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Title:
NOVEL FORMULATIONS HAVING INOCULATING AND BIOFUNGICIDAL ACTIVITY BASED ON THE STRAIN STREPTOMYCES JOFER
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/055939
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to formulations used in the agro-industrial sector, said formulations containing ferments and spores of Streptomyces and having fungicidal and inoculating activity. These formulations contain various plant extracts that ensure a greater fungicidal effectiveness because they act as adjuvants of the microorganisms of the formulation. Said formulations also have inoculating effects since they contain micro-elements and adjuvants, which promote plant growth and development, increasing the production of the fruit and products of interest. This formulation is water-based and is environmentally friendly because it does not contain chemical compounds that affect the environment and humans. Finally, the use of this formulation achieves improved results in comparison with conventional agro-chemical treatments.

Inventors:
MERCADO MARTÍNEZ, Diego (San Agustín 292, Fracc. Hacienda San Agustín .Tlajomulco de Zúñig, Jalisco. 5645, 5645, MX)
HERNÁNDEZ RIVERA, Juan Simón (Diamante No. 124, Colonia Bonanza ResidencialTlajomulco de Zúñig, Jalisco. ., 45645, MX)
ESPARZA CERÓN, Miguel Angel (Rubí No. 51-C, Colonia Valle EscondidoTlalpa, Ciudad de México ., 14600, MX)
Application Number:
IB2016/053453
Publication Date:
April 06, 2017
Filing Date:
June 10, 2016
Export Citation:
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Assignee:
ALTUS BIOPHARM S.A. DE C.V. (Paseo del Valle No. 5065 Fracc. Guadalajara Technology Park, Zapopan Jalisco, 45010, MX)
International Classes:
C12N1/20; A01P3/00; C12R1/465
Foreign References:
ES2140339A12000-02-16
US5527526A1996-06-18
Other References:
KRUGEL H ET AL.: "Sequence and transcriptional analysis of the nourseothricin acetyltransferase-encoding gene nat 1 from Streptomyces noursei.", GENE, vol. 127, no. 1, 15 May 1993 (1993-05-15), AMSTERDAM, NL, pages 127 - 131, XP055371419, ISSN: 0378-1119
STUART D C JR: "Fine structure of the nucleoid and internal membrane systems of Streptomyces", JOURNAL OF BACTERIOLOGY NOT, vol. 78, August 1959 (1959-08-01), pages 272 - 281, XP055371422, ISSN: 0021-9193
FRANCO-CORREA M ET AL.: "Evaluation of actinomycete strains for key traits related with plant growth promotion and mycorrhiza helping activities.", APPLIED SOIL ECOLOGY, vol. 45, no. 3, 1 July 2010 (2010-07-01), AMSTERDAM, NL, pages 209 - 217, XP027111788, ISSN: 0929-1393
Attorney, Agent or Firm:
MIER Y CONCHA SEGURA, Jorge (Insurgentes Sur 1605, Piso 20 Col. San José Insurgente, Ciudad de México ., 03900, MX)
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Claims:
REIVINDICACIONES

Una cepa de Streptomyces sp. aislada, seleccionada de una cepa de Streptomyces sp. y que ha sido depositada en el CM-CNRG con el número de depósito CM- CNRG0002 llamada Streptomyces jofer, caracterizada porque produce esporas y secreta metabolitos secundarios y compuestos antifúngicos.

La cepa de Streptomyces jofer de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque los compuestos antifúngicos son streptotricinas y nourseotricinas.

El fermento y esporas obtenidas del cultivo de Streptomyces jofer, caracterizado porque contiene metabolitos secundarios antifúngicos y esporas.

Un medio de cultivo semilla para el crecimiento de S. jofer caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

a) Extracto de malta en proporciones de 0.1 al 1 %

b) Triptona en proporciones de 0.1 al 1 %

c) Harina de soya en proporciones de 0.1 al 1 %

d) Glucosa en proporciones de 0.1 al 1 %

e) Extracto de levadura en proporciones de 0.1 al 1 %

f) Carbonato de calcio en proporciones de 0.1 al 1 %

g) Agua

h) pH de 6.5 a 8.0

Un método de obtención de un cultivo semilla de Streptomyces jofer caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) Preparar 5 L de cultivo semilla reclamado en la reivindicación 4 y agregarlo a un matraz. b) Inocular el matraz del inciso b) con esporas provenientes de un vial (Banco de trabajo) en una cantidad de aproximadamente 1 x 107 esporas por mililitro. c) Mantener el matraz a una temperatura aproximada de entre 25 a 31 °C durante 48 horas con una agitación de 220 rpm.

Un medio de cultivo para obtención fermento y esporas de Streptomyces jofer caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

a) Almidón soluble en proporciones de 0.1 al 1 %

b) Glucosa en proporciones de 0.1 al 1 %

c) Harina de soya en proporciones de 0.1 al 1 %

d) Cloruro de calcio en proporciones de 0.1 al 1 %

e) Carbonato de calcio en proporciones de 0.1 al 1 %

f) Agua

g) pH de 6.7 a 8.0

Un método de obtención de fermento de Streptomyces jofer caracterizado porque comprende los pasos de:

a) Inocular 3 L del cultivo semilla reclamado en la reivindicación 5, en un termentador tipo tanque agitado de 1000 L que contiene el medio de cultivo de la reivindicación 6.

b) Mantener el biorreactor a 28oC durante 96 h con una agitación interna de 350 rpm.

c) Introducir de manera continua aire al cultivo

d) Al término de las 96 horas, sedimentar el medio de cultivo por 3 días a una temperatura de 4°C hasta obtener un caldo clarificado.

e) Filtrar el líquido sobrenadante utilizando un filtro de tamaño de poro de 100 mieras o 0.2 μηι para retirar las esporas del caldo.

8. El uso del fermento y esporas obtenidos de la cepa Streptomyces jofer, caracterizado porque son utilizados para tratar plantas vegetales infectadas con hongos.

9. El uso de conformidad con las reivindicación 8, caracterizado porque el fermento y las esporas son utilizados para preparar una composición antifúngica para plantas.

10. Una formulación antifúngica para plantas caracterizada porque comprende esporas y fermento de Streptomyces jofer, extractos de plantas vegetales y adyuvantes.

1 1 . La formulación de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque los extractos de plantas vegetales comprenden extractos de las especies Larrea tridentata, Agave lechuguilla y Cinnamomun zeylanicum.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque los adyuvantes comprenden, ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzoico), quitosano, propilenglicol, ácidos grasos de cocos nucífera, carboximetil celulosa, ácidos grasos omega, algas marinas, ácido húmico, ácido fúlvico, microelementos y agua.

13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque los microelementos comprenden, hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno, magnesio, azufre, calcio, boro y otros minerales los cuales son absorbidos por la planta en cantidades mínimas.

14. La formulación de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque dicha formulación no tiene efectos fitotóxicos.

15. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 14 caracterizada porque es utilizada para prevenir y combatir enfermedades vegetales ocasionadas por hongos fitopatógenos.

16. La formulación de conformidad la reivindicación 15, caracterizado porque los hongos fitopatógenos comprenden Mycosphaerella fijiensis, Fusarium sp, P. cinnamomi, Moniliophthora roreri, P. infestans, A.solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Pestalotia sp, Botrytis cinérea, Alternaría alternata, Verticillium dahliae, Curvularia sp, F. oxysporum, Colletotrichum, Aspergillus niger, Botryosphaeria, Botrytis cinérea, Phytophthora capsici, Colletotrichum sp, C. gloeosporioides, Penicillium expansum, P. palmivora entre otros.

17. La formulación de conformidad la reivindicación 16, caracterizada porque se aplica por vía foliar.

18. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque dicha formulación incrementa la cantidad de hongos y bacterias totales benéficas para la planta vegetal.

19. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 14 y 18, caracterizada porque dicha formulación incrementa el rendimiento de los productos vegetales así como algunas variables de importancia para el productor.

20. La formulación reclamada en la reivindicaciones 19 caracterizada porque se utiliza como agente inoculante de plantas vegetales.

21 . La formulación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque es utilizada como inoculante y antifúngica en diversos tipos de plantas que comprende a las familias botánicas Solanaceae, cucurbitaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Apiaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Compositaceae, Liliaceae, Umbelliferae, Rosaceae, Musaceae, Ornamentales entre otras.

22. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 14 caracterizada porque tiene los componentes de la tabla 6.

23. Un proceso de aplicación de las formulaciones reclamadas en las reivindicaciones 6 a 12, 23 a 29 y 36 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) Preparar una solución antifúngica acuosa en una concentración que va de 1 .0

L/Ha hasta 2.5 L/Ha.

b) Administrar por vía foliar dicha solución antifúngica por aire a través de un aeroplano, mecánicamente a través de un equipo automotor acoplado a un aspersor o manualmente por aspersión con bombas de aspersión.

REIVINDICACIONES MODIFICADAS

recibidas por la oficina Internacional el 17.03.2017

REIVINDICACIONES

1 . Una cepa de Streptomyces sp. aislada, seleccionada de una cepa de Streptomyces sp. y que ha sido depositada en el CM-CNRG con el número de depósito CM-CNRG0002 llamada Streptomyces jofer, caracterizada porque produce esporas y secreta metabolitos secundarios y compuestos antifúngicos.

2. La cepa de Streptomyces jofer de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque los compuestos antifúngicos son streptotricinas y nourseotricinas.

3. El fermento obtenido del cultivo de Streptomyces jofer, caracterizado porque contiene metabolitos secundarios antifúngicos.

4. Las esporas obtenidas del cultivo de Streptomyces jofer, caracterizado porque contiene únicamente esporas de Streptomyces jofer.

5. Una mezcla de fermento y esporas obtenidos del cultivo de Streptomyces jofer, caracterizado porque contiene metabolitos secundarios antifúngicos y esporas de Streptomyces jofer.

6. Un método de obtención de un cultivo semilla de Streptomyces jofer caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) Preparar 5 L de cultivo semilla reclamado en la reivindicación 4 y agregarlo a un matraz.

b) Inocular el matraz del inciso a) con esporas provenientes de un vial de Streptomyces jofer (Banco de trabajo) en una cantidad de aproximadamente 1 x 107 esporas por mililitro. c) Mantener el matraz a una temperatura aproximada de entre 25 a 31 °C durante 48 horas con una agitación de 220 rpm.

7. Un método de obtención de fermento de Streptomyces jofer caracterizado porque comprende los pasos de:

a) Inocular 3 L del cultivo semilla reclamado en la reivindicación 5, en un termentador tipo tanque agitado de 1000 L que contiene el medio de cultivo de la reivindicación 6.

b) Mantener el biorreactor a 28°C durante 96 h con una agitación interna de 350 rpm.

c) Introducir de manera continua aire al cultivo

d) Al término de las 96 horas, sedimentar el medio de cultivo por 3 días a una temperatura de 4°C hasta obtener un caldo clarificado.

e) Filtrar el líquido sobrenadante utilizando un filtro de tamaño de poro de 100 mieras o 0.2 μηι para retirar las esporas del caldo.

8. El uso de la mezcla del fermento y esporas obtenidos de la cepa Streptomyces jofer, caracterizado porque son utilizados para tratar plantas vegetales infectadas con hongos.

9. El uso de conformidad con las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el fermento y las esporas son utilizados para preparar una composición antifúngica para plantas.

10. Una formulación antifúngica sin efectos fitotoxicos para plantas que incrementa la cantidad de hongos y bacterias totales benéficas para la planta y que incrementa el rendimiento de los productos vegetales y otras variables importantes para el productor caracterizada porque la formulación comprende esporas y fermento de Streptomyces jofer, extractos de plantas vegetales y adyuvantes.

1 1 . La formulación de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque los extractos de plantas vegetales comprenden extractos de las especies Larrea tridentata, Agave lechuguilla y Cinnamomun zeylanicum.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque los adyuvantes comprenden, ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzoico), quitosano, propilenglicol, ácidos grasos de cocos nucífera, carboximetil celulosa, ácidos grasos omega, algas marinas, ácido húmico, ácido fúlvico, microelementos y agua.

13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque los microelementos comprenden, hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno, magnesio, azufre, calcio, boro y otros minerales los cuales son absorbidos por la planta en cantidades mínimas.

14. El uso de la formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 13 caracterizada porque es utilizada para prevenir y combatir enfermedades vegetales ocasionadas por hongos fitopatógenos.

15. El uso de la formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los hongos fitopatógenos comprenden Mycosphaerella fijiensis, Fusarium sp, P. cinnamomi, Moniliophthora roreri, P. infestans, A.solani, fíhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Pestalotia sp, Botrytis cinérea, Alternaría altérnala, Verticillium dahliae, Curvularia sp, F. oxysporum, Colletotríchum, Aspergillus niger, Botryosphaería, Botrytis cinérea,

Phytophthora capsici, Colletotríchum sp, C. gloeosporioides, Penicillium expansum, P. palmivora entre otros.

16. La formulación de conformidad la reivindicación 10, caracterizada porque se aplica por vía foliar.

17. El uso de la formulación reclamada en la reivindicación 10 caracterizada porque se utiliza como agente inoculante de plantas vegetales.

18. La formulación de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque es utilizada como inoculante y antifúngica en diversos tipos de plantas que comprende a las familias botánicas Solanaceae, cucurbitaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Apiaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Compositaceae, Liliaceae, Umbelliferae, Rosaceae, Musaceae, Ornamentales entre otras.

19. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 10 a 13 caracterizada porque tiene los siguientes componentes:

Componentes Fórmula B Fórmula C Fórmula D Fórmula E

Fermentos de S. 30-60% 30-60% 30-60% 30-60% jofer

Esporas de S. 30-60% 30-60% 30-60% 30-60% jofer

Acido salicílico 0.5-1 .5% 0.5-1 .5% 0.5-1 .5% 0.5-1 .5%

Quitosán 0.5-2.0% 0.5-2.0% 0.5-2.0% 0.5-2.0%

(poli-D-

Glucosamina)

Taninos 5.0-10.0% 5.0-10.0% 5.0-10.0% 5.0-10.0%

(extracto

gobernadora)

Cinnamaldehidos 5.0-10.0% 1 .0-10.0% 1 .0-10.0% 4.0-8.0% (Extracto de

canela)

Saponinas 1 .0-5.0% 1 .0-5.0% 1 .0-5.0% 4.0-8.0%

(extracto

lechuguilla) Manteca de coco 0.5-5.0% 0.5-5.0% 0.7-5.0% 4.0-5.0% fundida

(Ácidos grasos)

Carboximetil 1 .0% 0.8-1 .5% 0.8-1 .5% 0.8-1 .5% Celulosa

Propilenglicol 3.0-5.0% 3.0-5.0% 2.0-5.0% 2.0-5.0%

Acidos grasos 1 .0-2.0% 1 .0-2.0% 1 .0-2.0% 1 .0-2.0% omega 3

Extracto de algas 4.0% 5.0-7.0% 3.0-7.0% 3.0-7.0% marinas

Acido Húmico 0.2-0.5% 0.2-0.5% 0.3-0.5% 0.3-0.5%

Microelementos 5.0-15.0% 5.0-15.0% 5.0-15.0% 5.0-15.0%

Agua 25% 25% 25% 25%

20. Un proceso de aplicación de las formulaciones reclamadas en las reivindicaciones 10 a 13, 16 y 18 a 19 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) Preparar una solución antifúngica acuosa con el contenido de cualquiera de las formulaciones de la reivindicación 19 en una concentración que va de 1 .0 L/Ha hasta 2.5 L/Ha.

b) Administrar por vía foliar dicha solución antifúngica por aire a través de un aeroplano, mecánicamente a través de un equipo automotor acoplado a un aspersor o manualmente por aspersión con bombas de aspersión.

Description:
FORMULACIONES NOVEDOSAS CON ACTIVIDAD INOCULANTE Y BIOFUNGICIDA BASADA EN LA CEPA Streptomyces jofer

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN.

La presente invención se relaciona con el campo de la agroindustria, en particular con el tratamiento de enfermedades fúngicas en plantas y con formulaciones novedosas inoculantes que favorecen el crecimiento y la producción de una gran cantidad de plantas frutales, hortalizas entre otras. En la presente invención se desarrolló un producto antifúngico e inoculante con base en el microorganismo Streptomyces jofer, el cual fue aislado en suelo del estado de Jalisco. Junto con este microorganismo el producto contiene extractos de diversas plantas.

ANTECEDENTES.

Los daños producidos por enfermedades causadas por hongos y mohos en cultivos de plantas son cuantiosos en todo el mundo. Conllevan pérdidas económicas y, en el peor de los casos, escasez de alimentos para humanos y ganado. Para combatir estas infecciones, tradicionalmente se ha estado empleado fungicidas que, convencionalmente, han sido y todavía son productos químicos cuyo uso implica riesgos para la salud de humanos, animales, otras plantas y, en general, para el medioambiente.

Para evitar, o al menos minimizar esos riesgos en la medida de lo posible, se han desarrollado biofungicidas basados en materias activas en forma de microorganismos antagonistas, y/o en esporas y/o metabolitos de tales microorganismos, y/o extractos, soluciones, mezclas, compuestos, o combinaciones de lo anterior.

Los biofungicidas desarrollados en el transcurso de los últimos años pertenecen principalmente al grupo de los actinomicetos. Estos son organismos unicelulares, de distribución cosmopolita, muy abundantes en el suelo y compostas; procariontes (bacterias gram positivas), presentan aproximaciones morfológicas a hongos y bacterias. Algunas de sus especies tienen gran importancia biotecnológica por su capacidad para producir diversos tipos de metabolitos.

Otro ejemplo de la importancia de los actinomicetos en la industria, es la aplicación de estas bacterias para mejorar cultivos con el fin de establecer un nuevo tipo de agricultura sostenible.

Una de las cualidades que se observan en estas bacterias es su presencia en la rizosfera (zona del suelo afectada por el desarrollo de las raíces), razón por lo que se les denomina rizobacterias. Debido a esta particular localización, los diferentes géneros resultan muy beneficiosos para las plantas, ya que favorecen su crecimiento, controlan la aparición de hongos no deseables y ayudan a la asimilación de hierro, fósforo y nitrógeno.

Se puede hablar de simbiosis planta-bacteria o incluso, de "helper bacteria" (bacteria ayudante). La bio-fertilización, por tanto, consiste en el aumento del número de microorganismos en un suelo para acelerar los procesos microbianos y aumentar la cantidad de nutrientes asimilables por la planta. Este tipo de tratamiento de la planta con actinomicetos presenta numerosas ventajas: disminuye el uso intensivo de fertilizantes, disminuye los costes de producción de muchos alimentos, y aumenta la competitividad en el mercado. En resumen, una buena bio-fertilización reduce el uso de energía de la planta a la hora de absorber los distintos 20 nutrientes, disminuye la degradación del agro- ecosistema y reduce la pérdida de nutrientes del suelo por lixiviados, sobre todo de nitrógeno.

Esta misma aplicación se ha utilizado, donde el cultivo de la papa reporta muchos beneficios, pero la existencia de hongos que destruye gran cantidad de cultivos (de un 20 a un 50%) provoca pérdidas sustanciosas. La solución es la misma que en el caso anterior, control biológico por actinomicetos. En este sentido, se ha visto que son los actinomicetos son efectivos frente a numerosos patógenos de la planta, además son microorganismos baratos, duraderos, no contaminan y no alteran el ecosistema. Así pues, se reducen aquellos microorganismos indeseables en el suelo favoreciéndose los organismos útiles para los cultivos, con lo que la producción de la planta aumenta.

Unos microorganismos particularmente interesantes para el sector de los biofungicidas son las bacterias del género Streptomyces que producen estreptotricinas, antibióticos naturales de diversos tipos con actividades antibióticas frente a un amplio espectro de bacterias y hongos.

Streptomyces es una bacteria filamentosa gram positiva de contenido GC (=contenido de guanina y citosina) que habita principalmente en el suelo. Las bacterias del género Streptomyces constituyen el 95% de los Actinomicetales. Tienen hifas no fragmentadas, un micelio aéreo extenso, así como esporas o conidias en cadena. Precisamente, el olor característico de los suelos se debe a la producción de una serie de metabolitos de los estreptomicetos llamados geosmicinas.

El género Streptomyces está representado por un gran número de especies y variedades -actualmente se conocen alrededor de 500 especies-. Estos microorganismos producen una gran variedad de pigmentos además, estos microorganismos producen más del 80% de los antibióticos conocidos, así como otras sustancias antitumorales y antiparasitarias. La bacteria produce los antibióticos dependiendo de determinadas señales ambientales, como la cantidad de nutrientes, la temperatura o la acidez (el pH) del suelo. Streptomyces es capaz de obtener estas señales ambientales, y de regular la producción de antibióticos. Las bacterias del género Streptomyces, actúan en la descomposición de residuos animales y vegetales liberando amoníaco y ácidos orgánicos capaces de formar complejos muy importantes en edafogénesis (proceso de formación y evolución de un suelo) y en la nutrición vegetal, ya que tienen una gran movilidad y capacidad quelante para ceder a las raíces el nutriente que se requiera. Además, participan activamente en los procesos de humificación, particularmente en la formación de sustancias melánicas. Su micelio presenta una parte interesante de la materia prima para la síntesis de compuestos húmicos, además posee unas proteínas (hidrofobinas) que tienen capacidad para que el micelio resista a la falta de agua. Además, segregan sustancias antibióticas como la estreptomicina, tetraciclina, etc., con el fin de producir equilibrios genéricos o antagónicos específicos hacia los componentes de la microflora bacteriana. Incluso son capaces de producir una acción fitopatogénica ejercida por algunas especies sobre plantas de interés agrícola.

Diversos estudios han identificado unos sistemas de regulación denominados Sistemas de Dos Componentes, que están constituidos por dos proteínas, una proteína sensora que recibe una señal ambiental, y otra proteína que regula la respuesta haciendo que los genes se expresen o no. Se sabe que Streptomyces posee unos 67 sistemas de este tipo, siendo una de las bacterias con mayor número de Sistemas de Dos Componentes. Esta abundancia de Sistemas de Dos Componentes refleja una compleja red de regulación necesaria para que esta bacteria se adapte y sobreviva en condiciones tan cambiantes y adversas como puede ser el suelo. Sin embargo, la función concreta de la mayoría de estos sistemas es desconocida.

Los documentos siguientes describen efectos de algunas cepas de Streptomyces sobre el control de enfermedades en plantas.

La patente US53968503A describe el uso de cepas de Streptomyces YCED 9 en el control de patógenos de plantas susceptibles de infecciones fúngicas, particularmente en semillas y raíces de pasto. La patente US5527526A describe el uso de cepas de Streptomyces W EC 108 para la protección de plantas, tales como semillas de garbanzos, contra infecciones por fúngicas

Roberts (2000) estudió el uso de cepas de actinomicetos fungicidas. Dichas cepas fueron utilizadas para conferir protección contra patógenos en plantas.

El Certificado de Autor de Invención CU22795A1 describe el uso de estreptotricinas B y F obtenidas de cepas de Streptomyces para el control de fitopatógenos en bananos y plátanos.

La solicitud de patente CN102329756A describe el uso de cepas de Streptomyces albospinus BWL 15-4 contra la marchitez vascular en bananos causada por cepas de fusarium oxysporum f.sp cúbense.

La solicitud de patente CN102329755A describe el uso de cepas de Streptomyces ahygroscopicus BWL 58 contra la marchitez vascular en bananos causada por cepas de fusarium oxysporum f.sp cúbense. La solicitud de patente CN102206593A describe el uso de cepas de Streptomyces aureoverticillatus HN 6 contra la marchitez vascular en bananos causada por cepas de fusarium oxysporum f.sp cúbense.

De los documentos anteriores se puede ver que el uso de una variedad de cepas de Streptomyces son utilizadas como agentes antifúngicos. Adicionalmente, se ha observado que, si una planta sobrevive a un ataque inicial de patógenos ya sean virus, hongos o bacterias, la planta puede protegerse contra ataques posteriores de tales patógenos. También se puede constatar tal protección después de un ataque de artrópodos herbívoros, un daño mecánico o después del contacto con algunos químicos. Se ha observado que el primer patógeno infectante, o algún daño, "inmuniza" a la planta contra infecciones posteriores por patógenos homólogos, aun cuando la planta no lleve genes determinantes de la resistencia específica del cultivar. Obviamente, el primer patógeno infectante, o un daño, "indujo" la expresión de reacciones de resistencia contra subsecuentes infecciones de patógenos, independientemente si son virus, hongos o bacterias. Esta capacidad de las células para repeler los ataques subsecuentes, se dispersa a través de toda la planta. A esta respuesta se le llama resistencia sistémica adquirida (RSA). También se ha descubierto otra forma de resistencia inducida por rizobacterias promotoras del crecimiento de la planta (PGPR) denominada "resistencia sistémica inducida" (RSI). En muchas plantas se ha observado de manera contundente que las paredes celulares se lignifican después de la infección por hongos, bacterias, virus y nematodos. Esta lignificación de las paredes celulares es uno de los mecanismos importantes de la generación de la resistencia. La lignina se forma por polimerización y deshidrogenación de precursores producidos en la vía metabólica de fenilpropanoides. El primer paso en esta vía es la desaminación de fenilalanina a ácido cinámico catalizado por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL). PAL suministra los precursores de lignina y para varios productos secundarios derivados de fenilpropanoides involucrados en la resistencia. Son ejemplos las fitoalexinas furanocoumarina e isoflavonoides en gobernadora (Larrea tridentata) y canela (Cinnamomum zeylanicum), respectivamente, así como el ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzóico). Por otra parte, las solicitudes de patente CN102792948A, CN102792948A,

MX2010004022A, MX2010004020A, WO201 1 1 14347A2, KR201 10008362A describen composiciones fungicidas a base de canela, eventualmente combinada con clavo o jengibre y/u otros componentes, para tratar infecciones de cepas de fungus rhizoctonia solani, fusarium y verticillium, en diversas plantas de cultivo, como por ejemplo trigo, maíz, arroz, patata, caña de azúcar, pimiento, guisante, algodón, cacahuete, remolacha, col, pepino, judia, col, tomate, lenteja, cerezas, peras, manzanas, cacao, piña. También se conocen biofungicidas que comprenden mezclas de extractos de resina de gobernadora y quitosano, y eventualmente aceite esencia de agave lechugilla, con respecto al que se indica que previenen podredumbres causadas por aspergillus flavus y versicolor durante el almacenaje de frutas y hortalizas. Este biofungicida se describe en la solicitud de patente MX201 1013349A, sin embargo este biofungicida no contiene microorganismos con actividad antifúngica.

Se conocen otros biofungicidas que se componen de productos esencialmente naturales, como por ejemplo las composiciones fungicidas descritas en la solicitud de patente WO2014153042A1 , que comprenden aceite de ajo, aceite de romero, aceite de tomillo y aceite de canela, para el tratamiento de sigatoka negra causada por mycosphaerella fijensis, en musáceas.

Sin embargo, puede observarse que los productos biofungicidas del estado de la técnica no contemplan composiciones en las que coexistan componentes a base de bacterias del género Streptomyces o esporas o metabolitos, o extractos de dichas bacterias, con componentes obtenidos de plantas naturales que por sí mismo ya presentan efectos beneficiosos para plantas de cultivo seleccionados de manera que todos estos componentes permiten obtener un producto biofungicida en el que los efectos de estos componentes se complementan y además se presente un efecto sinérgico, no sólo a nivel de prevención y protección en cuanto a infecciones fúngicas de la planta, sino también a nivel de inducción de resistencia a tales infecciones en la planta, particularmente en una planta musácea como el banano y el platanero.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con los antecedentes anteriores, en la presente invención se ha utilizado una cepa de Streptomyces aislada del suelo que es nueva ya que no había sido descrita anteriormente y que de acuerdo a los datos experimentales incluidos en la presente, dicha cepa permite preparar composiciones y formulaciones que tienen actividades antifúngicas e inoculantes.

Por ello, un objetivo de la presente solicitud es el de proveer una composición con actividad antifúngica que contiene fermento y esporas de una cepa de Streptomyces con número de depósito CM-CNRG0002 a la cual se le dio el nombre de Streptomyces jofer (S. jofer), este depósito se realizó el día 24 de septiembre de 2015 ante el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CM-CNRG, INIFAP-México) el cual es Autoridad Internacional de Depósito bajo el tratado de Budapest desde agosto de 2015 el cual le asignó el número de certificado de depósito CM-CNRG0002. La dirección del CM-CNRG es Av. Biodiversidad No. 400, Mpio. Tepatitlán de Morelos Jalisco. CP. 47600.

Otro objetivo de esta invención es la de proveer una composición con actividad inoculante que contiene fermento y esporas de Streptomyces jofer.

Otro objetivo de esta invención es la obtención de formulaciones con actividad antifúngica que contiene fermentos y esporas de Streptomyces jofer en combinación con extractos de plantas tales como Larrea tridentata (gobernadora), Agave lechuguilla (lechuguilla), Cinnamomun zeylanicum (canela) y diversos adyuvantes.

Otro objetivo de esta invención es la obtención de formulaciones con actividad inoculante que contiene fermento y esporas de Streptomyces jofer en combinación con extractos de plantas tales como Larrea tridentata, Agave lechugilla y Cinnamomun zeylanicum y adyuvantes necesarios.

Otro objetivo de la invención es demostrar que las formulaciones que contiene fermento y esporas de S. jofer en combinación con extractos Larrea tridentata, Agave lechugilla y Cinnamomun zeylanicum tiene actividad antifúngica e inoculante in vitro e in vivo. Asimismo, otro objetivo de la invención es la de proveer el método de aislamiento, identificación y crecimiento de los Streptomyces jofer.

Otro de los objetivos de la presente invención es la de identificar la cepa S. jofer a través de métodos de ingeniería genética para evaluar si esta cepa corresponde con alguna otra que haya sido publicada.

Otro objetivo es el de proveer un medio de cultivo líquido ideal para el crecimiento de Streptomyces jofer y generación de esporas y proveer las condiciones óptimas para su crecimiento en dicho medio de cultivo líquido para la obtención de un fermento rico en metabolitos secundarios (compuestos antifúngicos y péptidos) con actividad inoculante y antifúngica.

Otro objetivo de la presente invención es el método de elaboración de la formulación con actividad antifúngica e inoculante que contiene fermentos y esporas de Streptomyces jofer en combinación con extractos Larrea tridentata, Agave lechuguilla y Cinnamomun zeylanicum y diversos adyuvantes. Otro objetivo de la presente invención es el de proveer un método de aplicación y dosis adecuadas de las formulaciones descritas anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Con el fin de alcanzar los objetivos de la presente invención, se aislaron los actinomicetos Streptomyces jofer del suelo Jalisco, de manera particular de la zona de Zapopan. Posteriormente, los microorganismos se cultivaron en un medio de cultivo líquido apropiado dentro de un biorreactor para obtener un fermento líquido de composición rica en metabolitos (compuestos antifúngicos y péptidos). Asimismo, estos mismos microorganismos se cultivaron en un medio de cultivo óptimo para obtener un componente rico en esporas. Estos fermentos y esporas son efectivos en el control de microorganismos patógenos que además poseen un efecto inoculante (concentrado de bacterias para mejorar el desarrollo de un cultivo) en una gran variedad de plantas.

Estos dos tipos de productos de la fermentación de los microorganismos (fermento y esporas) son efectivos en el control de microorganismos patógenos que afectan a plantas, esto se demostrará más adelante en pruebas in vitro e in vivo. Asimismo, se demostrará que dichos fermentos son efectivos como inoculantes en plantas frutales y hortalizas, principalmente.

Más aún, a partir del fermento y esporas obtenidos de esta cepa, se desarrollaron formulaciones que contienen, además, extractos naturales a base de plantas, que contienen también, diversos adyuvantes con propiedades antifúngicas e inoculantes probadas experimentalmente en una gran variedad de plantas.

Las formulaciones divulgadas en la presente solicitud tienen varias ventajas técnicas, prácticas y funcionales ya que son de origen 100% biológico, sus componentes sustituyen a químicos de alto riesgo para la salud animal y humana, son fáciles de aplicar, tienen como base al agua, son amigables con el medio ambiente, tienen componentes nutricionales que actúan en el metabolismo y fortalecimiento de los cultivos y se pueden aplicar todo el año ya que no generan resistencia.

El principal componente de las formulaciones de la presente invención son las esporas y los metabolitos secundarios (fermento) que se obtienen de la bacteria Streptomyces jofer, dichos fermentos y esporas con inocuos para las plantas pero tiene la capacidad de generar compuestos con actividad antifúngica, asimismo se incorporan diversos extractos vegetales naturales que permiten una optimización mejor de la acción de las esporas y el fermento de Streptomyces. Adicionalmente, los extractos de plantas y adyuvantes contienen diversos elementos y compuestos con actividad antimicrobiana lo que favorece al control e incluso la eliminación de microorganismos indeseables y patógenos de una gran variedad de cultivos.

Más aún, las formulaciones, a través de los diversos componentes, favorecen la resistencia sistémica adquirida (RSA) como a la resistencia sistémica inducida (RSI) de las plantas. Por otra parte, los inventores demuestran que las formulaciones que contiene esporas y el fermento de Streptomyces, extractos vegetales y diversos adyuvantes tienen la capacidad de incrementar los rendimientos de diversos productos agrícolas, además de incrementar la cantidad de hongos y bacterias benéficas en el suelo de los cultivos. Finalmente, los inventores demuestran que ninguna de las formulaciones descritas en la presente invención provoca efectos citotóxicos en todos los cultivos probados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Cinética de crecimiento de Streptomyces jofer en medio semilla.

Figura 2. Cinética de crecimiento de Streptomyces jofer en medio de cultivo de producción.

Figura 3. Fotografías de placas en agar donde se presentan resultados representativos de pruebas de inhibición en disco de fermentos de Streptomyces jofer (12, 24, 36, 48, 60, 72, y 84 horas) cuando se ponen a prueba contra un hongo patógeno como la Mycosphaerella fijensis.

Figura 4. Gráfica de las pruebas de inhibición en disco de fermentos de Streptomyces (12, 24, 36, 48, 60, 72, y 84 horas) vs Mycosphaerella fijensis. Figuras 5a-5d. Fotografías que muestran la capacidad antagónica in vitro de S. jofer para inhibir el crecimiento del micelio de cuatro diferentes hongos fitopatógenos, durante 5 a 8 días.

Figura 5a. (1 ) Efecto del fermento filtrado (metabolitos secundarios) en el crecimiento de Alternaría altemata. (2) Efecto del fermento sin filtrar (metabolitos secundarios y esporas); (3) Efecto de las esporas y (4) Testigo.

Figura 5b. (1) Efecto del fermento filtrado (metabolitos secundarios) en el crecimiento de Botryosphaeria. (2) Efecto del fermento sin filtrar (metabolitos secundarios y esporas); (3) Efecto de las esporas y (4) Testigo.

Figura 5c. (1) Efecto del fermento filtrado (metabolitos secundarios) en el crecimiento de Curvularia. (2) Efecto del fermento sin filtrar (metabolitos secundarios y esporas); (3) Efecto de las esporas y (4) Testigo.

Figura 5d. (1) Efecto del fermento filtrado (metabolitos secundarios) en el crecimiento de Fusairum. (2) Efecto del fermento sin filtrar (metabolitos secundarios y esporas); (3) Efecto de las esporas y (4) Testigo.

Figura 6. Evaluación in vitro de la efectividad biológica de las diferentes formulaciones sobre el crecimiento de M. fijiensis.

Figura 7. Inhibición del crecimiento radial de las formulaciones 2, 3 y 4. Figura 8. Método de Stover modificado para la evaluación visual del área total cubierta por todos los síntomas de la enfermedad en cada hoja de plantas próximas a la floración.

Figura 9. Cálculo del número de hojas por planta (H/P), hoja más joven enferma (HMJE) y promedio ponderado de la infección.

Figura 10. Resultados del primer monitoreo utilizando el método de Stover. Figura 1 1 . Resultados del segundo monitoreo utilizando el método de Stover. Figura 12. Resultados del tercer monitoreo utilizando el método de Stover. Figura 13. Resultados del cuarto monitoreo utilizando el método de Stover. Figura 14. Diagramas que muestran la localización de pizca en hoja del banano.

Figura 15. Diagramas que muestran la localización de estría en hoja de banano.

Figura 16. Grados de quema en hojas (amarillo) y hoja más joven enferma (línea verde) en relación con el porcentaje de grado de quema y la posición de la hoja. Figura 17. Promedio ponderado de infección (PPI) (línea azul) y porcentaje de disminución de Sigatoka negra (línea roja) en predio experimental.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.

Definiciones

Streptomyces. Actinobacterias o actinomicetos que pertenecen al grupo de bacterias gram positivas que se encuentran principalmente en suelos y en la vegetación descompuesta, que producen antibióticos.

Inoculante. Composiciones que contienen microorganismos que promueven el crecimiento vegetal al asociarse exitosamente con la planta; así, hay una serie de eventos que deben suceder después de la inoculación. En particular, después que los microorganismos son aplicados exogenamente y en contacto con la raíz, deben colonizar y adherirse al tejido radicular para ejercer su acción.

La colonización requiere tiempo y sucede sólo cuando hay compatibilidad entre los microorganismos y factores intrínsecos de la planta, como los exudados de raíz (Trivedi et al., 2012)

Fermento de Streptomyces jofer. Extracto líquido de composición rico en metabolitos secundarios (péptidos, antibióticos antifúngicos, antibióticos antibacterianos, inmunosupresores etc.) generados por los Streptomyces cultivados bajo condiciones óptimas.

Esporas de Streptomyces jofer. Esporas obtenidas a partir del cultivo de Streptomyces bajo condiciones óptimas y adecuadas para la generación de esporas.

Metabolitos primarios. Productos que se forman durante la fase primaria de desarrollo del microorganismo, tales como etanol (Microbiología, Thomas D. Brock y Michael T. Madigan).

Metabolitos secundarios. Productos producidos durante la fase estacionaria del crecimiento de los microorganismos. Dichos productos son generalmente complejos y permiten diferenciar diferentes tipos de microorganismos. Un ejemplo de metabolito secundario es un antibiótico.

Formulaciones antifúngicas. Formulaciones que inhiben el crecimiento de hongos patógenos en plantas.

Formulaciones inoculantes. Formulaciones que contienen microorganismos y adyuvantes promueven el crecimiento vegetal al asociarse exitosamente con la planta.

Estreptotricinas. Antibióticos naturales que son producidos por bacterias del género Streptomyces con un amplio espectro de actividad antibiótica. En la presente solicitud se demuestra la actividad antifúngica de Streptomyces. Estos antibióticos son parte del metabolismo secundario de las bacterias. Nourseotricinas. Antibióticos de la clase de las estreptotricinas que tienen un amplio espectro de acción para bacterias, células unicelulares eucarióticas u organismos complejos tales como plantas. En la presente solicitud tienen un efecto antifúngico. Fitopatógeno. Microorganismo que provoca enfermedades en plantas.

Explante. Cualquier parte vegetal que ha sido separada e la planta, que puede ser un tejido (fragmento de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.) un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.

Biofungicida. Fungicida biológico que se obtiene de microorganismos o plantas que no es tóxico para el hombre o animales y que no afecta ciertos insectos.

Descripción detallada

La presente invención provee formulaciones antifúngicas o biofungicidas e inoculantes que contienen fermentos (metabolitos secundarios producto del cultivo de microorganismos) y esporas de Streptomyces jofer junto con diversos extractos de plantas y adyuvantes.

Los metabolitos secundarios generados por los Streptomyces de la presente invención así como sus esporas, se caracterizan por su actividad contra microorganismos patógenos, especialmente tienen actividad antifúngica ya que este género contiene y produce streptotricinas y nourseotricinas (Vallin et al. 1997 y 1998).

Por otra parte también se demuestra que dichos productos de Streptomyces también poseen una función inoculante dado que mejoran la salud, crecimiento y desarrollo de una gran variedad de plantas así como el rendimiento y producción de diversos productos agrícolas. Las formulaciones antifúngicas e inoculantes reveladas en la presente invención contienen como principios activos diversos compuestos del tipo metabolitos secundarios, resultado del cultivo de Streptomyces en la fase estacionaria. Dichos metabolitos, streptotricinas y nourseotricinas, son antibióticos de baja toxicidad para seres humanos y animales obtenidos mediante procesos biotecnológicos, pero altamente tóxicos para hongos fitopatógenos (Vallin y cois. 1997 y 1998). Una de las ventajas de estas formulaciones es la de reducir en gran cantidad la carga química de los tratamientos convencionales a base de fungicidas químicos. Estas formulaciones contienen también, un complejo compensador fisiológico a base de microelementos, los cuales son parte importante de los requerimientos nutricionales del cultivo. La incorporación de estos microelementos tiene por finalidad disminuir el estrés causado por la enfermedad en sus diferentes estadios infecciosos. Algunos componentes de los microelementos son considerados inductores de resistencia que participan de manera esencial en la inducción de resistencia cuando los cultivos son infectados con microorganismos fitopatógenos.

La incorporación de macronutrientes a las formulaciones permite que éstas actúen en el metabolismo y desarrollo de las plantas, así como en el fortalecimiento de la pared celular de las hojas, dificultando la penetración de patógenos a la planta misma.

Estas formulaciones también contienen ácidos grasos, los cuales se pueden obtener de varios tipos de aceites, en la presente solicitud se utilizaron los aceites de coco para inducir la resistencia sistémica y formar una película de protección en la superficie de la parte aérea de las plantas protegiéndolas de una amplia gama de enfermedades. Las formulaciones de la presente solicitud no generan residualidad, además de ser inocuas para insectos benéficos. Esto último garantiza la seguridad para el hombre y su entorno. Tampoco inducen la resistencia sistémica adquirida en las plantas cuando existe una infección por fitopatógenos.

Los extractos vegetales presentes en la formulaciones incluyen extractos de Cinnamomun zeylanicum, Larrea tridentata y de Agave lechuguilla. Los extractos de estas plantas ofrecen múltiples mecanismos de acción sobre hongos patógenos entre los que se encuentran, la alteración de la pared celular de microorganismos, modificación en el transporte celular a través de la membrana plasmática y afectaciones en la respiración.

En los siguientes ejemplos quedarán demostradas las ventajas y aplicaciones de los metabolitos secundarios (fermento) y esporas obtenidos por la fermentación del cultivo de Streptomyces jofer, en relación con actividad antifúngica de plantas.

Por otra parte se demostrarán las ventajas y aplicaciones de formulaciones antifúngicas e inoculantes que contienen el fermento y esporas de Streptomyces ricos en metabolitos antifúngicos, extractos de plantas y diversos adyuvantes para el control de enfermedades causadas por hongos.

Finalmente, se realizará un análisis e identificación molecular del microorganismo para saber si pertenece a alguna otra cepa de Streptomyces conocida.

EJEMPLO 1. Obtención de los Actinomicetos Streptomyces jofer (Número de depósito provisional CM-CNRG YYY).

La cepa Streptomyces jofer fue aislada del suelo y caracterizados posteriormente mediante métodos bioquímicos y genéticos con los cuales se llegó a la conclusión de que son microorganismos no reportados anteriormente. A estos microorganismos se les denominó Streptomyces jofer como una nueva variedad ya que a partir del análisis de 16S y región rpo se encontró que son una nueva cepa de Streptomyces pero no corresponde con alguna especie reportada anteriormente.

En este sentido, los resultados derivados de la identificación de la región 16S indican que esta cepa posee un 95% de identidad en relación con otras especies de Streptomyces, mediante la técnica de 16Sf tales como Streptomyces FXJ8.1 17, T1 S6, tricolor cepa vh85, labedae cepa ECR77 y virginae parcial. Mientras que mediante la técnica de identificación de rpo (ARN polimerasa), la S. jofer tiene un 82% de identidad con la S. albulus ZPM y S. albulus cepa NK660 como se puede observar en la tabla 1 .

Tabla 1 . Estudio Filogenético de la región 16S de una cepa bacteriana utilizando dos diferentes métodos de agrupamiento en cada caso y porcentaje de similitud con las secuencias de los organismos más emparentados.

Una vez identificada y purificada la cepa de Streptomyces, un vial con el cultivo madre, se inoculó con 50 μΙ_ de la cepa obtenida de un vial de crio-conservación en cajas Petri con Agar SYM (nombre y tipo es este agar) y se incubaron a 30° C durante 48 horas. Una vez observado el crecimiento, se remueven las esporas con 5 ml_ de glicerol al 40 % y se origina un banco maestro tomando alícuotas de 500 μΙ_ las cuales se crio-conservan a -80° C. EJEMPLO 2. Generación de un cultivo semilla a partir de Streptomyces jofer. Método y condiciones de cultivo.

Un banco maestro se generó a partir de una cepa de Streptomyces obtenida del suelo en una solución de agar PDA comercial (BIOXON®), hasta generar el crecimiento del microorganismo. Enseguida se remueven las esporas con 5 mL de solución crioprotectora de leche descremada glicerol (10% de leche descremada, 1 % de glucosa, 0.5% de extracto de levadura y 15% de glicerol). Se toman alícuotas de 500 μί en viales, los cuales se conservan a -80°C. Posteriormente se toma un vial del paso anterior para generar un banco de trabajo en el que se inoculan 50 μί de la cepa obtenida de un vial en crio-conservación del respectivo banco maestro en cajas Petri con Agar SYM y se incuban a 30°C durante 48 horas. Una vez observado el crecimiento, se remueven las esporas con 5 mL de glicerol al 40 % y se forma el banco de trabajo tomando alícuotas de 500 μί las cuales se conservan a -80° C.

El siguiente paso fue generar un cultivo semilla a partir de una alícuota del banco de trabajo, en el que se cultivarán los Streptomyces en condiciones óptimas para obtener el inoculo que servirá de base para el cultivo de producción.

Cultivo semilla

Un vial del Banco de Trabajo (BCT) que se encuentra almacenado en el tanque de nitrógeno líquido es temperado en un baño de agua a 36 ± 1 ° C. Se inocula 1 x 10 7 esporas por mililitro en un matraz de 5 L con medio semilla cuya composición se muestra a continuación: :

Componente Cantidad

Extracto de malta 0.25 %

Triptona 0.4 %

Harina de soya 0.5 %

Glucosa 0.2 %

Almidón soluble 0.25 %

Extracto de levadura 0.3 %

Carbonato de calcio 0.25 %

pH 7.0 - 7.6 Tabla 2. Componentes del cultivo semilla.

El cultivo semilla se mantiene a 28° C durante 48 horas con una agitación de 220 rpm. Durante el cultivo semilla las muestras son monitoreadas en microscopio para llevar a cabo un conteo de viabilidad y observación de la contaminación microbiana. La inoculación y otras manipulaciones para la preparación del cultivo semilla se llevan a cabo en una campana de flujo laminar y el cultivo semilla se lleva a cabo en la incubadora.

Se puede apreciar en la figura 1 que la bacteria S. jofer muestra una fase de adaptación (lag) de aproximadamente 12 horas; a partir de ese tiempo se dispara la producción de biomasa y se observa un crecimiento constante hasta las 34 horas con una acumulación de masa celular de aproximadamente 4gL 1 . A partir de ese tiempo se observa una disminución en la concentración celular, esto es provocado por el agotamiento de la fuente de carbono de fácil asimilación como lo es la glucosa el crecimiento sostenido después de las 24 horas se presenta por el desdoblamiento de azúcares más complejos como el almidón.

EJEMPLO 3. Método y condiciones de cultivo de S. jofer para la producción de metabolitos secundarios de Streptomyces.

Del cultivo semilla se toman 3 L y se inoculan en un termentador tipo tanque agitado con propelas inferiores que permiten la agitación mecánica del fluido con paletas sencillas y entrada de aire por la parte inferior con capacidad de 1000 L que contiene el medio de producción de las esporas el cual tiene la siguiente composición: Componente Cantidad

Almidón soluble 0.3 %

Glucosa 0.4 %

Harina de soya 2.2 %

Cloruro de calcio 0.25 %

Carbonato de 0.25 %

pH 7.0 - 7.6

Tabla 3. Composición del medio de producción.

Además de los elementos de la tabla 3, este medio puede contener Amilodextrina 1 .5-4.5 gL 1 , Hidrolizado de soya desgrasado 4.4-13.2 gL 1 , Dextrosa anhidra 0.8-1 .6 gL 1 , Cloruro de Calcio 0.5-1 .5 gL 1 . Como otra opción, este medio de producción además puede contener Extracto de malta 4.5-7.5 gL 1 , Hidrolizado celular de Saccharomyces cerevisiae 8-12 gL 1 , dextrosa anhidra 10-20 gL 1 . El medio de producción se esterilizó para el proceso de fermentación, este medio de producción, junto con el inoculo se colocó en el Shaker a 180 rpm y 28 ° C durante 96 horas con una agitación de 350 rpm durante 96 h. Se monitorea el cultivo cada 24 horas, donde se lleva a cabo el muestreo y se observa microscópicamente para establecer el número viable de células y la contaminación microbiana. La concentración de esporas es monitoreada.

En la Figura 2 se presenta la cinética de producción de biomasa de Streptomyces donde se puede apreciar que a partir de las 36 horas de cultivo comienza con un crecimiento sostenido hasta las 96 horas. A partir de este tiempo se presenta una desaceleración del crecimiento y se obtiene una concentración celular aproximada de 20 gramos por litro de biomasa. Es importante señalar que a partir de las 60 horas de cultivo existe un cambio de coloración en el cultivo puesto que después de este tiempo comienza a expresarse el metabolismo secundario derivado de las condiciones de estrés que se presentan, el resultado es la síntesis de pigmentos, enzimas, antibióticos, ácidos, entre otros productos. De acuerdo a lo anterior los metabolitos se pueden extraer durante el periodo de cultivo que abarca de aproximadamente 72 hasta las 96 horas.

Sedimentación y filtración

El cultivo de producción fermentado (metabolitos secundarios) es sedimentado mediante centrifugación a 3000 rpm durante 20 minutos ó 4000 rpm por 15 min., con el fin de remover restos celulares y excedentes del medio de cultivo (repetir de 2 a 3 veces este proceso de centrifugado, hasta obtener un caldo clarificado. Alternativamente, se puede dejar que el medio de cultivo se sedimente un depósito en frío a una temperatura aproximada de entre -5°C a 5°C por un periodo de tiempo de 24 a 48 h. Cualquiera de los dos métodos es igual de eficiente para la presente invención. Posteriormente el líquido sobrenadante es sometido a un procedimiento de filtración que puede ser al vacío o por gravedad utilizando una membrana polimérica con un tamaño de poro de 100 mieras o 0.2 μηι para retirar las esporas del fermentado (caldo). El líquido sobrenadante purificado contiene los metabolitos secundarios originados por las condiciones de cultivo cuando el microorganismo se encuentra en su fase estacionaria de crecimiento. El líquido mayoritariamente contiene estreptotricinas.

EJEMPLO 4. Método y condiciones de cultivo de S. jofer para la producción de extractos ricos en esporas de Streptomyces. La obtención de esporas de Streptomyces se realiza cuando se inoculan 10 mi del cultivo semilla en un tanque con agitación con capacidad de 1 L, que contiene el medio de cultivo de la tabla 2.

Este tanque de agitación se mantiene a 28°C y 180 rpm, durante 96 h.

El conteo de esporas se realiza mediante el uso de una cámara de Neubauer.

La viabilidad de las esporas se evalúa colocando 1 mL de una muestra con la concentración deseada en una caja Petri, sobre la cual se vierte una pequeña cantidad de agar de soya. Se vierte una cantidad suficiente como para cubrir el fondo de la caja Petri y para ello se agita circularmente la misma. Las cajas Petri con la muestra y el agar se colocan en una incubadora a 35° C durante 24 h. Después de este período, las cajas Petri se colocan en una contadora de microorganismos y se procede a enumerar unidades formadoras de colonias (UFC). La fracción de esporas viables que corresponden a una muestra en particular se calcula dividiendo el número de esporas viables de la muestra (N) entre el número de esporas viables observadas al tiempo cero (No). Los valores aceptables de esporas viables se encuentran entre un 90% y 100%.

EJEMPLO 5. Composición del fermento y las esporas de Streptomyces jofer.

El fermento de Streptomyces de la presente invención está conformado por el sobrenadante líquido filtrado resultado de la fermentación de Streptomyces jofer, cultivados por separado, bajo condiciones descritas anteriormente y óptimas de temperatura, pH y de nutrientes, dicha fermentación es llevada a cabo en un birreactor para la obtención de metabolitos secundarios tales como estreptotricinas y nourseotricinas (Vallin et al. 1998). Las esporas de Streptomyces se obtuvieron del cultivo de S. jofer ba\o condiciones óptimas de crecimiento, temperatura, pH y de nutrientes hasta alcanzar la fase estacionaria de cultivo, adicionalmente la cantidad de esporas se debe normalizar a hasta obtener una cantidad de 1x10 7 esporas/mL en las formulaciones de la presente invención.

Tanto el fermento de Streptomyces como las esporas pueden ser usados por separado o en combinación para lograr su efecto antifúngico. Estos producto también pueden mezclarse con diversos adyuvantes para logar una formulación con muchas ventajas. Sin embargo, se prefiere la mezcla del fermento y de las esporas para conformar un producto con efectos antifúngicos a corto y a largo plazo, como se verá enseguida.

Los inventores, de manera inesperada, han encontrado que el fermento y las esporas de Streptomyces, al ser mezcladas, permiten tener dos efectos antifúngicos benéficos y complementarios: un efecto a corto plazo que consiste en el efecto antifúngico que le proporciona el fermento a la planta de manera inmediata, puesto que el fermento contiene las sustancias antifúngicas (streptotricinas, nourseotricinas etc.) que van a actuar en cuanto se pongan en contacto con la planta. El otro efecto es a largo plazo y está dado por las esporas de Streptomyces, estas esporas se van a adherir a la planta y en un futuro inmediato van a eclosionar y a transformarse en la bacteria de Streptomyces bajo condiciones ambientales adecuadas. Estas esporas adheridas se van a transformar en bacterias que van a generar los compuestos antifúngicos de manera local (in situ) con un efecto a mediano y largo plazo, con protección permanente contra hongos patógenos.

Como se mencionó anteriormente, la mezcla del fermento y las esporas tiene un efecto máximo en una relación de aplicación de un 85% de fermento y de un 15% de esporas. EJEMPLO 6. Determinación de la actividad antifúngica de la mezcla que contiene el fermento y las esporas obtenidos de S.y ' oferfrente a los microorganismos patógenos Mycos haerella fijensis y Fussarium oxisporum. Con la finalidad de comprobar el efecto antifúngico de la mezcla que contiene el fermento y las esporas de S. jofer, se realizaron pruebas "in vitro" en las que se utilizaron los hongos Mycosphaerella fijensis (el cual causa la enfermedad de Sigatoka negra en el banano) y Fussarium oxysporum (el cual causa la enfermedad de panamá en el banano). Los ensayos se llevaron a cabo en cajas Petri que contenían un medio de cultivo selectivo que facilitaba el crecimiento de cada hongo.

La capacidad antifúngica de S. jofer radica en la producción de antibióticos, de manera particular de Streptotricinas y nourseotricinas, como se mencionó en la parte de antecedentes de esta invención. La finalidad de este experimento es la de encontrar los tiempos de producción de los elementos antifúngicos de esta cepa, para ello se utilizó una metodología de inhibición de crecimiento de patógenos, esta consiste en colocar discos estériles impregnados con la mezcla de los extractos obtenidos de la fermentación de las cepas de Streptomyces en una superficie agarizada que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de hongos fitopatógenos.

Los enfrentamientos se realizaron colocando un explante del hongo patógeno de 7 días de crecimiento en el centro de una caja Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA); de forma equidistante en los bordes opuestos a la caja Petri, se colocaron 4 discos de filtro de 5 mm de diámetro impregnados con el tratamiento. Como testigo se colocó una caja Petri con un explante del hongo patógeno. Los tratamientos fueron mantenidos a 25 °C durante 5-8 días. Durante la incubación, el fermento de obtenido de esta cepa de Streptomyces difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentración del extracto de Streptomyces es incapaz de inhibir al microorganismo en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente.

La evaluación de los halos de inhibición se pueden observar en las figuras 3 y 4 donde se evidencian los efectos del fermento sobre el crecimiento de los microorganismos patógenos a probar.

En la figura 3 se presentan los resultados de colocar en contacto los discos impregnados del fermento de Streptomyces obtenidos a diferentes tiempos de fermentación. Se observan placas de cultivo de Mycosphaerella fijiensis de explantes de 2 días de crecimiento mantenidas durante 10 días. La caja 1 es el control negativo, es decir, no se colocaron discos con extractos, las cajas 2 a 8 representan la inhibición de extractos de 12, 24, 36, 48, 60, 72 y 96 horas de fermentación. Los resultados cuantitativos se muestran en la gráfica de la figura 4. De los resultados mostrados en las figuras 3 y 4 se desprende que existe un efecto inhibitorio de más de un 50% cuando se utiliza el fermento de Streptomyces obtenido desde las 12 horas de cultivo, esto indica que la cepa de Streptomyces están produciendo metabolitos secundarios con propiedades antibióticas desde las 12 horas, siendo los tiempos óptimo y máximo de inhibición a las 60 y 72 horas de fermentación con un valor de inhibición cercano al 80%. Por otra parte, es importante mencionar que la efectividad del fermento de Streptomyces se presenta a todos los tiempos probados ya que existe una inhibición del crecimiento del hongo desde las 12 horas con un valor superior al 50%, esto queda claro en la gráfica que se muestra en la figura 4.

Por tanto, en este ejemplo queda demostrado que los fermentos obtenidos de Streptomyces jofer.

a) secretan compuestos inhibidores de crecimiento de hongos patógenos (streptotricinas y nourseotricinas),

b) inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos y

c) produce compuestos antifúngicos desde las 12 horas de cultivo.

EJEMPLO 7. Determinación de la actividad antifúngica del a) fermento de S. jofer, b) de la mezcla que contiene fermento y esporas y c) de las esporas, frente diversos microorganismos fitopatógenos.

Para corroborar el efecto antifúngico en otros microorganismos, como se demostró en el ejemplo 5, los inventores realizaron varios experimentos en los que enfrentó diversos hongos fitopatógenos con los productos derivados del metabolismo de S. jofer. Esos productos del metabolismo son: a) El fermento que contiene metabolitos secundarios.

b) La mezcla del fermento con esporas.

c) Las esporas

Dichos enfrentamientos se realizaron colocando un explante del hongo patógeno de 7 días de crecimiento en el centro de una caja Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA); de forma equidistante en los bordes opuestos a la caja Petri, se colocaron 4 discos de filtro de 5 mm de diámetro impregnados con cada condición. El testigo consistió en un explante del hongo patógeno en una caja Petri. Las condiciones de mantenimiento fueron a 25°C durante 5 a 8 días.

Los hongos fitopatogenos que se enfrentaron con los diversos productos de S. jofer son los que se describen en la tabla 4.

Tabla 4. Hongos fitopatogenos evaluados con a) fermento, b) fermento/esporas y c) esporas obtenidos de S. jofer.

La evaluación de la inhibición de microorganismos fitopatogenos de la tabla 1 se realizó probando 3 condiciones o tratamientos diferentes, el primero con el fermento filtrado (metabolitos de S. jofer), el segundo tratamiento utilizó el fermento sin filtrar (metabolitos y esporas de S. jofer), mientras que el tercer tratamiento se utilizaron únicamente las esporas de S. jofer. La cuarta condición es el testigo o control.

El resultado de estas pruebas in vitro, muestran la capacidad inhibitoria de S. jofer frente a todos los hongos fitopatogenos, tales como los mostrados en la tabla 4. En particular, es importante mencionar que el tratamiento con esporas de S. jofer logró controlar de manera significativa el crecimiento de todos los fitopatogenos probados. Estos resultados se pueden ver en las fotografías representativas de las figuras 5a, 5b, 5c y 5d. En las figuras 5a, 5b, 5c y 5d se puede observar que la condición testigo (4) se caracteriza porque existe un crecimiento uniforme del hongo en toda la caja de Petri.

El crecimiento del hongo patógeno se inhibió de manera significativa en todos los casos, debido a la acción de los metabolitos secundarios presentes en el fermento (condición 1 , figura 5). Se puede apreciar que el halo de crecimiento del hongo sólo abarca la parte central de la caja, el límite es impuesto por los discos de filtro impregnados con el fermento.

El efecto anterior es todavía más significativo en el caso de la aplicación de fermento/esporas y esporas (condiciones 2 y 3 respectivamente).

Los datos anteriores indican que tanto el fermento como las esporas de S. jofer son eficaces en la inhibición del crecimiento de hongos fitopatógenos. EJEMPLO 8. Formulaciones que contienen fermentos y esporas de Streptomyces jofer y diversos extractos vegetales.

Una vez demostrada la efectividad antifúngica, de los productos del metabolismo de S. jofer contra una gran cantidad de hongos fitopatógenos, los solicitantes decidieron elaborar diversas formulaciones novedosas con actividad antifúngica que pudieran ser administradas a plantas con el mínimo o nulas afectaciones a los ecosistemas y al ambiente.

Es deseable tener formulaciones antifúngicas que contengan antibióticos de baja toxicidad para seres humanos y animales que sean inocuas para el medio ambiente en especial insectos y otras plantas y que además tengan elementos o componentes que ayuden a la planta a disminuir el estrés ocasionado por las enfermedades en sus diferentes estadios infecciosos. Es deseable tener formulaciones que contengan inductores de resistencia para proteger a las plantas de los microorganismos fitopatógenos.

También es deseable tener formulaciones que contengan nutrientes que favorezcan el metabolismo y desarrollo de las plantas, particularmente, es necesario una formulación que fortalezca la pared celular de las hojas para dificultar le penetración de patógenos.

La presente invención provee formulaciones que contiene extractos de plantas y ácidos grasos que inducen la resistencia sistémica de las plantas ya que permiten la formación de una película de protección para las hojas contra agentes patógenos.

Formulaciones con las características anteriores deben contener adyuvantes y excipientes que permitan la conservación adecuada de los compuestos antifúngicos y de las esporas así como la de proveer compuestos que permitan la absorción de los principios activos a las plantas. Asimismo son necesarios adyuvantes que permitan proporcionar y nutrir a las plantas.

Las características anteriores llevaron a los inventores a diseñar y probar formulaciones novedosas que actúan como antifúngico y al mismo tiempo brindan los nutrientes necesarios a la planta para un mejor desarrollo y producción de flores y frutos.

Las ventajas de las formulaciones divulgadas en la presente invención son que: • Sus componentes sustituyen a químicos de alto riesgo para la salud y el medio ambiente,

· Se obtienen mejores resultados que con tratamientos agroquímicos convencionales. • Es de origen 100% biológico ya que no contienen compuestos químicos que puedan afectar al medio ambiente, animales o humanos.

• Fortalece el cultivo con los elementos nutricionales favoreciendo el metabolismo y el desarrollo de las plantas.

· Es de fácil de aplicación y no deja residuos.

• No genera resistencia por lo que se puede aplicar todo el año.

Dentro de los componentes de las formulaciones de la presente invención se encuentran algunos extractos vegetales que provienen de al menos de 3 plantas que son Larrea tridentata conocida como gobernadora, Agave lechuguilla, conocida como lechuguilla y Cinnamomum zeylanicum, cuyo nombre común corresponde a la canela.

La planta gobernadora contiene altos niveles de Taninos los cuales tienen actividad antifúngica e inoculante en plantas y cultivos de hortalizas (Lira-Saldivar et al. 2002 y Vargas-Arispuro et al. 2005).

La lechuguilla, que contiene saponinas, las cuales tienen una actividad antifúngica, permite ser un buen candidato como elemento natural para combatir hongos fitopatogenos (Castro-Franco et al. 2001 ; Moreno-Cuccolotto, 2009; Verastegui, 1995.)

En el caso de la canela, esta contiene componentes con antifúngicos como el cinamaldehido o el eugenol que tienen probados efectos fungicidas (Landero et al. 2013; Silva-Espinosa et al. 2013)

Estas formulaciones contienen también diversos compuestos orgánicos de origen biológico que permiten el crecimiento y desarrollo de las plantas, entre los que se encuentran los microelementos que básicamente son elementos nutricionales de las plantas y que son sustancias necesarias para llevar a cabo su metabolismo para crecer y desarrollarse (Introducción a la fertilización con microelementos, 1996, Comercial Química Masso, S.A.) estos microelementos están conformados por hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno, magnesio, azufre, calcio, boro y otros minerales, que son elementos que la planta absorbe en cantidades mínimas.

Las formulaciones de la presente invención también contienen materia orgánica humidificada (ácidos fúlvicos y ácidos húmicos), la cual forma combinaciones con los iones metálicos, como los quelatos, que son complejos órgano-metálicos estables, donde el metal es insertado en una molécula complejante. Estos complejos permiten disolver, movilizar y transportar metales y sustancias orgánicas en los suelos y las aguas, es decir, disponibilidad de nutrientes, especialmente aquellos presentes en muy pequeñas cantidades. Las sustancias húmicas y fulvicas favorecen el crecimiento de la planta directamente a través de los efectos fisiológicos y nutricionales. Algunas de estas sustancias funcionan como hormonas naturales de las plantas (auxinas y giberelinas) y son capaces de mejorar la germinación de las semillas, la iniciación radical y pueden servir como fuente de nitrógeno, fósforo y azufre (Conservación de los recursos naturales para una Agricultura sostenible, FAO, http://wvw.fao.org/ap/ca/traininq materiais/cd27- s .anish/ba/organic malter.Qd j) .

Algunos ejemplos de composiciones de formulaciones de la presente invención se muestran en la tabla 5: Componentes Porcentajes (%)

Agua 25

Microelementos 5.0 -15.0

Acido Fúlvico 0.4-0.8

Acido Húmico 0.2 - 0.5

Extracto de algas marinas 3.0-7.0

Extracto lechuguilla (saponinas) 1.0-8.0

Extracto gobernadora (taninos) 5.0- 10

Extracto de canela (cinamaldehídos) 1.0- 10

Quitosán 0.5-2.0

(poli-D-Glucosamina)

Acidos grasos 0.5-6.0

(Manteca de coco fundida)

Acidos grasos omega 3 1.0-2.0

Propilenglicol 2.0-5.0

Ac. Salicílico 0.5-1.5

Fermento/Esporas de Streptomyces jofer 30-60

Carboximetil Celulosa 0.8-1.5

Tabla 5. Elementos y composición de formulaciones con actividad antifúngica e inoculante de plantas de la presente invención.

Ejemplo 9. Ejemplos prácticos de formulaciones con actividad antifúngica.

Enseguida se mostrarán algunas de las fórmulas probadas como inoculantes antifúngicas de la presente invención.

Fórmula 1. Fermento de Streptomyces jofer 30- 60%; Esporas de Streptomyces jofer 30 -60% (1x10 7 esporas/ml); Ácido 2- h id roxi benzoico 0.5- 1.5%; quitosano 0.5- 2.0%; Extracto de Larrea tridentata 5.0- 10.0%; Extracto de Cinnamomum zeylanicum 5.0 -10.0%; Extracto de Agave lechuguilla 1.0-5.0%; Ácidos grasos de Cocos nucífera 0.5- 5.0%; Carboximetil celulosa 1.0%; Propilenglicol 3.0- 5.0%; Ácidos grasos Omega 1.0- 2.0%; Algas marinas 4.0%; Ácido húmico 0.2- 0.5%; microelementos 5.0- 15.0%; Agua 25%. Fórmula 2. Fermento de Streptomyces jofer 30- 60%; Esporas de Streptomyces jofer 30-60% (1x10 7 esporas/ml); Ácido 2- hidroxibenzoico 0.5- 1 .5%; quitosano 0.5- 2.0%; Extracto de Larrea tridentata 5.0- 10.0%; Extracto de Cinnamomum zeylanicum 1 .0-10%; Extracto de Agave lechuguilla 1 .0-5.0%; Ácidos grasos de Cocos nucífera 0.5- 5.0%; Carboximetil celulosa 0.8- 1 .5%; Propilenglicol 3.0- 5.0%; Ácidos grasos Omega 1 .0- 2.0%; Algas marinas 5.0- 7.0%; Ácido húmico 0.2- 0.5%; microelementos 5.0- 15.0%; Agua 25%.

Fórmula 3. Fermento de Streptomyces jofer 30-60%; Esporas de Streptomyces jofer 30-60% (1 x10 7 esporas/ml); Ácido 2- hidroxibenzoico 0.5- 1 .5%; quitosano 0.5- 2.0%; Extracto de Larrea tridentata 5.0- 10.0%; Extracto de Cinnamomum zeylanicum 1 .0-10%; Extracto de Agave lechuguilla 1 .0-5.0%; Acidos grasos de Cocos nucífera 0.7- 5.0%; Carboximetil celulosa 0.8- 1 .5%; Propilenglicol 2.0- 5.0%; Ácidos grasos Omega 1 .0- 2.0%; Algas marinas 3.0- 7.0%; Ácido húmico 0.3- 0.5%; microelementos 5.0- 15.0%; Agua 25%. Fórmula 4. Fermento de Streptomyces jofer 30-60%; Esporas de Streptomyces jofer

30-60% (1 x10 7 esporas/ml); Ácido 2- hidroxibenzoico 0.5- 1 .5%; quitosano 0.5- 2.0%;

Extracto 5 de Larrea tridentata 4.0- 8.0%; Extracto de Cinnamomum zeylanicum 4.0- 8.0%;

Extracto de Agave lechuguilla 4.0- 8.0%; Acidos grasos de Cocos nucífera 4.0- 6.0%;

Carboximetil celulosa 0.8- 1 .5%; Propilenglicol 2.0- 5.0%; Ácidos grasos Omega 1 .0- 2.0%; Algas marinas 3.0- 6.0%; Ácido húmico 0.3- 0.5%; microelementos 5.0- 15.0%; Agua 25%.

Los componentes y cantidades de las formulaciones representativas, pero no limitativas se pueden ver resumidos en la Tabla 6. Componentes Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 Fórmula 4 Fermentos de S. jofer 30-60% 30-60% 30-60% 30-60%

Esporas de S. jofer 30-60% 30-60% 30-60% 30-60%

Acido salicílico 0.5-1 .5% 0.5-1 .5% 0.5-1.5% 0.5-1.5%

Quitosán 0.5-2.0% 0.5-2.0% 0.5-2.0% 0.5-2.0%

(poli-D-Glucosamina)

Tan i nos 5.0-1 0.0% 5.0-10.0% 5.0-10.0% 5.0-1 0.0%

(extracto gobernadora)

Cinnamaldehidos 5.0-1 0.0% 1.0-10.0% 1 .0-10.0% 4.0-8.0% (Extracto de canela)

Saponinas 1 .0-5.0% 1 .0-5.0% 1 .0-5.0% 4.0-8.0% (extracto lechuguilla)

Manteca de coco fundida 0.5-5.0% 0.5-5.0% 0.7-5.0% 4.0-5.0% (Ácidos grasos)

Carboximetil Celulosa 1.0% 0.8-1 .5% 0.8-1.5% 0.8-1.5%

Propilenglicol 3.0-5.0% 3.0-5.0% 2.0-5.0% 2.0-5.0%

Acidos grasos omega 3 1 .0-2.0% 1 .0-2.0% 1 .0-2.0% 1 .0-2.0%

Extracto de algas marinas 4.0% 5.0-7.0% 3.0-7.0% 3.0-7.0%

Acido Húmico 0.2-0.5% 0.2-0.5% 0.3-0.5% 0.3-0.5%

Microelementos 5.0-1 5.0% 5.0-15.0% 5.0-15.0% 5.0-1 5.0%

Agua 25% 25% 25% 25%

Tabla 6. Componentes de Formulaciones antifúngicas con actividad inoculante derivadas de Streptomyces jofer.

De acuerdo con la tabla 6, los microelementos están conformados por los siguientes componentes: EDTA Disódico dihidratado, FeS0 4 , MgCI 2 , ZnS0 4 .H 2 0, ZnS0 4 .H 2 0, MnS0 4 .H 2 0, Lignosulfonato de Calcio, H 3 B0 3 y NKS.

Los extractos de plantas utilizados (gobernadora, lechuguilla y canela) así como los componentes restantes de las formulaciones fueron adquiridos comercialmente a diferentes proveedores. EJEMPLO 10. Efecto antifúngico de formulaciones que contiene fermento y esporas de Streptomyces jofery extractos vegetales contra Mycosphaerella fijijensis in vitro.

Las formulaciones 2, 3 y 4 fueron evaluadas para determinar su actividad antifúngica contra Mycosphaerella fijiensis. Las tres formulaciones presentaron actividad fungistática in vitro contra este fitopatógeno. Los porcentajes de inhibición de dichas formulaciones al décimo día fueron de 31 .2 para el formulado 2, 73.51 para la fórmula 4 y de 89.91 en el caso la fórmula 3 (ver Figura 7). Las tres formulaciones evaluadas presentaron actividad fungistática.

A nivel mundial se considera que la Sigatoka negra es la principal enfermedad foliar del banano en los países tropicales. Esta enfermedad es causada por Mycosphaerella fijiensis y produce daños a nivel foliar disminuyendo la capacidad de fotosíntesis de la planta lo que conlleva a la disminución de su productividad (Rodríguez- Gaviria y Cayón, 2008). El control de Sigatoka se lleva a cabo tradicionalmente con la aplicación de fungicidas químicos. En México los fungicidas comúnmente usados son mancozeb y clorotalonil y benzimidasoles, triazoles y anilopirmidinas como tratamientos sistémicos (Martínez-Bolaños et al., 2012), los cuales son compuestos sintetizados químicamente. El control químico ha provocado la presencia de residuos en los frutos y la resistencia del hongo a estos fungicidas. Sin embargo, de manera novedosa con ventajas inesperadas, las formulaciones antes descritas son excelentes alternativas biológicas para el control de esta enfermedad. En el presente experimento se evaluó la efectividad de tres formulaciones (2, 3 y 4) sobre la inhibición de M. fijiensis. Las pruebas in vitro con M. fijijensis se realizaron en placas de agar papa dextrosa

(PDA) con el método de agar envenenado. Al agar estéril previo a su solidificación se le agregó la cantidad de la formulación especificada para el control de M. fijiensis. Los medios con los tratamientos se vertieron en placas Petri estériles. Posteriormente el hongo se sembró a manera de explantes discoidales de 3 mm de diámetro tomados con un sacabocados de una colonia de 7 días de crecimiento, incubada a 25°C y dichos explantes se colocaron en el centro de las cajas con los tratamientos. El experimento se incubó a 25 °C durante 10 días. Para la evaluación del porcentaje de inhibición se midieron de forma perpendicular los diámetros de la colonia con un vernier. El porcentaje de inhibición fue calculado con la siguiente fórmula:

% Inhibición = [(Xc-Xi)/Xc] X 100

Donde:

Xc: diámetro de crecimiento del hongo control

Xi: diámetro de crecimiento del hongo en tratamiento

Para cada tratamiento se realizaron tres replicaciones y un testigo con el inoculo sin tratamiento.

Para determinar si el efecto de las diferentes formulaciones es de tipo fungicida o fungistático, se observó el crecimiento de Mycosphaerella fijiensis en varios tratamientos, si existe crecimiento de la colonia se considera que el producto es fungistático. En caso de no presentar crecimiento, los explantes se transfieren a agar PDA sin tratamiento.

Los resultados de los tratamientos con las diferentes formulaciones se muestran en las figuras 6 y 7, donde se evalúa el crecimiento radial en relación con el tiempo (Figura 6) y el porcentaje de inhibición de crecimiento en cada formulación (Figura 7).

En la figura 6 se muestran los resultados de las pruebas de inhibición de M. fijiensis y se observó que la formulación 2 sigue la misma tendencia de crecimiento que el control pero con valores menores, es decir, retrasa el crecimiento del fitopatógeno en comparación al testigo. En el caso de la formulación 3, se observó un crecimiento los primeros 4 días de evaluación, posteriormente el crecimiento se detiene y permanece con el mismo diámetro los siguientes 6 días de estudio. En la evaluación de la formulación 3 se observó que existe un ligero crecimiento de M. fijiensis el primer día de estudio y posteriormente no se observa crecimiento durante los siguientes 9 días.

Estos datos indican que todas las formulaciones probadas demostraron una disminución efectiva y significativa, muy por debajo del grupo testigo o control.

La efectividad de las formulaciones se corrobora en la figura 7, donde se ve que la formulación 3 tiene casi un 90% de inhibición del crecimiento de M. fijiensis. Estos resultados sugieren que dichas formulaciones pueden ser utilizadas para tratar a plantas de banano contra la enfermedad de Sigatoka negra.

En el siguiente ejemplo se corroborará la eficacia de las formulaciones en un campo de cultivo contra la enfermedad Sigatoka negra que ataca al banano.

EJEMPLO 11. Efecto antifúngico de formulaciones que contiene fermento y esporas de Streptomyces y extractos vegetales en cultivos agrícolas. De los ejemplos anteriores se infiere que las diferentes formulaciones divulgadas en la presente invención tienen un efecto antifúngico a nivel de campos de cultivo, (ver ejemplo 7), y como un efecto nuevo e inesperado, propiedades inoculantes. Este nuevo efecto se traduce en plantas con un mayor grosor de tallo, incremento en el número de hojas y peso fresco de la planta, aumento de días de floración y en el número de flores por planta, mayor cantidad de producto por Hectárea etc., como se demostrará en los siguientes ejemplos. Para demostrar la capacidad antifúngica de las formulaciones anteriormente descritas se realiza un ensayo de sensibilidad de un cultivo fúngico y/o bacteriano a el fermento, usando como principio el método de Kirby Bauer. Para llevar a cabo este objetivo se realizó la siguiente prueba de campo:

Evaluación de efectividad de formulados para el control de Sigatoka Negra (Mycosphaerella fijensis) en el cultivo de banano (Musa Cavendish), cuyo objetivo es demostrar la efectividad de las formulaciones para el control de una enfermedad de la planta de Banano.

• Modo de aplicación: Vía Foliar Avioneta

• Área a tratar: 10 Has; Dosis: 1 .5 L/Ha; Número de aplicaciones: 1 aplicación cada 7 días; Muestra inicial: Resultado de monitoreo inicial; Muestra final: Resultado de monitoreo final; Parámetros a medir: localización de Pizcas y Estrías, grados de quema en hojas, numero de 10 hojas en planta recién parida, numero de hojas en plantas a corte, retorno del hijo, promedio ponderado de infección.

En principio, es necesario tener una idea clara y precisa del estado sanitario de la finca para prevenir daños severos al cultivo y evitar que se afecte la producción. Por esta razón se realizaron evaluaciones periódicas (cada 10 días) sobre la incidencia y severidad de la Sigatoka negra en cada finca. El Método de Stover Modificado por Gauhl estima visualmente el área total cubierta por todos los síntomas de la enfermedad en cada hoja de plantas próximas a la floración. Esta escala incluye seis grados. Se toman en cuenta todas las hojas presentes, excepto la hoja bandera y las hojas agobiadas. El número total de hojas en plantas recién florecidas es de 12 a 14. Se deben mantener de 8 a 10 hojas durante la fase de desarrollo de la inflorescencia y 5 a 6 hojas para el momento de cosecha. Para mayor claridad, la figura 8 muestra el método de Stover Modificado para evaluar el daño de las hojas, mientras que la figura 9 describe el cálculo del número de hojas por planta (H/P), Hoja más joven 5 Enferma (HMJE) y promedio ponderado de infección (PPI).

Luego de la florecida, la infección (manchas) se hace evidente en las hojas superiores. Si hay por lo menos 6 hojas sanas (sin manchas) cuando faltan de 7-8 semanas para la cosecha y se mantienen, se podría obtener un buen racimo. Si se produce un deterioro de hojas por encima de la hoja seis, la planta no tendría el número de hojas necesario para desarrollar un racimo adecuado. La incidencia del daño (infección) sobre la productividad y la calidad de la fruta dependerán, en gran parte, del estado de desarrollo del racimo y de la eficiencia del régimen de aspersiones. Un alto índice de daño es una situación grave si se detecta en la fase inicial de la florecida, sin embargo si los racimos están próximos a cosechar el problema no es alarmante.

En las figuras 10, 1 1 , 12 y 13 se puede observar los resultados de los 4 monitoreos de pizca en hoja de banano y su localización figura 14.

De dichos monitoreos se desprende que existe una mejoría en la localización de la pizca y de la estría (HMJE); teniendo la pizca en la H4 al inicio del estudio y dejando el 50 % de la localización en la hoja 5 lo que significa una efe; así como la estría pasando de la H6 y H7 (80 %) al inicio y dejándola en la H8 (84 %).

La Hoja más joven enferma (HMJE) es la primera hoja contando de arriba hacia abajo que tiene por lo menos 10 manchas (Grado 1). En el presente estudio, la localización inicial de la HMJE se presentó en la posición 7.4, el 40 % del total de las hojas muestreadas presentaron un grado de infección tipo 1 . Al llevar a cabo el ensayo en campo, la localización de la HMJE fue desplazándose hasta obtener la mejor ubicación en la posición 8.6, disminuyendo el porcentaje de hojas con grado de infección grado 1 en un 75 % (10 % de la población con grado 1). Los resultados obtenidos indican que las formulaciones desarrolladas confieren protección a las hojas más jóvenes.

En la figura 17 se muestra el Promedio ponderado de infección (PPI) y el porcentaje de disminución de Sigatoka negra en el predio experimental. El Porcentaje Ponderado de Infección (PPI) nos ayuda a determinar la severidad de la enfermedad en la finca. Su valor debe ser de 2 o menos en siembras que llevan a cabo un manejo adecuado. Los resultados obtenidos muestran un PPI final de 0.007, evidenciando la eficacia de las formulaciones desarrolladas. Se observa también un 75 % en la disminución de la presencia de Sigatoka Negra en los cultivos, demostrando así la efectividad de las formulaciones en el intervalo de aplicación estudiado Todos estos resultados indican que las formulaciones de la presente invención confieren protección a las hojas más jóvenes y que además, controlan la enfermedad, ya que lesiones tratadas sobre los estadios 1 , 2 y 3 cambian de color negro a marrón obscuro y no se expanden más, reduciendo 53% desde la primera aplicación. EJEMPLO 12. Efecto inoculante de las Formulaciones que contiene fermento y esporas de Streptomyces jofery extractos vegetales en cultivos agrícolas.

Las formulaciones antes descritas, presentaron también un efecto novedoso e inesperado relacionado con la nutrición de las plantas, dicho efectos es conocido como inoculante, puesto que son formulaciones que contienen un microorganismo vivo que al ser aplicados a plantas, favorecen la nutrición y/o desarrollo de la plantas aumentando el rendimiento de las mismas. En este sentido, los inventores han diseñado varios experimentos en los que se evalúa la efectividad biológica de las formulaciones de la presente invención, de manera particular se utilizó, a manera de ejemplo, la formulación 3 para valorar diferentes parámetros de crecimiento de varias plantas.

En primer lugar se utilizó un cultivo de calabacita (Curcubita pepo L) "var" Grey Zucchini, en el que se aplicó la formulación a una concentración de 1 .5, 1 .75 y 2.0 L/Ha y un testigo sin aplicación.

Las formulaciones fueron aplicadas de manera foliar en tres aplicaciones, estas fueron desde el momento del trasplante, con intervalos de 15 días entre cada aplicación, se evaluaron los parámetros de grosor de tallo, hojas por planta, longitud de raíz, peso fresco de la planta, días a floración, días a cosecha y madurez de frutos, altura de planta, número de flores, número de frutos, peso fresco y seco de fruto, clorofila, diámetro de fruto, longitud de fruto, peso de fruto, análisis nutrimental del fruto, rendimiento y fitotoxicidad. Se encontró que la formulación evaluada obtuvo mejores resultados con las dosis de 2.0 L/Ha. Resultando una buena opción en la producción del cultivo de Calabacita. Ninguna de las dosis probadas causó fitotoxicidad al cultivo de Calabacita, como se verá enseguida.

En la tabla 7 se muestran los Parámetros de evaluación y métodos de muestreo:

Parámetros de evaluación Métodos de muestreo

Número de frutos por planta Se cuantificaron el número de frutos por planta antes de la cosecha

Número de hojas por planta Se contabilizaron el número de hojas de 5 plantas.

Longitud de raíz Se determinó en un vaso de precipitado con capacidad para 2 L.

Peso fresco de la planta entera Se tomaron cinco plantas por repetición , las cuales se pesaron en una balanza granataria para determinar su peso fresco.

Número de flores Se contabilizaron el número de flores tanto masculinas como femeninas.

Días a floración Se cuantificaron los días transcurridos desde el trasplante hasta la aparición de la primera flor.

Días a cosecha y madurez de frutos Se cuantificaron los días transcurridos desde el trasplante hasta la aparición de los primeros frutos

Conteo de hongos y bacterias en la planta y en Se tomó una muestra de suelo, la cual se envió al el suelo rizosferico. laboratorio para realizar el conteo de bacterias y hongos presentes antes del establecimiento del cultivo y al momento de la cosecha.

Rendimiento ha -1 Con los datos de peso de fruto se estimó el rendimiento por hectárea

Peso seco de la planta entera Las plantas a las que se pesaron en fresco se secaron en un horno por dos días a 60°C para determinar el peso seco.

Análisis Nutrimental Al momento de terminar el experimento se tomaron muestras de tres plantas por tratamiento y se analizaron por medio del ICP los elementos de NPK.

Diámetro del fruto (cm) Se midió con un vernier en la parte media en cm.

Longitud del fruto (cm) Se midió con un vernier en cm

Peso del fruto (Kg) Con una balanza granataria, se determinó el peso de frutos al momento de alcanzar su madurez fisiológica.

Tabla 7. Parámetros de evaluación y métodos de muestreo.

Análisis estadístico.

Para el análisis estadístico de los resultados se realizó un análisis de varianza y para los valores que resultaron significativos se hizo una comparación de medias por Tukey al 5% de probabilidad, por medio del paquete estadístico SAS V9.2. También se calculó la eficacia del producto en relación al testigo absoluto mediante la fórmula Abbott.

Fórmula Abbott:

Ca-Ta X 100

Ca

Dónde:

Ta= Valores obtenidos en el testigo en las evaluaciones.

Ca= Valores obtenidos en los tratamientos en las evaluaciones. En las siguientes tablas se muestran los resultados de algunos de los parámetros evaluados.

Tabla 8. Grosor de tallo del estudio de efectividad biológica para la formulación 3.

La tabla 8 muestra diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos evaluados, siendo los que presentaron el mayor número de hojas los que fueron tratados con las dosis más altas del inoculante cuya formulación 3 (1.75 Y 2.0 L/Ha).

Tabla 9. Número de hojas por planta del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Tabla 10. Longitud de raíz del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Foi mulactón/Dosts Peso fresco Significada Turkey planta (g) a.) 95%

Testigo 285.52 c

Formulación 1.50 L/Ha 329.11 B

Formulación 1.75 L/Ha 380.54 BA

Formulación 2.00 L/Ha 440.23 A

Tabla 1 1 . Peso fresco de la planta entera del estudio de efectividad biológica para la formulación.

El peso fresco de la planta se vio afectado considerablemente con la adición de la formulación inoculante en plantas de calabacita, presentando diferencias estadísticas entre los tratamientos evaluados, y donde el mayor peso fresco de planta se produjo con la dosis de 2.0 L/Ha con 440.23 g, mientras que el testigo únicamente alcanzo un peso de 285.52

Tabla 12. Flores por planta del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Como se puede observar, la producción de flores por planta se vio beneficiada con la aplicación de la formulación inoculante 3, como se aprecia en el análisis de varianza de la tabla 10, se presentaron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos evaluadas, y donde el que mejores resultados arrojo fue la dosis de 2.0 L/Ha con una media de 1 1 .75 flores por planta, y con una efectividad del 29.78 % superior al testigo que únicamente produjo una media de 8.25 flores.

Tabla 13. Número de frutos por planta del estudio de efectividad biológica para la formulación.

El parámetro mostrado en la tabla 10 es de los más importantes para evaluar la efectividad de las formulaciones como inoculante, ya que se puede ver que hay un aumento del 75% en el cultivo tratado con la formulación inoculante con una concentración de 2.00 L/Ha del número de frutos en comparación con el testigo, este aumento también se aprecia en la menor concentración, siendo este de un 30% de aumento.

Formulación/Dosis Rendimiento Significacia

Ton/Ha Turkey al 95%

Testigo 17.74 C

Formulación 1 .50 L/Ha 22.23 B

Formulación 1 .75 L/Ha 27.40 B

Formulación 2.00 L/Ha 28.34 A

Tabla 14. Rendimiento de fruto del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Otro parámetro de suma importancia para el productor es el del rendimiento del producto por Hectárea y cómo se puede apreciar en la tabla 1 1 , la formulación de la presente invención, incrementa dicho rendimiento en un 60% en relación al grupo control su dosis más alta. Existe un incremento de un 25% a la dosis más baja.

Formulación/Dosis Diámetro det Significacia

fruto (cm) Turkey al 95%

Testigo 5.58 C

Formulación 1 .50 L/Ha 5.67 c

Formulación 1 .75 L/Ha 6.17 B

Formulación 2.00 L/Ha 6.69 A

Tabla 15. Diámetro del fruto del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Formulació /Dosis Hongos totales UFC Bacterias totales UFC g-1 suelo g-1 suelo

Testigo 29.36X10 2 6.26X10 4

Formulación 1 .50 L/Ha 4.10X10 4 6.10X10 5

Formulación 1 .75 L/Ha 5.8X10 4 7.20X10 5

Formulación 2.00 L/Ha 7.2X10 4 8.30X10 5 Tabla 16. Conteo de hongos y bacterias en el suelo del estudio de efectividad biológica para la formulación.

Finalmente, se evaluó la Fitotoxicidad, encontrándose que ninguno de los tratamientos presento Fitotoxicidad por la aplicación la formulación inoculante a dosis 1 .5, 1 .75 y 2.0 L/Ha.

Con base en los resultados presentados en este ejemplo se concluye que:

1 . La formulación inoculante probada en ninguna de las dosis evaluadas provocó efectos fitotóxicos en las plantas de Calabacita (Cucúrbita pepo L), variedad

Grey Zucchini, calificándose como 1 (sin efecto sobre el cultivo) según la escala de la EWRS.

2. Con base a los resultados mostrados, el uso de la formulación inoculante es recomendable a todas las dosis probadas, es decir, 1 .5, 1 .75 y 2.0 L/Ha, siendo la preferida la de 2.0 L/Ha, ya que mostró una mayor efectividad con respecto al testigo, incrementando el rendimiento y las variables de importancia para el productor, tales como número de frutos por planta, peso fresco de la planta entera, número de flores, rendimiento por Ha, diámetro del fruto, peso del fruto etc.

3. La cantidad de hongos y bacterias totales en el suelo se vio incrementada con el uso de la formulación inoculante, estas se incrementaron con en todas las dosis probadas 1.5, 1 .75 y 2.0 L/Ha, beneficiando con esto la producción del Calabacita (Cucúrbita pepo L), variedad Grey Zucchini.

Con todos los ejemplos y datos presentados en la presente solicitud de patente, queda demostrado suficientemente que las formulaciones reclamadas tienen un efecto antifúngico e inoculante para plantas, es decir, tienen un doble efecto benéfico para las plantas que son tratadas, por tanto este efecto doble que es inesperado (dos efectos en una misma formulación) le confiere, a la presente invención y las modalidades preferidas, un aspecto novedoso que no es derivable de manera obvia a partir del estado de la técnica.

Aunque la presente invención se ha descrito de manera completa y suficiente, será aparente para aquellos expertos en la materia que ciertos cambios y modificaciones pueden realizarse. Por tanto, la descripción y los ejemplos no deben ser limitantes del alcance de la invención, la cual está establecida por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a cabo la presente invención es el descrito en la misma.

Finalmente se incorpora a la presente solicitud la constancia de depósito correspondiente al microorganismo base de la presente invención con la siguiente información:

Ingreso a la CM-CNRG: 24/09/2015

Vigencia del Certificado: 24/09/2045

Número de certificado: CM-CNRG0002

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