Die Erfindung betrifft einen Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I

Formel I, wobei Fluo aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen ausgesucht, F ein Finker und die Gruppe X entweder eine -SO2- oder eine -PO(OH)- Gruppe ist. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker insbesondere auch als Standard in der Glycan- Analyse, Konjugate aus Fluoreszenzmarker und Glycanen, sowie ein Kit-of-Parts ent haltend die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker.

Die Untersuchung biologischer Makromoleküle stellt auch heutzutage immer noch eine analy tische Herausforderung dar. Zum einen handelt es sich bei den zu untersuchenden Proben meist um mehr oder minder inhomogene Gemische, deren physikalische und chemische Eigenschaf ten neben der chemischen Zusammensetzung als solche auch noch von anderen Faktoren, wie beispielsweise dem 3 -dimensionalen Aufbau der Moleküle, abhängt. Zum anderen kann es zwi schen den einzelnen Bestandteilen auch zu signifikanten Wechselwirkungen kommen, welche eine weitere Komplikation der Analytik und in der Interpretation der erhaltenen Ergebnisse darstellt. Das Gesagte trifft insbesondere für die Glycan-Analytik zu. Glycane werden dabei allgemein als polymere Verbindungen aus einer großen Anzahl an Monosaccharid-Bausteinen definiert, welche über eine glycosidische Bindung miteinander verbunden sind. In diese Klasse fallen auch die Glycokonjugate, beispielsweise Glycoproteine oder Glycolipide, welche häufig in Eu- karyoten, weniger häufig in Prokaryoten zu finden sind. Diese Verbindungen erfüllen in leben den Organismen eine Vielzahl unterschiedlicher Aufgaben. Darunter fallen beispielsweise die strukturelle Integrität der Zellmembranen, das Ausbilden der extrazellulären Matrix, die Sig nalübertragung, die Proteinfaltung und der interzellulare Informationsaustausch. Basierend auf der Vielfalt an strukturellen Ausgestaltungen und der Vielzahl an biologischen Funktionen hat die Glycan-Analytik für die pharmazeutische und die Nahrungsmittelindustrie in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung eingenommen.

Die Molmassenbestimmung der Glycane und deren Konjugate kann beispielsweise über Kapil lar-Elektrophorese (CE) erfolgen, welche auf Basis der Molekülladung eine schnelle und effi ziente Auftrennung selbst kleinster Probenvolumina erlaubt. Eine Abwandlung des CE-Prinzips wird in der Kapillar-Gelelektrophorese (CGE) verfolgt. In diesem Verfahren werden die Kapil laren zusätzlich zum Elektrolyten auch mit einem Gelbildner gefüllt. Basierend auf der Gel komponente erfolgt die Auftrennung deutlich verstärkt auch über die Größeneigenschaften (Molekularsiebeffekt) der zu untersuchenden Moleküle, da größere Moleküle einen deutlich höheren Migrationswiderstand durch das Gel-Netzwerk erfahren als kleinere. Der Einsatz des Polymergels erlaubt also eine deutliche Aufspreizung der physikalischen Einflussfaktoren, wel che in dieser Methode neben der Ladung auch eine Funktion der Molekülform ist. Letzteres erweitert das Anwendungsspektrum erheblich und ermöglicht selbst die Auftrennung makro molekularer Strukturisomere.

Zur Detektion der Glycane in der CE und der CGE hat sich verstärkt der Einsatz der Laser induzierten Fluoreszenz-Spektroskopie (LIF) durchgesetzt. Aufgrund der Tatsache, dass die Glycane in der Regel keine Fluorophore aufweisen, müssen zur Untersuchung der Substanzen zusätzliche Fluorophore ins Zielmolekül eingebracht werden. Letzteres ist insbesondere auch der Tatsache geschuldet, dass die optische Weglänge innerhalb der Kapillaren sehr kurz ist und die Proben nur eine sehr kleine Analytmengen aufweisen, so dass an die Nachweismethoden sehr hohe Sensitivitätsanforderungen zu stellen sind. Die Randbedingungen erfordern daher den Einsatz hocheffizienter Fluorophore und hocheffizienter optischer Komponenten. Ein„üb- licher“ Aufbau basiert dabei auf einem Argon-Laser mit Fluoreszenzanregungswellenlängen bei 488 nm und 514 nm und einem Photodetektor mit mehreren Detektionsfenstern.

Zur Bestimmung absoluter Größen des Molekulargewichts müssen die eingesetzten Systeme über den Einsatz von Referenzsubstanzen kalibriert werden. Als Standards werden häufig mit Fluorophoren gelabelte DNA-Fragmente („DNA-Leitem“) mit 35-500 Nukleotiden eingesetzt. Die Referenzsubstanzen werden dabei entweder vor oder nach der eigentlichen Probe auf die Kapillaren gegeben. Dies hat den Vorteil, dass Probe/Referenz mit denselben Fluorophoren arbeiten können. Mit den DNA-Referenzen können über einen sehr breiten Elutionsbereich gleichmäßige Elutionsabstände bereitgestellt werden. Nachteilig ist jedoch, dass sich der grund legende Aufbau der Polynukleotide von denen der Glycane unterscheidet. Aus diesem Grund werden analog zu den DNA- auch Dextran-Leitern als Referenzsubstanzen angeboten. Diese besitzen im Vergleich zu den Glycanen strukturähnliche Monomere und zeigen deshalb ein deutlich vergleichbareres Migrationsverhalten. Nachteilig ist jedoch, dass nur wenige geeignete Fluorophore existieren, welche den analytischen Randbedingungen der Methode genügen. Er schwerend kommt hinzu, dass diese zudem noch sehr ähnliche spektrale Eigenschaften zeigen.

Der Einsatz von Fluoreszenzmarkern in der Analytik wird auch in der Patentliteratur behandelt. So beschreibt beispielsweise die EP 0 943 918 Al Fluoreszenzmarkierungskomplexe mit nied rigem Molekulargewicht und mit großen Wellenlängen Verschiebungen zwischen der Absorp tion eines Farbstoffs in dem Komplex und der Emission eines anderen Farbstoffs in dem Kom plex. Diese Komplexe können zum Beispiel für Multiparameter-Fluoreszenz-Zellanalysen un- ter Verwendung einer einzelnen Anregungswellenlänge verwendet werden. Das niedrige Mo lekulargewicht des Komplexes erlaubt es den Materialien, die mit dem Komplex markiert sind, in Zellstrukturen zur Verwendung als Sonden einzudringen. Die Markierungskomplexe werden durch kovalente Bindung durch Linker unter Bildung von Donor- Akzeptor- Komplexen synthe tisiert. Der Resonanzenergietransfer von einem angeregten Donor zu einem fluoreszierenden Akzeptor liefert Wellenlängenverschiebungen von bis zu 300 nm. Die Fluoreszenzmarkie rungskomplexe enthalten vorzugsweise reaktive Gruppen für die Markierung von funktionellen Gruppen an Zielverbindungen, wie derivatisierte Oxy- und Deoxynukleinsäuren, Antikörper, Enzyme, Lipide, Kohlenhydrate, Proteine und andere Materialien. Die Komplexe können funk tionelle Gruppen enthalten, die eine kovalente Bindung zu Materialien ermöglichen, welche reaktive Gruppen tragen.

Des Weiteren offenbart die WO 2009 078 970 Al allgemein Fluoreszenzfarbstoffe nach der folgenden Formel

_ g - p

Zudem stellt die Schrift eine breite Palette von Fluoreszenzfarbstoffen und diese enthaltende Kits bereit, die zum Markieren einer Vielzahl von Biomolekülen, Zellen und Mikroorganismen anwendbar sind. Das Dokument stellt auch verschiedene Verfahren zur Verwendung der Fluo reszenzfarbstoffe für Forschung und Entwicklung, forensische Identifizierung, Umweltstudien, Diagnose, Prognose und / oder Behandlung von Krankheitszuständen bereit.

Trotz der schon im Bereich der Analytik bekannten Fluoreszenzmarker besteht weiterhin ein Interesse an neuen Verbindungen, welche selbst unter schwierigen Randbedingungen der je weiligen Analysemethode in der Lage sind, hoch genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Ansprüchen beschriebenen Fluoreszenz marker, den Fluoreszenzmarker-Glycan-Konjugaten und den erfindungsgemäßen Kit-of-parts erfüllt. Bevorzugte Ausführungsformen derselben sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.

Erfindungsgemäß ist ein Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I

Formel I,

mit

Ri -H oder Cl - C6 Alkyl;

R ₂ -H oder -PO(OH) ₂ ;

X -S0 ₂ - oder -PO(OH)-;

L = -(CH ₂ ) _n -CHR ₃ -CH ₂ - mit n = 1, 2, 3 und R ₃ = -H oder -(CH ₂ )-OPO(OH) ₂ ;

wobei Fluo ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen.

Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker eine Vielzahl positiver Ei genschaften im Bereich der Analytik und insbesondere im Bereich der kapillarelektrophoreti schen Untersuchung von Glycanen aufweisen. Durch ihre Struktur sind die Fluoreszenzmarker in der Lage, einfach und reproduzierbar über eine reduktive Aminierung an Glycane gekoppelt zu werden. Dies hochwahrscheinlich durch die vorhandene Aminogruppe, welche einem pK _a - Wert von ungefähr 4-5 aufweist. Die weiteren Strukturbestandteile des Fluoreszenzmarkers sind unter üblichen Kopplungsbedingungen stabil, sodass eine verlässliche und hoch effiziente Kopplung erhalten werden kann. Die Fluoreszenzmarker können eine hohe negative Nettola dung aufweisen und eignen sich dadurch insbesondere für schnelle Auftrennungen in üblichen Elektrophorese-Puffern, beispielsweise bei einem pH-Wert um die 8. Des Weiteren zeigen die beanspruchten Strukturen eine hohe Absorption in den üblicherweise verwendeten Wellenlän genbereichen von Ar-Lasern um die 488 nm. Dadurch können diese Fluoreszenzmarker mit Standardgeräten der Gelelektrophorese verwendet werden. Die Fluoreszenzmarker zeichnen sich zudem durch hohe Extinktionskoeffizienten und ausgezeichnete Quantenausbeuten aus. Besonders hervorzuheben ist, dass die Emission der beanspruchten Fluoreszenzmarker außer halb des Emissionsbereiches der aus dem Stand-der-Technik bekannten Fluoreszenzmarker liegt. Dadurch wird es zum ersten Mal möglich, dass Referenz und Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarker markiert und zur selben Zeit vermessen werden können. Die Signale beider Komponenten, Referenz sowie Probe, können dabei einfach über die unterschiedlichen Emis sionswellenlängen auseinandergehalten werden. Die Emissionswellenlängen der hier bean spruchten Strukturen liegen in einem Bereich um die 560 - 600 nm, während die im Stand der Technik verwendeten Fluoreszenzmarker eine Emission um die 500 nm liefern. Die Emissions- maxima sind also weit genug entfernt, um eine signifikante Zuordnung zu erlauben. Ein weite rer Vorteil ergibt sich auch dadurch, dass die Fluoreszenzeigenschaften der beanspruchten Flu orophore sich gar nicht oder nur marginal durch Kopplung an Glycane verändern. In Summe wurden Fluoreszenzmarker erhalten, welche sich durch die existierenden Randbedingungen äu ßerst vorteilhaft für modernste CE- und GCE-Methoden eignen.

Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker weisen eine spezifische Struktur nach der Formel I

Formel I,

auf. Dies bedeutet, dass die Fluoreszenzmarker mindestens eine Fluorophoreinheit Fluo auf weisen, welche kovalent sowohl an eine funktionelle Gruppe X als auch direkt kovalent an eine stickstoffenthaltende Gruppe gebunden sind. Die funktionelle Gruppe X ist wiederum kovalent an eine Finker-Gruppe F gebunden, welche sauerstoffverbrückt mit der terminalen Gruppe R ₂ verbunden ist. Die Aminogruppe Ri kann dabei erfindungsgemäß ein primäres (-H) oder ein sekundäres Amin sein, welches dann eine Cl - C6 Alkylgruppe trägt. Bevorzugt kann diese Gruppe als Bin dungsstelle zur Kopplung von Glycanen genutzt werden. Trotz der Nähe zum Fluorophor hat es sich gezeigt, dass sich auch nach Kopplung großer Glycanreste an die Aminogruppe in dieser Position sich die spektroskopischen Eigenschaften, und hier insbesondere die Lage des Emis sionsmaximums, nur unwesentlich ändern. Dies kann den apparativen Aufbau bei der Messung reduzieren und liefert sehr reproduzierbare Messwerte.

Die terminale Gruppe R ₂ kann Wasserstoff oder -PO(OH) ₂ sein. Es ergeben sich also erfin dungsgemäß Phosphorsäure-derivate oder Alkohole an dieser Stelle. Als Funktion des vorlie genden Puffersystems kann diese Gruppe natürlich auch geladen, beispielsweise als Alkoholat bzw. Phosphat, vorliegen. Durch diese Ausgestaltung können weitere Ladungen am Fluores zenzmarker erzeugt werden, welches die Migrationsgeschwindigkeit von Konjugaten im Rah men der CE erhöhen kann.

Die verbrückende Gruppe X kann entweder -S0 ₂ - oder -PO(OH)- sein. Diese Gruppen haben sich zur Veränderung der Emissionswellenlänge des Fluoreszenzmarkers als besonders effi zient herausgestellt. Durch diese Gruppen ist man in der Lage, die Emissionswellenlänge in Richtung größerer Wellenlänge zu verschieben, und es werden über diese Substituenten Flu orophore mit hohen Quantenausbeuten erhalten. Durch das Einbringen dieser Gruppe wird zu dem die Umsetzung mit Glycanen zu Konjugaten nicht negativ beeinflusst. Es werden ohne nennenswerte Nebenreaktionen ähnliche Reaktionsgeschwindigkeiten erhalten.

Der Linker L kann ein reiner Kohlenwasserstoff (R ₃ = -H) sein oder aber auch noch eine wei tere, als Funktion des pH-Werte ionisierbare, Gruppe tragen (R ₃ = -(CH ₂ )-OPO(OH) ₂ ). Letzte res kann besonders bevorzugt sein, falls höhere Ladungsdichten auf dem Fluoreszenzmarker gewünscht sind. Die Gruppe Fluo kann aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen ausgesucht sein. Dies bedeutet, dass der Fluorophor-Grundköper, welcher an die Aminogruppe und über die funktionelle Gruppe X an den Linker gebunden ist, zu einer der 3 genannten Verbindungsklassen gehört. Überraschend wurde gefunden, dass sich insbesondere diese 3 Grundkörper eignen, durch den erfindungsge mäßen Aufbau Fluoreszenzmarker zu liefern, welche einen bestimmten Emissionswellenlän genbereich aufweisen. Dies ist umso überraschender, da diese drei Fluo-Grundkörper einen doch sehr unterschiedlichen Aufbau aufweisen können. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein weisen die drei unterschiedlichen Grundkörper im Rahmen des erfindungsgemäßen Auf baus sehr vergleichbare elektrische Eigenschaften auf, was zu einem ähnlichen Absorptions und Emissionsverhalten führt. Zudem ist die chemische Stabilität dieser Gruppen vergleichbar, sodass mit sehr vergleichbaren Kinetiken und mit einer ähnlichen Selektivität effiziente Kopp lung sreaktionen mit Glycanen erhalten werden können. Überraschend ist weiterhin, dass diese Gruppen eine vergleichbare Invarianz in Bezug auf die Verschiebung des Emissionsmaximums nach der Kopplung zeigen. Dies mag darin begründet liegen, dass die unterschiedlichen Fluo- Grundkörper zusätzlich zu den vergleichbaren elektronischen Eigenschaften auch eine ähnliche räumliche Struktur aufweisen.

Erfindungsgemäß fallen in die Gruppe der C10-C30 Acridone folgende Beispielverbindungen;

Erfindungsgemäß fallen in die Gruppe der C10-C30 Aminoacridine folgende Beispiel Verbin dungen:

Erfindungsgemäß fällt in die Gruppe der C10-C30 Pyrene die folgende Verbindung:

Diese Verbindungen können zudem an jeder bindungsfähigen Stelle durch weitere funktionelle Gruppen wie -OH, -COOH, OR, -NH ₂ , -NHR, -NR ₂ mit R Alkyl, Halogene, -S0 ₃ H, -OPO ₃ H ₂ substituiert sein oder schon einen Teil oder die ganzen Gruppen X und NH-Ri aufweisen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Fluoreszenzmarkers kann Fluo ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus den Fluorophoren nach den Formeln II-IV

Formel IV, wobei R ₄ , R _S = jeweils unabhängig voneinander -OPO(OH) ₂ oder -OH; R ₆ , R ₇ = jeweils unab hängig voneinander -S0 ₂ -CH2-CHR2-(CH ₂ )q-R4 oder -PO(OH)-CH ₂ -CHR2-(CH ₂ )q-R4 mit q = 1, 2, 3; o, p = jeweils unabhängig voneinander 1, 2, 3; und die Fluo nach den Formeln II-IV an jeder bindungsfähigen Stelle mit NH und X verbunden sein können. Gerade diese Strukturen aus den unterschiedlichen Klassen haben als Fluoreszenzmarker in der Glycan-Analytik als be sonders geeignet erweisen. Zusätzlich zu dem schon zu den unterschiedlichen Gruppen ausge führten, scheinen durch das vergleichbare Molekulargewicht, die vergleichbare Größe und die vergleichbaren elektronischen Eigenschaften, sich sehr ähnlich Fluoreszenzmarker-Eignungen herauszubilden. Diese Verbindungen sind unter den Bedingungen der CE stabil und lassen sich innerhalb sehr ähnlicher Reaktionszeiten an Glycane koppeln. Die erhaltenen Konjugate sind chemisch stabil und zeigen ausgezeichnete Haltbarkeiten selbst in Gegenwart eines wässrigen Puffers. Die Verbindungen sind zudem mit den üblichen Puffersystemen in der CE kompatibel und können als Funktion des pH-Wertes ein breites Ladungsspektrum abdecken. Die Anbin dung an die Gruppe X und die Aminogruppe kann dabei an jeder Stelle des Fluorophor-Grund- gerüstes erfolgen. Dies können bevorzugt die aromatischen Strukturen des Fluorophors sein. Diese Anbindungsstellen haben sich als besonders stabil erwiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Fluoreszenzmarkers können die Fluorophore Fluo den Formeln V - VII entsprechen

Formel V Formel VI

Formel VII. wobei die Fluorophore durch die geschlängelten Bindungen mit NH und X verbunden sind. Die Definition der weiteren Markush-Gruppen ist weiter oben definiert. Diese Strukturen mit den spezifischen Bindungs stellen zu den weiteren funktionellen Bestandteilen des Fluoreszenzmar kers haben sich als besonders geeignet erwiesen. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein ergeben sich durch diese spezifischen Bindungsstellen sterische Ausgestaltungen des Fluores zenzmarkers, welche eine besonders einfache und effiziente Wechselwirkung mit Glycan-Mak- romolekülen erlauben. Dadurch lassen sich die Kopplungsreaktionen schnell und effizient durchführen. Es werden innerhalb kurzer Reaktionszeiten stabile Konjugate erhalten, welche zudem in wässrigen Systemen sehr stabil sind.

Im Rahmen einer weiteren Charakteristik des Fluoreszenzmarkers kann X = -S0 ₂ - sein. Insbe sondere Fluoreszenzmarker mit der dargestellten verbrückenden Einheit haben sich für die Flu- oreszenzanalytik als besonders geeignet erwiesen. Die verbrückende S0 ₂ -Einheit scheint für den starken Shift in der Fluoreszenzemission mit verantwortlich zu sein und liefert im Vergleich zu Stand-der-Technik-Fluoreszenzmarker ein deutlich anderes Emissionsverhalten. Dies ist eine der Grundlagen, dass man im Rahmen einer Messung zwei unterschiedliche Fluoreszenz marker mit unterschiedlichen Emissionsfenstem betrieben kann. Diese Einheit liefert zudem ein chemisch sehr stabiles Molekül, welches auch im Rahmen der harschen Kopplungsbedin gungen an Glycane stabil bleibt. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform des Fluoreszenzmarkers kann im Linker L R ₃ = -(CH ₂ )-OPO(OH) ₂ sein. Die Grundform des erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarkers ist so fle xibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktioneller Teilgruppen, wie oben dargestellt, sich die Fluoreszenz-Grundeigenschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluoreszenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhöhen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan -Analytik beitragen kann. Über die zusätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zentralatom können diese Fluoreszenzmarker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unter schiedlichen pH-Werten angewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisierung in der Glycan- Analytik beitragen.

Innerhalb eines bevorzugten Aspektes des Fluoreszenzmarkers können in dem Fluorophor nach der Formel III oder VI R ₄ und Rs jeweils -OPO(OH) ₂ sein. Die Grundform des erfindungsge mäßen Fluoreszenzmarkers ist so flexibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktionellen Teilgruppen in den Strukturen II und VI, wie oben dargestellt, sich die Fluoreszenz-Grundei genschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluores zenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhöhen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan-Analytik beitragen kann. Über die zu sätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zentralatom können diese Fluoreszenz marker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unterschiedlichen pH-Werten an gewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisierung in der Glycan-Analytik bei tragen.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Fluoreszenzmarkers können in dem Fluorophor nach der Formel IV und VII R ₆ und R ₇ jeweils -PO(OH)-CH ₂ -CHR ₂ -(CH ₂ )-OPO(OH) ₂ sein. Die Grundform des erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarkers ist so flexibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktioneller Teilgruppen in den Strukturen IV und VII, wie oben darge stellt, sich die Fluoreszenz-Grundeigenschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluoreszenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhö hen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan-Ana- lytik beitragen kann. Über die zusätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zent ralatom können diese Fluoreszenzmarker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unterschiedlichen pH-Werten angewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisie rung in der Glycan- Analytik beitragen.

Des Weiteren erfindungsgemäß ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmar ker als Standard in einer Glycan-Analyse. Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker eignen sich insbesondere als Standard zur Untersuchung von Glycanen. Basierend auf der Struktur der Fluoreszenzmarker ergeben sich kovalente Bindungsstellen zu Glycanen, welche im Zuge ge steuerter Reaktion einfach und reproduzierbar mit funktionellen Gruppen der Glycane umge setzt werden können. Derart lassen sich Glycane oder allgemein Zucker mit einem spezifischen Molekulargewicht einfach an die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker koppeln. Man erhält also gelabelte Glycan-Proben mit spezifischem Molekulargewicht und reproduzierbaren Mig rationseigenschaften, welche in der CE oder der GCE auch als MW-Referenzproben eingesetzt werden können. Durch den vergleichbaren chemischen Aufbau eignen sich diese Moleküle deutlich besser als DNA-Leitem. Ein weiterer Vorteil ergibt sich über das veränderte Emissi onsverhalten und hier insbesondere die veränderte Emissionswellenlänge. Diese führt dazu, dass man innerhalb einer Auftrennung sowohl die zu untersuchende Probe als auch die Referenz gleichzeitig in unterschiedlichen Emissionsfenstem detektieren kann, vorausgesetzt, dass die Probe mit ein Stand-der-Technik-Fluoreszenzmarker gelabelt ist. Da Probe und Referenz unter exakt gleichen Bedingungen aufgetrennt werden, sind diese Messung reproduzierbarer als Mes sungen, in denen die Referenz mit demselben Fluoreszenzmarker in einem pre- oder post-Ex- periment untersucht wird. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kön nen also Analysenzeit und Kosten eingespart werden. Sinnvollerweise können die verwendeten Glycan-Standards Standards als Funktion des Molekulargewichts der Glycane sein. Des Weiteren erfindungsgemäß ist ein Konjugat aus einem Fluoreszenzmarker und einem Gly- can, wobei das Glycan an mindestens einen erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kovalent gebunden ist. Bedingt durch den chemischen Aufbau lassen sich die erfindungsgemäßen Fluo reszenzmarker effizient an Glycane koppeln. Auf die Art und Weise können eine oder mehrere Fluoreszenzmarker an die Glycane gekoppelt und diese so einer Fluoreszenzuntersuchung zu gänglich gemacht werden. Vorteilhafterweise können die Konjugate als Funktion des vorlie genden pH-Wertes eine größere Anzahl an Ladungen tragen. Dies kann beispielsweise durch eine Deprotonierung der sauren Gruppen des Fluoreszenzmarkers erfolgen. Die Konjugate kön nen also eine höhere Nettoladung tragen und insbesondere elektrophoretische Messungen kön nen schneller durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Variante des Konjugats kann das Glycan ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus mono-, oligo-, Polysacchariden, Glycoproteinen, Glycolipiden, Proteoglycanen oder Mischungen daraus. Die oben genannte Gruppe an Glycanen lassen sich schnell und ohne die Bildung unerwünschter Nebenprodukte an die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kop peln. Dadurch können innerhalb eines Experimentes sowohl die Proben aus der Gruppe der oben angegebenen Glycane als auch beispielsweise Molekulargewichtsstandards vermessen werden. Es ergeben sich dabei die schon für den Fluoreszenzmarker diskutierten Vorteile.

Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Kit-of-parts, welches mindestens ein oder mehrere Behälter mit einem oder mehreren Lösungsmitteln und ein oder mehrere Behälter mit jeweils den erfin dungsgemäßen Fluoreszenzmarker oder den erfindungsgemäßen Konjugaten umfasst. Insbe sondere eine Verkaufsverpackung mit einer oder mehreren Glycan-Fluoreszenzmarker-Konju- gaten, bevorzugt mit unterschiedlichen Molekulargewichten, kann die Fluoreszenzuntersu chung unbekannter Glycan-Proben deutlich erleichtern. Die Konjugate können dabei schon in Lösung, beispielsweise einem Puffer, oder als isolierte Substanz vorliegen. Letztere kann dann beispielsweise zusammen mit einem im Kit bereitgestellten Puffer kurz vor der Messung zu einer Konjugat-Lösung verarbeitet werden. Dies kann vorteilhaft sein, da die zu verwendende Menge über das Mischungsverhältnis von Puffer zu Konjugat eingestellt werden kann. Zudem kann die Menge auf die Empfindlichkeit des Versuchsaufbaus adaptiert werden. Bevorzugt kann das Kit eine, noch bevorzugter zwei oder drei Konjugate mit unterschiedlichen Moleku largewichten aufweisen. Der Einsatz mehrerer Konjugate kann über eine mögliche mathemati sche Weiterverarbeitung der erhaltenen Informationen zu einer verlässlicheren Messung beitra gen. Es ist aber auch möglich, ein Kit zur Färbung von Glycanen bereitzustellen.

Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform des Kits kann das Kit ein„Labeling“ Kit zur Verwendung in der Markierung von Glycanen sein. Dieses Labeling Kit kann neben dem erfin dungsgemäßen Farbstoff als fakultativen Bestandteil noch weitere optionale Bestandteile wie eine oder mehrere Pufferlösungen, ein oder mehrere Reduktionsmittel (beispielsweise Natri- umcyanoborhydrid, 2-Picolinboran); Verbrauchsmaterialien für die Durchführung der Färbung (Gefäße etc.) und eine Färbeanleitung umfassen. Mittels dieses Kits lassen sich Glycan-Proben erfindungsgemäß anfärben.

In Rahmen einer weiteren Ausgestaltung des Kits kann das Kit ein Glycan-Leiter-Kit zur Ver wendung als interner Standard sein. Das Kit kann dabei fakultativ eine Mischung gefärbter Glycane, bevorzugt Dextrane, unterschiedlichen Molekulargewichts und diese vorzugsweise in lyophilisierter Form aufweisen. Weiterhin optional kann das Kit Lösemittel oder Puffer, Ver brauchsmaterial für die Färbung (Gefäße etc.) und eine Anleitung zur Rekonstitution und Ver wendung umfassen. Mittels dieses Kits lassen sich gelabelte Glycane mit bekannten Moleku largewichten als interne Standards in der Untersuchung von Glycanen mit unbekannten Mole kulargewichten bereitstellen.

Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Gegenstände wer den durch die Figuren veranschaulicht und nachfolgenden erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Es zeigen:

Fig. 1 einen Syntheseweg für einen phosphorylierten Acridon-Fluoreszenzmarker nach der Verbindung 1;

Fig. 2 Absorptions-/Emissionsspektren der Beispielverbindung 1 (in 0,05 M TEAB-Puffer mit Anregung bei 488 nm) als isolierter Fluoreszenzmarker ( ) und als Glucose-Konjugat (- - ) im Wellenlängenbereich zwischen 250 und 800 nm.

Die Figur 1 zeigt einen möglichen Syntheseweg zum Erhalt der Verbindung 1. Die einzelnen Synthesestufen und Reaktionsbedingungen sind weiter unten im Beispielteil beschrieben.

Die Figur 2 zeigt die Absorptions- und Emissionseigenschaften eines erfindungsgemäßen Flu oreszenzmarkers sowie eines Konjugats aus einem Fluoreszenzmarker und einem Einfachzu cker. Dargestellt sind die normierten Absorptions- und Emissionsspektren von 7-[(3-phosphop- ropyl)sulfonyl]-2-aminoacridin-9(lOH)-on (1) sowie dessen Glucose-Konjugats. Die Absorpti onseigenschaften wurden in 0,05 M TEAB-Puffer (Triethylammoniumbicarbonat-Puffer) bei einem pH-Wert von 8,0 gemessen. Die Anregung erfolgte bei 488 nm. Es ist deutlich die Flu oreszenzemission mit einem Maximum um ca. 585 nm zu erkennen. Durch Bildung des Kon jugats wird das Emissionsmaximum nur unwesentlich zu höheren Wellenlängen verschoben und liegt bei ca. 590 nm. Durch die spektroskopischen Eigenschaften eignet sich der Fluores zenzmarker insbesondere für die Glycan- Analytik, wobei der Fluoreszenzmarker alleine oder aufgrund seines Emissionsmaximums gleichzeitig in Kombination mit einem Fluoreszenzmar ker aus dem Stand der Technik verwendet werden kann. Durch die verschiedenen Emissions fenster lassen sich zwei Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander detektieren. Beispiele

Synthese der Beispielverbindungen

Ein möglicher Syntheseweg zum Erhalt der Verbindung (1) ist in der Figur 1 dargestellt.

(I) 5-Nitro-N-phenyl-anthranilsäure (4)

2-chloro-5-nitrobenzoesäure (7,5 g, 38 mmol) werden in 50 mL n-butanol at 40 °C gelöst. Ani lin (7,7 mL, 83 mmol, 2,2 eq.) und DIEA (82,5 mmol, 14,4 mL, 2,2 eq.) werden hinzugefügt. Die Mischung wird unter Rückfluss (l20°C) für 3 Tage gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtem peratur werden die leicht flüchtigen Bestandteile im Vakuum abgedampft. Es wird ein braunes Öl erhalten. Der Rückstand wird in eine stark gerührte Mischung aus zerstoßenem Eis und Salzsäure (1 M, 100 mL) überführt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Wasser ge waschen und an der Luft getrocknet. Das Rohprodukt wird in Essigsäure rekristallisiert (180 mL), abfiltriert und mit Diethylether gewaschen. Nach Trocknen im Vakuum erhält man die Verbindung (4) (6,37 g, 24,7 mmol, 66 %) als gelben Rückstand.

MS (ESI):

m/z (positive mode) = 259,1 [M+H] ⁺ , 281,1 [M+Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): C13H10N2O4: Calc. [M+H] ⁺ 259,0713, gefunden 259,0714, [M+Na] ⁺ : Calc. 281,0533, gefunden: 281,0535.

1H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 14,42 (s, 1H, COOH), 10,53 (s, 1H, NH), 8,87 (d, J = 2,8 Hz, 1H, 6-H), 8,25 (dd, J = 9,4, 2,8 Hz, 1H, 4-H), 7,56 - 7,49 (m, 2H, 3’-H), 7,47 - 7,42 (m, 2H, 2’-H), 7,32 (m,lH, 4’-H), 7,26 (d, J = 9,4 Hz, 1H, 3-H), ¹³ C-NMR (101 MHz, DMF-A): d [ppm] = 170,2, 154,0, 139,7, 138,2, 131,0, 130,4, 129,7, 126,9, 125,2, 114,4, 112,3,

TLC: R/= 0,54 (Me0H/H ₂ 0, 80/20)

(II) 2-Nitroacridin-9(10H)-on (5)

Verbindung 4 (0,51 g, 1,96 mmol) wird in POCI3 (5 mL) gelöst und die Reaktionsmischung wird unter Rückfluss (125 °C) für 3 Stunden gerührt. Das POCI3 wird im Vakuum abgedampft und zum Rückstand wird zerstoßenes Eis (50 g) und Salzsäure (1 M, 100 mL) gegeben. Die Mischung wird für eine Stunde unter Rückfluss gekocht bis ein gelbes Produkt ausfällt. Das Präzipitat wird gefiltert, mit Wasser, kalten Methanol und Diethylether gewaschen und an- schließend an der Luft getrocknet. Man erhält ein reines 2-Nitroacndin-9( 10 7)-on (0,40 g, 1,66 mmol, 85 %) als hellgelben Leststoff.

^! H-NMR (400 MHz, DMSC )-d ₆ ): d [ppm] = 12,37 (s, 1H, NH), 8,99 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,49 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,26 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H, 8-H), 7,84 (ddd, J = 8,4, 7,0 Hz, 1H, 7-H), 7,69 (d, J= 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,61 (dd, J= 8,4, 1,5 Hz, 1H, 5-H), 7,39 (ddd, J= 8,1, 7,0 Hz, 1H, 6-H),

HPLC: tR = 9,87 min (ACN/H2O+ 0,1 % TLA; 30/70-^ 10/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)

(III) 7-Bromo-2-nitroacridin-9(10H)-on (6)

Verbindung 5 (0,4 g, 1,6 mmol) wird in Nitrobenzol (40 mL) suspendiert. Brom (140 pL, 2,5 mmol, 1,5 eq.) wird hinzugefügt und die Reaktionsmischung wird für 18 h bei 120 °C ge rührt. Nach Abkühlen auf 0 °C wird das ausgefallene Präzipitat abgefiltert und mit Diethylether gewaschen. Weiterer Diethylether (100 mL) wird zum Filtrat gegeben und die Mischung für eine Stunde auf 0 °C gekühlt. Das gebildete Präzipitat wird abgefiltert und mit Diethylether gewaschen. Die vereinigten Feststoffe werden im Vakuum getrocknet und man erhält die Ver bindung 6 (442 mg, 1,38 mmol, 86 %) als gelben Feststoff.

MS (ESI): m/z (positive mode): 341,0 [M+ Na] ⁺ , 660,9 [2M+Na] ⁺ ,978,9 [3M+Na] ⁺ ,

HR-MS (ESI): C13H7N2O3: calc. [M+H] ⁺ : 318,9713, gefunden: 318,9719, [M+Na] ⁺ : calc. 340,9532, gefunden: 340,9539.

^! H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 12,66 (s, 1H, NH), 9,08 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,54 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H, 8-H ), 7,99 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1H, 6-H), 7,81 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,70 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 5-H),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMSC ö): d [ppm] = 176,8, 146,0, 142,7, 141,2, 138,2, 129,4, 128,8, 124,2, 123,7, 121,8, 120,8, 120,5, 116,3;

HPLC: tR = 12,32 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70 100/0 in 12 min; Detektion bei

254 nm)

(IV) 7-[(3-hydroxypropyl)thio]-2-nitroacridin-9(10H)-on (7)

Verbindung 6 (500 mg, 1,57 mmol) wird zu einer Suspension aus K2CO3 (433 mg, 2 eq.) in DMF (40 ml) gegeben. 3-Mercapto-l -propanol (216 mg, 2,35 mmol, 1,5 eq.) und Triethylamin (150 uL) warden hinzugegeben. Argon wird für 10 min. durch die Lösung geleitet und anschlie ßend werden Xantphos (308 mg, 530 pmol, 0,34 eq.) und Pd2(dba)3 (402 mg, 430 pmol, 0,28 eq.) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird für 23 h bei 105 °C unter Argon- Atmo sphäre bis zur vollständigen Umsetzung (HPLC) gerührt. Das Lösungsmittel wird unter redu ziertem Druck abgedampft, der Rückstand in ACN (+10% TFA) aufgelöst und auf ein Celite gegeben. Eine Flash-Chromatographie ( Reveleris (SiO ₂ ) 40 g cartridge, ACN/DCM, ACN: 8 % 66 %) liefert das reine Produkt 7 (229 mg, 0,69 mmol, 44 %).

MS (ESI): m/z (positive mode): 331,1 [M+H] ⁺ , 353,1 [M+ Na] ⁺ , 683,1 [2M+ Na] ⁺ ,l l l3,2 [3M+ Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): C ₁₆ H ₁₄ N ₂ O ₄ S: calc. [M+H] ⁺ : 331,0747, gefunden: 331,0751, [M+Na] ⁺ : calc. 353,0566, gefunden: 353,0566.

^! H-NMR (400 MHz, DMF- _< 7 ₇ ): d [ppm] = 12,40 (s, 1H, NH), 8,95 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,45 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,08 (d, J = 2,3 Hz, 1H, 8-H), 7,78 (dd, J = 8,7, 2,3 Hz, 1H, 6-H), 7,65 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,56 (d, J = 8,7 Hz, 1H, 5-H), 3,52 (t, J = 6,1 Hz, 2H, 3’- H), 3,13 - 3,01 (m, 2H, l’-H), 1,83 - 1,66 (m, 2H, 2’-H),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMSO+fc): d [ppm] = 176,2, 144,9, 141,4, 139,4, 135,6, 131,6, 127,4, 125,4, 123,3, 121,8, 119,9, 119,4, 109,9, 60,0, 32,5, 30,3,

HPLC: t _R = 9,67 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70 100/0 in 12 min; Detektion bei

254 nm)

(V) 7-[(3-Hydroxypropyl)sulfonyl]-2-nitroacridin-9(10H)-on (8)

Verbindung 7 (255 mg, 0,77 mmol) wird in eine Mischung aus Essigsäure (10 mF) und Wasser (2,4 mF) suspendiert. Na ₂ W0 ₄ · 2H ₂ 0 (63 mg, 0,19 mmol, 0,25 eq) wird hinzugegeben und die Suspension auf 0 °C heruntergekühlt. Danach wird Wasserstoffperoxid (10 mF, 50 % (v/v)) über 10 Minuten zugetropft. Die Suspension wird auf Raumtemperatur erwärmt und unter Auf lösung des Feststoffs für weitere 5 h gerührt. Nach vollständiger Umsetzung des Eduktes (HPLC) wird die Reaktionsmischung über Nacht gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wird in DMF (0,5 mL) aufgelöst und über eine Biotage SNAP Ultra 25 g cartridge gereinigt. Flash chromatography (ACN/DCM, ACN 10% 100%) resultiert in 8 (179 mg, 0,49 mmol, 64 %) als orangener Feststoff.

MS (ESI): m/z (positive mode): 363,1 [M+H] ⁺ , 385,1 [M+ Na] ⁺ , 747,1 [2M+ Na] ⁺ , 1109,2 [3M+ Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): C _IÖ H _R N _I O _Ö S: calc. [M+H] ⁺ : 363.0645, gefunden: 363,0650, [M+Na] ⁺ : calc. 385,0465, gefunden: 385,0465.

^! H-NMR (400 MHz, DMF- _< 7 ₇ ): d [ppm] = 12,86 (s, 1H, NH), 9,06 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,79 (d, J = 2,1 Hz, 1H, 8-H), 8,58 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,26 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 6- H), 7,89 (d, J = 8,7 Hz, 1H, 5-H), 7,84 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 4,74 (bs, 1H, OH), 3,60 (t, J = 6,2 Hz, 2H, l’-H), 3,56 - 3,41 (m, 2H, 3’-H), 1,93 - 1,81 (m, 2H, 2’-H),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMF -di) d [ppm] = 177,5, 146,1, 145,15, 143,2, 134,5, 133,6, 129,2, 128,7, 124,0, 121,6, 121,5, 120,8, 120,8, 60,4, 53,9, 27,6,

HPLC: ίk = 7,68 min (ACN/H ₂ 0+ 0,1 % TFA; 30/70-^ 100/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)

(VI) 7-[(3-hydroxypropyl)sulfonyl]-2-aminoacridin-9(10H)-on (2)

Pd/C (10%, in oxidierter Form, 8 mg) wird in einer Argon-Atmosphäre in 2-Propanol (5 mL) suspendiert. Verbindung 8 (20 mg, 55 m mol) wird hinzugefügt und eine Wasserstoffatmosphäre eingestellt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur über Nacht unter teilweisem Auflösen des Feststoffes gerührt. Die gelb fluoreszierende Lösung wird zum Entfernen des Pd/C über Celite gefiltert und der Feststoff mit 2-Propanol gewaschen. Anschließend wird das Lösemittel unter reduziertem Druck entfernt. Man erhält die reine Verbindung 2 (HPLC, 12 mg, 37 m mol, 68 %). MS (ESI): m/z (positive mode): 333,1 [M+H] ⁺ , 355,1 [M+ Na] ⁺ , 665,2 [2M+ H] ⁺ ,687,2 [2M+ Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): CieHi _ö NiCFS: calc. [M+H] ⁺ : 333,0904, gefunden: 333,0911, [M+Na] ⁺ : calc. 355,0723, gefunden: 355,0730

^! H-NMR (400 MHz, DMSO -de): d [ppm] = 12,03 (s, 1H, NH), 8,62 (d, J = 2,2 Hz, 1H, l-H), 7,98 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 3-H), 7,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 4-H), 7,46 - 7,37 (m, 2H, 6-H, 8- H), 7,19 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1H, 5-H), 5,39 (s, 2H, NH ₂ ), 4,61 (t, J = 5,3 Hz, 1H, OH), 3,40 (q, J = 5,9 Hz, 2H, 3’-H), 3,35 - 3,27 (m, 1H, l’-H), 1,78 - 1,60 (m, 2H, 2’-H),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMSO -de): d [ppm] = 175,8, 144,6, 142,5, 132,4, 129,9, 129,4, 127,9, 123,8, 122,5, 118,7, 118,6, 117,9, 105,9, 58,7, 52,5, 26,2,

HPLC: t _R = 4,2 min (ACN/H ₂ 0 + 0,05 M TEAB pH ~ 8; 90/10-^50/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)

(VII) 7-[[3-(O,O-di-tert-butylphosphate)propyl]sulfonyl]-2-nitroac ridin-9(10H)-on (9)

Verbindung 8 (58 mg, 162 m mol) wird unter Argonatmosphäre in einem trockenen Kolben in DMF (1 mL) aufgelöst. 1 7-Tetrazol (39 mg, 0,561 mmol, 4 eq.) wird in DMF (1 mF) gelöst und zusammen mit di-/e/7-butyl /V,/V-Diisopropylphosphoramidit (203 pF, d = 0,88 g/mF, 179 mg, 0,646 mmol, 4 eq.) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 40 °C für 1.5 h gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mCPBA (139 mg, 0,805 mmol, 5 eq.) in DCM (1 mF) gelöst hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird für 1 h gerührt und eine HPFC zeigt die vollständige Umsetzung des Startmaterials an. Die Fösemittel werden unter reduzier tem Druck entfernt. Der Rückstand wird in DMF (300 pF) gelöst und in eine präparative HPFC (ACN/H20 + 0.1 70/30, in 20 min) gegeben. Man erhält die reine Verbindung

9 (59 mg, 106 pmol, 65 %). MS (ESI): m/z (positive mode): 577,1 [M+Na] ⁺ , 1131,3 [2M+ Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): C ₂₄ H ₃₁ N ₂ O ₉ S: calc. [M+H] ⁺ : 555,1561, gefunden: 555,1565, [M+Na] ⁺ : calc. 577,1380, gefunden: 577,1380

³ H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 12,95 (s, 1H, NH), 9,05 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,79 (d, J = 2,2 Hz, 1H, 8-H), 8,57 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,27 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 6-H), 7,90 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 5-H), 7,85 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 4,06 (m, 2H, 3’-H), 3,60 - 3,41 (m, 2H, l’-H), 2,12 - 2,00 (m, 2H, 2’-H), 1,41 (s, 18H, ^£ Bu),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMF-J7): d [ppm] = 177,2, 145,9, 145,0, 143,0, 133,8, 133,3, 129,0,

128,6, 123,7, 121,4, 121,3, 120,7, 120,5, 82,5, 82,5, 65,4, 53,1, 30,0, 30,0, 25,1,

³¹ P-NMR (162 MHz, DMF- _< 7 ₇ ) d [ppm] = -9,78,

HPLC: tR = 11,62 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70^ 100/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)

(IIX) 7-[(3-phosphopropyl)sulfonyl]-2-aminoacridm-9(10H)-on (1)

Pd/C (10%, in oxidierter Form, 11 mg) wird in einer Argon- Atmosphäre in 2-Propanol (3 mL) suspendiert. Verbindung 9 (24 mg, 43 m mol) wird hinzugefügt und eine Wasserstoffatmosphäre eingestellt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur über 21 h unter teilweisem Auflösen des Feststoffes gerührt. Die Lösung wird zum Entfernen des Pd/C über Celite gefiltert und das Lö semittel abgedampft. Eine HPLC zeigt die vollständige Umsetzung des Eduktes an. Das Roh produkt wird in Wasser (5 ml) suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Anschließend gibt man TFA (10 mL) tropfenweise hinzu. Man erwärmt die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur und rührt für 3 h. HPLC zeigt eine vollständige Entschützung des Phosphates. Die Reaktionsmi schung wird über Nacht gefriergetrocknet und anschließend in aq. TEAB-buffer (pH 8) glöst. Das Rohprodukt wird über eine präparative HPLC (ACN/H2O (0,05% v/v TEAB Puffer pH 8, 5/95 27/73 %, in 10 min, I _R = 8,3 min) aufgereinigt. Man erhält das Triethylammoni- umsalz (1,5 eq.) der Verbindung 1 als braunen Feststoff (13 mg, 31 m mol, 86 %).

MS (ESI): m/z (positive mode): 413,1 [M+H] ⁺ , 435,0 (M+H) ⁺ , 457,0 [M+ 2Na] ⁺ ,

HR-MS (ESI): C ₁₆ H ₁₇ N ₂ O ₇ PS: calcd. [M+H] ⁺ : 413,0572, gefunden: 413,0567, [M+Na] ⁺ : calc. 435,0386, gefunden: 435,0393

³ H-NMR (400 MHz, D ₂ 0): d [ppm] = 8,37 (d, J = 2,1 Hz, 1H, l-H), 7,83 (dd, J = 8,9, 2,1 Hz, 1H, 3-H), 7,21 (d, J= 8,9 Hz, 1H, 4-H), 7,06 - 6,95 (m, 2H, 6-H, 8-H), 6,91 (d, J= 8,7 Hz, 1H,

5-H), 3,82 (q, J= 5,9 Hz, 2H, l '-H), 3,65 - 3,42 (m, 2H, 3'-H), 3,15 (q, J= 7,4 Hz, 10H, NEt ₃ ) 2,08 - 1,95 (m, 2H, 2'-H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz ,15H, NEt ₃ ),

¹³ C-NMR (100 MHz, D ₂ 0): d [ppm] = 177,3, 142,2, 141,9, 133,9, 129,7, 128,7, 127,9, 126,1,

120,7, 118,9, 118,6, 117,3, 107,8, 61,9, 52,9, 46,6 (NEt ₃ ), 23,9, 8,2 (NEt ₃ ),

3 ¹ P-NMR (162 MHz, D ₂ 0): d [ppm] = 3,76.

(IX) Synthese der Glukose-Konjugate Synthese der Verbindung 1-GLU

Verbindung 17 (3 mg, 7 m mol) wird in einer Malonsäurelösung (0,36 mL, 1 M in DMSO) ge löst. Wässrige Glucoselösung (72 mE, 0,1 M, 1,1 eq.) und pic-BH ₃ (87 pL, 1 M, 12 eq., in DMSO) werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 35 °C für 18 h auf einem Shaker inkubiert. Nach Hinzufügen von H ₂ 0/ACN (3: 1) wird die Reaktionsmischung gefriergetrock net. Das Rohprodukt wird über präparative HPLC (ACN/H20 + 0,1 30/70, in

10 min) aufgereinigt. Man erhält reines 1-Glu als orangefarbenen Feststoff (2,1 mg, 3 m mol, 33 %).

MS (ESI): m/z (negative mode) = 575,1 [M]

Verbindung 2 (3,35 mg, 10 mihoΐ) wird in einer Malonsäurelösung (0,4 mL, 1 M in DMSO) ge löst. Wässrige Glukoselösung (90 pL, 0,1 M, 1,1 eq.) and pic-BH ₃ (108 pL, 1 M, 12 eq., in DMSO) werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 35 °C für 18 h auf einem Shaker inkubiert. Nach Hinzufügen von H ₂ 0/ACN (3: 1) wird die Reaktionsmischung gefriergetrock net. Das Rohprodukt wird über präparative HPLC (ACN/H20 + 0,1 30/70, in

10 min) aufgereinigt. Man erhält reines 2-Glu als orangefarbenen Feststoff (2 mg, 4 m mol, 40 %).

MS (ESI): m/z (negative mode) = 495,2 [M]

HR-MS (ESI): C22H28N2O9S: calc. [M+H] ⁺ : 497,1600, gefunden: 497,1588.

Fotophysikalische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker

Die spektroskopischen Eigenschaften werden beispielhaft in den beiden folgenden Tabellen anhand der Verbindungen 1 und 2 aufgezeigt.

Für die Verbindung 1 ergeben sich als Funktion des Lösungsmittels die folgenden Eigenschaf ten:

Tabelle 1

Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten auch in unterschiedlichen Lösungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellen längen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es können somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen.

Die Verbindung 1 lässt sich zudem über die folgenden Parameter charakterisieren:

MS(ESI): m/z (positive mode): 413,1 [M+H] ⁺ , 435,0 (M+H) ⁺ , 457,0 [M+ 2Na] ⁺

HR-MS (ESI): C16H17N207PS: calc. [M+H] ⁺ : 413,0572, gefunden: 413,0567,

[M+Na] ⁺ : calc. 435,0386, gefunden: 435,0393

^! H-NMR (400 MHz, D ₂ 0): 5[ppm] = 8.37 (d, J = 2,1 Hz, 1H l-H), 7,83 (dd, J = 8,9, 2,1 Hz, 1H 3-H), 7,21 (d, J = 8,9 Hz, 1H 4-H), 7,06 - 6,95 (m, 2H, 6-H, 8-H), 6,91 (d, J = 8.7 Hz, 1H 5-H), 3.82 (q, J = 5,9 Hz, 2H, l'-H), 3,65 - 3,42 (m, 2H, 3'-H), 3,15 (q, J = 7,4 Hz, 10H, NEt ₃ ) 2,08 - 1,95 (m, 2H, 2'-H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz ,15H, NEt ₃ ). ¹³ C-NMR (100 MHz, D ₂ 0): 5[ppm] = 177,3, 142,2, 141,9, 133,9, 129,7, 128,7, 127,9, 126,1, 120,7, 118,9, 118,6, 117,3, 107,8, 61,9, 52,9, 46,6 (NEt ₃ ), 23,9, 8,2 (NEt ₃ ).

³¹ P-NMR (162 MHz, D ₂ 0): 5[ppm] = 3,76. Für die Verbindung 2 ergeben sich als Funktion des Lösungsmittels die folgenden Eigenschaf ten:

Tabelle 2

Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö- sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen.

Die Verbindung 2 lässt sich zudem über die folgenden Parameter charakterisieren: MS (ESI): m/z (positive mode): 333,1 [M+H] ⁺ , 355,1 [M+Na] ⁺ , 665,2 [2M+H] ⁺ , 687,2 [2M+Na] ⁺ .

HR-MS (ESI): C16H16N204S: calc. [M+H] ⁺ : 333,0904, gefunden: 333,0911, [M+Na] ⁺ : calc. 355,0723, gefunden: 355,0730

^! H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 5[ppm] = 12,03 (s, 1H, NH), 8,62 (d, J = 2,2 Hz, 1H, l-H), 7,98 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 3-H), 7,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 4-H), 7,46 - 7,37 (m, 2H, 6-H, 8- H), 7,19 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1H, 5-H), 5,39 (s, 2H, NH 2 ), 4,61 (t, J = 5,3 Hz, 1H, OH), 3,40 (q, J = 5,9 Hz, 2H, 3’-H), 3,35 - 3,27 (m, 1H, l’-H), 1,78 - 1,60 (m, 2H, 2’-H),

¹³ C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): 5[ppm] = 175,8, 144,6, 142,5, 132,4, 129,9, 129,4, 127,9, 123,8, 122,5, 118,7, 118,6, 117,9, 105,9, 58,7, 52,5, 26,2.

HPLC: tr = 4,2 min (ACN/H ₂ 0 + 0,05 M TEAB pH- 8; 90/10 -> 50/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)

Fotophysikalische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker-Konjugate

Die spektroskopischen Eigenschaften der Fluoreszenzmarker-Konjugate mit einem Glucose- Molekül werden beispielhaft in den beiden folgenden Tabellen aufgezeigt.

Für das Konjugat der Verbindung 1 ergeben sich die folgenden Eigenschaften:

Tabelle 3 Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Fluoreszenzmarkers aufgrund der Konjugat bildung nur unwesentlich ändern. Dies ist ein Indiz für ein stabiles spektroskopisches System. Für das Konjugat der Verbindung 2 ergeben sich die folgenden Eigenschaften:

Tabelle 4 Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Fluoreszenzmarkers aufgrund der Konjugat bildung nur unwesentlich ändern. Dies ist ein Indiz für ein stabiles spektroskopisches System.