobiologi- schen Oxidation eines Substrates aus einer der Gruppen a) bis d), insbesondere N-heterocyclischer ein-, zwei-oder mehrkerniger ar-

motischer Verbindungen, und bevorzugt zur Bildung von Indigo und/ oder Indirubin.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 : Randomisierung spezieller Codons von P450 BM-3 Die Versuche wurden im wesentlichen wie beschrieben in (19) durchgeführt. Drei Positionen (Phe87, Leul88 und Ala74) wurden mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese unter Verwendung des Stratagene QuikChange kit (La Jolla, CA, USA) randomisiert. Fol- gende PCR-Primer wurden für die einzelnen Positionen verwendet : Phe87 : S'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO : 3), 5t-cgtccagcttgtnnncaacccgtetcctgc-3t, (SEQ ID NO : 4) Leul88 : 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (SEQ ID NO : 5), 5t-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3t (SEQ ID NO : 6) ; Ala74 : 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (SEQ ID No : 7), 5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO : 8) Die Bedingungen für die PCR waren für alle drei Positionen iden- tisch. Insbesondere wurden je 50 Fl Reaktionsvolumen 17,5 pmol eines jeden Primers, 20 pmol Template-Plasmid-DNA, 3 U der Pfu Polymerase und 3,25 nmol von jedem dNTP verwendet. Die PCR Reak- tion wurde bei 940C/1 min gestartet und dann wurde folgender Temperaturzyklus 20 mal durchgeführt : 94°C, 1 min ; 46°C, 2,5 min ; 72°C, 17 min. Nach 20 Zyklen wurde die Reaktion 15 min bei 72°C fortgesetzt. Nach der PCR wurde die Template DNA mit 20 U DpnI bei 37°C 3 h verdaut. Anschließend wurde E. coli DH5a transfor- miert. Die transformierten E. coli DH5a-Zellen wurden auf LB- Agarplatten ausplattiert, welche 150 g/ml Ampicillin enthielten.

Anschließend wurde 18 h bei 37°C inkubiert.

Beispiel 2 : Expression und Reinigung der P450 BM-3 und dessen Mutanten und Produktion eines blauen Pigmentes Das P450 BM-3-Gen und die Mutanten davon wurden unter der Kon- trolle des starken, Temperatur-induzierbaren PRPL-Promotors des Plasmids pCYTEXPl in E. coli DH5a wie bereits beschrieben (20), exprimiert. Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, enthaltend je Ver- tiefung 200 1 TB-Medium und 100 ßg/ml Ampicillin transferiert.

Anschließend wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. 40 fol der Zell- kultur einer jeden Vertiefung wurden anschließend in ein Kultur-

röhrchen überführt, das 2 ml TB-Medium mit 100 tg/-mi Ampicillin enthält. Anschließend wurde 2 h bei 37°C kultiviert. Dann wurde die Tempertur zur Induktion 6 h auf 42°C erhöht. Dann wurde die Kultivierung über Nacht bei 37°C fortgesetzt, wobei ein blaues Pigment produziert wurde.

Die präparative Herstellung von Enzym oder blauem Pigment wurde ausgehend von einer 300 ml Zellkultur (OD578n, = 0,8 bis 1,0) durchgefürht. Zur Isolierung des Enzymes wurden die Zellen 10 min bei 4000 Upm abzentrifugiert, in 0,1 M KxP04-Puffer, pH 7,4 resus- pendiert. Die eisgekühlten Zellen wurden mit Hilfe eines Branson Sonifiers W25 (Dietzenbach, Deutschland) bei einer Energieoutput von 80 W durch dreimalige Beschallung von 2 min vorsichtig aufge- schlossen. Die Suspensionen wurden 20 min bei 32570 x g zentrifu- giert. Der Rohextrakt wurde zur Aktivitätsbestimmung bzw. zur En- zymreinigung eingesetzt. Die Enzymreinigung erfolgte wie in (21) bereits beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Konzentration an gereinigtem Enzym wurde über die Ex- tinktionsdifferenz bei 450 und 490 nm, wie in (11) bereits be- schrieben, unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten s von 91 mM-1 cm-1 bestimmt.

Beispiel 3 : Isolierung von Mutanten, welche große Mengen an blauem Pigment produzieren Jeweils 100 Kolonien wurden von den Mutanten einer jeden Position isoliert, welche durch randomisierte Mutagenese des Codons der entsprechenden Position erzeugt wurden. Diese Kolonien wurden in Kulturröhrchen zur Produktion von blauem Pigment kultiviert. Nach dem Waschen der Zellen mit Wasser und mehreren langsamen Zentri- fugationsschritten (500 Upm) wurde das blaue Pigment mit Dime- thylsulfoxid (DMSO) extrahiert. Die Löslichkeit des blauen Pig- mentes war in DMSO am größten. Die Absorption des Extraktes wurde bei 677 nm bestimmt. Diejenige Mutante, welche die größte Menge an blauem Pigment von allen Mutanten einer bestimmten Position produzierte, wurde für eine DNA-Sequenzierung (ABI DNA Sequenzie- rungs-Kit ; ABI PrismTM 377 DNA Sequencer) verwendet und außerdem als Template für ortsspezifische randomisierte Mutagenese verwen- det.

Beispiel 4 : Aktivitätstest für die Indol-Hydroxylierung Die Indol-Hydroxylierungsaktivität wurde in einer Lösung gete- stet, die 8 1 einer 10-500 mM Indollösung in DMSO, 850 1 Tris/ HCl-Puffer (0,1 M, pH 8,2) und 0,6 nmol P450 BM-3 Wildtyp oder Mutante in einem Endvolumen von 1 ml enthielt. Das Gemisch wurde 9 min vorinkubiert, bevor man die Reaktion durch Zugabe von 50 1

einer wässrigen 1 mM Lösung von NADPH startete. Die Reaktion wurde nach 20 sec durch Zugabe von 60 1 1,2 M KOH gestoppt.

Innerhalb von 5 bis 30 sec (unter aeroben Bedingungen) wurden die Enzymprodukte vollständig in Indigo [022'-Biindolin]-3, 3-dion) und Indirubin ([A2t3-Biindolin]-2^, 3-dion) überführt. Die Indigo- produktion wurde über dessen Absorption bei 670 nm bestimmt. Eine Eichkurve mit reinem Indigo zeigte einen Extinktionskoeffizienten von 3,9 mM-1 cm-1 bei dieser Wellenlänge. Ein linearer Kurvenver- lauf wurde für die Indigoproduktion in einer Reaktionszeit von 40 sec unter Verwendung von 0,6 nmol Wildtyp bzw. P450 BM-3-Mutante und 0,05 bis 5,0 mM Indol erhalten. Indirubin zeigt eine sehr schwache Absorption bei 670 nm und die gebildete Indirubinmenge war sehr viel geringer als die gebildete Indigomenge. Die Bildung von Indirubin wurde bei der Bestimmung der kinetischen Parameter vernachlässigt. Der NADPH-Verbrauch wurde bei 340 nm bestimmt und unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 6,2 mM-1 cm-1 wie beschrieben (17) berechnet.

Beispiel 5 : Reinigung von Indigo und Indirubin Nach Waschen der Zellen mit Wasser und wiederholter Zentrifuga- tion bei 500 g wurde das gebildete blaue Pellet mit Tetrahydrofu- ran (THF) extrahiert. Der Extrakt wurde bis fast zur Trockene eingedampft und das rote Pigment wurde mehrmals mit 50 ml absolu- tem Ethanol extrahiert. Der verbleibende blaue Feststoff wurde in THF gelöst und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert.

Die Ethanollösung wurde eingedampft und durch Silicagelchromato- graphie (DC 60, Merck, Darmstadt, Deutschland ; 2 cm x 30 cm) gereinigt, bevor sie mit THF und Petrolether in einem Verhältnis von 1 : 2 gewaschen wurde. Die erhaltene rote Lösung wurde einge- dampft und deren Reinheit wurde durch TLC bestimmt. Die Absorpti- onsspektren des blauen und des roten Pigmentes wurden mit Hilfe eines Ultraspec 3000 Spektrophotometers (Pharmacia, Uppsala, Swe- den) in einem Bereich von 400 bis 800 nm bestimmt. Außerdem wurde der blaue und der rote Farbstoff durch Massenspektrometrie und 1H-NMR Spektroskopie analysiert.

Versuchsergebnisse 1. Erhöhung der Produktivität für blaues Pigment durch P450 BM-3-Mutagenese Natives P450 BM-3 besitzt nicht die Fähigkeit zur Produktion des blauen Indigo-enthaltenden Pigments, bzw. der Vorläufersubstanten 2-bzw 3-Hydroxyindol. Um eine ausreichende Menge an blauem Pig- ment herstellen zu können, wurde P450 BM3 einer gezielten Evolu- tion ausgesetzt. Sämtliche Mutanten, welche das blaue Pigment

produzierten, wurden sequenziert. Es wurde festgestellt, daß we- nigstens eine der folgenden drei Positionen mutiert waren : Phe87, Leul88 und Ala74. Es wurde deshalb angenommen, daß diese drei Positionen eine entscheidende Rolle für die Aktivität von P450 BM-3 bei der Produktion von blauem Pigment spielen. Aus der Struktur der Häm-Domäne von Cytochrom-P450-BM 3, komplexiert mit Palmitoleinsäure sieht man, daß Phe87 das Substrat an einem nähe- ren Heranrücken an die Häm-Gruppe hindert (14). Die Mutante Phe87Val zeigt eine hohe Regio-und Stereoselektität bei der Epo- xidation von (14S, 15R)-Arachidonsäure (13) und die Mutante Phe87Ala verschiebt die Hydroxylierungsposition von-1,-2 und tu-3 zu (22). Die Position 87 wurde deshalb als erste für die ortspezifische randomisierte Mutanese mit Hilfe von PCR ausge- wählt. In Röhrchenkulturen wurden 7 Kolonien erhalten, welche eine geringe Menge an blauem Pigment nach Induktion produzierten.

Die Kolonie, welche die größte Menge des blauen Pigments produ- zierte, wurde für die DNA-Sequenzierung ausgewählt Die Sequenz- daten ergaben eine Substitution von Phe87 durch Val. Die Mutante Phe87Val wurde anschließend als Template für die zweite Runde der ortsspezifischen randomisierte Mutagenese an Position Leul88 ver- wendet. Die Struktur der Ham-Domäne, komplexiert mit Palmitolein- säure zeigt, daß die Repositionierung der F-und G-Helices den Rest Leul88 in direkten Kontakt mit dem Substrat bringt (14).

Diese Position könnte deshalb eine wichtige Rolle bei der Sub- stratbindung oder-orientierung spielen. Nach dem zweiten Scree- ningdurchgang wurden 31 Kolonien beobachtet, welche das blaue Pigment produzierten. Die Mutante, welche die größte Pigmentmenge produzierte, enthielt die Substitutionen Phe87Val und Leul88Gln.

Diese Mutante wurde anschließend in Position Ala74 im dritten Durchgang der ortspezifischen randomisierten Mutagenese mutiert.

Man erhielt dabei die Dreifachmutante F87L188A74 (Phe87Val, Leul88Gln und Ala74Gly), welche mehrere mg blaues Pigment in ei- nem 2-Liter-Kolben, enthaltend 300 ml TB-Medium, produzierte.

Diese Menge reichte zur Isolierung und Charakterisierung des blauen Pigmentes aus.

2. Isolierung und Identifizierung des blauen Pigments Nach dem Auswaschen der Zellen wurde das verbleibende blaue Pel- let mit THF extrahiert und TLC analysiert. Das blaue Pigment wurde in eine schneller wandernde blaue Komponente und in eine langsamer wandernde rote Komponente aufgetrennt. Beide Komponen- ten zeigten exakt die gleichen Mobilitätsparameter wie die Kompo- nenten einer kommerziellen Indigo-Probe.

Nach der Reinigung wurden die Absorptionsspektra beider Komponen- ten in DMSO bestimmt. Die blaue Komponente zeigte das gleiche Spektrum wie eine kommerzielle Indigoprobe. Die gereinigte blaue und rote Komponente wurden jeweils durch Massenspektrometrie ana-

lysiert. Die Massenspektra beider Pigmente zeigten einen starken Molekülionenpeak bei m/z = 262 und zwei Fragmentionenpeaks bei m/z = 234 und 205 (relative Intensität jeweils 10%). Dieses Mu- ster ist typisch für indigoide Verbindungen. Die Elementarzusam- mensetzung dieser Ionen wurde durch hochauflösende Massenspektro- metrie bestimmt als C16HloN2o2 Ci5HioN20 bzw. C14H9N2. Dies ist ebenfalls charakteristisch für Strukturen vom Indigotyp. Das blaue Pigment wurde somit als Indigo und das rote Pigment als Indirubin bestimmt. Zur Bestätigung der Struktur wurden 500 MHz 1H-NMR-Spektren beider Pigmente in DMSO-D6-Lösung durchgeführt.

Die Ergebnisse stimmten mit den Literaturangaben (23) überein.

3. Produktion von Indigo mit isolierten Enzymen Es ist bekannt, daß Indigo aus Indol durch mikrobielle Transfor- mation zugänglich ist (24-26). Keines dieser mikrobiellen Systeme enthielt jedoch eine P450 Monooxygenase. Erfindungsgemäß wurde zunächst die katalytische Aktivität des reinen Enzyms für Indol bestimmt. Die Mutante F87L188A74 wurde mit Indol vermischt. Keine Farbreaktion war zu beobachten. Erst nach Zugabe von NADPH zum Reaktionsgemisch bildete sich das blaue Pigment nach etwa 20 min.

Durch Einstellung des pH-Werts der Reaktionsmischung auf einen Wert von etwa 11,30 sec nach Zugabe von NADPH, wurde die blaue Färbung innerhalb von wenigen Sekunden sichtbar. Kontrollversuche unter Verwendung von nativem P450 BM-3 waren immer negativ, selbst unter Verwendung erhöhter Konzentrationen an Enzym, Indol und NADPH. Das blaue Pigment wurde mit Ethylacetat extrahiert und durch TLC analysiert. Das blaue Pigment trennte sich wieder in eine schneller laufende blaue Komponente und in eine langsamer laufende rote Komponente auf. Die Rf-Werte und die Absorptions- spektren waren identisch mit denjenigen Werten der Extakte aus der Fermentationsbrühe. Die F87L188A74-Mutante von P450 BM-3 stellt somit eine Indolhydroxylase dar.

Es sind bisher zwei Wege für die enzymatische Transformation von Indol zu Indigo beschrieben worden. Ein Weg wird durch eine Dio- xygenase, der andere durch eine StyrolMonooxygenase katalysiert (24,25). Die NADPH-Stöchiometrie beträgt in beiden Fällen 2. Es wurde deshalb angenommen, daß im Gegensatz zu den Dioxygenasen die erfindungsgemäße Mutante F87L188A74 Indol in nur einer Posi- tion hydroxyliert, um Oxindol (2-Hydroxyindol) oder Indoxyl (3-Hydroxyindol) zu bilden.

4. Kinetische Parameter der Indolhydroxylierung Reine Proben des Wildtyp-Enzyms P450 BM-3 und der Mutanten Leul88Gln, Phe87Val, F87L188 und F87L188A74 wurden zur Bestimmung der kinetischen Parameter der Indolhydroxylierung verwendet. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1 : Kinetische Parameter der P450 BM-3 Mutanten für Indol- hydroxylierung Mutanten KCat (s-l) Km (mM) KCat/Km (M-ls-l) WT _a) Leul88Gln n. d. b) n. d. n. d.

Phe87Val 2,03 (0,14) 17,0 (1,0) 119 F87L188 2,28 (0,16) 4,2 (0,4) 543 F87L188A74 2,73 (0,16) 2,0 (0,2) 1365 a) keine Aktivität wurde beobachtet ; b) nicht bestimmt (Aktivität war zu gering um gemessen zu werden Selbst beim Überschuß an gereinigtem Enzym und hoher Indolkonzen- tration ist das Wildtyp-Enzym nicht in der Lage, Indol zu oxidie- ren. Die Mutante Leul88Gln zeigt eine geringe Aktivität. Die Mu- tante Phe87Val zeigt eine katalytische Wirksamkeit von 119 M-ls-1 für die Indolhydroxylierung. Die katalytische Effizienz der Dop- pelmutante F87L188 (Phe87Val, Leul88Gln) erhöhte sich auf 543 M-ls-1 und wurde durch Einführung der weiteren Substitution Ala74Gly auf 1365 M-ls-1 erhöht. Die Kcat-Werte erhöhten sich von Phe87Val zur Dreifachmutante hin um insgesamt 35%, während die Km-Werte etwa um das Siebenfache abnahmen. Dies weist darauf hin, daß Ala74Gly und Leul88Gln vorwiegend an der Substatbindung be- teiligt sind.

Die Indol-Turnover-Rate (KCat=2/73 5-1) war für die Dreifachmu- tante F87L188A74 mehr als zehnfach höher als für die meisten P450-Enzyme (18).

Beispiel 6 : n-Oktanhydroxylierung mit modifizierter Cytochrom P450 Monooxyge- nase Die Umsetzungen wurden mit einer P450 BM-3-Monooxygenase Mutante durchgeführt, die folgende Mutationen enthält : Phe87Val Leul88Gln Ala74Gly Als Substrat wurde n-Octan gewählt. Für die Hydroxylierung des n-Octans wurde folgender aerober Reaktionsansatz verwendet : P450 BM-3 Mutante : 17,5 mg (Lyophylisat) Reaktionspuffer : 9,1 ml (Kaliumphosphat-Puffer 50 mM, pH 7.5) Substrat : 50 1 einer 60 mM Lösung (in Aceton) Temperatur : 25°C

Enzymlyophylisat wurde in 500 l Reaktionspuffer gelöst und zu- nächst mit Substrat und Reaktionspuffer 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 300 1 NADPH-Lö- sung (5mg/ml). Die NADPH Zugabe wurde noch zweimal wiederholt.

Der Reaktionsverlauf wurde durch Absorptionsmessungen bei 340 nm verfolgt, wobei die NADPH Abnahme beobachtet werden kann. NADPH wird dabei in 300 1-Schritten zugegeben, da eine zu hohe Konzen- tration an NADPH in der Reaktionslösung zu einer Inaktivierung des Enzyms führt. Zur Isolierung der Produkte wurde anschließend die Reaktionslösung 3 mal mit 5 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Anschließend wurden die Produkte über DC, GC/MS und NMR charakterisiert.

Die GC/MS Analyse des Reaktionsgemisches führte zu folgendem Er- gebnis : Verbindung Rt [min] 1) Umsatz [%] 4-Octanol 13.51 37 3-Octanol 14.08 47 2-Octanol 14.26 16 1) Temperaturprogramm : 40°C 1 min isotherm/3°C/min 95°C/10°C/min 275°C ; Apparatur : Finnigan MAT 95 ; GC : HP 5890 Series II Split Injector ; Säule : HP-5MS (Methylsiloxan) 30m x 0.25mm ; Träger- gas : 0,065 ml/min He Edukt wurde nicht mehr gefunden.

Beispiel 7 : Hydroxylierung von Aromaten, Heteroaromaten und Trimethylcyclohe- xenylverbindungen a) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n-Ok- tan als Substrat Naphthalin eingesetzt wurde. Als Produkte wurden 1-Naphthol und cis-1,2-Dihydroxy-1,2-dihydronaphthalin identifiziert. Vom eingesetzten Naphthalin wurden 88% umge- setzt.

Analytik für Umsetzungen mit Naphthalin GC : Apparatur : Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on Column Injector ; Säule : DB5 30m x 0,2 mm ; Material : 5% Diphenyl-95% Dimethylpolysiloxan ; Trägergas : 0,5 bar H2 ;

Temperaturprogramm : 40°C 1 min isotherm/10°C/min bis 300°C Rt (1-Naphthol) = 16.68 NMR : Im 1H-NMR konnte 1-Naphthol und cis-1,2-Dihydroxy-1,2-dihy- dronaphthalin identifiziert werden. b) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n-Ok- tan als Substrat 8-Methylchinolin eingesetzt wurde. Als Hauptprodukt wurde 5-Hydroxy-8-methylchinolin neben weiteren Derivaten (Produktverhältnis 5 : 1) identifiziert. Vom einge- setzten Edukt wurden 35% umgesetzt. c) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n-Ok- tan als Substrat a-Ionon eingesetzt wurde. Als Hauptprodukt wurde 3-Hydroxy-a-ionon neben weiteren Derivaten (Produktver- hältnis 76 : 24) identifiziert. Vom eingesetzten Edukt wurden 60% umgesetzt. d) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n-Ok- tan als Substrat Cumol (i-Propylbenzol) eingesetzt wurde. Es wurden fünf Monohydroxyprodukte und ein Dihydroxyprodukt identifiziert. Vom eingesetzten Edukt wurden 70% umgesetzt.

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