Esta invención se relaciona con el campo de Ia industria biotecnológica y, en particular, con el sector agroalimentario dedicado a Ia obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales. También se relaciona con el campo de Ia industria farmacéutica y cosmética.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los hidratos de carbono, el material biológico más abundante en Ia naturaleza, se utilizan como elementos de partida en una gran variedad de procesos industriales; por ello, las enzimas implicadas en su metabolismo tienen un enorme interés, tanto desde un punto de vista básico como tecnológico.

El campo de los oligosacáridos prebióticos como ingredientes funcionales en alimentación se ha desarrollado de manera espectacular en los últimos años. El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid, quienes definieron a los prebióticos como ingredientes no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de una o un limitado grupo de bacterias en el colon. Los oligosacáridos prebióticos son fundamentalmente los fructooligosacáridos (FOS), aunque también tienen gran aplicación los isomaltooligosacáridos (IMOS) y los transgalactooligosacáridos (GaIOS). Los efectos de los prebióticos sobre Ia persona que los consume pueden ser muy variados: reducción de los episodios de diarreas causadas por rotavirus; mejora de los síntomas de Ia intolerancia a Ia lactosa; control del estreñimiento por aumento de Ia masa fecal; aumento de Ia absorción de calcio, y en consecuencia una reducción del riesgo de osteoporosis; disminución de Ia capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como Ia nitro-red uctasa, asociadas con el cáncer de colon; posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias, etc.

Los isomaltooligosacáridos (IMOS) son azúcares formados por unidades de glucosa unidas mediante enlaces α-1 ,6, aunque los productos que se

comercializan también contienen oligosacáridos formados por glucosas unidas por enlaces α-1 ,6 y α-1 ,4, como el trisacárido panosa. El interés de los IMOS radica en sus propiedades prebióticas, además de mejorar las características higroscópicas y Teológicas de los productos a los que se incorporan. Afortunadamente estas interacciones son muy selectivas: los IMOS son específicamente metabolizados por Ia microflora bacteriana beneficiosa (géneros Bifidobacterium. Bacteroides. Lactobacillus). favoreciendo el crecimiento de estos microorganismos, sin presentar ningún tipo de interacción con Ia microflora potencialmente patógena (efecto bífidus). También tienen aplicación para Ia prevención de Ia caries (al inhibir Ia síntesis de glucanos por parte de Streptococcus mutans y especies relacionadas) y como sustancias inmunoestimuladoras.

Los maltooligosacáridos son azúcares que tienen típicamente entre 2 y 7 unidades de glucosa unidas mediante enlaces α-1 ,4 ([α-D-Glu-(1→4)-] ₂ -τ)- Su ingestión mejora el estado del colon en el hombre; el consumo de jarabes ricos en maltotetraosa ([α-D-Glu-(1→4)-] ₄ ) reduce los niveles intestinales de Clostridium perfrinqens y miembros de Ia familia Enterobacteriaceae. No obstante, y dado que normalmente son hidrolizados por las enzimas digestivas tras su ingestión, no pueden considerarse prebióticos estrictos. Los maltooligosacáridos tienen una serie de propiedades (alta solubilidad, viscosidad elevada, bajo poder endulzante, no son higroscópicos, etc.) que les proporcionan un gran número de aplicaciones en alimentación. Entre ellas destacan su uso como aglomerantes, sustitutos de grasas, aportadores de textura, o espesantes (cfr. F. Barresi et al., "Maltooligosaccharides from com", Oligosaccharides in food and agricultura. G. Eggleston and G. L. Cote, eds., ACS Symposium Series, 2003, vol. 849, pp. 182-95).

Los oligosacáridos prebióticos se obtienen comúnmente a nivel industrial por síntesis enzimática, empleando glicosiltransferasas o glicosidasas. Los IMOS se producen a partir de almidón utilizando dos etapas enzimáticas. En Ia primera el almidón es parcialmente degradado por Ia acción de una α-amilasa, obteniendo maltooligosacáridos. En Ia segunda etapa, los maltooligosacáridos son convertidos en isomaltooligosacáridos por Ia acción conjunta de una beta-amilasa, que degrada a maltosa las maltodextrinas formadas, y una α-glucosidasa, que forma por transferencia enlaces α-1 ,6 (cfr. T. Kaneko et al.,"Effects of isomaltooligosaccharides with different

degrees of polymerization on human fecal bifidobacteria", Biosci. Biotech. Biochem. 1994, vol. 58, pp. 2288-90). Las enzimas procedentes de Asperqillus niger y Bacillus stearothermophilus se utilizan actualmente para Ia obtención de oligosacáridos prebióticos (cfr. respectivamente KJ. Duan et al., "Transglucosylation of a fungal α-glucosidase - The enzyme properties and correlation of isomaltooligosaccharide production", Ann. New York Acad. ScL 1995, vol. 750, pp. 325-8; S. Mala et al., "Towards regioselective synthesis of oligosaccharides by use of α-glucosidases with different substrate specificity", Carbohvdr. Res. 1999, vol. 322, pp. 209-18).

La producción anual de oligosacáridos prebióticos supera las 10.000 toneladas y tiene lugar principalmente en el Japón. Un producto típico comercial (lsomalto-900), fabricado por Showa Sangyo Co., es un jarabe que contiene un 75% (p/v) de sólidos, de los cuales más del 85% corresponde a oligosacáridos (cfr. R.G. Crittenden et al., "Production and applications of food-grade oligosaccharides" Trends Food Sci. Technol. 1996, vol. 7, pp. 353-61 ). Dada Ia importancia industrial de los oligosacáridos prebióticos, es deseable proporcionar enzimas y procedimientos para su obtención que sean viables industrialmente.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado una nueva enzima de Xanthophyllomvces dendrorhous caracterizada por presentar actividad α-glucosidasa y útil para Ia obtención de oligosacáridos. Así, un aspecto de Ia invención se refiere a un procedimiento de obtención de un producto enzimático con actividad α-glucosidasa, que comprende cultivar células de X. dendrorhous en un medio y condiciones apropiados. Mediante métodos convencionales, el experto en Ia materia escogerá los medios de cultivo y las condiciones como pH, temperatura y agitación para el cultivo de X. dendrorhous. Ejemplos de cultivo se describen en detalle más adelante.

Una α-glucosidasa (EC 3.2.1.20, α-D-glucósido glicosil-hidrolasa, según Ia IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number 9001-42-7) actúa sobre los extremos no reductores de un variado número de glúcidos produciendo Ia liberación sucesiva de unidades de D-glucosa.

El producto enzimático crudo resultado del procedimiento de Ia invención ya puede ser utilizado industrialmente para Ia obtención de oligosacáridos sin requerir etapas de separación o purificación posteriores. De todas formas, en una realización particular de Ia invención, el procedimiento comprende además el paso de recuperar el producto enzimático del medio de cultivo y/o de las células, pues Ia enzima objeto de Ia invención se libera extracelularmente. Así se entiende como producto enzimático en esta descripción tanto Ia suspensión de células de X. dendrorhous con el medio de cultivo apropiado para que se haya expresado Ia actividad α-glucosidasa, como Ia fracción libre de células. Mediante métodos convencionales, el experto en Ia materia escogerá el producto enzimático de partida más apropiado a cada procedimiento industrial, es decir, crudo o con más o menos nivel de purificación.

En otra realización particular de Ia invención las células de X. dendrorhous pertenecen a una cepa seleccionada del grupo que consiste en ATCC:MYA-131 , ATCC 24230, CECT 11028 y CECT 1690 (CECT corresponde a Ia Colección Española de Cultivos Tipo en Burjassot, Valencia). Se incluye más adelante una descripción detallada del organismo X. dendrorhous. La cepa ATCC: MYA-131 ha sido depositada en Ia Colección de Cultivos Tipo Americana (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, USA). Se designó como UCD67-210 y se catalogó como ATCC: MYA-131.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al producto enzimático con actividad α-glucosidasa obtenible por el procedimiento definido anteriormente. El producto enzimático de Ia invención es muy eficiente en Ia degradación de maltosa y oligosacáridos con enlaces α-1 ,4 (p. ej. maltotriosa, maltoheptosa) y actúa también sobre polisacáridos como las maltodextrinas y el almidón soluble. En una realización particular de Ia invención, el producto enzimático de Ia invención se caracteriza porque Ia actividad α-glucosidasa tiene baja especificidad de sustrato, actuando sobre maltosa, maltotriosa, maltoheptosa, dextrinas, X-α-glucósido, glucógeno y almidón soluble. En otra realización particular de Ia invención, el producto enzimático no tiene actividad α-glucosidasa sobre isomaltosa, isomaltotriosa, pululan y dextrano. En otra realización particular, Ia actividad α-glucosidasa del producto enzimático presenta un máximo en el intervalo de pH entre 4.5 y 6.0 a 42 ⁰ C,

y en un intervalo de temperatura entre 40 y 50 ⁰ C.

La formación de un nuevo enlace glicosídico, que tiene lugar en una reacción de transferencia (transglicosilación), y Ia hidrólisis de ese mismo enlace son dos variantes de un mismo proceso catalítico. Así, algunas enzimas glicosidasas son capaces de catalizar tanto Ia formación de un enlace glicosídico como su hidrólisis, y su actividad en uno u otro sentido depende en gran medida de las condiciones fisiológicas en las que actúan in vivo, o del control termodinámico o cinético que se ejerza in vitro. Las glicosiltransferasas (EC 2.4) son enzimas que catalizan Ia transferencia de unidades de azúcar de moléculas dadoras activadas a moléculas aceptoras específicas, formando enlaces glicosídicos.

Los inventores han encontrado que además de Ia actividad α-glucosidasa, el producto enzimático de Ia invención tiene actividad glicosiltransferasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos, en particular maltooligosacáridos (p.ej. maltosa en altas concentraciones). En una realización particular, los productos resultantes de Ia actividad glicosiltransferasa son oligosacáridos con enlaces α-1 ,4, en particular maltotriosa y maltotetraosa; oligosacáridos con enlaces α-1 ,6, en particular, isomaltosa; y/o oligosacáridos mixtos con enlaces α-1 ,4 y α-1 ,6, en particular, panosa y el tetrasacárido α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu- (1→4)-α-D-Glu.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a un procedimiento de obtención de una enzima sustancial mente pura con actividad α-glucosidasa, que comprende los pasos de: (a) obtener un producto enzimático con actividad α-glucosidasa mediante el cultivo de células de X. dendrorhous en un medio y condiciones apropiados; (b) recuperar el producto enzimático del medio de cultivo y/o de las células; y (c) purificar el producto enzimático hasta obtener una enzima sustancial mente pura con actividad α-glucosidasa. En una realización particular de Ia invención, las células de X. dendrorhous pertenecen a una cepa seleccionada del grupo que consiste en ATCC:MYA-131 , ATCC 24230, CECT 11028 y CECT 1690. La invención también se refiere a una enzima sustancialmente pura con actividad α-glucosidasa obtenible por el procedimiento definido. Los métodos de purificación convencionales podrán utilizarse para obtener Ia enzima de Ia

invención. Un ejemplo de método de purificación se describe en detalle en esta descripción.

Las características indicadas de especificidad de sustrato para el producto enzimático de Ia invención se atribuyen también a Ia enzima purificada. La actividad glicosiltransferasa también es característica de Ia enzima purificada. Además, en una realización particular, Ia enzima se caracteriza por tener un peso molecular determinado por filtración molecular de aproximadamente 115 kDa, y un punto isoeléctrico de aproximadamente 5.5. Los inventores han caracterizado Ia enzima purificada cinéticamente y por espectrometría de masas. Estos datos se incluyen más adelante en esta descripción.

Algunos aspectos positivos del producto enzimático y de Ia enzima de Ia invención, son que presentan un alto espectro de actuación y una alta actividad específica, convierténdolos en candidatos idóneos para hidrolizar o modificar oligosacáridos. Otro aspecto importante a nivel industrial es que el producto enzimático y Ia enzima son estables durante largos tiempos de reacción (p.ej. 300 h) a una temperatura de aproximadamente 40 ⁰ C como se ilustra en Ia descripción detallada que viene a continuación.

La presente invención conlleva un procedimiento de obtención de oligosacáridos viable industrialmente. Así, otro aspecto de Ia invención se refiere a un procedimiento de obtención de oligosacáridos que comprende permitir que el producto enzimático o Ia enzima purificada, definidos anteriormente, actúen sobre uno o varios sustratos glucídicos. Mediante métodos convencionales, el experto en Ia materia escogerá los medios de cultivo, los sustratos y las condiciones de reacción para llevar a cabo el procedimiento. Además, Ia enzima o las células de X. dendrorhous. productoras de Ia enzima, pueden usarse como tal o de manera inmovilizada, acopladas física o químicamente a un material portador. De esta manera se permite Ia reutilización de Ia enzima o las células. Ejemplos de preparación se incluyen más adelante en esta descripción.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos,

ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. La siguiente descripción detallada, ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra Ia producción de actividad α-glucosidasa extracelular a Io largo del cultivo de X. dendrorhous. La levadura se creció en Medio Mínimo Maltosa a 24 ⁰ C y agitación orbital constante de 160 rpm durante 175 horas. Se representa el crecimiento del cultivo en UDO 660 nm (cuadrados) y Ia actividad α-glucosidasa valorada en el medio extracelular, en U/ml (triángulos), alcanzada a los tiempos que se indican. La actividad se ensayó sobre maltosa al 1%.

La FIG. 2 es el resultado del análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF de Ia proteína purificada a homogeneidad. Se muestra Ia intensidad relativa (r.i.) de los péptidos tríticos ionizados frente a Ia masa/carga (m/z) de los mismos. El sobrenadante de Ia digestión con tripsina se analizó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF modelo Autoflex de Bruker equipado con reflector, empleando HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) como matriz en condiciones de saturación.

La FIG. 3 muestra Ia actividad de Ia Fracción F-3 de X. dendrorhous sobre almidón (Paselli SA2, Avebe, con un grado de polimerización medio de 50 unidades de glucosa). Los ensayos se realizaron utilizando proteína purificada y una concentración de sustrato del 10% (p/v) en tampón acetato sódico 0.2 M pH 5.4. Se muestra un cromatograma de una mezcla de oligosacáridos desde G1 (glucosa) hasta G7 (maltoheptosa). Los cromatogramas de Ia reacción de hidrólisis de almidón corresponden a los siguientes tiempos de reacción: I, tiempo 0; II, 15 horas; III, 63 horas; IV, 168 horas.

La FIG. 4 indica Ia actividad enzimática (A) en función del pH y de Ia temperatura, mostrando los máximos correspondientes. FIG. 4A: Se valoró Ia actividad α-glucosidasa a distintos pH (3-7 unidades pH) y temperaturas (25-60 ⁰ C). El ensayo se realizó sobre maltosa utilizando una solución de

proteína pura. El 100% se corresponde con una actividad de 100 U/ml. En Ia valoración de pH se utilizó una temperatura de ensayo de 42 ⁰ C y tampón citrato o fosfato (50 mM) para los intervalos de pH de 3-4.5 y 5-7 respectivamente. FIG. 4B: El ensayo de temperaturas se realizó en fosfato sódico 50 mM pH 5.5.

La FIG. 5 muestra el perfil de productos obtenidos tras Ia incubación de maltosa con Ia enzima purificada (F-3) de X. dendrorhous. Las condiciones de reacción, las condiciones de análisis mediante HPLC y los nombres de los compuestos son los mismos que en Ia TABLA 5. El análisis corresponde a las 143 h de reacción.

DESCRIPCIÓN DE XANTHOPHYLLOMYCES DENDRORHOUS

La levadura Xanthophyllomvces dendrorhous (también llamada Phaffia rhodozyma) se emplea actualmente en Ia industria biotecnológica para producir astaxantina, carotenoide que ha demostrado una enorme eficacia en Ia pigmentación de salmónidos, crustáceos y en avicultura. X. dendrorhous acumula de forma natural este caroteno y además de forma libre, Io que facilita Ia preparación del pigmento. Esto Io convierte en el microorganismo en el que de una manera global Ia producción es más rentable que en ningún otro. Actualmente se comercializa como "Natupink" por Gist-Brocades (cfr. EP 551676 B1 ). Hoffman-La Roche (Basle, Suiza) ha comercializado Ia denominada astaxantina sintética "Carophyll pink". Antibióticos S.A. ha desarrollado el procedimiento para Ia producción de astaxantina mediante Ia fermentación de cepas seleccionadas de X. dendrorhous (cfr. ES 2203315 A1 ).

El atractivo comercial de Ia astaxantina ha originado un considerable avance en el conocimiento genético-molecular del organismo productor. Se han caracterizado los genes implicados en Ia producción de Ia astaxantina, pero también algunos de los relacionados con Ia utilización de fuentes de carbono, como los responsables de Ia síntesis de una endo-beta-1 ,3(4)-glucanasa, una proteasa (cfr. M. L. Bang et al., "Cloning and characterization of an endo-beta-1 ,3(4)-glucanase and aspartic protease from Phaffia rhodozyma CBS 6938", Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, vol. 51 , pp. 215-22); o Ia gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (cfr. J. C. Verdoes et al., "Molecular

characterization of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene of Phaffia rhodozyma", Yeast 1997, vol. 13, pp. 1231-42). Se ha purificado parcialmente y caracterizado una proteína extracelular de 240 kDa con actividad beta-amilasa (cfr. A. Díaz et al., "Production and partial characterization of a beta-amylase by Xanthophyllomvces dendrorhous". Lett. Appl. Microbiol. 2003, vol. 36, pp. 203-7). Algunas proteínas, como Ia invertasa asociada a Ia fracción celular o Ia ureasa, también han sido estudiadas en este organismo (cfr. D. S. Persike et al., "Invertase and urease activities in the carotenogenic yeast Xanthophyllomvces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma)", Bioresour Technol. 2002, vol. 82(1 ), pp. 79-85).

Además de Ia producción de astaxantina, X. dendrorhous se ha indicado para Ia producción de neokestosa (CAS Registry Number 3688-75-3), un trisacárido prebiótico que se obtiene a partir de sacarosa (cfr. S. M. Kritzinger et al., "The effect of production parameters on the synthesis of the prebiotic trisaccharide, neokestose, by Xanthophyllomvces dendrorhous (Phaffia rhodozyma)", Enzvme and Microbial Technology 2003. vol. 32, pp. 728-37).

CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA

Expresión de actividad α-glucosidasa de X. dendrorhous en medios sólidos.

La actividad α-glucosidasa de Ia levadura se ensayó en medios sólidos utilizando X-α-D-glucósido (5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-glucopiranósido, Glycosynth), elemento que contiene un grupo cromóforo unido mediante un enlace glicosídico a D-glucosa. Se emplearon placas de 20 mi que contenían medio mínimo para levaduras: YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO) al 0.7% (p/v), agar al 2% (p/v), fuente de carbono al 2%, suplementadas con X-α-D-glucósido. Las placas se inocularon con Ia cepa de X. dendrorhous MYA-131. Se obtuvo un crecimiento positivo del microorganismo cuando se usó maltosa, almidón, glucosa, mañosa o fructosa. Se detectó una buena actividad α-glucosidasa, adquisición de color azul intenso por los microorganismos que expresan esta actividad, en presencia de almidón y maltosa.

Expresión de Ia actividad amilásica de X. dendrorhous.

La levadura se creció en distintos medios suplementados con diferentes fuentes de carbono. Este organismo puede utilizar distintos monosacáridos (glucosa, mañosa, y fructosa), y oligosacáridos (maltosa, maltotriosa y sacarosa). La actividad amilolítica de X. dendrorhous se testó inicialmente en medio sólido utilizando medios mínimos con almidón (MMA): YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO) al 0.7% (p/v), almidón 2%, agar 2%. El almidón es soluble a temperatura ambiente, pero precipita a 4 ⁰ C. Cuando un microorganismo expresa una actividad amilásica, Ia concentración de almidón disminuye alrededor de sus colonias y no se produce precipitación; aparece un halo de hidrólisis. Se obtuvo halo de hidrólisis del polisacárido con las cepas de X. dendrorhous ATCC 24230, CECT 11028, CECT 1690 y ATCC: MYA-131.

Caracterización de Ia actividad α-qlucosidasa de X. dendrorhous después del cultivo y centrifugación de Ia fracción libre de células.

La producción de actividad α-glucosidasa se analizó en cultivos de X ₁ dendrorhous crecidos en medio mínimo para levaduras: YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO) al 0.7% (p/v), fuente de carbono al 2%. Los cultivos se realizaron en matraces de vidrio incubados a 24 "C y agitación constante de 160 rpm.

Se obtuvo Ia fracción libre de células por centrifugación (F-O) y en ella se ensayó Ia actividad α-glucosidasa valorando Ia liberación de glucosa sobre distintos sustratos. Se usó un ensayo colorimétrico y Ia metodología estándar. La glucosa liberada se cuantificó utilizando Ia reacción acoplada de Ia glucosa oxidasa-peroxidasa: 0.4 mi de Ia solución a valorar se mezcló con 0.1 mi de solución A:B (20:1 ) (A: 0.85 U/ml glucosa oxidasa, 0.40 U/ml peroxidasa en tampón fosfato sódico pH 5; B: O-Dianisidina 0.6%). Se incubó 30 minutos a 37 ⁰ C y cuantificó espectrofotométricamente a 450 nm. Se utilizó una curva patrón de glucosa (1 a 100 μg/ml). La unidad de actividad α-glucosidasa se define como Ia cantidad de enzima necesaria para liberar 20 μg/ml de glucosa en las condiciones descritas. La FIG. 1 muestra los resultados obtenidos cuando se utiliza Ia cepa MYA-131 y el ensayo se realiza sobre maltosa. Los resultados del ensayo también se muestran en Ia

TABLA 1. No se detectó actividad cuando se utilizó dextrano, isomaltosa e isomaltotriosa como sustrato.

TABLA 1. Actividad α-glucosidasa de Ia fracción extracelular de X ₁ dendrorhous sobre diferentes polímeros de glucosa.

Purificación de Ia enzima con actividad α-glucosidasa de X. dendrorhous.

En Ia purificación de Ia enzima se utilizó el siguiente método y con los resultados resumidos en Ia TABLA 2.

1 ^o ) Concentración de Ia fracción extracelular de máxima actividad utilizando un sistema de filtración tangencial (filtro de 30 kDa) y diálisis frente a fosfato sódico 20 mM pH 7 (tampón A) durante 3 horas a una temperatura de 4 ⁰ C (F-1 ).

2 ^o ) Cromatografía de intercambio iónico a pH 7. La muestra se aplicó a una columna de 10 mi de intercambio iónico de DEAE-sephacel equilibrada con tampón A. La elución se llevó a cabo utilizando un gradiente de NaCI de 0 a 0.5 M. La fracción eluida a 0.05 M de sal se dializó frente a acetato sódico 20 mM pH 4.5 (tampón B) (F-2).

3 ^o ) Cromatografía de intercambio iónico a pH 4.5. La muestra se aplicó a Ia columna de intercambio iónico DEAE-sephacel equilibrada con tampón B y se eluyó utilizando 0.2 M de NaCI (F-3).

TABLA 2. Resumen del proceso de purificación de Ia actividad α-glucosidasa de X. dendrorhous y rendimiento obtenido. La actividad enzimática durante el proceso de purificación se determinó utilizando maltosa como sustrato.

Determinación por filtración molecular del peso molecular de Ia enzima con actividad α-qlucosidasa de X. dendrorhous.

Para determinar el peso molecular de Ia actividad α-glucosidasa se empleó cromatografía de exclusión molecular, utilizando un sistema de cromatografía líquida (HPLC). Se utilizó una columna de 24 mi de Superosa 12 HR10/30 (Pharmacia) equilibrada con 50 mi de fosfato sódico 50 mM pH 7, NaCI 0.15 M a una velocidad de 0.25 ml/min. Se aplicó 0.1 mi de una preparación enzimática con una actividad específica de 1x10 ⁶ U/mg sobre maltosa. Se recogieron fracciones de 0.3 mi. Como marcadores de peso molecular se usaron: inmunoglobulina G (160,000 Da), albúmina (67,000 Da), beta-lactoglobulina (35,000 Da) y citocromo C (12,400 Da) que eluyeron a 12, 13.2, 14.42 y 16.64 mi, respectivamente. Todo el proceso se realizó a 4 ⁰ C. La actividad α-glucosidasa se ensayó sobre maltosa utilizando Ia metodología que se describe previamente. Se detectó actividad en Ia fracción eluida a 12.3 mi, Io que se corresponde con una proteína de 115 ± 5% kDa de peso molecular.

La α-glucosidasa purificada a homogeneidad según el procedimiento descrito tiene un peso molecular calculado por filtración molecular (HPLC y Superosa 12 HR) de 115 ± 5% kDa y un punto isoeléctrico (pl) de 5.5.

Caracterización por espectrometría de masas de Ia enzima con actividad α-qlucosidasa de X. dendrorhous

La proteína se digirió con tripsina (Tripsina-TPCK Promega) en condiciones de digestión estándar (cfr. A. Shevchenko et al., "Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels", Anal Chem. 1996 vol. 68(5), pp. 850-8). El sobrenadante de Ia digestión con tripsina se analizó en un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF (matriz-assisted láser desorption ionisation/time-of-flight) modelo Autoflex de Bruker equipado con reflector no lineal, con láser de nitrógeno-UV a 337 nm, con pulsos de 3 nanosegundos, siguiendo Ia metodología estándar, empleando HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) como matriz en condiciones de saturación y trifluoroacéticos 0,1% y acetonitrilo 33% (v/v). El resultado obtenido se muestra en Ia FIG. 2. Este espectro se utilizó como "huella peptídica" para Ia identificación de proteínas en las bases de datos utilizando los motores de búsqueda (Mascot, Profound) accesibles en red, basándose en Ia intensidad relativa (r.i.) de los péptidos tríticos ionizados frente a Ia masa/carga (m/z) de los mismos. La proteína aislada es una nueva molécula nunca antes descrita al no encontrarse perfiles MALDI-TOF coincidentes con proteínas conocidas por su secuencia de aminoácidos, ni Ia correspondiente deducida por Ia secuencia de DNA.

Caracterización de Ia actividad α-qlucosidasa de Ia enzima purificada.

La actividad hidrolítica de Ia enzima purificada a homogeneidad (F-3), siguiendo el procedimiento descrito, se ensayó sobre distintos sustratos. El máximo nivel de actividad se obtiene sobre maltosa, maltoheptosa, almidón soluble (Difco o Sigma) y dextrinas. No se observó actividad sobre dextrano, pululan, isomaltosa e isomaltotriosa. Los resultados obtenidos se recopilan en Ia TABLA 3.

TABLA 3. Actividad α-glucosidasa de Ia fracción F-3 de X. dendrorhous sobre distintos sustratos. Los ensayos se realizaron utilizando proteína purificada y una concentración para todos los sustratos ensayados del 1%.

El perfil de productos obtenidos en Ia hidrólisis de almidón se estudió por cromatografía líquida. La FIG. 3 muestra claramente que el producto principal final formado en esta reacción es glucosa.

La actividad glucosidasa se ensayó a diferentes pHs y temperaturas. Se obtuvieron niveles máximos de actividad en un rango de pH comprendido entre 4.5 y 6 unidades y una temperatura de 40-50 ⁰ C. La FIG. 4 muestra los resultados obtenidos.

La caracterización cinética de Ia enzima purificada, según el procedimiento descrito, se realizó sobre maltosa, maltotriosa, maltoheptosa y almidón. Los datos se recopilan en Ia TABLA 4. Los ensayos se realizaron en 30 minutos y 100 ng de enzima para cada reacción. El peso molecular del almidón, suministrado por Avebe, es de 8100 Da.

TABLA 4. Constantes cinéticas de Ia actividad glicosilhidrolasa de Ia α-glucosidasa de X. dendrorhous.

Actividad glicosiltransferasa de Ia enzima de X. dendrorhous.

Se realizó un estudio utilizando una alta concentración de maltosa (240 g/l), condiciones que pueden favorecer Ia formación de enlaces glicosídicos en detrimento de Ia hidrólisis. El perfil de los productos formados se muestra en Ia FIG. 5. Se puede apreciar que Ia α-glucosidasa de X. dendrorhous presenta actividad de transferencia. Además, se forman dos familias de productos: oligosacáridos con enlaces α-1 ,4 (maltooligosacáridos: maltotriosa [α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu]; maltotetraosa [α-D-Glu- (1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu]) y oligosacáridos que contienen algún enlace α-1 ,6 (isomaltosa [α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu], panosa [α-D-Glu-(1 →6)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu] y el tetrasacárido: α-D-Glu-(1→6)- OrD-GIu-(I →4)-α-D-Glu-(1 →4)-α-D-Glu).

En Ia TABLA 5 se muestra Ia composición (en g/l) de los azúcares valorados en Ia mezcla de reacción a Io largo de 288 horas de incubación. La nueva enzima caracterizada en este trabajo sigue manteniendo actividad glicosiltransferasa tras 288 horas a 40 ⁰ C.

TABLA 5. Composición de Ia mezcla de reacción con el tiempo tras Ia incubación de maltosa con Ia enzima purificada (F-3) de X. dendrorhous. Condiciones de reacción: 240 g maltosa/1 en 0.2 M acetato sódico (pH 5.4), 40 ⁰ C, 150 rpm. Análisis mediante HPLC utilizando una bomba Waters delta 500, columna Lichrospher 100-NH2 (Merck) de 250 x 4.6 mm, acetonitrilo:agua 75:25 v/v, 0.7 ml/min, 25 ⁰ C, detector de índice de refracción Varían. Nombre de los compuestos: 1 , glucosa; 2, maltosa [α-D-Glu-(1→4)-α- D-GIu]; 3, isomaltosa [α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu]; 4, maltotriosa [α-D-Glu- (1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu]; 5, panosa [α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu-(1→4)-α- D-GIu]; 6, maltotetraosa (α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D- GIu); 7, el tetrasacárido α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu-(1→4)-α-D-Glu-(1→4)-α-D- GIu.

EJEMPLOS DE PREPARACIÓN

EJEMPLO 1 : Producción de α-qlucosidasa a Io largo de un cultivo de X. dendrorhous crecido en medio rico.

Para Ia producción de α-glucosidasa, se cultivó X. dendrorhous de Ia cepa ATCC 24230 crecido en 100 mi de medio rico para levaduras (YEP) suplementado con maltosa (YEPM): extracto de levadura (DIFCO) al 1% (p/v), bactopeptona (DIFCO) al 2% (p/v), maltosa al 2% (p/v), se siguió durante 60 horas. El crecimiento celular se valoró espectrofotométricamente siguiendo Ia absorbancia del cultivo a una densidad óptica de 660 nm (UDO660). Se utilizó un matraz de vidrio de 250 mi, 24 ⁰ C de temperatura y

agitación orbital constante. La fase estacionaria se alcanzó a las 35 horas de crecimiento, a 5 UDO660. Cada 3-4 horas se tomó 1 mi del cultivo y se retiraron las células por centrifugación; 2-3 minutos en microcentrífuga (16000xg).

EJEMPLO 2: Uso de Ia enzima para Ia producción de glucosa a partir de maltosa con sobrenadante de medio rico

El sobrenadante del cultivo del EJEMPLO 1 se utilizó para Ia liberación de glucosa a partir de maltosa por acción de Ia actividad glucosidasa del sobrenadante donde se encuentra Ia enzima extracelular. Para ello, 0.5 mi de

Ia fracción libre de células y 0.5 mi de maltosa al 1% en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 5.5 se mezclaron e incubaron a 42 ⁰ C durante 60 minutos.

Se obtuvieron niveles apreciables de actividad glucosidasa desde el final de Ia fase de crecimiento logarítmico del cultivo hasta el inicio de Ia fase estacionaria, durante unas 20 horas de cultivo. Los máximos niveles de actividad (20 U/ml) se obtuvieron a 3-4 UDO660.

EJEMPLO 3: Producción de α-glucosidasa a Io largo de un cultivo de X. dendrorhous crecido en medio mínimo con almidón.

Para Ia producción de α-glucosidasa se cultivó X. dendrorhous MYA-131 crecido en 100 mi de Medio Mínimo Almidón (MMA): YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO) al 0.7% (p/v), almidón, DIFCO al 2% p/v) y se siguió durante 150 horas. El crecimiento celular se realizó y valoró como en el ejemplo anterior. La fase estacionaria se alcanzó a las 75 horas de crecimiento, a 3.4 UDO660. Cada 5-7 horas se obtuvo Ia fracción libre de células como en el EJEMPLO 1.

EJEMPLO 4: Uso de Ia enzima para Ia producción de glucosa a partir de maltosa con sobrenadante de medio mínimo con almidón

El sobrenadante del cultivo del EJEMPLO 3 se utilizó para Ia liberación de glucosa a partir de maltosa por acción de Ia actividad glucosidasa del sobrenadante donde se encuentra Ia enzima extracelular. Para ello, 0.5 mi de Ia fracción libre de células y 0.5 mi de maltosa al 1% en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 5.5 se mezclaron e incubaron a 42 ⁰ C durante 60 minutos.

Se obtuvieron niveles valorables de actividad glucosidasa desde Ia mitad de Ia fase de crecimiento logarítmico del cultivo hasta el inicio de Ia fase estacionaria, durante unas 30 horas de cultivo. Los máximos niveles de actividad (15 U/ml) se obtuvieron a 2.3-2.5 UDO660.

EJEMPLO 5: Degradación de almidón a partir de Ia enzima extracelular de un cultivo de X. dendrorhous crecido en medio mínimo con almidón.

El almidón presente en el medio a Io largo de Ia curva de crecimiento del cultivo del EJEMPLO 3 se cuantificó con lugol (I ₂ 0.15% (p/v), Kl 0.5% (p/v)). Para ello, 0.05 mi de Ia fracción libre de células se mezclaron con 0.05 mi de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 5.5. A 0.025 mi de esta mezcla se Ie añadieron 0.1 mi de lugol y 2.5 mi de agua. El polisacárido se cuantificó espectrofotométricamente a 595 nm utilizando una curva patrón de almidón (1-10 mg/ml). El valor de almidón del 100% fue el valorado en el medio de cultivo inicial, el que se utilizó para realizar el inoculo. Utilizando esta metodología, no se apreció disminución de almidón en el medio extracelular durante las primeras 30 horas de cultivo. Se obtuvieron reducciones en Ia concentración del polisacárido del 10, 20, 40 y 60% a las 50, 60, 70 y 80 h de cultivo, respectivamente. El último valor, 60%, permaneció constante durante crecimientos prolongados, de hasta 300 horas.

EJEMPLO 6: Degradación de almidón catalizada por Ia α-glucosidasa de X. dendrorhous.

Se preparó una disolución al 10% (p/v) de almidón soluble (Paselli SA2, con un grado de polimerización medio de 50 unidades de glucosa) en tampón acetato sódico 0.2 M pH 5.4. Sobre 10 mi de esta disolución se añadieron 0.5 mi de disolución de α-glucosidasa pura correspondiente a Ia fracción 3 de Ia TABLA 2. La mezcla de reacción se incubó durante 168 horas a 40 "C, en un agitador orbital a 200 rpm. El perfil de productos obtenidos en Ia hidrólisis de almidón se estudió por cromatografía líquida. El análisis de los productos formados se realizó mediante HPLC utilizando una bomba Waters 515, 2 columnas Aminex HPX-42A (BioRad) con dimensiones 300 x 4.6 mm, agua como fase móvil a 0.6 ml/min, 65 ⁰ C, detector de índice de refracción Waters.

EJEMPLO 7: Formación de oligosacáridos a partir de maltosa catalizada por Ia α-glucosidasa de X. dendrorhous.

Se preparó una disolución de alta concentración de maltosa (240 g/l) en tampón acetato sódico 0.2 M pH 5.4. Se añadieron 0.7 μg de α-glucosidasa procedente de Ia disolución de α-glucosidasa pura correspondiente a Ia fracción 3 de Ia TABLA 2. La mezcla de reacción se incubó durante 288 horas a 40 "C, con agitación orbital a 200 rpm. A diferentes tiempos se extrajeron alícuotas, se incubaron 5 minutos a 80 "C para inactivar Ia enzima, se diluyeron 1 :4 (v/v) con agua, se centrifugaron 5 min a 6000 rpm en un tubo eppendorf con un filtro de 0.45 μm y se analizaron por cromatografía líquida HPLC. El perfil de los productos formados se aprecia en Ia FIG. 7. Se puede apreciar que Ia α-glucosidasa de X. dendrorhous presenta actividad de transferencia. Además, se forman dos familias de productos: oligosacáridos con enlaces α-1 ,4 (maltooligosacáridos), oligosacáridos que contienen algún enlace α-1 ,6 (isomaltosa, panosa, etc.). A tiempo final (288 horas) Ia composición del sistema fue: 66.3 g/l de glucosa, 69.2 g/l de maltosa, 14.4 g/l de isomaltosa, 35.9 g/l de maltotriosa, 21.2 g/l de panosa, 15.4 g/l de maltotetraosa, y 17.6 g/l del tetrasacárido α-D-Glu-(1→6)-α-D-Glu-(1→4)-α- D-GIu-(I →4)-α-D-Glu.