TITRE : Nouveaux exopolysaccharides dépolymérisés, issus de micro-algues, leur procédé de préparation et leurs utilisations en cosmétique pour retarder les effets du vieillissement cutané

La présente invention concerne le domaine cosmétique et notamment le retardement des effets du vieillissement cutané.

Le vieillissement cutané est un phénomène normal qui touche l’ensemble des personnes et qui est sous l’influence de différents facteurs regroupés en deux catégories : les facteurs intrinsèques et extrinsèques. Les causes intrinsèques sont sous l’influence de paramètres génétiques touchant l’ensemble du corps. On peut citer la sénescence cellulaire qui correspond à un arrêt de la prolifération des cellules lorsqu’un nombre précis de mitoses est atteint, la diminution des hormones touchant principalement les femmes en ménopause et le raccourcissement des télomères ayant aussi pour conséquence l’arrêt de la prolifération cellulaire. Les facteurs extrinsèques regroupent les rayonnements UV (UVA et UVB), une mauvaise alimentation, le tabagisme et le stress. Ils ont pour conséquence d’accélérer les signes du vieillissement cutané que sont l’apparition de rides, une perte d’élasticité de la peau, des modifications des reliefs cutanés, une perte de l’hydratation ou bien encore une pigmentation anormale.

Ces signes sont principalement les conséquences d’une désorganisation de la matrice extracellulaire du derme (couche intermédiaire de la peau). Cette matrice, abondante et dense, se compose de fibroblastes et de cellules sanguines auxquels sont associés des protéines fibreuses, collagènes, réticuline et élastine, formant un ensemble compact. Ces protéines fibreuses baignent dans un liquide dénommé matrice extra-fibrillaire, incolore, transparent, visqueux et essentiellement constitué d’eau, de glycosaminoglycanes acides, en particulier d’acide hyaluronique, de glycoprotéines et de protéoglycanes. Les fibres de collagène confèrent au derme ses propriétés de résistance et de cicatrisation tandis que l’acide hyaluronique lui apporte des capacités importantes d’hydratation, 1 g d'acide hyaluronique pouvant retenir jusqu'à 6 L d'eau, et joue par conséquent un rôle majeur, avec les fibres d’élastine, dans ses propriétés de souplesse et d’élasticité. Environ 50% de l’acide hyaluronique total de l’organisme se trouve dans le derme mais une part est également retrouvée dans l’épiderme. Avec l’âge et/ou une exposition importante aux facteurs extrinsèques, les fibroblastes, cellules à l’origine des synthèses de collagènes et d’acide hyaluronique, voient leurs capacités de renouvellement de ces macromolécules diminuer, en parallèle de l’augmentation de leur dégradation, notamment due à l’activation des métalloprotéases et hyaluronidases matricielles. De plus, la croissance de ces cellules est aussi ralentie avec l’âge.

C’est dans ce contexte que les nouveaux actifs cosmétiques interviennent avec pour objectifs de favoriser la croissance des fibroblastes, de ralentir la dégradation et/ou d’augmenter la synthèse des macromolécules du derme, afin de lutter contre les signes du vieillissement cutané.

L’acide hyaluronique est un polysaccharide linéaire non sulfaté, composé d’unités disaccharidiques répétitives appelées acides hyalobiuroniques, associant un acide D-glucuronique et une N-acétyl-D-glucosamine, liés en b-(1 ,3). Les acides hyalobiuroniques sont liés en b-(1 ,4) pour former l’acide hyaluronique. La quantité d’acide hyaluronique dans le corps est estimée à 15 g, dont la moitié est située dans la peau avec une distribution plus importante dans le derme. La synthèse de ce polysaccharide débute au niveau de la face interne de la membrane cellulaire puis il passe au travers de cette membrane pour se retrouver dans la matrice extracellulaire où sa synthèse se termine. Sa taille varie entre 0,4.10 ⁵ et 4. 10 ⁶ Da selon les enzymes intervenant dans sa production. Au sein de la matrice extracellulaire, l’acide hyaluronique a plusieurs fonctions. Tout d’abord il sert de matrice sur laquelle une centaine de protéoglycanes sulfatés peuvent se fixer. De par sa structure supramoléculaire, il a la capacité de fixer une quantité importante de molécules d’eau permettant de maintenir l’hydratation et la turgescence des tissus.

Le collagène est la protéine la plus abondante dans le corps humain. Cette protéine représente 30 % des protéines totales dont 65 à 75 % (en poids sec) sont retrouvés dans le derme. A ce jour, 27 collagènes ont été décrits. Ils sont numérotés en chiffres romains de I à XXVII, dans l’ordre quasi-respecté de leurs découvertes. Ils sont classés en 5 catégories :

- Les collagènes fibreux

- Les collagènes formant un réseau

- Les collagènes associés aux triples hélices

- Les collagènes transmembranaires

- Les autres Le derme est majoritairement composé de collagènes fibrillaires comme les collagènes de type I (75 %) et III (15 %), dont le rôle est de conférer à la peau une résistance à la traction.

La tendance actuelle dans le domaine cosmétique est l’utilisation d’actifs d’origines naturelles, dans la mesure où les consommateurs sont de plus en plus attentifs aux effets secondaires des produits chimiques, ce qui pousse les acteurs de l’industrie cosmétique à orienter leur communication vers les avantages des ingrédients naturels.

Les exopolysaccharides (EPS) issus des micro-algues sont principalement connus pour leurs activités antioxydantes, anticancéreuses ou bien immuno- modulatrices.

Les micro-algues sont principalement retrouvées sous la forme d’extrait dans les formulations cosmétiques.

L’application cosmétique d’EPS issus de micro-algues a par ailleurs été envisagée. Ainsi, NSPS ^® (Natural Sulfated Polysaccharide) est un EPS excrété par la micro-algue rouge Porphyridium cruentum, dont les activités anti-âge, antioxydante, hydratante et protectrice des UV ont été rapportées. D’un point de vue structural, cet EPS anionique présente un poids moléculaire estimé entre 3 000 et 5 000 kDa, est composé de xylose (40 %), glucose (5 à 25 %), galactose (20 à 30 %) et acide glucuronique (7 %), et affiche une teneur en groupements sulfates comprise entre 7 et 13 %.

US 2009/0069213 rapporte pour sa part l’activité pro-collagène d’EPS issus de micro-algues de type Porphyridium sp.

La dépolymérisation d’extraits issus d’algues (WO 2019/193556), ou de souches bactériennes (WO 2012/072245), ainsi que l’utilisation des extraits dépolymérisés obtenus, en cosmétique notamment, ont également été envisagées.

Néanmoins, la dépolymérisation d’extraits de micro-algues est généralement difficile, certains extraits étant résistants à l’hydrolyse acide supportée, ce qui limite fortement leur application industrielle.

De plus, la relation entre structure oligo- ou poly-saccharidique et fonction biologique est inconnue, notamment pour les activités pro-collagène et pro-acide hyaluronique. Il reste donc à mettre à disposition de nouveaux actifs issus de micro-algues, présentant des activités pro-collagène et pro-acide hyaluronique.

La présente invention concerne un exopolysaccharide dépolymérisé issu de micro-algues sélectionnées parmi le groupe constitué des espèces suivantes : Glossomastix sp. RCC3688,

Chrysotila dentata RCC6312,

Pavlova sp. RCC3438,

Diacronema ennorea RCC3514,

Glossomastix sp. RCC3707,

Phaeodactylum tricornutum RCC2967, et Synechococcus sp RCC 2380.

De façon inattendue, selon l’invention, des effets anti-âges agissant sur les synthèses de collagènes et d’acide hyaluronique ont été découverts pour les EPS micro-algaux tels que définis ci-avant. De plus, ces EPS exercent des activités beaucoup plus importantes que l’acide hyaluronique, qui est le polysaccharide retrouvé dans de nombreuses crèmes anti-âges, et ce à des concentrations 5 à 100 fois plus faibles.

Au sens de l’invention, le terme « exopolysaccharide » (EPS) désigne les polysaccharides secrétés par les micro-algues, les polysaccharides étant définis comme des polymères de la famille des glucides constitués de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons osidiques.

Une liaison osidique désigne une liaison chimique covalente de type oxydique entre :

• Le carbone hémi-acétalique d'un ose (carbone anomère, numéro 1 chez les aldoses et numéro 2 chez les cétoses) ; et

• L’alcool d’un carbone non anomérique d’un deuxième ose, les oses impliqués pouvant être variés : oses neutres, acides, aminés, N-acétylés, sulfatés, ...

Les EPS sous leur forme initiale présentent généralement un poids moléculaire supérieur à 1500 kDa. Typiquement, les EPS sous leur forme initiale présentent les compositions monosaccharidiques suivantes, déterminées par recoupement des méthodes d’analyse par chromatographie gazeuse couplée à la détection par spectrométrie de masse (GC-MS) et chromatographie liquide haute performance échangeuse d’anions couplée à la détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) :

1 ) EPS de Glossomastix sp. RCC3688 :

Composition osidique caractérisant un rhamno-fucane (54-57 % fucose, 20-28 % rhamnose), présentant également en moindres proportions : acide glucuronique (9-10 %), acide galacturonique (5-11 %) et galactose (2-4 %).

2) EPS de Chrysotila dentata RCC6312 :

Composition osidique caractérisant un xylo-arabino-galactane (33-36 % galactose, 33-36 % arabinose, 16-17 % xylose), présentant également en moindres proportions : mannose (8-10 %), acide glucuronique (4 %), fucose (traces), glucose (traces) et acide galacturonique (traces).

3) EPS de Pavlova sp. RCC3438 :

Composition osidique caractérisant un gluco-galacto-rhamnane (30-47 % rhamnose, 27-29 % galactose, 11 -17 % glucose,), présentant également en moindres proportions : arabinose (5-14 %), xylose (3-6 %), acide glucuronique (4-5 %) et mannose (traces %).

4) EPS de Diacronema ennorea RCC3514 :

Composition osidique caractérisant un gluco-galacto-rhamnane (33-37 % rhamnose, 23-26 % galactose, 15-16 % glucose), présentant également en moindres proportions : arabinose (8-17 %), xylose (5-10 %), acide glucuronique (4 %) et acide galacturonique (traces).

5) EPS de Glossomastix sp. RCC3707 :

Composition osidique caractérisant un galacturono-rhamno-fucane (40-47 % fucose, 27-31 % rhamnose, 15-21 % acide galacturonique), présentant également en moindres proportions : acide glucuronique (6-7 %), galactose (2-3 %), glucose (traces) et xylose (traces).

6) EPS de Phaeodactylum tricornutum RCC2967 :

Composition osidique caractérisant un rhamno-xylo-galactane (27-36 % galactose, 16-25 % xylose, 13-23 % rhamnose), présentant également en moindres proportions : fucose (4-9 %), glucose (6 %), arabinose (6 %) et acide glucuronique (3-4 %).

7) EPS de Synechococcus sp. RCC2380 : Composition osidique caractérisant un fuco-galacto-glucane (38-49 % glucose, 27-38 % galactose, 20-24 % fucose), présentant également des traces de rhamnose, arabinose, acide glucuronique et acide galacturonique.

Selon un mode de réalisation, ledit EPS sous sa forme initiale présente donc une structure choisie parmi : xylo-galactane, rhamno-xylo-galactane, xylo-arabino- galactane, rhamno-fucane, galacturono-rhamno-fucane gluco-galacto-rhamnane, fuco-galacto-glucane.

Les EPS selon la présente invention sont dépolymérisés.

On entend par dépolymérisation un processus de conversion de chaînes polymériques en fragments de bas poids moléculaires moyens, de type oligomère et/ou monomère, généralement sous forme de mélanges.

Les EPS dépolymérisés sont obtenus par hydrolyse acide supportée puis lyophilisés. Typiquement, les EPS dépolymérisés ont un poids moléculaire moyen en masse compris entre 14 et 2 000 kDa, notamment inférieur à 100 kDa, notamment entre 40 et 60 kDa, particulièrement environ 50 kDa.

Tel qu’utilisé ici, le terme micro-algue fait référence aux algues microscopiques, parfois appelées microphytes.

Selon l’invention, les micro-algues appartiennent aux genres Glossomastix, Chrysotila, Pavlova, Diacronema Phaeodactylum et Synechococcus, et plus particulièrement aux espèces Glossomastix sp. RCC3688, Chrysotila dentata RCC6312, Pavlova sp. RCC3438, Diacronema ennorea RCC3514, Glossomastix sp. RCC3707, Phaeodactylum tricornutum RCC2967, et Synechococcus sp RCC 2380.

On peut ainsi citer les EPS issus des micro-algues suivantes :

Synechococcus sp référencée RCC2380 dans la collection de culture de Roscoff ;

Glossomastix sp. et Phaeodactylum tricornutum, respectivement référencées RCC3688 et RCC2967 dans la collection de culture de Roscoff.

Plus précisément, les EPS de l’invention sont issus des souches suivantes :

Glossomastix sp. RCC3688, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/2. Chrysotila dentata RCC6312, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 918/3.

Pavlova sp.RCC3438, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 940/5.

Diacronema sp.RCC3514, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 914/3.

Glossomastix sp. RCC3707, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/1 .

Phaeodactylum tricornutum RCC2967, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 1055/17. et

Synechococcus sp RCC2380 souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 1479/23.

Lesdites souches ont été déposées par SATT Ouest Valo, 14 C rue du Pâtis Tatelin, Métropolis 2, CS 80804, 35708 Rennes Cedex, France, le 9 décembre 2020, auprès de l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Association for Marine Science (SAMS), Scottish Marine Institute, Oban, Argyll, PA37 1QA, UK.

Une souche est définie ici comme un rang taxinomique de bas niveau représentant un sous-type de micro-algue.

Selon un autre objet, la présente invention concerne le procédé de préparation des EPS dépolymérisés selon l’invention.

Selon un mode de réalisation, les EPS natifs sont tout d’abord obtenus par culture des micro-algues correspondantes. Cette culture peut être faite selon des méthodologies classiques, telles que par exemple en erlenmeyer, en photobioréacteur cylindrique ou torique, ou en airlift. La culture des micro-algues est maîtrisée par les industriels, permettant ainsi de générer une matière première plus facilement.

Les EPS étant excrétés par les micro-algues, ils sont présents dans les milieux de cultures. Leur séparation peut être effectuée par collecte des surnageants de culture dans lesquels ils sont solubles.

Cette collecte ne requiert donc aucune étape d’extraction intracellulaire. Ceci a pour avantage de réduire le coût d’obtention de la matière première.

Typiquement, les surnageants sont ensuite traités par des séries de dilution/concentration, puis congélation et séchage, par lyophilisation par exemple.

Ainsi selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend l’étape d’obtention de l’EPS à partir de la micro-algue par :

- culture de ladite micro-algue,

- collecte du surnageant de culture,

- concentration/dilution,

- et éventuellement lyophilisation.

La dépolymérisation est conduite à partir des EPS ainsi obtenus, préalablement mis en solution et traités par haute pression.

Typiquement, le traitement par haute pression est conduit à des pressions comprises entre 1 et 5 kBars, notamment 2,7 kBars.

Si nécessaire, les EPS ainsi pré-traités peuvent être congelés et lyophilisés avant d’être dépolymérisés.

Typiquement, la dépolymérisation est conduite par hydrolyse acide, notamment assistée par une résine cationique, notamment une résine cationique forte.

Ainsi, selon l’invention, le procédé de préparation d’un EPS comprend :

- le traitement de l’EPS tel que décrit ci-avant à haute pression, et

- l’hydrolyse acide assistée par une résine cationique forte.

Selon un mode de réalisation, la résine cationique forte est une résine CAS39389-20-3 Amberlyst ^® 15 DRY (Merck, France). Avantageusement, il a été mis en évidence que la résine de type Amberlyst ^® 15 DRY, résine cationique acide forte (4,5 meq H ⁺ /g _m atière sèche) permet la dépolymérisation des 8 EPS, y compris ceux présentant des structures résistantes à la dépolymérisation par hydrolyse acide supportée. L’hydrolyse peut être discontinue (en batch) ou continue. Avantageusement, la résine cationique peut être réutilisée après une simple étape de régénération à l’aide d’acide concentré.

L’hydrolyse est typiquement conduite pendant la durée nécessaire pour atteindre des poids moléculaires moyens dans la gamme désirée, notamment compris entre 15 et 200 kDa, notamment inférieurs à 100 kDa. Ceci peut être réalisé et contrôlé par prélèvements et analyses par HPLC, par exemple par application de la méthodologie décrite dans les exemples.

Selon un autre objet, la présente invention concerne également l’utilisation cosmétique des EPS dépolymérisés.

Ainsi, elle vise une composition cosmétique comprenant un ou plusieurs exopolysaccharide(s) dépolymérisé(s) tels que définis ci-avant, et au moins un excipient dermatologiquement acceptable.

Le terme cosmétique utilisé ici s’entend au sens du règlement CE 1223/2009, article 2 : « Les produits cosmétiques regroupent toute substance ou tout mélange destiné à être mis en contact avec les parties superficielles du corps humain ou avec les dents et les muqueuses buccales en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d’en modifier l’aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles. ».

Il est entendu que l’utilisation cosmétique selon l’invention est non- thérapeutique.

Les compositions sont des formulations aptes à être appliquées par voie topique.

« Formulations adaptées pour une administration topique » fait référence à des formulations qui sont sous une forme adaptée pour être appliquées par voie topique à un patient. La formulation peut se présenter comme une pommade topique, des baumes, des poudres, des sprays, des gels (à base d'eau ou d'alcool), des crèmes, comme il est généralement connu dans la technique. Quand ils sont formulés dans une pommade, les ingrédients actifs peuvent être employés avec une base de pommade paraffinique ou miscible dans l'eau. En variante, les ingrédients actifs peuvent être formulés dans une crème avec une base de crème huile-dans-l'eau, l'ingrédient actif étant dans un véhicule liquide adapté. Le terme « Composition cosmétique » signifie une composition comprenant un EPS dépolymérisé selon l’invention et au moins un excipient cosmétiquement acceptable, choisi dans le groupe comprenant les transporteurs, diluants, adjuvants, excipients, ou véhicules, tels que les agents de conservation, les charges, les agents désintégrants, les agents mouillants, les agents émulsifiants, les agents de suspension, les agents édulcorants, les agents aromatisants, les agents parfumants, les agents antibactériens, les agents antifongiques, les agents lubrifiants, et les agents dispersants, selon la nature du mode d'application et les formes de dosage. Les exemples d'agents de suspension comprennent les alcools isostéaryle éthoxylés, le polyoxyéthylène sorbitol et les esters de sorbitan, la cellulose microcristalline, le métahydroxyde d'aluminium, la bentonite, l'agar-agar et la tragacanthe, ou des mélanges de ces substances. La prévention de l'action des microorganismes peut être assurée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple les parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique, et similaires. Il peut aussi être souhaitable de comprendre les agents isotoniques, par exemple les sucres, le chlorure de sodium et similaires. Les exemples de transporteurs, diluants, solvants ou véhicules adaptés comprennent l'eau, l'éthanol, les polyols, leurs mélanges adaptés, les huiles végétales (telles que l'huile d'olive) et les esters organiques injectables tels que l'oléate d’éthyle. Les exemples d'excipients comprennent le lactose, le sucre de lait, le citrate de sodium, le carbonate de calcium, le phosphate dicalcique. Les exemples d'agents désintégrants comprennent l'amidon, les acides alginiques et certains silicates complexes. Les exemples de lubrifiants comprennent le stéarate de magnésium, le lauryl sulfate de sodium, le talc, ainsi que des polyéthylène-glycols de haute masse moléculaire.

« Cosmétiquement acceptable » signifie que c'est adapté pour une utilisation en contact avec le derme des humains, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaires, et sont proportionnés à un rapport avantage/risque raisonnable.

La présente invention concerne également une méthode cosmétique pour lutter contre le vieillissement cutané comprenant l’application topique d’une composition selon l’invention.

Selon un mode de réalisation, la méthode comprend :

- l’augmentation de la production de collagène et/ou

- l’augmentation de la production d’acide hyaluronique.

Figures : [Fig 1 ] La Figure 1 illustre les effets des EPS sous forme initiale sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD-1059Sk (20 ans).

[Fig 2] La Figure 2 représente les effets des EPS sous forme initiale sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD-1090Sk (46 ans).

[Fig 3] La Figure 3 représente les effets des EPS dépolymérisés en système discontinu sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD-1059Sk (20 ans).

[Fig 4] La Figure 4 représente les effets des EPS dépolymérisés en système discontinu sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD-1090Sk (46 ans).

[Fig 5] La Figure 5 représente les effets des EPS dépolymérisés en système continu sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD- 1059Sk (20 ans).

[Fig 6] La Figure 6 représente les effets des EPS dépolymérisés en système continu sur la production de collagène par les fibroblastes dermiques humains CCD- 1090Sk (46 ans).

[Fig 7] La Figure 7 représente les effets des différentes formes des EPS sur la production d’acide hyaluronique sécrété par les fibroblastes dermiques humains CCD-1059Sk (20 ans).

[Fig 8] La Figure 8 représente les effets des différentes formes des EPS sur la production d’acide hyaluronique sécrété par les fibroblastes dermiques humains CCD-1090Sk (46 ans).

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.

Exemple 1 : Culture des micro-alaues et obtention des exopolvsaccharides (EPS) micro-alaaux.

A. Cultures des micro-alaues : a. Composition du milieu de culture. Le milieu de référence pour la culture des micro-algues est un milieu F/2 développé par Guillard ( Canadian Journal of Microbiology 8 (2) : 229-39 (1962)), enrichi en NaNC>3 et NahbPC . Il est constitué d’eau de mer artificielle supplémentée par 0,01 % d’une solution de microéléments ; 0,01 % d’une solution de vitamines ; 0,17 % de NaNC>3 et 0,055 % de NaH ₂ PC> ₄ . Les compositions des différentes solutions sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous :

[Table 11: Compositions des différentes solutions pour réaliser le milieu de culture F/2 enrichi

Solution d'eau de mer artificielle

NaCI 28,13 g

KCI 0,77 g

CaCI ₂ ,2H ₂ 0 1 ,6 g MgCI ₂ ,6H ₂ 0 4,8 g NaHCOs 0,11 g MgS0 ₄ .7H ₂ 0 3,5 g Eau Milli-Q qsp 1000 mL

Solution de microéléments 10X

Na ₂ EDTA 4,16 g

FeCI ₃ ,6H ₂ 0 3,15 g

CUSC> ₄ ,5H ₂ 0 0,01 g

ZnS0 ₄ ,7H ₂ 0 0,022 g

COCI ₂ ,6H ₂ 0 0,01 g

MnCI ₂ ,4H ₂ 0 0,18 g

Na ₂ MoC> ₄ ,2H ₂ 0 0,006 g

Eau Milli-Q qsp 100 mL

Solution de vitamines 10X

Cyanocobalamine (B12) 0,0005 g Thiamine (BI ) 0,1 g

Biotine 0,0005 g

Eau Milli-Q qsp 100 mL

Les solutions de microéléments et de vitamines sont réalisées au préalable et sont stérilisées respectivement par autoclavage à 121 °C pendant 20 min et filtration sur 0,22 pm. Elles sont ensuite stockées à 4 °C avant leur utilisation. Le pH du milieu est ajusté à 8 avant l’ajout des solutions de microéléments et de vitamines puis le milieu est stérilisé par filtration sur 0,22 pm. Ce milieu final sera appelé « milieu F/2 enrichi ». b. Systèmes de culture.

Les différentes souches de micro-algues productrices d’EPS sont cultivées dans différents bioréacteurs.

1. Culture en erlenmever.

La souche Synechococcus sp. (référencée RCC2380 dans la collection de culture de Roscoff et CCAP 1479/23 dans la collection du SAMS), est cultivée dans des erlenmeyers de 500 mL contenant chacun 200 mL de milieu F/2 enrichi et 20 mL d’inoculum. Les cultures sont maintenues en photoautotrophie avec les paramètres de culture suivants :

- Température de 20 °C

- Agitation de 120 rpm

- Irradiance de 40 pmol _Photons .nr ² .s ^·1 avec un cycle jour/nuit de 16 h/8 h

2. Culture en photobioréacteur cylindrique.

Les souches Glossomastix sp. et Phaeodactylum tricornutum (respectivement référencées RCC3688 et RCC2967 dans la collection de culture de Roscoff et CCAP 2912/2 et CCAP 1055/17, respectivement)) sont cultivées séparément dans un photobioréacteur cylindrique de 5 L irradié par de la lumière blanche émise par 55 lampes halogènes (Sylvania professional 25, BAB 38°, 12 V, 20 W) situées en périphérie. L’irradiance, contrôlée et modulée par un générateur de tension variable, est fixée à 150 pmol _Photons .nr ² .s ^·1 au début des cultures puis est augmentée au fur et à mesure de la densification cellulaire sans jamais dépasser 350 pmol _Photons .nr ² .s ^·1 . Le photobioréacteur est pourvu de sondes permettant le suivi des paramètres de culture (pH, pC>2 et température). La température, fixée à 20 °C, est maintenue par thermorégulation à l’aide d’un cryostat. Un condensateur thermorégulé à 4 °C permet de limiter l’évaporation. Le pH, aux alentours de 8, est régulé à la fois par modification du taux de CO2 injecté dans le photobioréacteur à un débit de 100 mL.min ^_1 (variable selon les souches mais jamais supérieur à 3 %) et par ajout d’HC1 1 M via un septum. Le mélange Air/CC>2 est stérilisé par filtration sur 0,22 pm. Les cultures sont homogénéisées par une agitation mécanique provenant de 2 pales Rushton. La vitesse de rotation est initialement fixée à 120 rpm puis augmentée en fonction de l’hétérogénéité des cultures de micro-algues. Les cultures sont réalisées dans un volume final de 5 L contenant 4,2 L de milieu de culture F/2 enrichi et 800 mL d’inoculum en phase exponentielle. Le mode de culture est discontinu (batch) et en photoautotrophie sans phase d’obscurité.

3. Culture en photobioréacteur torique.

Les souches Chrysotila dentata, Pavlova sp. et Diacronema sp.(respectivement référencées RCC6312, RCC3438 et RCC3514 dans la collection de culture de Roscoff et CCAP 918/3, CCAP 940/5 et CCAP 914/3, respectivement) sont cultivées en photobioréacteur torique. Il s’agit d’un réacteur plan composé de deux parties non communicantes séparée par une plaque en inox. La première partie de 1 ,4 L contient la culture des micro-algues et l’autre partie est reliée au circuit d’eau qui permet le maintien de la température de culture. La paroi de la partie culture est réalisée en polycarbonate transparent afin de laisser pénétrer la lumière. Le système lumineux, situé devant la partie culture, est composé de 144 lampes LED (72 lampes rouges et 72 lampes bleues), qui émettent à des longueurs d’ondes spécifiques des pigments intervenant dans la photosynthèse (chlorophylles a et b). L’intensité lumineuse est fixée initialement à 150 pmol _Photons .nr ² .s ¹ et est augmentée au fur et à mesure de la densification cellulaire sans jamais dépasser 300 pmol _Photons .nr ² .s ¹ . Ce photobioréacteur est équipé de capteurs de température et de pH. Les paramètres de culture (intensité lumineuse, température et pH) sont contrôlés via un logiciel développé sous LabView, et sont modulables au cours de l’expérimentation. La température est fixée à 20 °C et est maintenue stable par thermorégulation via un cryostat. Le photobioréacteur dispose aussi d’un condensateur thermorégulé à 4 °C pour réduire les effets d’évaporation. Le pH, autour de 8, est régulé à la fois par modification du taux de CO2 injecté dans le réacteur à un débit de 200 mL.min ^_1 (variable suivant les souches mais jamais supérieur à 3 %) et par ajout d’HC1 1 M via un septum. Le mélange Air/CC>2 est stérilisé par filtration sur 0,22 pm. L’agitation mécanique provient de 2 pales de type hélice marine. Elle est fixée à 100 rpm lors de l’inoculation puis évolue en fonction de l’hétérogénéité de la culture. Les cellules sont cultivées en mode discontinu (batch) et en photoautotrophie continue. Les cultures de volume final de 1 L sont préparées avec 800 mL de milieu F/2 enrichi et 200 mL d’inoculum en phase exponentielle.

4. Culture en airlift.

La souche Glossomastix sp. (référencée RCC3707 dans la collection de culture de Roscoff et CCAP 2912/1 ) est cultivée en condition airlift dans des bouteilles (2 à 5 L), afin de pallier sa sensibilité à l’agitation mécanique. Les cultures airlift sont équipées d’un diffuseur d’air cylindrique relié à un réseau d’air comprimé stérilisé par filtration sur 0,22 pm. Les cultures sont réalisées à 20 °C et irradiées par des néons afin de générer une irradiance de 40 pmol _P hotons.nr ² .s· ¹ . La souche est cultivée en mode discontinu (batch) et en photoautotrophie avec un cycle jour/nuit de 16 h/8 h. Les cultures de 2 et 5 L sont réalisées respectivement avec 200 et 500 mL d’inoculum en phase exponentielle et complétées avec du milieu F/2 enrichi.

B. Procédé de post-culture pour obtenir les exopolvsaccharides micro-alaaux :

Pour les souches RCC2380, RCC3438, RCC3688 et RCC3707, les volumes de cultures finaux sont dilués par trois avec du milieu F/2 enrichi afin de réduire leurs viscosités importantes.

L’ensemble des cultures sont centrifugées à 14000 x g pendant 25 min à 20 °C afin de séparer les cellules et de collecter les surnageants contenant les EPS solubles. Les surnageants sont traités par des séries de concentrations/dilutions au moyen d’un système Vivaflow 200, couplé à une cassette de filtration tangentielle constituée d’une membrane en polyéther-sulfone avec un seuil de coupure de 50 kDa. Les cycles de concentrations/dilutions sont répétés jusqu’à l’obtention d’une conductivité des perméats équivalente à celle de l’eau (~ 2 pS.cnr ¹ ). Les solutions concentrées d’EPS obtenues sont congelées à -80 °C avant d’être séchées par lyophilisation (Thermo Electron Corporation, Heto PowerDry OL 6000). Les EPS secs sont stockés dans des flacons hermétiques à température ambiante jusqu’à leurs utilisations.

Exemple 2 : Méthode de dépolvmérisation des EPS par prétraitement haute pression suivi d’une hvdrolvse acide supportée utilisant une résine cationique forte.

A. Prétraitement des exopolvsaccharides par haute pression :

La dépolymérisation débute par un prétraitement par haute pression afin de réduire la viscosité des EPS et d’initier la réduction de leur taille.

Le prétraitement par haute pression est réalisé à l’aide d’un broyeur haute pression TS HAIVA initialement conçu pour la lyse cellulaire. La solution d’exopolysaccharide à 20 mg/mL est passée dans le broyeur réglé sur une pression de 2,7 kBars. 10 mL d’eau ultra-pure sont ensuite injectés dans le broyeur afin de limiter les pertes de matière. Ces deux étapes sont répétées 4 fois. La solution d’EPS ainsi que les eaux de rinçages sont rassemblées puis congelées à -80 °C avant d’être séchées par lyophilisation (Thermo Electron Corporation, Heto PowerDry OL 6000). B. Dépolvmérisation des exopolvsaccharides par hydrolyse acide supportée :

La dépolymérisation par hydrolyse acide supportée est réalisée à l’aide d’une résine Amberlyst ^® 15 DRY (Merck, France). Il s’agit d’une résine cationique forte caractérisée par 4,5 meq H ⁺ /g _m atière sèche- Cette hydrolyse est réalisée dans des systèmes discontinu (batch) ou continu. a. Système discontinu (batch).

Le système discontinu est composé d’une bouteille en verre de 50 mL contenant 10 g de résine Amberlyst ^® 15 DRY préalablement hydratée et nettoyée avec de l’eau ultra-pure. 25 mL de solution d’EPS prétraité sont ajoutés dans le système, qui est maintenu à 80 °C et homogénéisé par agitation orbitale à 120 rpm. Après 48 h, durée considérée optimale après étude de la cinétique de dépolymérisation, la solution d’EPS dépolymérisé est récupérée, refroidie dans un bain de glace, séparée de la résine par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante, puis neutralisée à pH 7 par ajout de NaOH 1 M, congelée à - 80 °C et lyophilisée. Le lyophilisât ainsi obtenu, dénommé « EPS-DPB », est conservé en flacon hermétique à température ambiante, avant utilisation ultérieure. b. Système continu.

Le système continu utilisé est un système en boucle, composé d’une bouteille en verre de 50 mL ci-après dénommée réservoir d’alimentation, contenant 30 mL de solution d’EPS prétraité, alimentant au moyen d’une pompe péristaltique une colonne en verre contenant 10 g de résine Amberlyst ^® 15 DRY préalablement hydratée et nettoyée avec de l’eau ultra-pure. En sortie de colonne, la solution d’EPS est reconduite dans le réservoir d’alimentation Le réservoir d’alimentation et la colonne sont maintenus à 80 °C, respectivement grâce à une plaque chauffante (Radleys, Royaume-Uni) et une étuve. La solution d’EPS prétraité présente dans le réservoir d’alimentation est homogénéisée par agitation magnétique continue à 120 rpm. La circulation de la solution d’EPS prétraité est maintenue à un débit de 10 mL/min. Après 72 h, durée considérée optimale après étude de la cinétique de dépolymérisation, l’ensemble du système est laissé sans circulation durant 1 h à température ambiante. Ainsi refroidie, la solution d’EPS dépolymérisé est récupérée puis le système est nettoyé par passage de 30 mL d’eau ultra-pure, également récupérée et ajoutée à la solution d’EPS dépolymérisé. L’ensemble est finalement neutralisé à pH 7 par ajout de NaOH 1 M, congelé à -80 °C puis lyophilisé. Le lyophilisât ainsi obtenu, dénommé « EPS-DPC », est conservé en flacon hermétique à température ambiante, avant utilisation ultérieure.

Exemple 3 : Détermination des poids moléculaires moyens en masse et en nombre , et des indices de polydispersité (I).

La détermination des poids moléculaires moyens en masse (M _w ) et en nombre (M _n ) des EPS est effectuée par chromatographie d’exclusion stérique couplée à un système de triple détection composé d’un diffuseur de lumière multi-angles (MALLS) (Down HELEOS II, Wyatt Technology, CA, USA), d’un viscosimètre (VD) (Viscostar II, Wyatt Technology, CA, USA) et d’un détecteur à réfractométrie différentielle (RID 10 A, Shimadzu, Japon). La séparation est réalisée à l’aide de deux colonnes en série

OHPAK SB 804 et OHPAK SB 806 HQ (Shodex, NY, USA).

Les EPS lyophilisés sont solubilisés dans l’éluant (0,1 M L1NO ₃ ) afin de réaliser des solutions à 20 mg/mL. 100 pL de solution d’EPS sont injectés et élués à un débit de 0,5 mL/min.

Les poids moléculaires moyens en masse (M _w ) et en nombre (M _n ), ainsi que les indices de polydispersité (I) sont déterminés à l’aide des formules ci-dessous (Ye et al.

Où N, est le nombre de moles des espèces du polymère et M, est le poids moléculaire des espèces du polymère.

Le tableau 2 ci-dessous regroupe les valeurs de M _w , M _n et I obtenues pour l’ensemble des formes des EPS.

Les dépolymérisations par hydrolyse acide supportée réalisées avec les systèmes discontinu et continu permettent de réduire le poids moléculaire de chaque EPS. On remarque une grande efficacité de cette méthode de dépolymérisation pour les EPS produits par Chrysotila dentata, qui voient leur poids moléculaire moyen réduit à moins de 50 kDa. Les poids moléculaires moyens en nombre sont par ailleurs inférieurs à 50 kDa pour l’ensemble des EPS, exceptés ceux issus de Paviova sp. et Phaeodactylum tricornutum. Les indices de polydispersité très supérieurs à 1 traduisent quant à eux une importante polydispersité des EPS dépolymérisés. [Table 21 : Valeurs des poids moléculaires moyens en masse (M _w ) et en nombre (M _n ), et des indices de polydispersité (I) des différentes formes des EPS.

Exemple 4 : Effets des différentes formes d’EPS sur la viabilité cellulaire de fibroblastes dermiques humains

Méthode :

Les tests sont réalisés sur deux lignées de fibroblastes dermiques humains normaux (FDHN) fournies par ATCC Cell (VA, USA), référencées CCD-1059Sk (ATCC ^® CRL-2072™) et CCD-1090Sk (ATCC ^® CRL-2106™). Ces deux lignées sont issues respectivement de peaux de femmes de 20 ans et 46 ans. Les cellules sont cultivées dans un milieu EMEM (Eagles’s Minimum Essential Medium), supplémenté par 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF), et 1 % (v/v) d’une solution antibiotique (10,000 U/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine), provenant de Eurobio Ingen (France). Ce milieu, ci-après dénommé « milieu complet », est stérilisé par filtration sur 0,22 pm. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de cultures de 75 cm ² stériles (BD Biosciences, NJ, USA), avec un renouvellement du milieu complet tous les 2 à 3 jours. Les cellules sont ensuite placées dans une étuve à 37 °C avec 5 % de CO ₂ , sous atmosphère humide. Toutes les manipulations sont effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de classe 2. Les effets des différentes formes des EPS sur la viabilité cellulaire sont déterminés via la conversion enzymatique du MTT (bromure de 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) (Mosmann Journal of Immunological Methods 65 (1): 55-63, 1983). Ce test repose sur la réduction du sel de tétrazolium par la succinate déshydrogènase mitochondriale en cristaux de Formazan. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits stériles (BD Biosciences, NJ, USA), à une concentration de 5x10 ⁴ cellules/mL dans un volume de 100 pL de milieu complet. Après 24 h d’adhérence, le milieu complet est remplacé par 100 pL de milieu complet dépourvu de SVF contenant les différents EPS à 3 concentrations : 10, 100 et 200 pg/mL. Un témoin négatif contenant uniquement du milieu complet dépourvu de SVF est également réalisé. Après 48 h d’exposition, 25 pL d’une solution de MTT à 5 mg/mL sont ajoutés dans chaque puits, lesquels sont alors incubés pendant 4 h dans l’étuve de culture. Le milieu est ensuite retiré puis 200 pL de DMSO (diméthyl-sulfoxide) sont ajoutés dans chaque puits afin de solubiliser les cristaux de Formazan formés. L’absorbance à 550 nm est alors mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Oméga (BMG LABTECH, Allemagne).

La viabilité cellulaire est déterminée selon la formule ci-dessous :

Viabilité cellulaire (

Un test-t de Student est enfin appliqué à l’aide du logiciel Origin 6 (OriginLab Corporation, MA, USA), pour apprécier la significativité des différences de viabilité cellulaire observées sous les différentes conditions de culture.

Résultats :

L’acide hyaluronique, testé à 1000 pg/mL en tant que témoin positif stimulant la production de collagène, diminue de 20 % et 30 % les viabilités cellulaires respectives des FDHN CCD-1059Sk (20 ans) et CCD-1090Sk (46 ans).

L’ensemble des EPS sous leur forme initiale diminuent de 20 % à 50 % les viabilités cellulaires des deux modèles cellulaires. L’EPS issu de Chrysotila dentata testé à 200 pg/mL diminue pour sa part de 80 % leur viabilité cellulaire.

A l’instar des EPS sous leur forme initiale, les EPS dépolymérisés, par méthode discontinue (batch) ou continue, induisent une diminution de la viabilité cellulaire des deux modèles de FDHN, de l’ordre de 20 à 80 %.

Au vu de ces résultats, deux hypothèses peuvent être émises. La première est que la diminution de viabilité cellulaire induite par les différentes formes d’EPS est due à une augmentation de la mortalité cellulaire, par nécrose ou apoptose. La deuxième hypothèse implique que les EPS induisent une réorientation métabolique des FDHN vers la biosynthèse de macromolécules, pouvant induire un ralentissement de la croissance cellulaire, et donc un effet cytostatique se caractérisant par une diminution de viabilité cellulaire.

Exemple 5 : Effets des différentes formes des exopolvsaccharides sur la mortalité cellulaire de fibroblastes dermiques humains

Méthode :

Les cellules ainsi que leurs conditions de cultures sont les mêmes que ceux décrits dans l’exemple 4.

Les effets des différentes formes des EPS sur la mortalité cellulaire sont déterminés par dosage de la lactate déshydrogènase (LDH) dans les surnageants de culture. A cette fin, le kit « LDH cytotoxity détection kit » produit par Roche (France) est utilisé (Decker et al Journal of Immunological Methods 115 (1 ): 61 -69, 1988). Les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits stériles (BD Biosciences, NJ, USA), à une concentration de 5x10 ⁴ cellules/mL dans un volume de 100 pL de milieu complet. Après 24 h d’adhérence, le milieu complet est remplacé par 200 pL de milieu complet dépourvu de SVF contenant les différents EPS à 3 concentrations : 10, 100 et 200 pg/mL. Des témoins négatif et positif contenant respectivement uniquement du milieu complet dépourvu de SVF et du Triton 1X sont également réalisés. Après 48 h d’exposition, les microplaques sont centrifugées à 250 x g pendant 10 min à température ambiante. 100 pL de surnageant cellulaire sont transférés dans une nouvelle microplaque puis 100 pL de réactif LDH sont ajoutés dans chaque surnageant. La microplaque est incubée à 22 °C pendant 30 min à l’obscurité puis l’absorbance à 490 nm est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Oméga (BMG LABTECH, Allemagne).

La mortalité cellulaire est déterminée selon la formule ci-dessous :

Mortalité cellulaire (

Un test-t de Student est enfin appliqué à l’aide du logiciel Origin 6 (OriginLab Corporation, MA, USA), pour apprécier la significativité des différences de mortalité cellulaire observées sous les différentes conditions de culture.

Résultats :

Le Triton 1X, utilisé comme témoin positif de mortalité cellulaire, correspond à une mortalité cellulaire égale à 100 %.

Aucun des EPS sous leur forme initiale n’impacte la mortalité cellulaire des FDHN CCD-1059Sk (20 ans) et CCD-1090Sk (46 ans), excepté l’EPS issu de la microalgue Chrysotila dentata. En effet, cet EPS induit une augmentation de 20 % de la mortalité cellulaire des FDHN CCD-1059Sk (20 ans) à une concentration de 200 gg/mL. Son impact négatif est encore plus important sur les FDHN CCD-1090Sk (46 ans), qui voient leur mortalité cellulaire augmenter de 270 % à 200 gg/mL. Au vu de ces résultats, l’EPS issu de Chrysotila dentata RCC6312 sous forme initiale a été exclu des tests de stimulation de la production de collagène et d’acide hyaluronique.

Aucune des formes dépolymérisées des EPS, en système discontinu (batch) ou continu, n’affecte la mortalité cellulaire des FDHN CCD-1059Sk (20 ans) et CCD- 1090Sk (46 ans). Même l’EPS issu de Chrysotila dentata RCC6312, pourtant très cytotoxique sous sa forme initiale, ne provoque plus de nécrose cellulaire une fois dépolymérisé. Les formes dépolymérisées de cet EPS ont donc pu être testées sur les productions de collagène et d’acide hyaluronique.

Exemple 6 : Effets des différentes formes des exopolvsaccharides sur la production de collaqène par des fibroblastes dermiques humains

Méthode :

Les cellules ainsi que leurs conditions de cultures sont les mêmes que ceux décrits dans l’exemple 4.

Les productions de collagène sont dosées par coloration du collagène au Sirius red (T ullberg Histochemistry and Cell Biology 112 (4): 271 -76, 1999). A cette fin, les cellules sont ensemencées dans des microplaques 24 puits stériles (BD Biosciences, NJ, USA), à une concentration de 5x10 ⁴ cellules/mL dans 500 gL de milieu complet. Après 24 h d’adhérence, le milieu complet est remplacé par 500 gL de milieu complet dépourvu de SVF contenant les différents EPS à 3 concentrations : 10, 100 et 200 gg/mL. Des témoins négatif et positif contenant respectivement uniquement du milieu complet dépourvu de SVF et de l’acide hyaluronique à 1000 gg/mL sont également réalisés. Après 48 h d’exposition, les surnageants de culture sont récupérés et réservés pour doser l’acide hyaluronique produit par les FDHN (exemple 7). Les tapis cellulaires sont nettoyés deux fois par 500 gL de tampon phosphate salin (PBS) puis les cellules sont fixées en ajoutant 1 mL de solution de Bouin (Merck, France) dans chaque puits. Après 1 h à température ambiante, la solution de Bouin est retirée et les tapis cellulaires sont lavés 2 fois avec 1 mL d’eau ultra-pure. 1 mL de solution de Sirius red à 1 % est alors ajouté avant incubation sous agitation durant 1 h à température ambiante. La solution de Sirius red est ensuite retirée et les tapis cellulaires sont nettoyés deux fois avec 1 mL d’eau ultra-pure puis une fois avec 1 mL d’HCI 0,01 M. Après ajout de 250 gL de NaOH 0,1 M puis incubation sous agitation durant 1 h à température ambiante pour dissoudre le colorant, l’absorbance est mesurée à 550 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Oméga (BMG LABTECH, Allemagne).

Un test-t de Student est enfin appliqué à l’aide du logiciel Origin 6 (OriginLab Corporation, MA, USA), pour apprécier la significativité des différences de production de collagène observées sous les différentes conditions de culture.

Résultats :

Tout d’abord, l’acide hyaluronique utilisé à 1000 pg/mL comme témoin positif induit une augmentation de 70 % de la production de collagène par les deux modèles de FDHN.

Les figures 1 et 2 présentent les effets des différents EPS sous forme initiale sur les productions de collagène par les deux modèles de FDHN (l’EPS issu de Chrysotila dentata RCC6312 n’a pas été évalué, compte-tenu de sa cytotoxicité démontrée). On remarque que les sept EPS stimulent significativement la production de collagène par les deux modèles cellulaires, avec un effet plus important sur le modèle CCD-1090Sk (46 ans). Sur le modèle CCD-1059Sk (20 ans), cinq EPS induisent l’augmentation de la production de collagène d’au-moins 50 % pour des concentrations allant de 10 à 200 pg/mL. Il s’agit des EPS issus de Glossomastix sp. RCC3688, Pavlova sp. RCC3438, Phaeodactylum tricornutum RCC2967et Synechococcus sp.RCC2380. Ce dernier EPS testé à 200 pg/mL stimule d’ailleurs la production de collagène à hauteur de 70 %, ce qui correspond à l’effet de l’acide hyaluronique, mais avec une dose 5 fois moins importante. Sur le modèle CCD- 1090Sk (46 ans), l’ensemble des EPS stimulent la production de collagène avec un effet similaire à l’acide hyaluronique mais à des concentrations 5, 10 et 100 fois moins importantes.

Après dépolymérisation à l’aide des systèmes discontinu et continu, l’EPS issu de Chrysotila dentata RCC6312 a pu être testé car il n’impacte plus la mortalité cellulaire des FDHN sous ces formes.

Les figures 3 et 4 présentent les effets des différents EPS sous leur forme dépolymérisée en système discontinu (batch). L’ensemble des EPS dépolymérisés en système discontinu stimulent la production de collagène avec des effets plus importants que l’acide hyaluronique, particulièrement les EPS issus de Glossomastix sp. RCC3688, Diacronema ennorea RCC3514., Glossomastix sp. RCC3707, Phaeodactylum tricornutum RCC2967 et Synechococcus sp. RCC2380, qui induisent des augmentations de production de 100 % à 350 % par les FDHN CCD-1059Sk (20 ans) et 100 % à 400 % par les FDHN CCD-1090Sk (46 ans), avec des concentrations allant de 10 à 200 pg/mL. La dépolymérisation en système discontinu permet donc de générer des fragments polysaccharidiques plus actifs que leur forme initiale.

Les figures 5 et 6 présentent les effets des différents EPS sous leur forme dépolymérisée en système continu. L’ensemble des EPS dépolymérisés en système continu stimulent la production de collagène par les deux modèles de FDHN. On remarque que tous les EPS, à l’exception de l’EPS issu de Chrysotila dentata RCC6312, exercent un effet dose-dépendant sur les deux modèles cellulaires, avec toujours une stimulation plus importante des FDHN CCD-1090Sk (46 ans).

La comparaison des deux systèmes de dépolymérisation révèle que le système en continu génère en général des fragments moins actifs que le système discontinu. Par exemple, l’EPS issu de Synechococcus sp. RCC2380 induit une augmentation de 350 % de la production de collagène par les FDHN CCD-1059Sk après dépolymérisation en système discontinu, contre 100 % après dépolymérisation en système discontinu.

Exemple 7 : Effets des différentes formes des exopolvsaccharides sur la production d’acide hyaluronique par des fibroblastes dermiaues humains

Méthode :

Les cellules ainsi que leurs conditions de cultures sont les mêmes que ceux décrits dans l’exemple 4.

La production d’acide hyaluronique est dosée par ELISA au moyen d’un kit « Hyaluronic acid PLUS ELISA » fourni par R&D Systems (MN, USA). Les surnageants de culture cellulaire utilisés pour ce dosage sont récupérés durant la procédure de dosage de collagène décrite dans l’exemple 6. Le TGF-b à la concentration de 0,01 pg/mL est utilisé en tant que témoin positif. L’acide hyaluronique produit par les deux modèles de FDHN est dosé selon les instructions du fournisseur.

Un test-t de Student est enfin appliqué à l’aide du logiciel Origin 6 (OriginLab Corporation, MA, USA), pour apprécier la significativité des différences de production d’acide hyaluronique observées sous les différentes conditions de culture.

Résultats :

Les figures 7 et 8 présentent les effets des différentes formes d’EPS testées à une concentration de 100 pg/mL sur la production d’acide hyaluronique par les deux modèles de FDHN. Le TGF-b à 0,01 pg/mL stimule la synthèse d’acide hyaluronique des FDHN CCD-1059Sk et CCD-1090Sk à hauteurs respectives de 50 % et 30 %.

On remarque que tous les EPS ne stimulent pas la production d’acide hyaluronique. S’agissant du modèle CCD-1059Sk (20 ans) (figure 7), seuls les EPS sous forme initiale issus de Glossomastix sp. RCC3688 et Pavlova sp. RCC3438 stimulent la synthèse d’acide hyaluronique, induisant des augmentations de production respectives de 43 %, 34 % et 43 %. Sous leur forme dépolymérisée en système discontinu (batch), les EPS issus de Glossomastix sp RCC3688 et Pavlova sp. RCC3438 perdent leur effet stimulant alors que L’EPS issu de devient plus actif, induisant une augmentation de 70 % de la synthèse d’acide hyaluronique. L’EPS issu de Synechococcus sp. RCC2380 dépolymérisé en système discontinu est quant à lui le plus actif, stimulant la production d’acide hyaluronique à hauteur de 185 %. La dépolymérisation en système continu génère un nombre plus important d’EPS bioactifs. En effet, tous les EPS dépolymérisé en système continu, excepté celui issu de Chrysotila dentata RCC6312, augmentent la synthèse d’acide hyaluronique de 35 % à 130 %.

Les effets des EPS sont différents sur le modèle CCD-1090Sk (46 ans) (figure 8). Concernant les EPS sous forme initiale, seuls ceux issus de Glossomastix sp. RCC3688 augmentent la synthèse d’acide hyaluronique, respectivement de 46 % et 93 %. Contrairement au modèle CCD-1059Sk (20 ans), l’ensemble des EPS dépolymérisés en système discontinu (batch) augmentent la synthèse d’acide hyaluronique, à des niveaux bien plus élevés s’étalant sur une plage allant de 57 % à 407 % pour l’EPS le plus actif, issu de Synechococcus sp. RCC2380. De même, l’ensemble des EPS sous leur forme dépolymérisée en système continu, à l’exception de celui issu de Chrysotila dentata RCC6312, stimulent la production d’acide hyaluronique par les FDHN CCD-1090Sk, induisant des augmentations de l’ordre de 71 % à 307 %, le plus actif étant l’EPS issu de Diacronema ennorea RCC3514.

Conclusion :

Les EPS issus de Glossomastix sp.RCC3707 et RCC3688, Chrysotila dentata RCC6312, Pavlova sp.RCC3438, Diacronema ennorea RCC3514, Phaeodactylum tricornutum RCC2967 et Synechococcus sp.RCC2380 dépolymérisés en système discontinu (batch) et continu exercent un fort potentiel anti-âge en stimulant in vitro la synthèse de collagène et d’acide hyaluronique par des fibroblastes dermiques humains normaux d’âges physiologiques différents : lignées modèles CCD-1059Sk (issue d’une femme de 20 ans) et CCD-1090Sk (issue d’une femme de 46 ans). Ils induisent en effet des augmentations respectives de la production de collagène par ces deux modèles fibroblastiques d’environ 100 % et 200 %, alors que leurs formes initiales stimulent la production de collagène d’environ 50 % et 100 %.

Concernant la production d’acide hyaluronique, seul deux EPS sous leur forme initiale, issus de Glossomastix sp. 3688, stimulent respectivement d’environ 40 % et

100 % la synthèse d’acide hyaluronique par les fibroblastes CCD-1059Sk et CCD- 1090Sk. En revanche, l’ensemble des EPS dépolymérisés à l’aide des systèmes discontinu et continu stimulent la production d’acide hyaluronique par les fibroblastes CCD-1090Sk (issus d’une femme de 46 ans). Par ailleurs, aucun des EPS dépolymérisés, en systèmes discontinu (batch) ou continu, ne provoque la mort cellulaire par nécrose des lignées fibroblastiques CCD- 1059Sk et CCD-1090Sk, laissant entendre que la diminution de leur viabilité cellulaire observée dans l’exemple 4 est due à un effet cytostatique lié à leur réorientation métabolique en faveur de la biosynthèse de collagène et/ou d’acide hyaluronique, et au détriment de la croissance cellulaire. Aucune altération morphologique caractéristique des fibroblastes n’étant observée, l’éventualité d’un effet pro apoptotique non nécrotique, indétectable via le test LDH, est écartée.

Ces résultats démontrent que les EPS dépolymérisés issus de Glossomastix sp., Chrysotila dentata, Pavlova sp., Diacronema sp., Phaeodactylum tricornutum et Synechococcus sp., sont des composés bioactifs d’efficacité supérieure à celle de leur forme native, et peuvent être intégrés à des formulations cosmétiques pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané.