Neuartige genetische Werkzeuge Beschreibung Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft neuartige genetische Werkzeuge für Lac- tobacillus. Dies betrifft insbesondere einen Promotor zur Ex- pression von Proteinen, insbesondere einen Vektor mit einem solchen Promotor. Der Vektor kann auch noch zusätzlich mindes- tens ein Toxin/Antitoxin-System umfassen. Stand der Technik Laktobazillen (Lactobacillus) sind gram-positive, stäbchenför- mige Milchsäurebakterien (LAB), die typischerweise bei Menschen und Tieren als Kommensalen vorkommen. Ihre stressresistenten phänotypischen Eigenschaften ermöglichen ihnen die Besiedlung eines breiten Spektrums von Mikroumgebungen des Wirts, wie Darm, Haut, Vagina, Nasen- und Rachenhöhle. Sie bieten häufig gesundheitliche Vorteile wie entzündungshemmende, antipathogene und immunmodulatorische Aktivität. Aus diesem Grund sind sie eine der größten Klassen von Probiotika und mehrere Arten wer- den klinisch zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten wie Colitis ulcerosa, Mastitis, atopische Dermatitis, bakterielle Vaginose und Parodontitis verwendet. Abgesehen von ihrem ge- sundheitlichen Nutzen sind Laktobazillen auch für zahlreiche Fermentationsprozesse in der Lebensmittelindustrie unerläss- lich, zum Beispiel bei der Herstellung von Joghurt, Käse, Sau- erteigbrot, Bier und Wein. Aufgrund dieser Allgegenwärtigkeit im täglichen Leben besteht ein erhebliches Interesse daran, die Fähigkeiten dieser Bakterien sowohl für medizinische als auch für industrielle Zwecke genetisch zu verbessern und zu erwei- tern. Im medizinischen Bereich werden Laktobazillen als lebende biotherapeutische Produkte (LBPs) entwickelt, die Medikamente direkt am Ort von Krankheiten wie Colitis ulcerosa produzieren und abgeben. Um die Pharmakokinetik und die Besiedlung dieser therapeutischen Bakterien im Körper zu untersuchen, wurden diese Bakterien so manipuliert, dass sie Reporterproteine ex- primieren, die in situ abgebildet werden können. In der Indust- rie werden Laktobazillen als alternative Wirte für die rekombi- nante Expression von E. coli in Betracht gezogen, da sie zwei entscheidende Vorteile bieten: (i) Sie produzieren keine En- dotoxine, und viele Stämme haben den Status "Generally Recog- nized as Safe" (GRAS), was die Gefahr minimiert, dass gerei- nigte therapeutische Proteine toxische Wirkungen beim Menschen hervorrufen und (ii) die Infrastruktur für ihre Kultur ist in der Lebensmittelindustrie bereits gut etabliert und optimiert. Trotz dieses Potenzials sind die wichtigsten Einschränkungen für das Engineering von Lactobacillus der Mangel an gut charak- terisierten genetischen Werkzeugen und das unzureichende Ver- ständnis der biochemischen Wege. Mehr als zwei Jahrzehnte sorg- fältiger Untersuchungen und Screenings bei phylogenetisch nahe- stehenden Bakterien haben eine Handvoll zuverlässiger Werkzeuge für die Verwendung in Lactobacillus hervorgebracht, wie konsti- tutive und induzierbare Promotoren, Operatoren, Replikons, Re- tentionsmodule, Signalpeptide usw. Die meisten dieser Werkzeuge wurden in einigen wenigen Arten entwickelt, die sich für eine gentechnische Veränderung als geeignet erwiesen haben, wobei Lactiplantibacillus plantarum (oder Lactobacillus plantarum) eine der am häufigsten verwendeten Arten ist. Die genomische Integration von Genen wurde bei diesen Bakterien zwar nachge- wiesen, die größte Funktionsvielfalt wurde jedoch mit Hilfe von Plasmiden erreicht. Allerdings sind die verfügbaren, gut cha- rakterisierten genetischen Werkzeuge im Vergleich zum Werkzeug- kasten von E. coli immer noch winzig und müssen erweitert wer- den, um die Art von Kreisläufen zu konstruieren, die für Anwen- dungen in der Medizin- oder Lebensmittelindustrie erforderlich sind. Aufgabe Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, in Lactobacillus Proteine in hoher Ausbeute zu exprimieren. Lösung Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindungen umfassen auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinati- onen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen. Der Klarheit halber werden bestimmte Begriffe, die in der Be- schreibung verwendet werden, wie folgt definiert und beschrie- ben: "Assoziiert mit / operativ verbunden" bezieht sich auf zwei Nukleinsäuren, die physisch oder funktionell miteinander ver- bunden sind. So wird beispielsweise ein Promotor oder eine re- gulatorische DNA-Sequenz als "assoziiert mit" einer DNA-Sequenz bezeichnet, die für RNA oder ein Protein kodiert, wenn die bei- den Sequenzen operativ miteinander verknüpft sind oder so ange- ordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz das Expressi- onsniveau der kodierenden oder strukturellen DNA-Sequenz beein- flusst. Eine "kodierende Sequenz" ist eine Nukleinsäuresequenz, die in RNA wie mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA oder antisense RNA transkribiert wird. Vorzugsweise wird die RNA dann in einem Or- ganismus übersetzt, um ein Protein herzustellen. "Expressionskassette" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidse- quenz in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern, und die einen Promotor umfasst, der funktionell mit der interessierenden Nuk- leotidsequenz verbunden ist, die funktionell mit Terminierungs- signalen verbunden ist. Außerdem umfasst sie in der Regel Se- quenzen, die für eine ordnungsgemäße Translation der Nukleo- tidsequenz erforderlich sind. Die Expressionskassette, die die interessierende Nukleotidsequenz enthält, kann mindestens einen ihrer Bestandteile aufweisen, der im Vergleich zu mindestens einem ihrer anderen Bestandteile heterolog ist. Bei der Expres- sionskassette kann es sich auch um eine natürlich vorkommende Kassette handeln, die jedoch in einer für die heterologe Ex- pression geeigneten rekombinanten Form erhalten wurde. In der Regel ist die Expressionskassette jedoch heterolog in Bezug auf den Wirt, d. h., die bestimmte Nukleinsäuresequenz der Expres- sionskassette kommt in der Wirtszelle nicht natürlich vor und muss durch ein Transformationsereignis in die Wirtszelle oder einen Vorfahren der Wirtszelle eingeführt worden sein. Die Ex- pression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors erfolgen, der die Transkription nur dann auslöst, wenn die Wirtszelle einem bestimmten externen Stimulus ausgesetzt ist. Außerdem umfasst die Expressionskassette bevorzugt mindestens eine Ribosomenbindungsstelle. Diese ist bevorzugt in 5‘-3‘- Richtung zwischen Promotor und zu exprimierendem Protein ange- ordnet, bzw. Startkodon (ATG) des zu exprimierenden Proteins. Eine Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz von Inte- resse enthält, kann chimär sein, d. h., dass mindestens einer ihrer Bestandteile heterolog in Bezug auf mindestens einen ih- rer anderen Bestandteile ist. Eine Expressionskassette kann auch einen nativen Promotor enthalten, der das native Gen an- treibt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die für die heterologe Expression geeignet ist. Eine solche Verwen- dung einer Expressionskassette bewirkt, dass sie in der Zelle, in die sie eingeführt wurde, nicht natürlich vorkommt. Eine Expressionskassette kann auch optional eine transkriptio- nelle und/oder translationale Terminationsregion (d.h. Termina- tionsregion) enthalten, die in Lactobacillus funktionell ist. Für die Verwendung in Expressionskassetten steht eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren zur Verfügung, die für die Been- digung der Transkription nach der heterologen Nukleotidsequenz von Interesse und die korrekte mRNA-Polyadenylierung verant- wortlich sind. Die Terminationsregion kann für die Transkripti- onsinitiationsregion nativ sein, sie kann für die operativ ver- knüpfte Nukleotidsequenz von Interesse nativ sein, sie kann für Lactobacillus nativ sein, oder sie kann aus einer anderen Quelle stammen (d. h. fremd oder heterolog für den Promotor, die Nukleotidsequenz von Interesse, Lactobacillus oder eine be- liebige Kombination davon). Darüber hinaus kann auch der native Transkriptionsterminator einer kodierenden Sequenz verwendet werden. Jeder verfügbare Terminator, von dem bekannt ist, dass er in Lactobacillus funktioniert, kann im Rahmen der vorliegen- den Erfindung verwendet werden. Der Begriff "Expression", wenn er in Bezug auf ein Polynukleo- tid, wie ein Gen, einen ORF oder einen Teil davon, oder ein Transgen in Lactobacillus verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess der Umwandlung der in einem Gen kodierten genetischen Information in RNA (z. B. mRNA, rRNA, tRNA oder snRNA) durch "Transkription" des Gens (d. h. durch die enzymatische Wirkung einer RNA-Polymerase) und gegebenenfalls durch "Translation" der mRNA in Protein (z. B. wenn ein Gen für ein Protein ko- diert). Die Genexpression kann in vielen Phasen des Prozesses reguliert werden. Im Falle von Antisense- bzw. dsRNA-Konstruk- ten kann sich die Expression beispielsweise nur auf die Tran- skription der Antisense-RNA oder der dsRNA beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht sich der Begriff "Expression" auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense-RNA (mRNA) o- der funktioneller RNA. Der Begriff "Expression" kann sich auch auf die Produktion von Proteinen beziehen. Ein "Gen" ist eine definierte Region innerhalb eines Genoms, die eine kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst und typischer- weise auch andere, vor allem regulatorische Nukleinsäuren ent- hält, die für die Kontrolle der Expression, d. h. der Tran- skription und Translation, des kodierenden Teils verantwortlich sind. Ein Gen kann auch andere 5'- und 3'-untranslatierte Se- quenzen und Terminationssequenzen enthalten. Weitere Elemente, die vorhanden sein können, sind z. B. Introns. Die regulatori- sche Nukleinsäuresequenz des Gens ist normalerweise nicht mit der in der Natur vorkommenden zugehörigen Nukleinsäuresequenz operativ verbunden und wäre somit ein chimäres Gen. Eine "heterologe" Nukleinsäuresequenz oder ein "heterologes" Nukleinsäuremolekül ist eine Nukleinsäuresequenz oder ein Nuk- leinsäuremolekül, die bzw. das nicht auf natürliche Weise mit der Wirtszelle, in die sie bzw. es eingebracht wird, assoziiert ist. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz oder ein heterologes Nukleinsäuremolekül kann eine chimäre Sequenz, wie z. B. eine chimäre Expressionskassette, umfassen, bei der der Promotor und die kodierende Region aus mehreren Ausgangsorganismen stammen. Bei der Promotorsequenz kann es sich um eine konstitutive Pro- motorsequenz, eine chemisch induzierbare Promotorsequenz, eine temperaturinduzierbare Promotorsequenz oder eine stressindu- zierbare Promotorsequenz handeln. Heterolog wird auch als endo- gen bezeichnet. Eine "homologe" Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäurese- quenz, die von Natur aus mit einer Wirtszelle assoziiert ist, in die sie eingeführt wird. "Homologe Rekombination" ist der wechselseitige Austausch von Nukleinsäurefragmenten zwischen homologen Nukleinsäuremolekü- len. "Identität" oder "prozentuale Identität" bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäure- oder Pro- teinsequenzen. Beim Sequenzvergleich dient in der Regel eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen vergli- chen werden. Bei der Verwendung eines Sequenzvergleichsalgo- rithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, gegebenenfalls werden Teilsequenzkoordinaten ange- geben und Programmparameter für den Sequenzalgorithmus festge- legt. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die pro- zentuale Sequenzidentität für die Testsequenz(en) relativ zur Referenzsequenz auf der Grundlage der angegebenen Programmpara- meter. Der Ausdruck "im Wesentlichen identisch" bezieht sich im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäuren oder zwei Aminosäuresequen- zen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Teilsequenzen, die min- destens etwa 50 % Nukleotid- oder Aminosäurerestidentität auf- weisen, wenn sie verglichen und auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden, wie mit einem der folgenden Sequenzver- gleichsalgorithmen oder durch visuelle Inspektion gemessen. In bestimmten Ausführungsformen weisen im Wesentlichen identische Sequenzen mindestens etwa 60 % oder mindestens etwa 70 % oder mindestens etwa 80 % oder mindestens etwa 85 % oder sogar min- destens etwa 90 % oder 95 % Nukleotid- oder Aminosäurerestiden- tität auf. In bestimmten Ausführungsformen besteht wesentliche Identität über einen Bereich der Sequenzen, der mindestens etwa 50 Reste lang ist, oder über einen Bereich von mindestens etwa 100 Resten, oder die Sequenzen sind über mindestens etwa 150 Reste im Wesentlichen identisch. In weiteren Ausführungsformen sind die Sequenzen im Wesentlichen identisch, wenn sie über die gesamte Länge der kodierenden Regionen identisch sind. Das Vor- stehende gilt auch für regulatorische Sequenzen, wie Promoto- ren, dann bezogen auf ihre Nukleotidsequenz. Eine optimale Ausrichtung der zu vergleichenden Sequenzen kann z. B. mit dem lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie-A- lignment-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch die Methode der Ähnlichkeitssuche von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch computergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Pack- age, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o- der durch visuelle Inspektion erfolgen. Ein Beispiel für einen Algorithmus, der sich zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit eignet, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) erwähnt wird. Die Software zur Durch- führung von BLAST-Analysen ist über das National Center for Bi- otechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffent- lich zugänglich. Bei diesem Algorithmus werden zunächst hoch bewertete Sequenzpaare (HSPs) ermittelt, indem kurze Wörter der Länge W in der Abfragesequenz identifiziert werden, die entwe- der mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz übereinstimmen oder einen positiv bewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn sie mit diesem Wort ausgerichtet werden. T wird als Schwellenwert für den Nachbarschaftswortwert bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese anfänglichen Worttreffer in der Nachbarschaft dienen als Startpunkt für die Suche nach längeren HSPs, die diese Wörter enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, wie der kumulative Alignment Score erhöht werden kann. Die ku- mulativen Ergebnisse werden für Nukleotidsequenzen mit den Pa- rametern M (Belohnungswert für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafwert für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um die kumulative Bewertung zu be- rechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird gestoppt, wenn der kumulative Alignment-Score um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abweicht, der kumulative Score aufgrund der Ansammlung eines oder mehrerer negativ be- werteter Rest-Alignments auf Null oder darunter geht oder das Ende einer der beiden Sequenzen erreicht wird. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Alignments. Das Programm BLASTN (für Nukle- otidsequenzen) verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff von 100, M=5, N=-4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequen- zen verwendet das BLASTP-Programm standardmäßig eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62- Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)). Neben der Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähn- lichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Ein Maß für die Ähnlichkeit, das der BLAST-Algorithmus liefert, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auf- treten würde. Eine Testnukleinsäuresequenz gilt beispielsweise als ähnlich zu einer Referenzsequenz, wenn die kleinste Summen- wahrscheinlichkeit bei einem Vergleich der Testnukleinsäurese- quenz mit der Referenznukleinsäuresequenz weniger als etwa 0,1, vorzugsweise weniger als etwa 0,01 und besonders bevorzugt we- niger als etwa 0,001 beträgt. Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren im Wesentli- chen identisch sind, ist die Tatsache, dass die beiden Moleküle unter strengen Bedingungen aneinander hybridisieren. Der Aus- druck "spezifisch hybridisieren mit" bezieht sich auf die Bin- dung, Duplexbildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer bestimmten Nukleotidsequenz unter strengen Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. gesamter zellulärer) DNA oder RNA vorhanden ist. "Bindung(en) im Wesent- lichen" bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwi- schen einer Sondennukleinsäure und einer Zielnukleinsäure und umfasst geringfügige Fehlpaarungen, die durch Verringerung der Stringenz der Hybridisierungsmedien ausgeglichen werden können, um den gewünschten Nachweis der Zielnukleinsäuresequenz zu er- reichen. "Strenge Hybridisierungsbedingungen" und "strenge Hybridisie- rungswaschbedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybri- disierungsexperimenten wie Southern- und Northern-Hybridisie- rungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich in verschie- denen Umgebungsparametern. Längere Sequenzen hybridisieren spe- zifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Over- view of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Im Allgemeinen werden sehr strenge Hybridisierungs- und Waschbedingungen gewählt, die etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezi- fische Sequenz bei einer bestimmten Ionenstärke und einem be- stimmten pH-Wert liegen. Typischerweise hybridisiert eine Sonde unter "strengen Bedingungen" mit ihrer Zielsubsequenz, aber nicht mit anderen Sequenzen. Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50 % der Zielsequenz mit einer perfekt angepassten Sonde hybridisieren. Sehr strenge Bedingun- gen werden so gewählt, dass sie dem Tm-Wert für eine bestimmte Sonde entsprechen. Ein Beispiel für strenge Hybridisierungsbe- dingungen für die Hybridisierung von komplementären Nukleinsäu- ren, die mehr als 100 komplementäre Reste auf einem Filter in einem Southern oder Northern Blot aufweisen, ist 50% Formamid mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel für sehr strenge Waschbedingun- gen ist 0,15M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten. Ein Beispiel für strenge Waschbedingungen ist ein 0,2-facher SSC-Waschlauf bei 65°C für 15 Minuten (siehe J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), für eine Beschrei- bung des SSC-Puffers). Häufig geht einem hochstringenten Wasch- vorgang ein niedrigstringenter Waschvorgang voraus, um das Sig- nal der Hintergrundsonde zu entfernen. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit mittlerer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 1x SSC bei 45°C für 15 Minuten. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit geringer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 4-6x SSC bei 40°C für 15 Minuten. Für kurze Sonden (z. B. etwa 10 bis 50 Nukleotide) umfassen strenge Bedingungen typischerweise Salz- konzentrationen von weniger als etwa 1,0 M Na-Ionen, typischer- weise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt typi- scherweise mindestens etwa 30°C. Strenge Bedingungen können auch durch die Zugabe von Destabilisierungsmitteln wie Formamid erreicht werden. Im Allgemeinen deutet ein Signal-Rausch-Ver- hältnis von 2x (oder höher) als bei einer nicht verwandten Sonde in dem jeweiligen Hybridisierungsassay auf den Nachweis einer spezifischen Hybridisierung hin. Nukleinsäuren, die unter strengen Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind den- noch im Wesentlichen identisch, wenn die Proteine, für die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies ist z. B. der Fall, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degenerierung, die der genetische Code zulässt, erstellt wird. Nachstehend sind Beispiele für Hybridisierungs-/Waschbedingun- gen aufgeführt, die zur Klonierung homologer Nukleotidsequenzen verwendet werden können, die im Wesentlichen mit den Referenz- nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung identisch sind: Eine Referenznukleotidsequenz hybridisiert vorzugsweise mit der Referenznukleotidsequenz in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO ₄ , 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 2X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO ₄ , 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, insbesondere in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO ₄ , 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,5X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, vor- zugsweise in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO ₄ , 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, noch bevorzugter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO ₄ , 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren oder Proteine im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das von der ersten Nukleinsäure kodierte Protein mit dem von der zweiten Nuklein- säure kodierten Protein immunologisch kreuzreaktiv ist oder spezifisch daran bindet. So ist ein Protein typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Protein, wenn sich die beiden Proteine nur durch konservative Substitutionen unter- scheiden. Eine Nukleinsäuresequenz ist "isokodierend" mit einer Referenz- Nukleinsäuresequenz, wenn die Nukleinsäuresequenz für ein Po- lypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz hat wie das Polypeptid, für das die Referenz-Nukleinsäuresequenz kodiert. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül oder ein isoliertes Toxin ist ein Nukleinsäuremolekül oder Toxin, das durch Menschenhand außerhalb seiner natürlichen Umgebung existiert und daher kein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Toxin kann in gereinigter Form vorliegen oder in einer nicht natürlichen Umgebung existieren, z. B. in einer rekombinanten mikrobiellen Zelle. Ein "Nukleinsäuremolekül" oder eine "Nukleinsäuresequenz" ist ein Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, das aus einer beliebigen Quelle isoliert werden kann. Im Zusam- menhang mit der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremo- lekül typischerweise ein DNA-Segment. In einigen Ausführungs- formen sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle iso- lierte Nukleinsäuremoleküle. Die Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" werden hier austauschbar verwendet. Der Begriff "kodonoptimierte" Sequenz bezeichnet die Nukleo- tidsequenz eines rekombinanten, transgenen oder synthetischen Polynukleotids, bei dem die Kodons so gewählt werden, dass sie den besonderen Kodon-Bias widerspiegeln, den eine Wirtszelle haben kann. Dies geschieht so, dass die Aminosäuresequenz des durch das kodonoptimierte Polynukleotid kodierten Polypeptids erhalten bleibt. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Nukleotidsequenz des rekombinanten DNA-Konstrukts eine Sequenz, die für die Zelle (z. B. eine Tier-, Pflanzen- oder Pilzzelle), in der das Konstrukt exprimiert werden soll, kodonoptimiert wurde. Ein "Promotor" ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz strom- aufwärts der kodierenden Region, die die Bindungsstelle für die RNA-Polymerase enthält und die Transkription der DNA einleitet. Die Promotorregion kann auch andere Elemente enthalten, die als Regulatoren der Genexpression wirken. Als "regulatorische Elemente" werden Sequenzen bezeichnet, die an der Kontrolle der Expression einer Nukleotidsequenz betei- ligt sind. Regulatorische Elemente umfassen einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz ver- bunden ist, sowie optional Terminierungssignale. Sie umfassen in der Regel auch Sequenzen, die für eine ordnungsgemäße Trans- lation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. "Transformation" ist ein Verfahren zur Einführung heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen Organismus. Insbe- sondere bedeutet "Transformation" die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom (Kern oder Plastid) eines Organismus von Interesse. "Transformiert / transgen / rekombinant" bezieht sich auf einen Wirtsorganismus wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nuklein- säuremolekül kann stabil in das Genom des Wirtsorganismus inte- griert sein oder auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann selbstreplizierend sein. Unter transformierten Zellen, Geweben oder Pflanzen sind nicht nur die Endprodukte eines Transformationsprozesses zu verstehen, sondern auch deren transgene Nachkommenschaft. Ein "nicht transformierter", "nicht transgener" oder "nicht rekom- binanter" Wirt bezieht sich auf einen Wildtyp-Organismus, z. B. ein Bakterium, den das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält. Nukleotide werden durch ihre Basen mit den folgenden Stan- dardabkürzungen angegeben: Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G). Die Aminosäuren werden ebenfalls mit den fol- genden Standardabkürzungen angegeben: Alanin (Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Cystein (Cys; C), Glutamin (Gln; Q), Glutaminsäure (Glu; E), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; 1), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V). Die Aufgabe wird unter anderem durch Expressionskassette zur Expression in Lactobacillus umfassend einen Promotor in opera- tiver Verknüpfung mit einer Nukleinsäure, welche mindestens ein Protein kodiert, wobei der Promotor im Wesentlichen identisch mit dem P _tlpA -Promotor ist, bevorzugt mit einer Sequenz, welche im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ID Nr. 1 ist, gelöst. Bevorzugt weist der Promotor eine Identität von mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindes- tens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder 100 % Identität mit der Sequenz der SEQ-ID Nr. 1 auf. Der Promotor ist dabei ein heterologer Promotor, bevorzugt aus Salmonella typhimurium. Überraschenderweise wurde gefunden, dass dieser Promotor in Lactobacillus eine sehr hohe Expression des operativ verknüpf- ten Proteins ermöglicht. Die Expression ist dabei insbesondere in dem Bereich bei Temperaturen zwischen 31 °C und 45 °C ver- stärkt, insbesondere in einem Temperaturbereich von 37 bis 43 °C. Überraschenderweise wurde gefunden, dass der P _tlpA -Promotor auch in Abwesenheit seines zugehörigen Repressors eine sehr starke Expressions ermöglicht, insbesondere im bevorzugten Temperatur- bereich. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Expressions- kassette mindestens eine mit dem Promotor operativ verknüpfte Ribosomenbindungsstelle, welche bevorzugt zwischen Promotor und kodiertem Protein angeordnet ist. In einer bevorzugten Ausfüh- rungsform beträgt der Abstand zwischen Ribosomenschnittstelle und Startkodon des kodierten Proteins mindestens 8 Basenpaare, insbesondere mindestens 9 Basenpaare, bevorzugt von 9 bis 24 Basenpaare, insbesondere 9 bis 15 Basenpaare. Die Erfindung betrifft außerdem einen Vektor, insbesondere ein Plasmid, umfassend die Expressionskassette. Es kann sich dabei um beliebige Vektoren handeln, welche für Lactobacillus geeignet sind. Die Vektoren können noch weitere regulatorische Elemente umfas- sen. Unter Lactobacillus im Sinne der Anmeldung wird bevorzugt ein Bakterium der Ordnung der Milchsäurebakterien (Lactobacilla- les), bevorzugt der Familie Lactobacillaceae verstanden, beson- ders bevorzugt der Gattung Lactobacillus, Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus. Bevorzugt sind dabei die Arten Lactobacillus reuteri, Lactoba- cillus paracasei (Lacticaseibacillus paracasei), Lactobacillus plantarum (Lactiplantibacillus plantarum), Lactobacillus john- sonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lac- tobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lacticaseibacillus casei), Lactococcus lactis, bevorzugt Lactobacillus plantarum (Lactiplantipacillus plantarum), besonders bevorzugt Lactoba- cillus plantarum WCFS1 (Lactiplantibacillus plantarum WCFS1). Das von der Nukleinsäure kodierte Protein kann ein zu Lactoba- cillus homologes oder heterologes Protein sein, bevorzugt ein heterologes Protein. Das Protein kann entsprechend der Verwendung des Lactobacillus angepasst werden. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend die mindestens eine Expressionskassette. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Expressionskassette. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens einen Vektor umfassend die mindestens eine Expressi- onskassette. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskas- sette mit mindestens einem Toxin/Antitoxin-System operativ ver- knüpft. Dies bedeutet, dass zusätzlich zur Expressionskassette mindestens ein Toxin und mindestens ein Antitoxin exprimiert werden kann. Solche Systeme sind aus der Antibiotikum-freien genetischen Stabilisierung bekannt. Dabei wird bei der Expres- sion eines Proteins auch ein Toxin und ein zugehöriges Antito- xin exprimiert. Das Toxin bewirkt dabei in der Regel eine Wachstumshemmung des Lactobacillus. Das Antitoxin neutralisiert dabei das Toxin, wobei das Toxin langsamer abgebaut wird, als das Antitoxin. Wenn bei einer Zellteilung eine Zelle ohne das Antitoxin-Gen entsteht, wird sie durch das Toxin abgetötet. Diese Systeme werden daher bevorzugt zur Generhaltung, insbe- sondere Plasmiderhaltung, in Zellen über mehrere Generationen eingesetzt. Da sie keine Antibiotika dafür benötigen, sind sie geeignet auch in lebenden Systemen, wie z. B. dem Magen-Darm- Trakt, eingesetzt zu werden. Das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System kann homolog oder heterolog sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System auf dem gleichen Vektor wie die Expres- sionskassette angeordnet. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskas- sette mit mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, bevorzugt mindestens zwei unterschiedlichen Toxin/Antitoxin-Systemen, operativ verknüpft. Im Falle eines Vektors sind diese Elemente auf dem Vektor angeordnet. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Toxin/Antitoxin- System mit einem Promotor verknüpft, bevorzugt einem anderen Promotor, als der Promotor der Expressionskassette. Wichtig ist nur, dass der Promotor mindestens auch aktiv ist, wenn der Pro- motor der Expressionskassette aktiviert wird. Bevorzugt handelt es sich um einen konstitutiven Promotor, welcher nicht von ei- nem externen Stimulus geschaltet wird. Dadurch ist diese Plas- midretention immer aktiv, wenn das Plasmid in der Zelle ist. In diesem Fall kann „operativ verknüpft“ auch bedeuten, dass die Expressionskassette und die TA-Systeme auf dem gleichen Vektor angeordnet sind und die Plasmidretention durch das Toxin/Anti- toxin-System die operative Verknüpfung darstellt. Es sind viele Toxin/Antitoxin-Systeme bekannt. Es werden verschiedene Typen von solchen Systemen unterschieden (Singh G. et al. Current Research in Microbial Sciences 2, 2021, 100047, Bacterial toxin-antitoxin modules: classifica- tion, functions, and association with persistence). Bei Typ-I-TA-Systemen ist das Antitoxin eine antisense RNA, welche die Translation der mRNA der Toxins inhibiert. Ein Bei- spiel dafür ist das hok-sok-Modul (Gerdes, K., Bech, F.W., Jørgensen, S.T., Løbner-Olesen, A., Rasmussen, P.B., Atlung, T., Boe, L., Karlstrom, O., Molin, S., von Meyenburg, K., 1986. Mechanism of postsegregational killing by the hok gene product of the parB system of plasmid R1 and its homology with the relF gene product of the E.coli relB operon. EMBO J 5 (8), 2023– 2029.). Bei Typ-II-TA-Systemen sind Toxin und Antitoxin Prote- ine, welche miteinander einen Komplex bilden. Viele der Toxine sind dabei Endoribonucleasen oder Inhibitoren der DNA Gyrase. Bei einem Typ-III-TA-System ist das Antitoxin eine RNA, welche direkt mit dem Toxin-Protein interagiert. Bei einem Typ-IV-TA-System sind Antitoxin und Toxin proteine, welche nicht direkt miteinander interagieren, sondern kompeti- tiv an ein Protein binden. Bei einem Typ-V-TA-System ist das Antitoxin eine Endoribonukle- ase gegen die mRNA des Toxins. Bei einem Typ-VI-TA-System hemmt das Toxin die Replikation, während das Antitoxin die Zersetzung des Toxins verursacht. Bei einem Typ-VII-TA-System modifiziert das Antitoxin das To- xin. Das TA-System kann ein System vom Typ I, Typ II, Typ III, Typ IV, Typ V oder Typ VI sein. Beispiele für Typ-I-TA-Systeme sind Hok und Sok, Fst und RNAII, TisB und IstR, LdrB und RdlD, FlmA und FlmB, lbs und Sib, TxpA/BmT und RatA, SymE und SymR, and XXCV2162 und ptaRNAl. Beispiele für Typ-II-TA-Systeme sind CcdB und CcdA, ParE und ParD, MaxF und MazE, yafO und yafN, HicA und HicB, Kid und Kis, Zeta und Epsilon, DarT und DarG, Txe und Axe, YafQ und DinJ, HigB und HigA, HipA und HipB, PhD und Doc, RelB und RelE, VapB und VapC, RnlA und RnlB, MqsR und MqsA. Ein Beispiel für ein Typ-III-TA-System ist ToxN und Toxl. Ein Beispiel für ein Typ-IV-TA-System ist Ein Beispiel für ein Typ-V-TA-System ist GoT and GoS. Ein Beispiel für ein Typ-VI-TA-System ist SocA and SocB. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System ein Typ-II-TA-System, bevorzugt ausge- wählt aus der Gruppe umfassend Txe (SEQ ID Nr. 8) / Axe (SEQ ID Nr. 9), YafQ (SEQ ID Nr. 10) / DinJ (SEQ ID Nr. 11), HicA (SEQ ID Nr. 12) / HicB (SEQ ID Nr. 13) , HigB (SEQ ID Nr. 14) / HigA (SEQ ID Nr. 15) und MazF (SEQ ID Nr. 16) / MazE (SEQ ID Nr. 17). Die Sequenzen sind bevorzugt benachbart angeordnet, wobei sie sich auch überlappen können. Ein solches Toxin/Antitoxin-System kann dabei die Retention ei- nes Plasmids über mehrere Generationen von Lactobacillus erhö- hen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die An- wesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, insbe- sondere zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, ganz besonders zwei ver- schiedene Toxin/Antitoxin-Systemen, die Retention deutlich ver- bessert wird. Bevorzugt ist eine Retention mindestens 15 % nach 100 Generati- onen, insbesondere mindestens 20 %. Bei Anwesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist eine Retention von mindestens 40 %, bevorzugt über 50 % nach 100 Generationen, bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform erreicht das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System einen G ₅₀ -Wert von mindestens 50, insbesondere mindestens 60. Dabei ist der G ₅₀ -Wert die Zahl der Generationen bis der Anteil an Zellen mit Plasmid auf unter 50 % fällt. Im Falle von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist ein G ₅₀ -Wert von über 100 bevorzugt. Diese Retentionen sind zwar geringer, als bei der Retention un- ter dem Einfluss von Antibiotika. Allerdings kommen diese Sys- teme ohne externe Zugabe von Antibiotika aus. Außerdem führt der Plasmidverlust zum Entstehen eines natürlichen Organismus ohne genetische Modifikation. Ein Lactobacillus mit einem sol- chen Vektor kann daher auch als temporärer genmodifizierter Or- ganismus (GMO) bezeichnet werden. Im Laufe der Generationen verliert dieser Organismus die genetische Modifikation. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn die Lactobacillus im medi- zinischen oder humanen Umfeld eingesetzt werden sollen. Der Vektor kann noch weitere regulatorische Elemente enthalten, beispielsweise Resistenzen von Antibiotika, welche die Herstel- lung vereinfachen. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungs- gemäßen Promotors der Expressionskassette in Lactobacillus. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungs- gemäßen Vektors in Lactobacillus, insbesondere in Lactobacillus plantarum. Gerade die verbesserte Expression des Proteins durch den erfin- dungsgemäßen Promotor ermöglicht viele neue Anwendungen. So er- laubt die hohe Expression auch die Detektion von exprimierten fluoreszierenden Proteinen in vivo, was bei den bekannten Pro- motoren aufgrund der geringen Expression nur schlecht möglich war. Dadurch kann der Promotor besser bei der Analyse und Diag- nose eingesetzt werden. Materialien und Methoden Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfol- genden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweili- gen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch darge- stellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeich- nen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt: Fig. 1 A) Fluoreszenzmikroskopie der P _tlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1, kultiviert bei 31°C und 39°C für 18 h. Skalenbalken = 10 µm. B) Durchflusszytometrische Analyse der P _tlpA , P ₂₃ ,P ₄₈ , P _spp und P _Tuf Promotor-gesteuerten mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C. C) Fluoreszenzspektroskopische Analyse der durch den P _tlpA , P ₂₃ , P ₄₈ , P _spp und P _Tuf Promotor gesteuerten mCherry-Expression nach 18 Stunden Inkubation bei Tem- peraturen von 31°C bis 41°C. D) Messung der Wachstums- rate (OD ₆₀₀ ) der Kontrolle (leerer Vektor) und der P _tlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 für 18 Stunden bei 37°C. In C und D entsprechen die Linien dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten und die schwachen Streifen der Standardabweichung; Fig. 2 A) Schematische Darstellung der direkten Klonierung der verschiedenen Toxin/Antitoxin-Genmodule in das Plasmid mit P _tlpA gesteuerter mCherry-Expression. B) Durchflusszytometrisches Histogramm des Stammes mit einem Plasmid, das kein TA-Modul enthält, nach 50 Ge- nerationen serieller Passage in Abwesenheit von Anti- biotika. Das rechte Kästchen entspricht der Bakterien- population, die das Plasmid enthält, und das linke Kästchen der Bakterienpopulation ohne das Plasmid in Abwesenheit von Selektionsdruck. C) Grafische Darstel- lung des Ausmaßes der Plasmid-Retention durch die TA- Module in L. plantarum WCFS1 für 100 Generationen im Vergleich zu ohne TA-System (No TA) oder antibioti- scher Kontrolle (Antibiotic). Die Linien entsprechen dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten, die schwachen Streifen sind die Standardabweichung; Die Reihenfolge der Messungen von oben nach unten ist: An- tibiotic, Combo, YafQ/DinJ; HicA/HicB, MazF/MazE, HigB/HigA, Txe/Axe, No TA); Fig. 3 A) Phylogenetischer Baum, der die Abstände zwischen den Arten aufzeigt, von denen verschiedene genetische Teile in L. plantarum getestet wurden. Die blauen Mar- kierungen entsprechen den Bakterien, von denen in die- ser Studie Promotoren adaptiert wurden, und die oran- gefarbenen Markierungen entsprechen den Bakterien, von denen TA-Systeme adaptiert wurden. L. plantarum WCFS1 ist grün markiert, da sowohl Promotoren als auch TA- Systeme von diesem Bakterium adaptiert wurden. B) Ho- mologieanalyse von σ70 RpoD-Genen aus L. plantarum, E. coli und S. typhimurium. Höhe und Helligkeit der gel- ben Balken zeigen an, inwieweit einzelne Reste über alle 3 Bakterien hinweg konserviert sind; Fig. 4 G50 Werte der verschiedenen TA-Systeme (No TA: kein TA-System, Combo: 2 TA-Systeme); und Fig. 5 A) Durchflusszytometrische Analyse der P _R , P _L und P _TlpA promotorkodierten mcherry-Konstrukte in L. plantarum WCFS1 nach 18 h Inkubation bei 37°C. B) Fluoreszenz- spektroskopische Analyse der P _R , P _L und P _TlpA promotor- kodierten mcherry-Konstrukte nach 18-stündiger Inkuba- tion bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wiederholun- gen. C) Fold Change (n-fache Zunahme) der auf dem P _TlpA Promotor basierenden mcherry-Expression im Vergleich zu den PR und PL Promotoren bei 37°C. D) RFU-Plot der auf P _TlpA und P _TlpA39 basierenden mcherry-Expression nach 18-stündiger Inkubation bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten entsprechen drei unabhängig voneinander durchgeführten biologischen Replikaten; Fig. 6 A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von P _TlpA , P ₂₃ , P ₄₈ , P _spp , P _Tuf kodierten mcherry-Konstrukten und lee- ren Vektorkonstrukten in L. plantarum WCFS1, kulti- viert bei 37°C für 18 h (Maßstab = 10µm). B) Fold Change der P _TlpA , P ₂₃ , P ₄₈ und P _spp kodierten mcherry- Konstrukte in Bezug auf die P _Tuf Promotor-basierte mcherry-Expression bei 31°C bzw. 39°C. Die Daten be- ziehen sich auf drei unabhängig voneinander durchge- führte biologische Wiederholungen; Fig. 7 A) RFU-Plot von P ₂₃ , P ₄₈ und P _Tuf kodierten mcherry- Konstrukten, die eine verstärkte Fluoreszenzexpression im Gegensatz zu der auf P _spp basierenden Proteinexpres- sion innerhalb der Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C zeigen. Die Daten beziehen sich auf drei unabhän- gig voneinander durchgeführte biologische Wiederholun- gen. B) Fold Change der P _TlpA Promotor-basierten mcherry-Expression mit 9 bp Spacer (zwischen RBS und Startcodon) im Vergleich zum P _TlpA -6 bp Spacer-Kon- strukt; Fig. 8 A) Durchflusszytometrie-Plots, die zeigen, dass Stämme mit P ₄₈ -getriebener mCherry-Expression relativ ge- ringe Intensitäten erzeugen, wobei sich ein Teil der Population mit dem Signal überschneidet, das von Bak- terien stammt, die keine fluoreszierenden Proteine ex- primieren (Kontrolle). Im Vergleich dazu ist das Sig- nal von P _tlpA deutlich von dem der Kontrolle abge- grenzt. B) Agarplattenbasierte Analyse der Plasmid-Re- tention, die von den verschiedenen TA-Systemen bereit- gestellt wird. Die Gesamtzahl der Kolonien kann aus den Hellfeldbildern (obere Reihe) bestimmt werden, und die in den Fluoreszenzbildern sichtbaren Kolonien (un- tere Reihe) stellen die Plasmid-enthaltenden Bakterien dar; Fig. 9 Messung der Wachstumsrate (OD ₆₀₀ ) von P _tlpA -mcherry- Konstrukten in Kombination mit den TA-Modulen im Ver- gleich zu dem P _tlpA -mcherry-Konstrukt, das in Abwesen- heit (ohne TA) und in Anwesenheit (Antibiotikum) des Selektionsdrucks 18 Stunden lang bei 37°C gewachsen ist. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wie- derholungen und die schwachen Banden sind die jeweili- gen Standardabweichungen (No TA: kein TA-System; Combo: 2 TA-Systeme; Antibiotic: Anwesenheit Antibio- tikum); Fig. 10 Erhalt unterschiedlicher Plasmide unter antibiotischer Kontrolle (A) und unter Toxin/Antitoxin-Kontrolle (B) (Combo: 2 TA-Systeme); Fig. 11 Schematische Darstellung des Vektors mit Replikations- beginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; Toxin/Anti- toxin; Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren; Stämme, Medien und Plasmide L. plantarum WCFS1 (ATCC Nummer BAA-793) wurde als Elternstamm für die Charakterisierung der Promotorstärke und der Plasmidre- tention verwendet. Der Stamm wurde in den Medien von De Man, Rogosa und Sharpe (MRS) gehalten. Die Kulturmedien, Antibiotika und ergänzenden Reagenzien wurden von der Carl Roth GmbH, Deutschland, bezogen. Das Nährmedium wurde mit 10 μg/ml Eryth- romycin ergänzt, um die manipulierten L. plantarum WCFS1-Stämme zu kultivieren. Die in dieser Studie verwendeten Plasmide pSIP403 und pLp_3050sNuc wurden von Prof. Lars Axelsson (Addgene Plasmid # 122028) (Sørvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versa- tile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) und Prof. Geir Mathiesen (Addgene-Plasmid Nr. 122030) (Mathiesen G, Sveen A, Brurberg MB, Fredriksen L, Axelsson L, Eijsink VG. Ge- nome-wide analysis of signal peptide functionality in Lactoba- cillus plantarum WCFS1. BMC genomics. 2009;10(1):1-13) bezie- hungsweise das Plasmid pTlpA39-Wasabi wurde von Prof. Mikhail Shapiro zur Verfügung gestellt (Addgene Plasmid # 86116) (Pira- ner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeu- tics. Nature chemical biology. 2017;13(1):75-80). Das Plasmid pUC-GFP-AT wurde von Prof. Chris Barnes zur Verfügung gestellt (Addgene-Plasmid Nr. 133306) (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segrega- tional killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Der L. plantarum WCFS1-Stamm wurde von Prof. Gregor Fuhrmann (Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarland) zur Verfügung gestellt. Die in dieser Studie erstellten se- quenzgeprüften genetischen Konstrukte wurden in einem E. coli DH5α-Stamm konserviert. Molekularbiologie Die in dieser Studie entwickelten genetischen Konstrukte basie- ren auf dem pLp3050sNuc/ pSIP403 Vektor-Backbone. Der HiFi As- sembly Master Mix, das Quick Blunting Kit und das T4 DNA Ligase enyzme wurden von New England BioLabs (NEB, Deutschland) bezo- gen. Die PCR wurde mit dem Q5 High Fidelity 2X Master Mix (NEB) und Primern von Integrated DNA Technologies (IDT) (Louvain, USA) durchgeführt. Die Oligonukleotid-Genfragmente wurden als eBlocks von IDT (Coralville, USA) erworben. Diese wurden für eine maximale Expression im Wirtsstamm mit dem Java Codon Opti- mization Tool (JCAT) oder dem IDT Codon Optimization Tool (Coralville, USA) optimiert. Für die Plasmidextraktion und die DNA-Aufreinigung wurden Kits der Qiagen GmbH (Hilden, Deutsch- land) bzw. der Promega GmbH (Walldorf, Deutschland) verwendet. Die Sanger-Sequenzierung der Kolonie-PCR-amplifizierten geneti- schen Segmente wurde durch die Eurofins Genomics GmbH (Ebers- berg, Deutschland) durchgeführt, indem der kommerziell angebo- tene zusätzliche DNA-Reinigungsschritt gewählt wurde. Die in dieser Studie verwendeten Promotorsequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. L. plantarum WCFS1 Herstellung kompetenter Zellen und DNA- Transformation Eine einzelne Kolonie von L. plantarum WCFS1 wurde in 5 mL MRS- Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) kultiviert. Die Primärkultur wurde im Verhältnis 1:50 (v/v) in einer 25-mL-Sekundärkultur verdünnt, die aus MRS- Medien und 1 % (w/v) Glycin bestand, das im Verhältnis 4:1 vor- gemischt wurde. Die Sekundärkultur wurde bei 37 °C und 250 U/min bebrütet, bis die OD6000,8 erreichte. Anschließend wur- den die Zellen durch Zentrifugieren bei 4000 U/min (3363 × g) für 10 Minuten bei 4 °C pelletiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 mL eiskalter 10 mM MgCl ₂ und anschließend zweimal mit 5 mL bzw. 1 mL eiskalter Sac/Gly-Lösung [10% (v/v) Glycerin (Gly) und 1 M Saccharose (Sac) im Verhältnis 1:1 (v/v)] gewaschen. Schließlich wurde der restliche Überstand verworfen und das Pellet in 500 μl Sac/Gly-Lösung resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden dann in 60 μl Aliquots für die DNA-Transformation verteilt. Für alle Transformationen wurden den kompetenten Zel- len 1 μg dsDNA (zirkuläres Plasmid oder DNA-ligierte Mischung) zugesetzt und dann in gekühlte Elektroporationsküvetten mit 2 mm Abstand (Bio-Rad Laboratories GmbH, Deutschland) überführt. Die Elektroporationstransformation wurde mit einem einzigen Puls bei 1,8 kV durchgeführt, woraufhin sofort 1 ml lauwarmes MRS-Medium zugegeben wurde. Die Mischung wurde für eine Erho- lungsphase von 3 Stunden bei 37 °C und 250 U/min bebrütet. Nach der Erholungsphase wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 4000 U/min (3363 × g) zentrifugiert, 800 μl des Überstands verworfen und 200 μl des resuspendierten Pellets auf MRS-Agar mit 10 μg/ml Erythromycin ausplattiert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet, um das Wachstum einzelner Kolonien zu ermöglichen. Konstruktion von genetischen Modulen in L. plantarum WCFS1 Die Plasmide wurden unter Verwendung der in dieser Studie opti- mierten DNA-Assembly-Methode konstruiert und direkt in den L. plantarum WCFS1-Stamm transformiert. Komplementäre Überhänge für die HiFi-Assemblierung wurden entweder mit PCR-Primern er- zeugt oder als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. Gereinigte überlappende DNA-Fragmente wur- den mit dem HiFi DNA Assembly Master Mix gemischt und wie im Standardreaktionsprotokoll empfohlen assembliert. Das assemb- lierte DNA-Produkt wurde dann durch eine weitere PCR-Runde ex- ponentiell vervielfältigt, wobei ein Primerpaar verwendet wurde, das sich spezifisch an das Insert-Segment anlagert. 5 µl der HiFi-Assembly-Reaktion wurden als Template für die PCR- Amplifikation des assemblierten Produkts verwendet (100 µl End- volumen). Das gereinigte PCR-Produkt wurde anschließend mit dem Quick Blunting Kit phosphoryliert. 2000 ng des gereinigten PCR- Produkts wurden mit 2,5 µl 10X Quick Blunting-Puffer und 1 µl Enzymmix gemischt (Milli-Q-Wasser wurde auf 25 µl aufgefüllt). Die Reaktion wurde zunächst 30 Minuten lang bei 25 °C und an- schließend 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Anschließend wurden die phosphorylierten Produkte mit Hilfe des Enzyms T4-Ligase ligiert. 6 µl der phosphorylier- ten DNA wurden mit 2,5 µl 10X T4 Ligase Buffer und 1,5 µl T4 Ligase Enzym gemischt (Milli-Q Wasser wurde auf 25 µl aufge- füllt). Pro Klonierung wurden zwei Ligationsreaktionen durchge- führt (jeweils 25 µl). Die jeweiligen Reaktionen wurden 2 Stun- den lang bei 25 °C und anschließend 30 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Die ligierten Reaktio- nen wurden zusammengemischt und gereinigt. Um das gereinigte Endprodukt zu konzentrieren, wurden drei Elutionsrunden statt einer durchgeführt. Jede Elution basierte auf 10 µl Milli-Q- Wasser. Die Konzentration des gereinigten Ligationsprodukts wurde mit dem NanoDrop Microvolume UV-Vis-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific GmbH, Deutschland) gemessen. Schließ- lich wurden 1000 ng des ligierten Produkts in L. plantarum WCFS1 elektrokompetente Zellen transformiert. Mikroplatten-Reader-Setup für die thermische Gradientenanalyse Die Bakterienkulturen wurden in 5 mL MRS-Medium (ergänzt mit 10 µg/mL Erythromycin, außer für den unveränderten Elternstamm) bei 30°C und kontinuierlichem Schütteln (250 U/min) kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Kulturen in 3 mL mit Antibiotika angereichertem frischem MRS-Medium auf 0,1 OD ₆₀₀ verdünnt und bei 30°C und 250 U/min vermehrt. Bei OD ₆₀₀ = 0,4 wurden die Kul- turen in Fisherbrand™ 0,2mL PCR Tube Strips mit flachen Kappen (Thermo Electron LED GmbH, Deutschland) abgefüllt und in den Biometra Thermocycler (Analytik Jena. GmbH, Deutschland) gege- ben. Für das P _spp -mCherry-Konstrukt wurden 25 ng/ml des 19 Ami- nosäuren umfassenden Sakacin P-Induktionspeptids (SppIp) mit der Sequenz NH ₂ -MAGNSSNFIHKIKQIFTHR-COOH (GeneCust, Frankreich) zu der Kultur gegeben und vor der Herstellung der Aliquots gründlich vortexen. Der thermische Test wurde mit einem Tempe- raturgradienten von 31°C auf 41°C mit regelmäßigen Steigerungen von 2°C durchgeführt. Die Deckeltemperatur wurde auf 50°C ein- gestellt, um die Verdunstung der Flüssigkeit zu verhindern und eine homogene Temperatur in den räumlich verteilten PCR-Gefäßen aufrechtzuerhalten. Nach einem Zeitintervall von 18 h wurden die PCR-Streifen in einer Tisch-Minizentrifuge (Biozym GmbH, Deutschland) zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu verwerfen. Die Zellen wurden dann in 200 µl 1X PBS resuspendiert und in die 96-Well-Mikrotiterplatte mit kla- rem Boden (Corning® 96 Well Opak Black Plate, USA) gegeben. Die Proben wurden dann im Microplate Reader Infinite 200 Pro (Tecan Deutschland GmbH, Deutschland) analysiert und sowohl die Ab- sorption (600 nm Wellenlänge) als auch die mCherry-Fluores- zenzintensität (Ex _λ / Em _λ = 587 nm/625 nm) wurden gemessen. Die z-Position und die Verstärkungseinstellungen für die Aufnahme der mCherry-Fluoreszenzintensität wurden auf 19442 µm bzw. 136 eingestellt. Die Fluoreszenzwerte wurden mit der optischen Dichte der Bakterienzellen normalisiert, um die relativen Fluo- reszenzeinheiten (RFU) nach der Formel RFU = Fluoreszenz/OD600 zu berechnen. Analyse der Fluoreszenzmikroskopie Die Bakterienkulturen wurden über Nacht in 5 mL MRS-Medium (er- gänzt mit 10 µg/mL Erythromycin, außer bei der Negativkon- trolle) bei 37◦C unter ständigem Schütteln (250 U/min) gezüch- tet. Am folgenden Tag wurde die OD ₆₀₀ des P _spp -mCherry-Konstrukts gemessen und bei OD ₆₀₀ = 0,01 subkultiviert. Als die P _spp - mCherry-Bakterienkultur eine OD ₆₀₀ = 0,3 erreichte, wurde sie mit 25 ng/mL SppIp induziert, und die übrigen Konstrukte wurden in frischem Medium bei 0,01 OD ₆₀₀ subkultiviert. Alle Kulturen wurden dann 18 Stunden lang unter denselben Wachstumsbedingun- gen (37◦C, 250 U/min) wachsen gelassen, um jegliche Heterogeni- tät in der Promotorstärkeexpression aufgrund unterschiedlicher Wachstumsparameter zu verhindern. Anschließend wurden 1 mL der Kulturen durch Zentrifugation (15700 × g, 5 min, 4 °C) geern- tet, zweimal mit Dulbeccos 1X PBS (Phosphatpuffersalzlösung) gewaschen und schließlich in 1 mL 1X PBS resuspendiert. 10 µL der Suspensionen wurden auf 1,5 mm dicke Glasobjektträger (Paul Marienfeld GmbH, Deutschland) gegeben und 1,5H-Glasdeckgläser (Carl Roth GmbH, Deutschland) daraufgelegt. Die Proben wurden dann unter dem Plan Apochromat 100X Ölimmersionsobjektiv (BZ- PA100, NA 1,45, WD 0,13 mm) des Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 (Keyence Corporation, Illinois, USA) beobachtet. Das mCherry- Signal wurde mit dem BZ-X TRITC-Filter (Modell OP-87764) bei einer Anregungswellenlänge von 545/25 nm und einer Emissions- wellenlänge von 605/70 nm mit einem dichroitischen Spiegel bei einer Wellenlänge von 565 nm aufgezeichnet. Die Bilder wurden auf identische Helligkeits- und Kontrasteinstellungen einge- stellt und mit der Software FiJi ImageJ2 bearbeitet. Durchflusszytometrische Analyse Die Quantifizierung der Fluoreszenzprotein-Expressionsniveaus der Stämme wurde mit dem Guava easyCyte BG-Durchflusszytometer (Luminex, USA) durchgeführt. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden Bakterienkulturen verwendet, die den oben ge- nannten Behandlungsbedingungen unterworfen waren. 1 mL der Bak- teriensuspensionen wurden durch Zentrifugation bei 13000 U/min (15700 × g) geerntet. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 mL steriler Dulbecco's 1X PBS resuspendiert. Die Proben wurden dann mit einem Verdünnungsfaktor (DF) von 104 seriell verdünnt und 5.000 Bakterienereignisse wurden für die Analyse aufgezeichnet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung an drei verschiedenen Tagen durchgeführt. Bei jeder Analyse diente der nicht fluoreszierende Wildtyp-Stamm als Ne- gativkontrolle. Zur Entfernung von Debris und Doubletten wäh- rend der Ereignissammlung und -analyse wurde ein vorgefertigter Schwellenwert auf der Grundlage von Vorwärts-Seitenstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) verwendet. Die Fluoreszenzinten- sität von mCherry wurde durch Anregung mit einem grünen Laser bei 532 nm (100 mW) und Signalanalyse mit dem Orange-G-Detekti- onskanal bei 620/52 nm gemessen. Die für die Datenaufzeichnung verwendeten Verstärkungseinstellungen waren: Vorwärtsstreuung (FSC) - 11,8; Seitenstreuung (SSC) - 4 und Orange-G-Fluoreszenz - 1,68. Die Kompensationssteuerung für die Fluoreszenzaufzeich- nung wurde auf 0,01 mit einer Erfassungsrate von 5 Dekaden ein- gestellt. Die Datenanalyse und -darstellung erfolgte mit der Luminex GuavaSoft 4.0 Software für EasyCyte. Konstruktion von Plasmiden auf der Grundlage von Toxin/Antito- xin-Modulen Auf der Grundlage einer Literaturrecherche wurde die Wirkung des Txe/Axe-Moduls (Toxin/Antitoxin) aus E. faecium (Grady R, Hayes F. Axe–Txe, a broad-spectrum proteic toxin–antitoxin sys- tem specified by a multidrug-resistant, clinical isolate of Enterococcus faecium. Molecular microbiology. 2003;47(5):1419- 32) in L. plantarum WCFS1 getestet, um seine Rolle bei der an- tibiotikafreien Plasmidretention zu untersuchen. Das Werkzeug TA Finder Version 2.0 (Xie Y, Wei Y, Shen Y, Li X, Zhou H, Tai C, et al. TADB 2.0: an updated database of bacterial type II toxin–antitoxin loci. Nucleic acids research. 2018;46(D1):D749- D53) wurde verwendet, um weitere Typ-II-TA-Systeme (Toxin/Anti- toxin) in Lactobacillus-Genomen auszuwählen. Die Genome von L. acidophilus, L. crispatus, L. casei, L. reuteri und L. planta- rum WCFS1 wurden vom NCBI Genome abgerufen. Die in diesen Geno- men enthaltenen TA-Systeme wurden mit den Standardparametern des TA-Finders durchsucht. Nur TA-Systeme, die von NCBI BlastP annotiert wurden, wurden als Testkandidaten ausgewählt. Die TA- Systeme YafQ/DinJ, HicA/HicB, HigB/HigA, MazF/MazE aus L. ca- sei, L. acidophilus und L. plantarum WCFS1 wurden für weitere Tests und Analysen ausgewählt. Das Axe/Txe-System wurde durch PCR aus dem Plasmid pUC-GFP-AT amplifiziert (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Die Systeme DinJ/YafQ und HicA/HicB wurden als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. HigA/HigB und MazE/MazF wurden aus dem Genom von L. plantarum WCFS1 amplifi- ziert. Die TA-Systeme wurden in das P _tlpA -mCherry-Plasmid einge- fügt, wodurch die Plasmide P _tlpA -mCherry-Txe/Axe, P _tlpA -mCherry- YafQ/DinJ, P _tlpA -mCherry-HicA/HicB, P _tlpA -mCherry-HigB/HigA, P _tlpA - mCherry-MazF/MazE entstanden. Alle diese Plasmide wurden mit der in dieser Studie optimierten DNA-Montagemethode direkt in L. plantarum WCFS1 kloniert. Für die Konstruktion des kombina- torischen TA-Moduls (P _tlpA -mCherry Combo) wurden die besten endo- genen und nicht endogenen TA-Systeme, die nach 100 Generationen erfasst wurden (MazF/MazE und YafQ/DinJ), subkloniert und in das gleiche Plasmid in umgekehrter Orientierung integriert. TA-vermittelte Plasmid-Retentionsanalyse Die TA-Module, die die Konstrukte enthielten, wurden in 5-mL- Kulturen mit 10 µg/mL Erythromycin-angereichertem MRS-Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter ständigem Schütteln (250 U/min) bebrütet. Am folgenden Tag wurden die Konstrukte bei ei- ner anfänglichen OD ₆₀₀ = 0,01 in frischem MRS-Medium (sowohl mit als auch ohne Antibiotikazusatz) subkultiviert. Die Bakterien- kulturen wurden an 12 aufeinanderfolgenden Tagen mit einer täg- lichen Wachstumszeit von 24 Stunden bebrütet, um eine durch- schnittliche Anzahl von 8 Generationen pro Tag zu gewährleis- ten, bis die endgültige Schwelle von 100 Generationen über- schritten war. Die Probenvorbereitung für die durchflusszyto- metrische Analyse erfolgte nach dem oben genannten Protokoll. Die mCherry-positive Zellpopulation korrelierte direkt mit der Bakterienpopulation, die das manipulierte Plasmid enthielt. Das gesamte Experiment wurde in biologischen Triplikaten wieder- holt. Für die qualitative Analyse wurden die 100 Generationen lang gezüchteten Bakterienkulturen ohne Antibiotikazusatz zentrifu- giert und in 1 ml sterilem Dulbeccos 1X PBS resuspendiert. Die resuspendierte Bakterienlösung wurde verdünnt (DF=10 ⁶ ) und auf MRS-Agarplatten mit und ohne Antibiotikazusatz aufgebracht und 48 Stunden lang in einem statischen Inkubator bebrütet. Die Platten wurden dann mit dem GelDocumentation System Fluorchem Q (Alpha Innotech Biozym GmbH, Deutschland) sowohl im Ethidium- bromid-Kanal (Ex _λ /Em _λ = 300 nm/600 nm) als auch im Cy3-Kanal (Ex _λ /Em _λ = 554 nm/568 nm) abgebildet, um die mCherry-Fluores- zenz produzierende Zellpopulation sichtbar zu machen. Messungen der Wachstumsrate Um den Einfluss der heterologen Proteinproduktion und der To- xin-Antitoxin-Module auf die bakterielle Wachstumsrate zu un- tersuchen, wurden die Bakterienkulturen über Nacht in mit Anti- biotika angereicherten MRS-Medien bei 37°C unter ständigem Schütteln (250 rpm) kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Bak- terienkulturen in Sekundärkulturen bei einer anfänglichen OD ₆₀₀ = 0,01 subkultiviert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C er- reichte die OD ₆₀₀ der Kulturen 0,1 und 200 µL der Kulturen wur- den in UV STAR Flat Bottom 96 Well Mikrotiterplatten (Greiner BioOne GmbH, Deutschland) verteilt. Die 96-Well-Assay-Platte wurde unter ständigem Schütteln bei einer Inkubationstemperatur von 37°C in den Microplate Reader gestellt. Der kinetische As- say wurde so eingestellt, dass die Absorption der Bakterienkul- turen bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Intervall von 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden aufgezeichnet wurde. Der Versuch wurde in dreifacher Ausführung an drei unab- hängigen Tagen durchgeführt. Experimentelle Ergebnisse Direkte Klonierung in L. plantarum WCFS1 Um ausreichende Plasmidmengen (~1 µg) für die Transformation in Lactobacillus zu erhalten, werden häufig Shuttle-Vektoren ver- wendet, die in E. coli amplifiziert werden können. Dabei ist bekannt, dass bestimmte Plasmidkonstrukte, die in E. coli passagiert wurden und Signalpeptide und sich wiederholende Se- quenzen im interessierenden Gen enthalten, Mutationen hervorge- rufen haben. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine PCR-basierte Amplifikation und Zirkularisierung der rekombinan- ten Plasmide durchgeführt, um 1000 ng zirkuläres Plasmid zu er- halten, was für die Transformation in L. plantarum WCFS1 aus- reichend war. Die Transformationseffizienz war mit 50 cfu/µg Plasmid relativ gering, aber die genetische Treue betrug >95%, da L. plantarum drei endogene Plasmide beherbergt. Da L. plant- arum drei endogene Plasmide besitzt, wurde die Sequenzierung an PCR-amplifizierten Abschnitten des transformierten Plasmids aus Zelllysaten durchgeführt. Diese direkte Klonierungsstrategie wurde im Folgenden für die Transformation aller Plasmide in L. plantarum WCFS1 verwendet. 1 - Der tlpA-Promotor von Salmonella treibt die konstitutive Expression auf hohem Niveau an Auf der Suche nach einem hitze-induzierbaren Promotor für the- rapeutische Anwendungen wurde die mCherry-Expression stromab- wärts des von Salmonella stammenden P _tlpA -Promotors zusammen mit dem thermoreaktiven TlpA-Repressor (Piraner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics. Nature chemical bi- ology. 2017;13(1):75-80; Hurme R, Berndt KD, Normark SJ, Rhen M. A proteinaceous gene regulatory thermometer in Salmonella. Cell. 1997;90(1):55-64) kodiert. Während der Repressor die Gen- expression nicht unterdrückte (Figur 5D), schien der Promotor überraschenderweise konstitutiv eine hohe Proteinexpression mit einem geringen Grad an thermischer Regulation (<5-facher An- stieg von 31°C auf 39°C) zu bewirken (Figur 1A). Im Vergleich dazu erwiesen sich pR und pL, zwei andere häufig verwendete Promotoren mit einem thermoreaktiven Repressor, cI, aus E. coli lambda-Phagen, als sehr schwach und trieben nur geringe Mengen an mCherry-Expression an (Figur 5A, 5B). Die Fluoreszenzspekt- roskopie zeigte, dass die Stärke des P _tlpA Promotors bei 37 ºC 26- bzw. 39-mal höher war als die des P _R - bzw. P _L -Promotors (Fi- gur 5C). Besonders bemerkenswert ist, dass die Fluoreszenzmik- roskopie und die Durchflusszytometrie-Analyse auch zeigten, dass die mCherry-Expression, die durch den PtlpA -Promotor ausge- löst wird, deutlich über derjenigen liegt, die durch die stärksten Promotoren ausgelöst wird, über die zuvor in L. plantarum berichtet wurde - P ₂₃ (Meng Q, Yuan Y, Li Y, Wu S, Shi K, Liu S. Optimization of electrotransformation parameters and engineered promoters for Lactobacillus plantarum from wine. ACS Synthetic Biology. 2021;10(7):1728-38), P ₄₈ (Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for con- stitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbi- ology. 2006;152(4):1011-9), P _spp (Sørvig E, Mathiesen G, Nater- stad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene ex- pression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum us- ing versatile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) und P _Tuf (Spangler JR, Caruana JC, Phillips DA, Walper SA. Broad range shuttle vector construction and pro- moter evaluation for the use of Lactobacillus plantarum WCFS1 as a microbial engineering platform. Synthetic Biology. 2019;4(1):ysz012) (Figur 1B, Figur 6A). Bei 31°C war die mCherry-Expression mindestens 2-fach höher als bei den anderen Promotoren, während sie bei 39°C auf das 5-fache anstieg (Figur 1C, Figur 6B). Die konstitutiven Promotoren (P ₂₃ ,P ₄₈ , P _Tuf ) wa- ren leicht thermoreaktiv, während der induzierbare Promotor (P _spp ) dies nicht war (Figur 7A). Bemerkenswert ist, dass in al- len Fällen die Spacerlänge zwischen der Ribosomenbindungsstelle (RBS, 5'-AGGAGA-3') und dem Startcodon das Expressionsniveau stark beeinflusste. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde eine hohe mCherry-Expression bei einer Spacer-Länge von 9 bp beobachtet, die deutlich abnahm, wenn sie auf 6 bp reduziert wurde (25-fach niedriger für P _tlpA ) (Figur 7B). Trotz der hohen Proteinexpression, die durch P _tlpA mit einem 9 bp Spacer ausge- löst wurde, war die Wachstumsrate dieses Stammes bei 37°C ähn- lich wie die des leeren Kontrollstammes, was darauf hindeutet, dass diese Proteinüberexpression die Zelle überraschenderweise nicht metabolisch überlastet (Figur 1D). Es wurden folgende Vektoren hergestellt und verwendet: Promotor P _L (pL mcherry; SEQ-ID Nr. 18), Promotor P _R (pR mcherry; SEQ-ID Nr. 19), Promotor P _TlpA (pTlpA mcherry; SEQ-ID Nr. 20), Promotor P _TlpA + TlpA-Repressor (pTlpA A39 mcherry; SEQ- ID Nr. 21), Promotor P ₂₃ (P23 mcherry; SEQ-ID Nr. 22), Promotor P ₄₈ (P48 mcherry; SEQ-ID Nr. 23), Promotor P _spp (SPP mcherry; SEQ-ID Nr. 24), Promotor P _tuf (tuf mcherry; SEQ-ID Nr. 25), lee- rer Vektor (SEQ-ID Nr. 32) 2 - Toxin/Antitoxin (TA)-basierte Plasmid-Retention und tran- siente GVOs TA-Systeme gewährleisten den Verbleib von Plasmiden in einer Bakterienpopulation durch einen Mechanismus zur Abtötung nach der Segregation. Sie exprimieren konstitutiv langlebige Toxine und kurzlebige Antitoxine. Solange das Plasmid vorhanden ist, wird ausreichend Antitoxin produziert, um das entsprechende To- xin zu neutralisieren. Erhält eine Tochterzelle bei der Bakte- rienteilung keine Plasmidkopien, wird das Antitoxin rasch abge- baut, und das aktive Toxin tötet die Zelle. Es wurden mehrere natürliche TA-Systeme untersucht (Yamaguchi Y, Inouye M. Regu- lation of growth and death in Escherichia coli by toxin–antito- xin systems. Nature Reviews Microbiology. 2011;9(11):779-90) und einige davon mit vielversprechenden Ergebnissen auf Plas- midrückhaltung in E. coli untersucht (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post- segregational killing mechanisms for the implementation of syn- thetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34; Wright O, Delmans M, Stan G-B, Ellis T. Ge- neGuard: a modular plasmid system designed for biosafety. ACS synthetic biology. 2015;4(3):307-16; Abedi MH, Yao MS, Mittel- stein DR, Bar-Zion A, Swift MB, Lee-Gosselin A, et al. Ultra- sound-controllable engineered bacteria for cancer immunother- apy. Nature communications. 2022;13(1):1-11), wurde ihre Ver- wendung in Lactobacillus bisher nicht erforscht. Dazu wurde zu- nächst das TA-System vom Typ II, Txe/Axe untersucht, das aus Enterococcus faecium stammt und nachweislich eine langfristige Plasmidretention in E. coli gewährleistet (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). In diesem System ist Txe eine Endoribonuklease und Axe das entsprechende inhibitorische Protein. Dieses Modul wurde zu dem Plasmid hinzugefügt, das für die P _tlpA -gesteuerte mCherry-Expression kodiert (Figur 2A), und der daraus resultie- rende Stamm wurde bis zu 100 Generationen lang wiederholt sub- kultiviert. Die Plasmid-Retention wurde quantifiziert, indem der Anteil der mCherry exprimierenden Bakterienpopulation mit Hilfe von Durchflusszytometrie und Agarplatten-Koloniebildana- lyse bestimmt wurde (Figur 8B). Die Sensitivität dieser Analyse wurde durch die hohe Expressionsrate, die durch den PtlpA-Promo- tor angetrieben wurde, erheblich verbessert, was eine klare Ab- grenzung von Zellen mit Plasmid-Retention und solchen ohne Plasmid ermöglichte (Figur 2B). Eine solch klare Abgrenzung war mit anderen Promotoren wie P ₂₃ nicht möglich, da sich das Fluo- reszenzsignal teilweise mit dem Hintergrundsignal von nicht fluoreszierenden Zellen überschnitt (Figur 8A). In Abwesenheit eines TA-Systems (PtlpA mCherry-Plasmid) nahm der Anteil der Plasmid-tragenden Bakterien stetig um etwa 1 % pro Generation ab und endete mit ~15 % der Population, die das Plasmid nach 100 Generationen behielten (Figur 2C). Im Vergleich dazu unter- stützte das Txe/Axe-System anfangs eine bessere Retention mit einem Plasmidverlust von etwa 0,5 %/Generation für 40 Generati- onen, danach beschleunigte sich dieser Verlust auf etwa 1,2 %/Generation und endete bei ~18 % der Population, die das Plas- mid nach 100 Generationen behielten. In einem Versuch, potenzi- ell leistungsfähigere TA-Systeme zu identifizieren, wurde das Bioinformatik-Tool TA-Finder verwendet, und es wurden 4 weitere TA-Systeme vom Typ II ausgewählt - YafQ/DinJ aus L. casei (Le- vante A, Folli C, Montanini B, Ferrari A, Neviani E, Lazzi C. Expression of DinJ-YafQ System of Lactobacillus casei group strains in response to food processing stresses. Microorga- nisms. 2019;7(10):438), HigB/HigA und MazF/MazE aus L. planta- rum WCFS1 und HicA/HicB aus L. acidophilus. Bei all diesen TA- Kandidaten handelt es sich um ein Endoribonuklease-Toxin, das auf den RNA-Pool des metabolisch aktiven und sich schnell tei- lenden mikrobiellen Wirts abzielt. Ähnlich wie das Txe/Axe-Mo- dul wurden diese TA-Module dem P _tlpA _mCherry-Plasmid hinzugefügt (Figur 2C). Die Analyse der Plasmid-Retention ergab, dass die Systeme HigB/HigA und MazF/MazE größtenteils ähnlich wie Txe/Axe funktionierten, aber nach 100 Generationen eine etwas bessere Retention aufwiesen (20 % bzw. 30 %). HicA/HicB ver- langsamte den Plasmidverlust auf 0,5 %/Generation für 50 Gene- rationen und 0,8 %/Generation danach, was zu einem Retentions- niveau von ~35 % nach 100 Generationen führte. Schließlich wurde festgestellt, dass YafQ/DinJ die besten Rückhaltefähig- keiten mit einem Plasmidverlust von 0,5 %/Generation für 70 Ge- nerationen und 1 %/Generation danach bietet, was zu einem Rück- haltegrad von ~40 % nach 100 Generationen führt (Fig. 10A, 10B). Figur 10A zeigt den Plasmiderhalt verschiedener Plasmide über 100 Generationen unter antibiotischer Kontrolle. Wie erwartet, bleiben die Plasmide nahezu vollständig erhalten. Figur 10B zeigt die Retention unter Kontrolle der Toxin/Antitoxin-Sys- teme. Es zeigt eine deutlich verbesserte Retention im Vergleich zum Wildtyp. Die Kombination von zwei Toxin/Antitoxin-Systemen führt noch einmal zu einer deutlichen Verbesserung. Grundlegende Studien haben gezeigt, dass verschiedene TA- Systeme kumulativ bessere Plasmidrückhaltefähigkeiten bieten können (Bardaji L, Añorga M, Echeverría M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians—multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1):1-17). Auf dieser Grundlage wurde das leistungs- stärkste endogene TA-System von L. plantarum WCFS1 (MazF/MazE) mit dem leistungsstärksten nicht endogenen System (YafQ/DinJ) kombiniert. Interessanterweise wurde bei dieser Kombination bessere Plasmid-Retentionsfähigkeiten mit einem Plasmidverlust von 0,2 %/Generation für 50 Generationen und einem allmählichen Anstieg auf 0,8 %/Generation danach beobachtet, was zu einer deutlich höheren Retention von 60 % über 100 Generationen führte. Im Vergleich dazu wurden Plasmide, die unter antibioti- schem Selektionsdruck gehalten wurden, erwartungsgemäß über 100 Generationen hinweg zu >90 % erhalten. Bei allen TA-Systemen unterschieden sich die bakteriellen Wachstumsraten über 10 Ge- nerationen nicht wesentlich von den Bedingungen ohne TA oder mit Antibiotika-Retention, was darauf hindeutet, dass die To- xine die reguläre Funktion der Zellen nicht drastisch beein- trächtigten (Figur 9). Bei den TA-Systemen führt der Verlust des Plasmids lediglich dazu, dass das Bakterium in seinen na- türlichen, genetisch unveränderten probiotischen Status zurück- versetzt wird, was die Konstruktion von transienten GVO ermög- licht. Aufgrund der vorteilhaften Präsenz von Laktobazillen im mensch- lichen Körper, in der Nahrung und in der Umwelt besteht ein er- hebliches Interesse an der gentechnischen Herstellung von hoch- gradig heterologer Proteinproduktion für medizinische und in- dustrielle Anwendungen. Unter den verschiedenen Stämmen ist L. plantarum einer der am intensivsten untersuchten, und bei der Suche nach starken Promotoren wurde in der Regel das Genom des Wirtsstamms durchleuchtet und Anpassung der Promotoren, die eine hochgradige Proteinexpression in phylogenetisch nahen Milchsäurebakterien (Figur 3A). Nur sehr wenige Studien haben Promotoren von phylogenetisch entfernten Arten wie P. megate- rium (P _xylA ) oder E. coli (P _T7 von lambda phage) getestet (Heiss S, Hörmann A, Tauer C, Sonnleitner M, Egger E, Grabherr R, et al. Evaluation of novel inducible promoter/repressor systems for recombinant protein expression in Lactobacillus plantarum. Microbial cell factories. 2016;15(1):1-17), obwohl die Expres- sionsraten gering waren. Überraschenderweise ermöglicht der Promotor (P _tlpA ) aus dem phylogenetisch weit entfernten gramnega- tiven Salmonella typhimurium, die Proteinexpression stärker an- zutreiben als die zuvor berichteten starken Promotoren in L. plantarum WCFS1. In Salmonella ist PtlpA ein Promotor der σ70- Sigma-Faktoren, die in den meisten Prokaryonten an der Regulie- rung der Expression von Housekeeping-Genen beteiligt sind. Todt et al., (Todt TJ, Wels M, Bongers RS, Siezen RS, Van Hijum SA, Kleerebezem M. Genome-wide prediction and validation of sigma70 promoters in Lactobacillus plantarum WCFS1. 2012) verwendeten einen genomweiten Analyseansatz zur Identifizierung von σ70-ba- sierten Promotor-Konsensussequenzen in L. plantarum WCFS1 und sagten 568 Promotorregionen in unmittelbarer Nähe der Tran- skriptionsstartstellen (<40 nt) voraus. Ihre Ergebnisse in Kom- bination mit ähnlichen Analysen aus anderen Organismen (Davis MC, Kesthely CA, Franklin EA, MacLellan SR. The essential ac- tivities of the bacterial sigma factor. Canadian journal of mi- crobiology. 2017;63(2):89-99; Paget MS, Helmann JD. The σ 70 family of sigma factors. Genome biology. 2003;4(1):1-6) deuten darauf hin, dass die σ70-Promotor-Bindungsmotive in verschiede- nen Gattungen konserviert sind und dass divergente Promotoren, die σ70 zur Steuerung der Transkription in diesen Bakterienar- ten rekrutieren, möglich sind. Multiple Sequence Alignment (MSA) zwischen den wichtigsten RNA-Polymerase-σ70-Proteinen (RpoD) von E. coli, S. typhimurium und L. plantarum-Stämmen (Figur 3B) ergab eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den Do- mäne-2- und Domäne-4-Regionen, die für die Bindung an die -10- und -35-Regionen des Promotors während der Transkriptionsein- leitung verantwortlich sind. Abgesehen von der hohen Expressionsrate erfordern die medizini- sche und industrielle Anwendbarkeit von Laktobazillen Strate- gien, um heterologe Gene in den manipulierten Bakterien auf kostengünstige und kompatible Weise zu erhalten. Während die genomische Integration eine stabile Retention heterologer Gene gewährleistet, bieten Plasmide eine weitaus größere Vielseitig- keit und einfachere Technik. Meistens wird die Retention durch die Bereitstellung eines Antibiotikaresistenzgens im Plasmid und die Kultivierung der Bakterien in Gegenwart des Antibioti- kums sichergestellt. Die wichtigste antibiotikafreie Retenti- onsstrategie für Laktobazillen besteht darin, auxotrophe Stämme zu erzeugen, indem ein wesentliches Stoffwechselgen ausgeschal- tet und in das Plasmid eingebaut wird. Die Notwendigkeit, auxotrophe Stämme durch Gen-Knockout zu entwickeln, schränkt jedoch die breite Anwendbarkeit dieser Strategie ein. Hier wur- den zum ersten Mal Toxin-Antitoxin-Systeme für die Plasmid-Re- tention in Laktobazillen erforscht, die keine Genom-Manipulati- onen erfordern und leicht auf verschiedene Stämme angewendet werden können, ohne dass externe Selektionsdruckbedingungen er- forderlich sind. Solche TA-Systeme wurden bisher nur bei eini- gen wenigen Bakterienarten erprobt und haben in E. coli be- trächtliche Rückhaltefähigkeiten gezeigt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl homologe als auch heterologe TA-Systeme dazu beitragen, den Plasmidverlust über mehrere Generationen zu verlangsamen, obwohl die Retention über 100 Generationen nur zwischen 10 und 30 % lag. Interessanterweise führte die Kombi- nation von zwei TA-Systemen in einem einzigen Plasmid zu einer erheblichen Verbesserung der Retention, nämlich bis zu 60 % über 100 Generationen (Figur 10 B). Diese verbesserte kumula- tive Wirkung von TA-Systemen ist zwar in der Natur beobachtet worden (Bardaji L, Añorga M, Echeverría M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians—multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1):1-17), wurde aber bisher noch nicht bei einem gen- technisch veränderten Plasmid gezeigt, insbesondere bei einer Kombination von heterologen und homologen TA-Systemen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine einzige Generation einer bakteriellen Verdopplung entspricht, so dass 10 Generationen = 2 ¹⁰ oder ~10 ³ Bakterien und 100 Generationen = 2 ¹⁰⁰ oder ~10 ³⁰ Bakterien aus einer einzigen Zelle sind. Potenzielle Anwendun- gen von Lactobacillus für lebende Therapeutika oder künstlich hergestellte lebende Materialien werden voraussichtlich keine so hohen Generationszahlen erreichen, entweder aufgrund kurzer Anwendungszeiträume (Watterlot L, Rochat T, Sokol H, Cherbuy C, Bouloufa I, Lefèvre F, et al. Intragastric administration of a superoxide dismutase-producing recombinant Lactobacillus casei BL23 strain attenuates DSS colitis in mice. International jour- nal of food microbiology. 2010;144(1):35-41; Janahi EMA, Haque S, Akhter N, Wahid M, Jawed A, Mandal RK, et al. Bioengineered intravaginal isolate of Lactobacillus plantarum expresses algal lectin scytovirin demonstrating anti-HIV-1 activity. Microbial pathogenesis. 2018;122:1-6; Wang M, Fu T, Hao J, Li L, Tian M, Jin N, et al. A recombinant Lactobacillus plantarum strain ex- pressing the spike protein of SARS-CoV-2. International journal of biological macromolecules. 2020;160:736-40) oder externer Wachstumsbeschränkungen (Bhusari S, Sankaran S, del Campo A. Regulating bacterial behavior within hydrogels of tunable vis- coelasticity. bioRxiv. 2022). Daher sollten die >90% Retenti- onsraten, die das Combo-TA-System für bis zu 40 Generationen bietet, für diese Anwendungen mehr als ausreichend sein. Da der Verlust des Plasmids die Bakterien nur in ihren probiotischen Nicht-GVO-Status zurückversetzt, könnten solche transienten GVO für solche Anwendungen sogar wünschenswert sein. Dementspre- chend könnte durch Variation des verwendeten TA-Systems die GVO-Lebensdauer dieser Organismen eingestellt werden. Auf der Grundlage dieses Konzepts wurde eine neue Metrik, G ₅₀ , zur Cha- rakterisierung solcher transienten GVO eingeführt. Der Wert G ₅₀ entspricht der Generation, in der die Hälfte der Population ei- nes Stammes ihr Plasmid verloren hat. Wie in Figur 4 darge- stellt, kann G ₅₀ von 50 gens für die Bedingung "Keine TA" bis zu 110 gens (extrapoliert) für das Combo-System eingestellt wer- den. Die weitere Erforschung zusätzlicher TA-Systeme in zukünf- tigen Studien wird zu einer feineren Abstimmung der Retentions- lebensdauern beitragen und möglicherweise sogar zu einer nahezu perfekten Retention führen, wie sie in E. coli durch das Txe/Axe-System erreicht wurde (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segrega- tional killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Es wird erwartet, dass diese G ₅₀ -Werte von Kulturparametern und Umweltfaktoren abhängen, weshalb sie auch zu einem nützlichen Maßstab für die Bewertung der natürlichen und industriellen Be- dingungen werden könnten, unter denen Laktobazillen wachsen und funktionieren. Es wurden folgende Vektoren verwendet: P _TlpA + Txe/Axe (pTlpA mcherry Txe/Axe; SEQ-ID Nr. 26), P _Tlpa + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry YafQ/DinJ; SEQ-ID Nr. 27), P _TlpA + HigB/HigA (pTlpA mcherry HigB/HigA; SEQ-ID Nr. 28), P _TlpA + MazF/MazE (pTlpA mcherry MazF/MazE; SEQ-ID Nr. 29), P _TlpA + HicA/HicB (pTlpA mcherry HicA/HicB; SEQ-ID Nr. 30), P _TlpA + MazF/MazE + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry Combo; SEQ-ID Nr. 31). In den Figuren und in der Beschreibung werden die Vektoren auch ohne die Angabe „pTlpA mcherry“ bezeichnet, z. B. HigB/HigA o- der Combo). TlpA wird auch als tlpA angegeben. Alle Sequenzen und ihre Bezeichnungen sind auch in Tabelle 2 angegeben. Figur 11 zeigte die schematische Darstellung des Vektors mit Replikationsbeginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; To- xin/Antitoxin. Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren. Die Antibiotikumresistenz ist optional. Das To- xin/Antitoxin-System weist einen eigenen Promotor auf. Die Rei- henfolge von Toxin/Antitoxin kann auch umgekehrt sein. Der Vek- tor kann auch mehrere Toxin/Antitoxin-Systeme aufweisen.

Tabelle 1

Tabelle 2

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