本发明涉及一种新型的糖基水解酶 （GH)、 该酶的氨基酸序列及编码该酶的 核苷酸序列。 具体讲， 该酶具有 β-木糖苷酶 -β-葡萄糖苷酶活性， 并且能专一性 地从 7-木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基， 本发明涉及编码该 7-木糖紫杉 烷糖基水解酶的核苷酸序列、 该酶的氨基酸序列以及该酶或者该酶产生菌的 应 用。 背景技术 紫杉醇 （Taxol®, Paclitaxel) 主要由红豆杉属植物产生， 作为二十世纪 90年 代抗癌药的重要成就之一， 自问世以来， 其独特的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤活 †生令世人嘱目 ( Kingston DGI, et al. The taxane diterpenoids. In: Herz W, et al. eds. Progress in the chemistry of organic natural products. New York: Springer- Verlag, 1993, 161-165 )。它可以与微管蛋白结合， 促进微管蛋白的聚合并抑制其解聚， 阻 止细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成， 使细胞停滞于 G2/M期（Horwitz SB. Taxol (paclitaxel): mechanisms of action. Ann Oncol. 1994a, 5 Suppl.)。 目前紫杉醇在临床 上被用作乳腺癌、 卵巢癌和非小细胞肺癌等的一线药物。对头颈 部癌症、 黑色素 瘤、 结肠癌以及由 HIV引起的卡波济肉瘤也有较好的疗效。

紫杉醇在红豆杉植株中含量很低，即使是含量 最高的部位树皮中也只有万分 之二左右 （美国专利 US 6028206 ) 。 一颗生长百年的红豆杉老树可得到大约 3公 斤树皮，从中可制取 300毫克左右的紫杉醇 （Horwitz, SB. How to make taxol from scratch. Nature 1994b, 367: 593-594 ) ， 因此， 从树皮中每提取 1公斤紫杉醇需要 大约 3000棵大树， 而满足 1例病人的用药量相当于毁掉 3〜4棵百年老树。 有一种 替代方法是从欧洲红豆杉 Taxus baccata L. ) 等的枝叶中提取含量较高的 10-去 乙酰巴卡亭 ΠΙ (含量可达 0.1%左右）， 以此为原料半合成紫杉醇或其结构类似物 多西紫杉醇 （taxotere) ， 后者的活性比紫杉醇稍强， 水溶性也高于紫杉醇 [Denis JN, et al. A highly efficient, practical approach to natural taxol. J Am Chem Soc. 1988. 1 10(17):5917-5919; Horwitz RI. Studies with RP 56976 (Taxotere): A semisynthet- ic analogue of taxol. J Nat Cancer Inst. 1991 , 83(4):288-291 ; 美国专利 US

4814470]。灌木型红豆杉杂交种的苗圃栽培也� ��认为是已知的解决紫杉醇来源最 简易、 资源可再生、 成本最低廉的方法。

除了含量极低的紫杉醇以外，还从红豆杉树皮 中分离到具有紫杉醇母核结构 的 C-7 木糖紫杉烷类化合物 （紫杉烷木糖苷）， 包括 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 ( 7-P-xylosyl- 10-deacytyltaxol, XDT )、 7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱 ( 7-P-xylosyl- 10-deacetylcepholomanine, XDC )、 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C ( 7-P-xylosyl-l O-deacytyltaxol C， XDTC ) 等， 其中， 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 ( 7-P-xylosyl- 10-deacytyltaxol, XDT) 的含量最为丰富 （Senilh V, et al. Mise en evidence de nouveaux analogues du taxol extraits de Taxus boccata. Nat Prod. 1984, 47: 131-137; Rao KV. Taxol and related taxanes. I. Taxanes of Taxus brevifolia bark. Pharm Res. 1993, 10:521-524)。例如， XDT、 XDC、 XDTC的收率可以分别达到： 0.5%, 0.02% and 0.0075% (欧洲专利 EP0905130B1 )。 这些 7-木糖紫杉烷类化合 物可以用化学方法 （美国专利 US 6028206; 欧洲专利 EP 1298128B1 ) 或生物方 法 （美国专利 US 5700669; 中国专利 CN申请号 No.200610046296.6; 中国专利 CN 申请号 No.200710012698.9 )水解去除其上的木糖基， 产生相应的 7-羟基紫 杉烷，后者可被用于化学半合成紫杉醇或多西 紫杉醇， 以提高红豆杉资源利用率 和缓解红豆杉资源的供求矛盾。但比较而言， 化学方法存在某些不足， 如相对较 低的收率、 较为复杂的反应过程以及环境污染等， 而生物方法则符合环保理念。

美国及欧洲专利 （US5700669A; EP0668360B1 ) 及发表的相关论文（Hanson RL, et al. Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem 1997, 26: 153-158 ) 公开了利用细菌 Moraxella sp.(ATCC55475) Bacillus macerans (ATCC55476) Bacillus circulans (55477) 禾口 Micrococcus sp.(ATCC55478) 将 C-7木糖紫杉烷转化为 C-7羟基紫杉烷的水解方 法， 其中， Mora;ce//fl sp.的转化能力最强， 在 2ml细胞悬浮液中加入 0.5 mg 7-木 糖 -10-去乙酰紫杉醇 （XDT ) (湿细胞 91.5 mg/ml; XDT 0.25 mg/ml) , 28。C、 12 rpm条件下极向 （end-over-end) 混合 21小时， 用甲醇终止反应、 HPLC检测， 没有看到 XDT剩余， 产物 DT的产率为 0.23mg/ml。 中国专利 （申请号 200610046296.6 ) 及发表的相关论文 （Hao DC, α/. Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches. FEMS Microbiol Lett 2008, 284:204-212 ) 公开了利用放线菌 Leifsonia shinshuensis DICP 16 (CCTCC No. M 206026) 将 C-7木糖紫杉烷转化为 C-7羟基 紫杉烷的水解方法。 利用类似于上述美国专利的培养及转化条件， 在 2 ml 菌体 悬浮液中加入 1 mg XDT, 在 30 ° C 、 120 rpm条件下反应 21小时后用 2 ml甲 醇终止反应， HPLC测得反应液中无 XDT残留， 产生 0.4 mg/ml DT。 在另一个 试验中， 2ml 反应液中湿细胞浓度为 231.58mg/ml， 7-木糖 -10-去乙酰巴卡亭 III 以不同浓度 ( 0.5, 0.9,1.95, 3.1 , 4.4, 5.2, 和 6.75 mg/ml) 分别加入， 在 31 °C 、 120 rpm条件下反应 40 h以上， 10-去乙酰巴卡亭 III的收率在底物浓度为 1.95 mg/ml时达至 lj最高 ( Hao DC, et al. Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches. FEMS Microbiol Lett 2008, 284:204-212 ) 。

另一份中国专利 （申请号 200710012698.9 ) 公开了放线菌纤维化纤维单孢 菌 Cellulosimicwbium cellulans, XZ-5CCTCC No. M 207130)、 水解酶及其在紫 杉烷转化方面的用途： 将 10 ml XDT (浓度为 5 mg/ml)加入到 90 ml粗酶液 （ 100 ml培养液加入 1 ml 30 °C培养 2天的纤维化纤维单孢菌种子液， 150 rpm, 30 °C 摇瓶培养 5天， 离心收集上清即为粗酶液）， 50 rpm, 30 °C下反应 20小时， 产 生 40mg DT。

总的来看，上述生物方法在水解 7-木糖紫杉烷方面均有潜在的应用价值，但 由于现存技术中的细胞酶量普遍偏低、底物在 水中的溶解度不高等因素， 导致产 率不高， 难以满足规模化工业生产的要求。 有一些 β-木糖苷酶已从真菌和其他生物中分离得到 [Tuohy MG， et al. The xylan-degrading enzyme system of Talaromyces emersonii: novel enzymes with activity against aryl beta-D-xylosides and unsubstituted xylans. Biochem J. 1993, 290 (Pt 2):515-523; Golubev AM, et al. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of β-xylosidase from Trichoderma reesei. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000, 56 (Pt 8): 1058— 1060; Pan I， et al. Effective extraction and purifi- two-phase partitioning. Enzyme Microb Technol. 2001 , 28 (2-3): 196-201 ; Rizzatti ACS, et al. Purification and properties of a thermostable extracellular β-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis. J Ind Microbiol BiotechnoL 2001 , 26(3): 156-160; Saha BC. Purification and characterization of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J Ind Microbiol Biotechnol 2001 , 27 (4):241-245; Gargouri M, et al. Fungus be- ta-glycosidases:immobilization and use in alkyl-beta-glycoside synthesis. J Mol Catal B: Enzym. 2004, 29, Issues 1-6:89-94; Lama L, et al. Purification and characterization of thermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus . Res Microbiol 2004,155(4):283-289; Belfaquih N & Penninckx MJ. A bifunctional β-xylosidase-xylose isomerase from Streptomyces sp. EC 10. Enzyme Microb Technol 2000, 27(1-2): 114-121] , 还成功克隆并鉴定了一些 β-木糖 苷酶基因 （如几种真菌来源的 β-木糖苷酶基因） [Margolles-Clark E, Cloning of genes encoding alpha-L-arabinofliranosidase and beta-xylosidase from Trichoder- ma reesei by expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 1996, 62(10):3840-3846.; van Peij 顺， et al. β-Xylosidase activity, encoded by xlnD, is essential for complete hydrolysis of xylan by Aspergillus niger but not for induction of the xylanolytic enzyme spectrum. Eur J Biochem. 1997, 245 (1): 164-173; Perez-Gonzalez JA, et al. Molecular cloning and transcriptional regulation of the Aspergillus nidulans xlnD gene encoding a β-xylosidase. Appl Environ Microbiol. 1998, 64(4): 1412-1419; Kitamoto N, et al. Sequence analysis, overexpression, and anti- sense inhibition of a β-xylosidase gene, xylA, from Aspergillus oryzae KBN616. Appl Environ Microbiol. 1999, 65(l):20-24; Berrin JG, et al. High-level production of recombinant fungal endo-β- 1 ,4-xylanase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2000, 19(1): 179-187; Reen FJ, et al. Molecular characterisation and expression analysis of the first hemicellulase gene (bxll) encoding β-xylosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii. Biochem Biophys Res Commun. 2003, 305(3):579-585; Kurakake M, et al. Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori 4. Biochim Biophys Acta. 2005, 1726(3):272-279; Wakiyama M, et al. Purification and properties of an extracellular β-Xylosidase from Aspergillus japonicus and sequence analysis of the encoding gene. J Biosci Bioeng. 2008, 106(4):398-404] _o 然而， 所有这些 β-木糖苷酶（天然的或重 组的） 尚未见到能专一性水解 7-木糖紫杉烷， 因此有理由认为， 迄今为止能够对 7-木糖紫杉烷类化合物具有专一性催化活性的 β-木糖苷酶的基因尚未见到克隆， 更谈不上对其进行功能分析。 事实上， 有许多商品化的木糖苷酶、木聚糖酶和其 他的糖苷酶根本不具备从 7-木糖紫杉烷上水解去除木糖基的能力 （Hanson RL， et al. Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Bio- technol Appl Biochem 1997, 26: 153-158)。 发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题， 本发明的目的是提供一种新型的、 高效 的、 能专一性地水解 7-木糖紫杉烷木糖基的水解酶， 及其基因序列。

为解决上述技术问题， 本发明的发明人进行了潜心的研究。首先， 从具有专 一性 β-木糖苷酶活性、能够转化 7-木糖紫杉烷为 7-羟基紫杉烷的真菌 Μ95.33中 纯化专一性的 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 （GH)， 对纯化的酶进行 LC-MS/MS De novo 测序， 得到一些寡肽的氨基酸序列。 根据这些寡肽的氨基酸序列设计出一 系列简并引物， 通过巢式 PCR、 RACE和 Genome Walking等分子生物学技术克 隆该酶的 cDNA及其结构基因。 将编码该酶的开放阅读框 （open reading frame, 0RF )之 cDNA片段与适当表达载体连接， 构建重组质粒， 后者被导入相应的宿 主细胞，如生长快并能进行高密度发酵的毕赤 酵母。重组菌能够高效催化 7-木糖 紫杉烷的糖基水解反应，产生 7-羟基紫杉烷。发明人还发现该酶是一种双功� ��酶， 能水解去除葡萄糖苷上的葡萄糖残基。

该核苷酸序列与 GenBank中已注册的所有核苷酸序列几乎没有同� �性， 最为 接近者也多为假定蛋白基因序列， 且两者的覆盖率仅 3〜7%； 由其核苷酸序列推 定的氨基酸序列与玉蜀黍黑粉菌 stilago maydis ) 的假定蛋白序列 （GenBank accession: XP_760179 )最为接近， 可比较范围内两者的一致性为 43%， 相似性为 59%。 本发明包含了如下的发明：

提供了一种新的 7-木糖紫杉烷糖基水解酶， 代号为 Lx≠- _P l。 本发明的第二发明目的在于提供编码该酶的核 苷酸序列。

本发明的第三发明目的在于提供含有该核苷酸 序列的重组质粒。

本发明的第四发明目的在于提供含有该重组质 粒或该核苷酸序列的宿主细 胞。

本发明的第五发明目的在于提供该酶的应用。 为了实现本发明之目的， 采用的技术方案为：

本发明提供一种 7-木糖紫杉烷的糖基水解酶 (一种双功能的 β-木糖苷酶 -β- 葡萄糖苷酶）， 该酶代号为 LXYL-P1。 所述 7-木糖紫杉烷糖基水解酶（LXYL-P1 )的氨基酸序列包括 SEQ ID NO: 2所示序列的至少 30%—致性的氨基酸序列；

优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 40%—致性的氨基酸序列；

更优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 50%—致性的氨基酸序列；

进一步优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 60%—致性的氨基酸序列； 进一步优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 70%—致性的氨基酸序列； 进一步优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 80%—致性的氨基酸序列； 进一步优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 90%—致性的氨基酸序列。

进一步优选包括具有 SEQ ID NO:2至少 95%—致性的氨基酸序列。 或者是 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的� �代、 缺 失或添加且具有与 SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID NO: 2 衍生的蛋白质。 本发明还提供了一种编码所述 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 （LXYL-P1 ) 的核 苷酸序列或编码基因，代号为 L^/-W，其核苷酸序列具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列的至少至少 30%—致性的核苷酸序列；

优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 40%—致性的核苷酸 序列；

更优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 50%—致性的核苷 酸序列；

进一步优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 60%—致性的 核苷酸序列；

进一步优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 70%—致性的 核苷酸序列；

进一步优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 80%—致性的 核苷酸序列；

进一步优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 90%—致性的 核苷酸序列。

进一步优选包括具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3至少 95%—致性的 核苷酸序列。

来自丝状真菌的基因， 其与 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3所示的 DNA 的全部或部分， 或与和 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3所示序列互补的 DNA 的全部或部分在严格条件下杂交，并且编码具 有水解 7-木糖紫杉烷木糖基活性的 蛋白质。 本发明还提供含有该核苷酸序列、 编码 L^/-/^的重组质粒， 该质粒能够 被导入到适当宿主细胞中。 本发明还提供适当的宿主细胞，该宿主细胞可 携带 L /-/^基因序列， 该基 因序列具有 SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID NO: 3所示的至少 30%—致性的核苷酸序 列。其宿主生物可以是所述肽（LXYL-P1 )的同源产生菌， 该肽具有 SEQ ID NO:

2所示的至少 30%—致性的氨基酸序列， 也可以是异源宿主细胞。

适宜的宿主生物选自细菌、 放线菌、 酵母菌、 丝状真菌、 植物细胞或动物细 胞。

优选的细菌选自大肠埃希氏菌属 ( Escherichia species ) 芽胞杆菌属 ( Bacillus species )；

优选的放线菌选自链霉菌属 ( Streptomyces species);

优选的酵母菌选自酵母菌属（^cc/Mramyce species )、毕赤酵母菌属 Pichia species ) 裂殖酉孝母菌属 (.Schizosacchawmyce species);

优选的丝状真菌选自曲霉属 Aspergillus species )、 木霉属 iTrichoderma species ) 青霉属 .Penicillium species ) 口蘑属 ( Tricholoma species ) 香 属 .Lentinula species ) 伞菌属 (Agaricus species);

优选的植物细胞选自双子叶植物 （dicotyledon);

动物细胞选自昆虫细胞。 优选的大肠埃希氏菌属 (Escherichia species) 优选大肠杆菌 (E. coli ; 优选的芽胞杆菌属 （Bad/Zi^ species) 优选枯草芽孢杆菌 B. subtilis ', 优选的链霉菌属 (Streptomyces species) 优选变铅青链霉菌 (S. lividans); 优选的酉孝母菌属 ( Saccharomyce species ) 优选酿酒酉孝母 ( Saccharomyce cerevisiae);

优选的毕赤酵母菌属 （ΑΆ species) 优选巴斯德毕赤酵母 P. pastoris)', 优选的裂殖酵母菌属 chizosaccharomyce species ) 优选粟酒裂殖酵母 (Schizosacchawmyce pombe);

优选的曲霉属 Aspergillus species) 优选黑曲霉 (A. niger), 米曲霉 （A. oryz e ) 构巢曲霉 (A. nidulans);

优选的木霉属 Trichoderma species) 优选里氏木霉 (T. ef 绿色木霉 ( T. viride )；

优选的青霉属 (Pem'd〃 画 species)优选产黄青霉 (Pem'd〃 画 chrysogenum); 优选的口蘑属 ( Tricholoma species )优选口蘑 ( Trichoderma mongolicum) 优选的香菇属 entirmla species) 优选香菇 (L. edodes ;

优选的伞菌属 (.Agaricus species) 优选双孢蘑 (Agaricus bisporus); 优选的双子叶植物 （dicotyledon) 优选拟南芥 (Ambidopsis thaliana ;

优选的昆虫细胞优选草地贪夜蛾 Spodopterafmgiperda S 细胞。 本发明还提供了本发明的核苷酸序列、 本发明的 7-木糖紫杉烷糖基水解酶， 以及含有本发明核苷酸序列的宿主细胞的应用 。 具体而言， 所述的应用如下， 使用本领域常规的方法将该 DNA转化合适的 宿主细胞， 转化后的重组细胞， 通过其产生的重组酶， 水解各种底物， 特别是糖 苷化合物。

优选的作为底物的糖苷化合物选自含有木糖残 基的化合物或含有葡萄糖残 基的化合物； 即本发明的应用为从这类糖苷化合物上水解去 除木糖基和 /或葡萄 糖基。

优选的含有木糖残基的化合物选自紫杉烷木糖 苷类化合物； 所述的底物优 选含 7-木糖残基的紫杉烷类化合物， δΡ， 7-木糖紫杉烷， 可以是天然形成的、 或 是非天然产生的， 如化学或生物合成的、 或半合成的。

本发明的 7-木糖紫杉烷糖基水解酶的应用优选是用于 7-木糖紫杉烷的生物 转化或生物催化制备 7-羟基紫杉烷。

作为底物 7-木糖紫杉烷包括但不限于如下化合物： 7-木糖 -10-去乙酰紫杉 醇、 7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱、 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 (：、 7-木糖 -10-去 乙酰巴卡亭 I I I、 7-木糖紫杉醇、 7-木糖三尖杉宁碱、 7-木糖紫杉醇 (：、 7-木糖 巴卡亭 Π Ι ; 水解去除木糖基后得到的产物包括但不限于： 10-去乙酰紫杉醇、 10-去乙酰三尖杉宁碱、 10-去乙酰紫杉醇 (：、 10-去乙酰巴卡亭 I I I、 紫杉醇、 三 尖杉宁碱、 紫杉醇 (：、 巴卡亭 I I I。

这些底物单独或彼此混合或与其他紫杉烷相混 合。

所述的底物也可选自含木糖残基的紫杉烷类化 合物的混合物，这类混合物包 括但不限于红豆杉属 ( T 植物组织， 优选的红豆杉属植物选自欧洲红豆杉

( T. baccata) , 短叶红豆杉 T. brevifolic 、 喜马拉雅红豆杉 T. wallichiana 曼地亚红豆杉（7： m ")、中国红豆杉（7： cfe '腦^ )、云南红豆杉（7： y醒匿 ';？）、 以及东北红豆杉 （7： cuspidate , 或者是这些植物的细胞培养物， 或者是能够产 生 7-木糖紫杉烷类化合物的微生物细胞培养物。 这里所述的植物组织包括植物 的根、 针叶、 树皮以及整个苗木。 本发明提供的方法中制备的紫杉醇或其类似物 （产物）， 以及所用的 C-7-木 糖紫杉烷原料 （底物）， 其结构特征如通式 I所示。 = Xylose

通式 I 化

7 -木糖 -10-去

10-

7-

-木糖 -lo-去乙酰

10-去乙酰

7-木糖

7-木糖 -10-去乙酰巴卡亭 III， XDB Xylose 676

H H

10-去乙酰巴卡亭 III， DB H 544

7-木糖巴卡亭 III， XB Xylose 718

H Ac 巴卡亭 III H 586

注： Ph为苯基， Bz为苯甲酰基， Ac为乙酰基 溶解底物的溶剂可以选自： 水、 甲醇、 乙醇、 乙酸乙酷 丙酮、 正己烷、 氯 仿、 二氯甲烷、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺 （DMF ) 、 二甲基亚砜 （DMSO )。

本发明的应用还包括将本发明的糖基水解酶用 于改善面包特性，改善动物伺 料特性， 生产 D-木糖用于制造木糖醇， 和再生纸脱墨等。 本发明的糖基水解酶 还可与纤维素酶 （ _ce ll _u l _ases )及半纤维素酶 （ hemicellulases )等合用， 水解木质 纤维获取单糖进而制备乙醇、丁醇等生物燃料 。本发明的糖基水解酶还可从其它 糖苷类化合物上释放出生物活性分子， 应用于医药领域。

本发明还提供了一种紫杉醇及其类似物的生物 转化制备方法：以 7-木糖紫杉 烷为原料，利用含有本发明基因序列的宿主细 胞或其产生的酶水解除去原料上的 木糖基， 得到紫杉醇或其类似物。优选的宿主细胞为口 蘑科的真菌或重组菌， 更 优选的为毕赤酵母属的巴斯德毕赤酵母 （简称毕赤酵母）。 总而言之，本发明的双功能的糖基水解酶，其 氨基酸序列包括 SEQ ID NO: 2 所示序列的至少 30%—致性的氨基酸序列， 能被用于从 7-木糖紫杉烷或其他糖 苷化合物上去除木糖或葡萄糖。 本发明亦涉及含有上述核苷酸序列的重组质粒 、 以及含有上述核苷酸序列的宿主细胞。本发明 还涉及 7-木糖紫杉烷糖基水解酶或 含有 7-木糖紫杉烷糖基水解酶的宿主细胞在水解去� ��木糖基和 /或水解去除葡萄 糖基方面的应用。 本发明提供的一种能明确其氨基酸序列的双功 能的 β-木糖苷酶 -β-葡萄糖苷 酶—— 7-木糖紫杉烷糖基水解酶， 系由一种口蘑科（Tricholomareceae)真菌香菇 (Lentinula edodes M95.33 ) 或由含有该酶编码基因的重组细胞产生， 可位于细 胞内或分泌到细胞外， 用于转化 7-木糖紫杉烷为紫杉醇或其类似物。 本发明的编码该糖基水解酶的核苷酸序列，包 括完整的开放阅读框架（0RF) 可以用来构建各种不同类型的重组表达质粒， 后者被转移到原来的真菌或其他真 菌宿主、 或者被转移到原核细胞 （包括大肠杆菌、 放线菌）、 植物细胞和动物细 胞等宿主细胞，由于该糖基水解酶基因的表达 可以使这些宿主获得水解 7-木糖紫 杉烷为 7-羟基紫杉烷的能力。 重组的宿主还可以用于其他含糖化合物的生物 转 化。

本发明的应用还包括将本发明的糖基水解酶用 于改善面包特性，改善动物伺 料特性， 生产 D-木糖进而用于制造木糖醇， 和再生纸脱墨等。 本发明的糖基水 解酶还可与纤维素酶 （cellulases )及半纤维素酶 （hemicellulases)等合用， 水解 木质纤维获取单糖进而制备乙醇、丁醇等生物 燃料。本发明的糖基水解酶还可从 其它糖苷类化合物上释放出生物活性分子， 应用于医药领域。 有益技术效果 本发明首次克隆并异源表达了能专一性地催化 7-木糖紫杉烷为 7-羟基紫杉 烷的糖基水解酶的基因， 制备出具有该酶活性的生物工程菌， 为大规模制备 7- 羟基紫杉烷提供了新的、 有效的途径。 术语和简称

CDS是指一个基因中编码蛋白的序列， 从起始密码子到终止密码子。

附图说明

图 1. 真菌 M95.33蛋白提取物中 β-木糖苷酶 -β-葡萄糖苷酶的 Phenyl Sepharose 疏水柱层析 （A) 和 XDT转化的薄层层析 （TLC) ( B)。

A: PI , LXYL-P1的活性洗脱峰； P2， LXYL-P2的活性洗脱峰。 横坐标为 不同流份 （不同分部收集管序号）， 纵坐标为 A405 (405nm) 时的吸光值

B: 1, XDT (对照）； 2， DT (对照）； 3 , LXYL-P1生物转化 XDT; 4. LXYL-P2 生物转化 XDT。 图 2. LXYL-P1的 SDS-PAGE电泳图。 1， 蛋白质分子量标记； 2， LXYL-P1还原 处理； 3， LXYL-P1非还原处理。箭头表示用于 LC-MS/MS分析的蛋白条带。 图 3. 重组酵母菌落 PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳。 M， 分子量标记； 1， 重组菌 GS115-9K (对照， 转入 pPIC9K ) ; 2， 重组菌 GS115-9K-P1-2 (转入 pPIC9K-Pl-2); 3， 重组质粒 pPIC9K-Pl-2 (对照）。 图 4. 重组菌 GS115-9K-P1-2和 GS115-9K (对照） β-木糖苷酶活性的比较。 图 5. 重组菌 GS115-9K-P1-2转化 XDT的 HPLC分析。 Α，转化前； Β，转化后。 图 6. 重组菌 GS115-3.5K-P1-2转化 7-木糖紫杉烷混合物的 HPLC分析。， A为混 合底物（对照）； B为导入空载体的重组酵母 +混合底物（对照）； C为导入 Lxyl-pl 基因的重组菌 +混合底物。 1、2、3分别代表 7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱（XDC)、 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 （XDT)、 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C (XDTC) ； 1'、 2' 和 3'分别为各自对应的 7-羟基紫杉烷产物 10-去乙酰三尖杉宁碱 （DC) 、 10-去 乙酰紫杉醇 （DT)、 10-去乙酰紫杉醇 C (DTC) 。 图 7. 重组菌 GS115-3.5K-P1-2转化 7-木糖 -10-去乙酰巴卡亭 III的 HPLC分析 （保 留时间为 2min的溶剂峰在 XDT之前）。 图 8. PCR扩增过程示意如图。 具体实施方式

本发明通过下列实施例予以进一步阐明， 这些实施例是仅用于说明性的， 而不是 以任何方式限制本发明权利要求的范围。 实施例 1: 香菇 P-木糖苷酶 -P-葡萄糖苷酶 （ LXYL-P1) 的纯化 真菌 M95.33的培养： 从培养好的菌种斜面挑取约 lcm ² 见方的菌苔， 接种到 100 ml无菌的麦麸液体培养基中 [麦麸培养基成分， 每升含： 麦麸 50.00g (加适 量水， 煮沸 30min， 过滤去渣）， 蛋白胨 20.00g， KH ₂ P0 ₄ 1.50g, MgSO ₄ 0.75g， 自然 pH〜6.3]， 25〜26。C、 160 rpm摇瓶培养 6-8d。

糖基水解酶的分离纯化与分析： 过滤收集菌丝， 加入液氮研磨后， 按照 3〜5 倍体积加入 50 mM Tris-HCl (pH8.0) 蛋白裂解液， 冰浴超声处理 5min (130 W, 10 秒 /次， 间隔 10秒）。 离心 （12000rpm, lOmin) 后收集上清为粗酶液,用于进 一步分离纯化。

以对硝基苯基 -β-D-木糖苷 （PNP-Xyl)作为特异性生色底物对有 β-木糖苷酶 活性的蛋白进行跟踪。一个酶单位定义为在 50 °C， pH5.0, 以 PNP-Xyl 为底物， 1 min内催化产生 1 nmol对硝基酚所需要的酶量。

DEAE Sepharose FF阴离子交换柱（1.6 cmX20 cm), 用 Tris-HCl 缓冲液（50 mM, pH8.0)平衡， 将上述粗酶液（80〜90ml/次）上柱， 用含有 0、 0.1、 0.25 和 2.0 MNaCl的 50 mM Tris-HCl 缓冲液 （pH 8.0) 阶段梯度洗脱 （流速 2ml/min)， 收集有酶活性的 0.1〜0.25 M NaCl洗脱组分并加入 1 M (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 用于下一步层 析。

Phenyl Sepharose疏水柱（1.6 cmX20 cm)用含有 1 M (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 的（50 mM, pH8.0)平衡， 将上一步洗脱组分上柱， 用含有 1.0〜0M(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 的 Tris-HCl 缓 冲液（50mM， pH8.0)线性梯度洗脱（流速 2ml/min)， 收集有活性的酶活组分， 用 Tris-HCl 缓冲液 （50mM， pH8.0) 透析。

透析后的溶液上 DEAE Sepharose FF 阴离子交换柱 [1.6 cmX20 cm, 用 Tris-HCl 缓冲液 (50 mM, pH 8.0) 平衡]， 用含有 0.1〜0.25 M NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液（50mM， pH8.0)线性梯度洗脱（流速 2ml/min)， 收集酶活最高的组分， 浓縮后上 Sephacryl S200 HR分子筛层析柱 [1.6 cmX60 cm，用含有 0.1M NaCl 的 Tris-HCl缓冲液 (50 mM, pH8.0)平衡]， 用含有 0.1 M NaCl的 Tris-HCl缓冲 液 （50mM， pH8.0)洗脱 （流速 2ml/min)， 收集酶活最高的组分， 最终得到纯 化的酶。 以上纯化过程可归纳为：

真菌 M95.33培养

液氮研磨菌丝、 裂解得总蛋白提取液

DEAE Sepharose FF阴离子交换柱

(1.6x20cm), 阶段洗脱收集 0.1~0.25 M

NaCl洗脱组分

Phenyl Sepharose疏水柱

(1.6x20cm), 1.0-0 M (NH4)2S04

线性洗脱

DEAE Sepharose FF阴离子交换柱

(1.6x20cm)， 0.1-0.25 M NaCl

线性洗脱

Sephacryl S200 HR分子筛

( 1.6 cmx60 cm)

SDS PAGE检测 · <—

PI的各个阶段纯化结果归纳于表 1。

寸 0 表 1 _:

体积 总蛋白 总活力 比活力 回收率 纯化倍数 纯化步骤

( ml) ( mg) (U) (U/ mg) (%)

粗酶液 510 527.8 4099550.9 7767.2 100 1

DEAE Sepharose

225 91.8 1384245.0 15078.9 33.77 1.94 FF

Phenyl Sepharose 120 8.27 1103753.3 133464.7

DEAE

Sephacryl S200

3 0.048 161373.8 3361954.7

HR 用 Phenyl Sepharose疏水柱线性梯度洗脱时得到两个独立的 具有 β-木糖苷酶 活性的峰， 分别命名为 LXYL-P 1 (或 P 1 )和 LXYL-P2 (或 P2 )。 P 1和 P2均能 水解 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇（XDT)为 10-去乙酰紫杉醇（DT) (如图 1所示）。 其中， 在图 1中， A. 为层析得到的酶活峰； B.为 Pl、 P2酶活样品对底物 XDT 转化的薄层层析 （TLC)。 B中的 1为 XDT对照品， 2为 DT对照品， 3为 P1 转化 XDT, 4为 P2转化 XDT。 后经 LC-MS/MS De novo测序结果分析， 推定 P1与 P2具有相同的氨基酸残基序列， 但为不同的糖基化类型。

实施例 2: LXYL-Pl (或 PI ) 蛋白水解不同糖苷类底物的特异性实验：

除了具有 β-木糖苷酶活性， 尤其是具有水解 7-木糖紫杉烷的活性以外， LXYL-P1 (或 P1 ) 对其他糖苷化合物的特异性也进行了试验： 选取 4种生色底 物：

对硝基苯基 -β-D-葡萄糖苷（ p-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside, PNP-Glc )、 对硝基苯基 -β-D-半乳糖苷 （ p-Nitrophenyl-P-D-galactopyranoside, PNP-Gal )、 对硝基苯基 -α-L-阿拉伯糖苷 （p-Nitrophenyl a-L-arabinopyranoside, PNP-Ara) 禾口

对硝基苯基 -β-D-木糖苷 ( -Nitrophenyl beta-D-xylopyranoside , PNP-Xyl) (对 昭、），，

均用 50 mM的醋酸缓冲液配制成 5 mM、 pH 5.0的溶液。

取实施例 1得到的 25 μΐ纯化的 P1蛋白稀释液， 加 100 μΐ生色底物， 50 °C，

20 min , 用 2 ml 饱和硼酸钠溶液终止反应， 在 405 nm 处检测对硝基苯酚 (p-nitrophenol ) 释放情况 （吸光值）。 结果显示： P1 蛋白能水解 PNP-Glc 和

PNP-Xyl, 不能水解 PNP-Gal和 PNP-Ara， 结果见表 2。

表 2:

底物 OD _4Q5 值 相对活力 (%对照：) p- ■nitrophenyl-P-D-xylopyranoside (PNP-Xyl) 0.745 100 p- ■nitrophenyl-P-D-glucopyranoside (PNP-Glc) 1.615 217 p- ■nitrophenyl-P-D-galactopyranoside (PNP-Gal) 0.000 0 p- ■nitrophenyl-a-L-arabinopyranoside (PNP-Ara) 0.000 0 实施例 3: 糖基水解酶 LXYL-P1编码基因 （Lx_)½ ) 的克隆

将实施例 1得到的 LXYL-P1经 SDS-PAGE电泳 （见附图 2 ) 后， 回收样品 经还原处理、 表观分子量在 110 KDa处的电泳条带， 进行 LC-MS/MS分析， 挑 选 5个峰值最高的肽段进行 De novo测序， 获得 5个肽段的氨基酸残基序列， 分 别为：

1. LPWTWGK

2. QSGSLPLQHPQR

3. HWLAYEQETSR

4. DLPVGDSAWTYPPR

5. TLTPLEALQK (其中 I 禾 B L无法区分， K和 Q无法区分） 应用生物信息学手段对这 5个肽段所处的相对位置进行评估， 确定了其在 LXYL-P1上的前后顺序为： 3， 2， 5， 1， 4。 根据肽段 3和 5分别设计上、 下游 简并引物：

3F1 : CTTGCGTACGAGCARGARAC

3F2: CACTGGCTTGCGTAYGARCA

3F3: CACTGGCTTGCNTAYG

5R1： AGCCTCCAGTGGCGTNAGNGT

5R2: CTGCAGAGCCTCCAGNGGNGT

5R3: TTCTGCAGAGCCTCNAGNGG

以真菌 M95.33总 R A为模板， 应用上述简并引物进行 nest-PCR扩增。 PCR产 物经证实含有肽段 3, 2和 5编码序列后， 再利用 RACE技术向两端扩增得到包 含上述 5个肽段编码区的 cDNA片段， 该片段含有 2412bp的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF，或称为 CDS, 命名为 Lxyl-pJ )，编码 803个氨基酸。该 cDNA 序列 SEQ ID NO : 3及其编码的氨基酸序列 SEQ ID NO : 2如附录所示。 其 PCR扩 增过程如图 8所示：

根据此 cDNA序列设计特异性引物， 以真菌 M95.33基因组 DNA为模板， 进行 PCR扩增和染色体步移 （Genome Walking) , 获得 LXYL-P1的结构基因序 列 ( G-lxyl-pl 。 在基因组水平， 该基因含有 19个外显子和 18个内含子， 从起 始密码子 ATG到终止密码子 TGA共有 3608bp， 其核苷酸序列 SEQ ID NO : 1如 附录所示。 实施例 4: 重组质粒的构建和重组酵母菌的筛选

将实施例 3得到的 P1编码区的 ORF CLxyl-pl ) 通过 PCR方法在其 5'-、 3'- 端分别引入 ΛίβΒ I和 Not I酶切位点， ΛίοΒ VNot I双酶切后将其连接到同样用 SnaB Ι/Λ¾ I双酶切的毕赤酵母表达载体 pPIC9K (分泌型表达载体）或 pPIC3.5K (非分泌型表达载体） 上， 形成重组表达质粒 pPIC9K-Pl-2 或 pPIC3.5K-Pl-2。 重组质粒通过 Sac l单酶切线性化， 电转入毕赤酵母 GS115感受态细胞， 同时， 以空载体 PPIC9K或 pPIC3.5K用同样方法电转入毕赤酵母 GS115感受态细胞作 为对照。 将转化后的酵母细胞涂布到 MD平板 [每升含： 葡萄糖 20.00g， 无氨基 酵母氮源 （YNB ) 13.40g， 生物素 0.4mg， 琼脂 15.00g]上， 28 °C培养 2〜3天后 挑取单菌落接种到 YPD-Geneticin®抗性平板上 （每升含： 酵母提取物 10.00g， 蛋白胨 20.00g， 葡萄糖 20.00g， 琼脂 15.00g， 抗生素 G418 ≤4.00g)， 继续培养 2〜3 天后筛选抗性菌落， 并对抗性菌落进行菌落 PCR 鉴定。 以 pPIC9K 和 PPIC9K-P1-2的转化子为例 （附图 3 ) :

PCR引物分别与 PPIC9K载体上克隆位点两侧的 序列相匹配： 正向： 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3'；

反向： 5' GGCAAATGGCATTCTGACATCC 3'。

空载体 pPIC9K转化菌株扩增出 492bp的片段， 而重组质粒 pPIC9K_Pl_2及 其转化菌株均能扩增出 2910bp的片段。 其中， 图 3中 1为导入空载体 pPIC9K 的重组酵母基因组对照扩增结果； 2为导入 pPIC9K-Pl-2的重组酵母基因组扩增 结果； 3为 pPIC9K-Pl-2重组质粒对照扩增结果。

用于培养重组酵母菌的种子和发酵培养基分别 为 BMGY (每升含： 酵母提取 物 10.00g，蛋白胨 20.00g，磷酸钾缓冲液 100 mM, pH 6.0，甘油 10ml)和 BMMY (用 10ml甲醇代替 BMGY中的 10ml甘油作为碳源） 培养基。 将筛选到的抗性 菌株接种到 10 ml种子培养基中， 30 °C， 220 rpm培养 18 h，离心洗涤菌体 2次， 并将菌体转入 50 ml发酵培养基， 30 °C， 220 rpm培养， 每隔 24 h补加 1 %的甲 醇诱导重组蛋白的表达， 定时取样观察重组菌的酶活力。菌体经蒸馏水 离心洗涤 两遍后用同样体积蒸馏水悬浮， 取 50 μΐ悬浮液加入 100 μΐ 5 mM PNP-Xyl, 30〜55 °C反应 20 min, 可见到重组菌具有水解底物 PNP-Xyl的能力， 而转入空 载体的对照菌没有酶活性 （见附图 4)， 另外， 重组菌的发酵液上清部分尚未检 测到明显活性， 说明重组酶主要位于细胞内。 实施例 5: 重组酵母菌水解 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇（XDT)

将实施例 4得到的重组酵母菌 GS115-9K-P1-2 (分泌型表达重组质粒转化 子）按照实施例 4的方法诱导培养 5天， 离心收集并洗涤细胞， 直接或冷干后用 pH 3.5- 7.5的 50mM醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液悬浮细胞（65 mg湿细胞 / ml, 或 16 mg干细胞 / ml), 作为水解反应液。 在 20 ml菌体反应液中加入 0.5 ml的 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇（XDT)溶液， 至 XDT终浓度为 0.625 mg/ml, 30-55 °C 水浴， 往返震荡 12 h。

反应结束后用乙酸乙酯萃取， 经 TLC分析底物已完全转化， HPLC [条件： 色谱柱： Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6x 150 mm, 5 μηι),流动相：乙睛 (38 %〜52%)， 流速： 1 ml/min， 柱温： 28 °C， 检测波长： 230 nm] 分析萃取物中底物 XDT和 产物 DT含量， 转化率为 98.80 %。

重组酵母菌水解 XDT反应结果的 HPLC分析如图 5所示，其中 A为转化前， B为转化后。 实施例 6: 重组酵母菌水解 7-木糖紫杉烷混合物

将实施例 4得到的重组酵母菌 GS115-3.5K-P1-2 (非分泌型表达重组质粒转 化子）进行如下生物转化反应， 转化底物为 7-木糖紫杉烷混合物， 主要成分含量 为： 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 62.12 %， 7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱 12.75%， 7- 木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C 17.04%, 其它成分约占 8.09%。

重组菌培养方法同实施例 5。 在 200 ml重组菌反应液中加入 16 ml浓度为

100 mg/ml 的 7-木糖紫杉烷混合物， 至 7-木糖紫杉烷混合物终浓度为 8 mg/ml (过饱和状态）。 以导入空载体的重组酵母作为阴性对照。 30〜55 °C、 磁力搅拌 混合 24 ho反应结束后按照实施例 5的方法用 HPLC分析转化体系中底物和产物 含量 （附图 6)， 转化率分别为： 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 （XDT) 92.45%, 7-木 糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱 （XDC) 93.60%, 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C (XDTC) 92.00% 三种主要产物的产率分别为： 10-去乙酰紫杉醇 (DT) 3.27 mg/ml, 10- 去乙酰三尖杉宁碱 （DC) 0.74 mg/ml, 10-去乙酰紫杉醇 C (DTC) 0.92 mg/ml， 三者之和为 4.93 mg/ml; 而对照则不具备上述活性 （附图 6)。

附图 6中， A为混合底物（对照）； B为导入空载体的重组酵母 +混合底物（对 照）； C为导入 Lxyl-pl基因的重组菌 +混合底物。 1为 7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁 碱； 2为 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇； 3为 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C; 1'、 2'和 3' 分别为对应的 7-羟基紫杉烷产物。 实施例 7: 重组酵母菌水解 7-木糖巴卡亭 III (XDB)

菌株同实施例 6， 底物为 7-木糖 -10-去乙酰巴卡亭 I I I (XDB)。 在 1.5 ml菌 体反应液中含有 16mg干细胞 /ml， 8 mg XDB/ml, 30〜55°C水浴，往返震荡 24 h。

HPLC分析结果显示： XDB 的转化率为 86.54%， 10-去乙酰巴卡亭 III (DB ) 的 产率为 5.57 mg/ml (附图 7)。