Gegenstand der Erfindung sind neue Gamma-Pyrone, Gamma- Pyridone sowie Gamma-Thiopyrone und deren Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung von viralen Erkrankungen.

Viruskrankheiten wie Hepatitis B und -C oder AIDS breiten sich exponentiell aus. Daher hat die Entwicklung anti- viraler Wirkstoffe eine große volkswirtschaftliche Be¬ deutung erlangt und steht im Zentrum der pharmakologischen Forschung. Die heute gängigen antiviralen Arzneimittel zeichnen sich durch ein geringes antivirales Wirkungs¬ spektrum und in den meisten Fällen durch eine hohe Toxi- zität aus. Als gravierende Nachteile treten eine schlechte Applizierbarkeit und die rasche Induktion resistenter Virusstämme in Erscheinung.

Als antivirale Prophylactica stehen Amantadin und Rimantadin gegen einige Influenzaviren sowie Metisazon gegen Pockenviren zur Verfügung. Amantadin und Rimantadin haben eine geringe Toxizität. Als weitere antivirale Mit¬ tel sind Idoxuridine, Trifluorthymidin, Ethyldeoxyuridin und Iododeoxycytidin bekannt, die insbesondere bei eini¬ gen lokalen Herpesinfektionen ausschließlich äußerlich angewendet werden können. Diese Substanzen sind jedoch teilweise hoch toxisch.

Adeninarabinosid und Cytosinarabinosid sind ausgespro¬ chene Immunsuppressiva und sehr nebenwirkungsreich. Sie bewirken zum Beispiel Veränderungen der Chromosomen.

Bromovinyldeoxyuridin wirkt gut gegen Herpes si plex Virus Typ 1 und einige andere Viren, nicht jedoch gegen Herpes simplex Virus Typ 2. Acyclovir wirkt ebenfalls gegen eini¬ ge Herpesviren, nicht aber gegen das Cytomegalovirus. Dihydroxyproposymethylguanin wirkt gegen das Epstein-Barr Virus und das Cytomegalovirus, ist jedoch sehr toxisch.

Phosphonoformiat, Suramin und Zidovudin wirken unter an¬ derem gegen HIV-Viren, besitzen jedoch eine hohe Toxizi¬ tät.

Viele der oben genannten Substanzen wirken gegen eine virale Thymidinkinase, eine virale Polymerase oder eine virale reverse Transkriptase. Für viele der Substanzen ist bereits während der Therapie eine Resistenzbildung der infizierenden Viren beobachtet worden.

Als vorteilhafte Substanzen haben sich in jüngster Zeit Polyanionen wie Dextransulfat und Peritosanpolysulfat er¬ wiesen, da sie spezifisch gegen die reverse Transkriptase von Retroviren, insbesondere von HIV, zu wirken scheinen. So beschreibt die DE-OS 36 01 136 die Verwendung von or¬ ganischen Polymerisaten, die anorganische anionische Gruppen enthalten, für Prophylaxe und Therapie von retro- viralen Infektionen in Säugern.

Die EP-OS 0 293 826 beschreibt therapeutische und pro¬ phylaktische Wirkungen von sulfatierten Polysacchariden gegen AIDS.

Das technische Problem der Erfindung liegt darin, ein antivirales Mittel mit geringer Toxizität, hoher spezi¬ fischer Wirksamkeit, guter Applizierbarkeit und möglichst geringer Neigung zur Induktion resistenter Virusstamme zur Verfügung zu stellen.

Dieses Problem wird durch die Verbindungen der Formel (I)

Formel (I)

gelöst, wobei R. und R, H, eine verzweigte oder unver¬ zweigte C ₁ bis C _2g Alkyl-, vorzugsweise C. bis Cg, C ₁ bis C _2g Alkenyl- oder C.. bis C_ _g Alkinylgruppe oder Kombina¬ tionen dieser sind, R_ eine verzweigte oder unverzweigte C. bis C _2g Alkylgruppe ist und R. eine C_ bis C ₂₆ Cyclo¬ alkyl, verzweigte oder geradkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe ist, und die Wasserstoffatome der Methylen¬ gruppen in R _lf R ₂ und R ₄ ersetzt werden können durch 0 Alkyl (C. bis g)-, 0 Acyl-, O Aryl-, O-Aralkyl- und Alkyl (C. bis C _g ) Gruppen, und in R. zusätzlich durch Halogengruppen, doppelt gebundene Oxogruppen und Hydroxyl¬ gruppen und Z jeweils unabhängig voneinander - O, S oder NH ist, und wenn R. = H, R ₂ H ist und wenn R ₂ = H, R.. H ist und die folgenden Verbindungen ausgenommen sind

Formel (II)

und die folgenden Verbindungen ebenfalls ausgeschlossen sind

lfd. r.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch Arzneimittel ent¬ haltend die Verbindung der Formel (I) , wobei R^ _^ bis R. und Z dieselbe Bedeutung haben wie zuvor beschrieben.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden als Arznei¬ mittel enthaltende Verbindungen Verbindungen der Formel (II)

(II)

v

vom Gamma-Pyron-Typ verwendet, wobei R _χ , R ₂ , R ₅ , X und Y die folgende Bedeutung haben

ERSATZBLATT

Diese Verbindungen können zur Herstellung von Arznei¬ mitteln zur Behandlung von viralen Erkrankungen, bevor¬ zugt von retroviralen Erkrankungen bei Säugern verwendet werde .

Gam a-Pyron-Derivate sind zugänglich ausgehend von Dehy- dracetsäure über 3,5-Dioxo-hexansäuremethylester. Die Dehydracetsäure wird durch entsprechend substituierte Acetessigsäure-Derivate gebildet. Aus Dehydracetsäure wird durch Umsetzung mit Magnesiummethanolat ein ent¬ sprechend substituierter 3,5-Dioxo-hexansäuremethylester gewonnen, welcher weiterhin derivatisiert werden kann, beispielsweise durch Alkylierung an CH-aciden Positionen. Danach schließt sich ein Recyclisierungsschritt an. Vor¬ zugsweise wird als Reagenz DBU zur Cyclisierung einge¬ setzt. Modifizierungen in den Seitenketten führen so zu den entsprechenden Strukturtypen (F. Wangemann, Disser¬ tation Berlin 1989, "Synthese von Gamma-Pyronen aus Podolepis hieracioides) .

Gamma-Pyron-Strukturen ohne Alkoxyfunktion werden erhal¬ ten durch Kondensation von Carbonsäuren oder deren Deri¬ vate (A.N. Sagredos et. al. Liebigs Ann. Chem. 706, 90 bis 94, Band 697, Seiten 111 bis 115). Aus Canadian Journal of Chemistry, .56, 1796-1799 (1978) werden Methoden zur Alkylierung von Pyrononen, die Ausgangsverbindungen für die erfindungsgemäß beanspruchten Strukturen sind, beschrieben.

Aus Tetrahedron lett. 2167 (1976) und beispielsweise J. Org. Chem. 4_3, 4966, 1978 ist die Darstellung von Thio- pyran-4-thio-derivaten beschrieben. G. Voss und H. Gerlach beschreiben in Liebigs Ann. Chem., 1982, Seiten 1466 bis 1477, die Synthese von Stickstoffanalogen Pyronen durch Umsetzung der entsprechenden Pyrone mit Ammoniak in Methanol durch Erwärmen in einem zugeschmolzenem Glas¬ rohr.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) kann auch erfolgen durch Isolation der Verbindung (II) aus Arten

der australischen Podolepispflanze, insbesondere aus Podolepis longipedata A. und aus den Wurzeln der Podolepis rugata sowie aus Podolepis hierakioides. Die Substanzen werden gewonnen durch Extraktion in organischen Lösungs¬ mitteln und anschließender Reinigung und Aufarbeitung des Extraktes mittels Chromatographie. Die entsprechenden Verfahren sind beschrieben in F. Bohlmann et. al., Phyto- chemistry. Vol. 26, Seiten 187 bis 190, 1987 und J. Jakupovic et al. Phytochemistry, Vol. 28, Seiten 3497 bis 3501, 1989.

Die so erhaltenen Substanzen wurden in einem Testsystem auf ihre antivirale Wirkung überprüft. Als Testsystem diente die Bestimmung der Virusreplikation in HlV-infi- zierten Blutzellen. Das System erlaubt, antivirale Sub¬ stanzen zu detektieren, die mit der Virusreplikation und dem Infektionspotential interferieren. Solche Substanzen könnten das Eindringen von Viruspartikeln in das Zell¬ innere verhindern und die in den bereits infizierten Zellen vermehrten Viren könnten so keine neuen Zielzellen mehr finden. Auf diese Art und Weise wäre eine effektive Prophylaxe gegen antivirale Erkrankungen möglich und es könnte eine Therapie eingeleitet werden, die das Ein¬ dringen von Viren in das Zellinnere verhindert. Die Folge ist, daß die Infektion zum Stillstand kommt und das thera¬ peutische Ziel schnell und einfach erreicht wird. Weitere intrazelluläre Angriffsorte für antivirale Wirkstoffe sind denkbar, zum Beispiel das sogenannte Uncoating oder das Ausschleusen infektiöser Virionen.

Das antivirale Testsystem ist so ausgelegt, daß es für das Modellvirus (HIV) sämtliche antiviral wirksamen Sub¬ stanzen anzeigt, ohne im Voraus Kenntnis über deren mole¬ kularen Angriffsort oder Wirkmechanismus zu haben. Die Stärke des Testsystems liegt in seiner Sensitivität,

Spezifität und Breite der möglichen Zielorte für anti¬ virale Substanzen. So zeigt das Testsystem Proteasehemmer ebenso an wie RT-Hemmstoffe oder Blocker der Virusauf¬ nahme durch die Wirtszelle. Auch virus-klassen-übergrei- fende Wirksubstanzen, wie Polyanionen mit ihrem breiten Wirkspektrum werden sicher angezeigt. Die hohe Sensiti- vität wird durch die Verwendung nichttransformierter, humaner peripherer Blutzellen gewährleistet.

Das System ist besonders geeignet zum Aufspüren neuer antiviral wirksamer Stoffklassen mit sogenannten Leit¬ strukturen, d.h. einem Strukturgrundmotiv, dessen che¬ mischen Derivate die pharmakologischen, hier antiviralen, Eigenschaften beeinflussen. Leitstrukturen sind dann die Basis für eine gezielte Synthese dieser Derivate.

Die erfindungsgemäßen Gamma-Pyrone fielen bei diesem Test durch ihre antivirale Wirksamkeit auf. Bei einer Konzen¬ tration von 10 μmol, die weniger als dem zehnten Teil der halbmaximalen cytotoxischen Konzentration entspricht, wurde vier Tage nach einer HIV-Exposition von mensch¬ lichen Lymphocyten eine verminderte HIV-Replikation beob¬ achtet. Damit ist überraschend eine neue antivirale Stoff- klasse entdeckt worden, der die Gamma-Pyrone-Struktur als gemeinsame Strukturmerkmale unterliegt.

Ausfύhrungsbeispiel:

Die Gamma-Pyrone der Tabelle 1 wurden aus australischer Podolepis herakioides durch Extraktion gewonnen und an¬ schließend mittels Chromatographie gereinigt.

TABELLE 1

lfd. Nr. R_ X Aktivität

Tabelle 1 zeigt die gewonnenen Substanzen sowie deren antivirale Aktivität, die wie folgt gemessen wurde:

Eine Substanzinduzierte Hemmung der HIV-Vermehrung in Zellkultur wird durch die quantitative Bestimmung eines viralen Strukturproteins (p24) sowie viraler Nukleinsäure (HIV-RNA) bestimmt. Für die Virusvermehrung findet eine Kultur humaner Lymphocyten Anwendung.

Die zu testende Substanz wird nach Herstellung einer 10 mM Lösung durch serielle 1 : 10 Verdünnungen im Kulturmedium auf eine im vorangehenden Cytotoxizitätstest näherungs¬ weise ermittelte nichttoxische Konzentration eingestellt. Humane Lymphocyten werden aus Spenderblut isoliert. Hierzu werden aus den "buffy coats" der Blutkonserven die Lympho¬ cyten mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnen.

In einem Sicherheitslabor, das den L3-Richtlinien ent¬ spricht, werden die Zellen mit humanem Immundefizienz- Virus (HIV) infiziert. Die infizierten Zellen werden an¬ schließend bei 37*C und einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre enthaltend 5 % C0 ₂ in Gegenwart der zu testen¬ den Substanz für vier Tage inkubiert.

Die Konzentration an HIV-spezifischem Core-Protein p24, das nach Infektion der Lymphocyten von den virusprodu¬ zierenden Zellen in den Kulturüberstand sezerniert wird, wird mit Hilfe eines "Sandwich Elisa" Testes bestimmt. Die Auswertung erfolgt hierbei photometrisch. Aus einer Eichkurve und den erhaltenen Absorptionswerten, die die Kulturen HIV-infizierter Lymphocyten ergeben, die in Gegen¬ wart der zu untersuchenden Substanz gewachsen sind, wird die Konzentration an Protein p24 errechnet. Die substanz¬ induzierte Hemmung der p24 - Produktion wird durch Ver¬ gleich mit einer unbehandelten Kontrollkultur prozentual berechnet.

Die in den infizierten Lymphocyten gebildete HIV-RNA wird durch Nukleinsäurehybridisierung nachgewiesen. Die Aus¬ wertung erfolgt hierbei photometrisch. Aus einer Eich¬ kurve und den erhaltenen Absorptionswerten, die die Kul¬ turen HlV-infizierter Lymphocyten ergeben, die in Gegen¬ wart der zu untersuchenden Substanz gewachsen sind, wird die Konzentration von HIV-RNA errechnet. Die substanz¬ induzierte Hemmung der HIV-RNA-Produktion wird durch Ver¬ gleich mit einer unbehandelten Kontrollkultur prozentual berechnet.

Die Viabilitat der infizierten Zellen wird mit Hilfe der Trypanblau-Methode bestimmt. Infizierte Zellen, die in Gegenwart der zu untersuchenden Substanzen für vier Tage kultiviert wurden, werden mit einer Trypanblaulösung ver¬ setzt. In einer mikroskopischen Analyse wird durch Aus¬ zählen der Anteil blaugefärbter, toter Zellen bestimmt. Die Viabilitat bestimmt sich aus der Differenz von Ge¬ samtzellen und toten Zellen und wird ebenfalls in Prozent angegeben.

Abbildung 1 zeigt die Dosis-Wirkungs-Beziehung für Hem¬ mung des Proteins 24, Hemmung der HIV-RNA und der Viabi¬ litat für die Verbindung 4 aus Tabelle 1.

Die Tabelle 2 zeigt die Wirkung der Verbindungen 3, 4, 6 und 7 gemäß Tabelle 1 gegenüber verschiedenen HlV-Isolaten im Vergleich mit Azidothymidin (AZT) und Tetrahydro-Imida- zol-Benzodiazepin (TIBO) als etablierte Wirkstoffe gegen HIV.

TABELLE 2

Ve__b___dung Könzentr. HIV-1 Standard HIV-1 AZT Resist. HEV-2

(3.Tag,ng p24/ml) (3.Tag,ng p24/ml) (4.Tag,pg RM

Kontrolle 55,7 48,9 333

21,0 0

AZT 43,2 141 47,1 298 47,9 283

42,9 583

ΪIBO 46,8 465 46,2 376 45,7 370

n.d. = nicht bestimmt

Gemessen wurde die Wirksamkeit der in Tabelle 2 angege¬ benen Verbindungen gegen ein HIV-1-Isolat, welches aus einem Patienten isoliert worden war, der 18 Monate mit AZT therapiert worden war. Dieses Isolat weist bei in- vitro-Tests eine deutliche Resistenz gegenüber Hemmstoffen der reversen Transkriptase auf, von denen zwei im vor¬ liegenden Test auch als Referenzsubstanzen mitgeführt wurden, nämlich Azidothy idin (AZT) als Nukleosid-Analogon und Tetrahydro-Imidazol-Benzodiazepin (TIBO) als nicht- Nukleosid-Analogon-Hemmstoff der reversen Transkriptase. Weiterhin wurde die Wirksamkeit dieser Verbindungen gegen¬ über einem HIV-2-Isolat untersucht. Als ReferenzSubstanzen wurden entsprechend AZT und TIBO mitgeführt, wobei TIBO bekanntermaßen eine selektive Wirksamkeit für HIV-1-Iso- late aufweist, wie sich auch aus den Meßdaten ergibt.

Die Tabelle 2 zeigt eindeutig, daß die Verbindungen 3, 4, 6 und 7 gemäß Tabelle 1 sowohl die Virusreplikation in HIV-2 infizierten Zellen als auch in Zellen, die mit einem AZT-resistenten Isolat infiziert wurden, hemmt.