Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Hydrogele, Verfahren zu ihrer Herstel lung sowie ihre Verwendung.

Stand der Technik

Hydrogele sind dreidimensionale Netzwerke von vernetzten hydro philen Polymeren, welche einen hohen Anteil an Wasser enthal- ten. Solche Materialien sind bekannt als Matrixmaterialien für biologische Anwendungen wie Wirkstofftransport, Wundmateria lien, Gewebezüchtung und können auch in der Zellkultur verwen det werden. Durch ihre wässrige und poröse Struktur erlauben sie einen guten Transport von Nährstoffen zu den Zellen.

Viele natürliche oder synthetische Polymere wurden bereits zur Herstellung von Hydrogelen verwendet, beispielsweise Collagen, Gelatine, Polyethylenglykol (PEG) . Zur Vernetzung der Hydrogele wurden unterschiedliche Reaktionen und Mechanismen untersucht, beispielsweise Photopolymerisation, Michaeladdition oder ähnli che . Gerade die Steuerung der Vernetzungsreaktion ist eine große Herausforderung. Insbesondere wenn das Hydrogel zur Umhüllung von Zellen erzeugt werden soll. Polymerisiert das Gel zu schnell, ist es häufig nicht homogen vernetzt. Wenn es zu lang sam polymerisiert, können sich die einzuschließenden Bestand teile, z. B. Zellen, ablagern und werden nicht homogen einge schlossen .

Aufgabe

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung ei nes Hydrogels bereitzustellen, welches eine Verwendung insbe sondere zur Umhüllung von Zellen erlaubt. Es ist außerdem Auf gabe, ein entsprechendes Hydrogel und seine Verwendung bereit zustellen .

Lösung

Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindungen umfassen auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinati onen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen.

Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels umfassend folgende Schritte :

a) Herstellen einer Zusammensetzung umfassend

al) mindestens ein Makromer umfassend als funktionelle Gruppen mindestens zwei Thiolgruppen, a2) mindestens ein Makromer umfassend als funktionelle Gruppen mindestens zwei aromatische oder heteroaromati sche Gruppen, die jeweils mit mindestens einer Sul- fonylgruppe substituiert sind, wobei mindestens eine Komponente al) oder a2) mindestens drei der genannten funktionellen Gruppen aufweist;

b) Reaktion der beiden Makromere über die funktionellen Gruppen unter Bildung eines Hydrogels.

Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrie ben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angege benen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.

Unter einem Makromer wird eine Verbindung verstanden, welche eine mittlere molare Masse von unter 500 kDa aufweist, bevor zugt von unter 100 kDa, insbesondere von unter 50 kDa. Die mittlere molare Masse wird als gewichtsmittleres Molekularge wicht mit Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) bestimmt.

Besonders bevorzugt sind Makromere mit einer mittleren molaren Masse von unter 50 kDa, insbesondere von unter 30 kDa.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung liegt die mittlere molare Masse eines Makromers zwischen 100 Da und 500 kDa, bevorzugt zwischen 200 Da und 200 kDa, insbesondere zwi schen 800 Da und 100 kDa.

Wichtig ist dabei, dass das Makromer die entsprechenden funkti oneilen Gruppen trägt und diese zur Reaktion zur Verfügung ste hen . Bevorzugt sind dabei Makromere, welche 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 funktionelle Gruppen aufweisen, bevorzugt 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8 funktionelle Gruppen, besonders bevorzugt 2, 3, 4, 5 oder 6 funktionelle Gruppen, insbesondere 2, 3 oder 4 funktio neile Gruppen aufweisen.

Unter Bildung des Hydrogels bedeutet, dass durch die Vernetzung ein Hydrogel gebildet wird. Es finden also ausreichend Vernet zungsreaktionen statt. Dies kann durch die Art und Menge der eingesetzten Komponenten gesteuert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist mindestens eine Komponente al) oder a2) mindestens 4 der genannten funkti oneilen Gruppen auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform weisen beide Komponenten al) und a2) mindestens 3, bevorzugt mindestens 4, der genannten funktionellen Gruppen auf. Besonders bevorzugt weisen beide Komponenten al) und a2) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 funktionei le Gruppen auf, bevorzugt 3, 4, 5, 6, 7, 8 funktionelle Grup pen, besonders bevorzugt 3, 4, 5 oder 6 funktionelle Gruppen, insbesondere 3 oder 4 funktionelle Gruppen.

Bevorzugt sind wasserlösliche Makromere. Dies bedeutet, dass die Makromere in notwendigem Maße unter den Bedingungen der Re aktion in Lösung vorliegen.

Bevorzugt sind Makromere basierend auf Oligomeren oder Polyme ren. Es können natürliche oder künstliche Oligomere oder Poly mere sein. Beispiele für künstliche Oligomere oder Polymere sind Poly (meth) acrylate wie Poly (meth) acrylamide, Po- ly (meth) acrylsäure, PolyHPMA oder PolyHEMA, Polyethylenglykol (PEG) , Polyvinylalkohol (PVA) , Polyurethan (PU) , Polyvinylpyr- rolidon (PVP), Polyamide, Poly ( amidoamine ) (PAMAM) , Polyester, Polylactide, Polyglycolsäure (PGA) oder Poly ( lactid-co- glycolid) (PLGA) , Polyanhydride, Poly (ortho) ester, Polyacetale, Poloxamere (Blockcopolymere aus Ethylenoxid (PEG) und Propylen oxid (PPG) ) wie PEG-Co-PPG-Co-PEG) , Poly-2-oxazoline, Polyphos- phazene, Polyglycerin, Polyamine wie Polylysin oder Polyethyl enimin (PEI), Polycarbonate, Polyglutaminsäure, insbesondere Poly-Gamma-Glutaminsäure, Polyasparaginsäure (PASA) , Polyphos- phonate, oder natürlichen Oligomeren wie DNA, RNA, Gelatine, Polyhydroxyalkanoate (PHA) , Poly-Gamma-Glutaminsäure, Proteine oder Peptide wie Kollagene, VPM, Albumin oder Fibrin, Polysac- ccharide wie Agarose, Chitin, Chitosan, Chondroitin, Mannan, Inulin, Dextran, Cellulose, Alginate oder Hyaluronsäure. Bevor zugt sind Oligomere basierend auf Polyethylenglykol. Die Oligo mere und Polymere sind mit den entsprechenden funktionellen Gruppen funktionalisiert .

Im Falle der Oligomere auf Peptidbasis werden die Thiolgruppen bevorzugt durch die entsprechenden Aminosäuren wie Cystein oder Homocystein bereitgestellt. Auf Peptidbasis bedeutet dabei, dass das entsprechende Oligomer zu mindestens 80 % der moleku laren Masse aus natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren auf gebaut ist. Solche Oligomere weisen daher mindestens zwei Thi olgruppen auf, insbesondere mindestens zwei Cystein.

Die zumindest teilweise Verwendung von natürlichen Polymeren erlaubt auch die Einführung von spezifisch spaltbaren Stellen im Hydrogel, beispielsweise durch Enzyme.

Es kann erforderlich sein, dass die funktionellen Gruppen über einen kurzen Linker an das Oligomer oder Polymer gebunden wer den, beispielsweise über eine oder mehrere Ester, Ether oder Amidbindungen. Bevorzugt sind Linker mit einer molaren Masse von unter 1500 mol, bevorzugt von unter 800 mol, insbesondere unter 500 mol oder unter 200 mol.

Die Thiolgruppen liegen bevorzugt als freie Thiolgruppen vor.

Es ist auch möglich, dass sie mit Gruppen versehen sind, welche vor der Bildung des Hydrogels abgespalten werden.

Das Makromer a2) ist ein Makromer umfassend mindestens zwei aromatische Gruppen, die jeweils mit mindestens einer Sul- fonylgruppe substituiert sind. Bevorzugt sind Gruppen der For mel ( 1 ) :

M-Ar-SC^-R ¹ (1) wobei Ar für eine elektronenarme Arylgruppe oder elektronenarme Heteroarylgruppe steht. Dadurch ist es möglich Reaktionsbedin gungen zu wählen, bei welchen die Thiolgruppen des ersten Mak- romers eine nukleophile aromatische Substitution an der Gruppe Ar durchführen können, wobei die Gruppe SO2-R ¹ als Abgangsgruppe dient .

M steht für eine bevorzugt kovalente Verbindung zum Makromer und ist bevorzugt eine Einfachbindung, Ether, oder Car- bonylgruppe. Die Carbonylgruppe kann Teil einer Ester oder Amidbindung sein. So können als Gruppe Ar die entsprechenden Ester oder Amide zur Ankopplung an das Makromer verwendet wer den, wie beispielsweise entsprechend substituierte Benzoesäu reester oder Benzoesäureamide.

Eine Arylgruppe im Sinne dieser Erfindung enthält 6 bis 40 C- Atome; eine Heteroarylgruppe im Sinne dieser Erfindung enthält 1 bis 40 C-Atome und mindestens ein Heteroatom, mit der Maßga be, dass die Summe aus C Atomen und Heteroatomen mindestens 5 ergibt. Die Heteroatome sind bevorzugt ausgewählt aus N, 0 und/oder S. Dabei wird unter einer Arylgruppe bzw. Heteroa rylgruppe entweder ein einfacher aromatischer Cyclus, also Ben zol, bzw. ein einfacher heteroaromatischer Cyclus, beispiels weise Pyridin, Pyrimidin, Thiophen, etc., oder eine kondensier te Aryl- oder Heteroarylgruppe, beispielsweise Naphthalin, Naphthalimid, Anthracen, Chinolin, Isochinolin, etc., verstan den .

Unter einer elektronenarmen Arylgruppe oder Heteroarylgruppe wird eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe verstanden, dessen n-Elektronendichte durch negative Induktionseffekte oder nega tive Mesomerieeffekte (-I-Effekte bzw. -M-Effekte) verringert ist. Eine Aufstellung von Substituenten oder Gruppen, die diese Effekte hervorrufen, findet sich in jedem Standardlehrbuch der organischen Chemie. Als Beispiele seien ohne Beschränkung ge nannt für -I-Substituenten : OH, Halogene, insbesondere Fluor und Chlor, NO2, ungesättigte Gruppen; für -M-Substituenten : NO2, CN, Arylgruppen oder Heteroarylgruppen. Diese elektronenziehen den Gruppen (EWG, engl, "electron withdrawing groups") müssen natürlich in Konjugation zur Abgangsgruppe -SO2-R ¹ stehen, d.h. bei Carbocyclen in ortho- oder para-Stellung, um den gewünsch ten Effekt ausüben zu können. Im Falle von Heteroarylgruppen tragen die Heteroatome entsprechend abhängig von ihrer Position zur Verringerung der Elektronendichte bei. Es können auch meh rere verschiedene Gruppen vorhanden sein.

Beispiele für elektronenarme Arylgruppen sind Nitrobenzole, Benzaldehyde, Benzonitrile, Benzoesäureester, welche noch mit einer oder mehreren Gruppen R ² wie nachstehend definiert substi tuiert sein können. Beispiel für eine solche Arylgruppe sind Verbindungen auf der Grundlage von Nitrobenzoesäure mit 1 oder 2 Nitrogruppen, beispielsweise Nitrobenzoesäureester oder Nit- robenzoesäureamide, welche mindestens an einer Position eine -SCh-Rt-Gruppe aufweisen. Bevorzugt ist diese Gruppe in Metapo sition zu einer Nitrogruppe angeordnet. Besonders bevorzugt ist eine Nitrogruppe in 3-Position und die -SCh-RG-Gruppe in 4— Position. Beispiele für eine solche Verbindung ist 3-Nitro-4- Sulfomethyl-Benzoesäure .

Beispiele für elektronenarme Heteroarylgruppen sind beispiels weise einkernige Heteroaromaten wie Pyridine, Pyrimidine, Pyra- zine, Pyridazine, Triazine, wie 1 , 3 , 5-Triazin, 1 , 2 , 4-Triazin oder 1 , 2 , 3-Triazin, Tetrazine, wie 1 , 2 , 4 , 5-Tetrazin, 1,2, 3, 4- Tetrazin oder 1 , 2 , 3 , 5-Tetrazin, Oxazole, Isooxazol, Thiazole, wie 1,2-Thiazol oder 1,3-Thiazol, Isothiazol, Oxadiazole, wie 1 , 2 , 3-Oxadiazol , 1 , 2 , 4-Oxadiazol , 1 , 2 , 5-Oxadiazol und 1,3,4- Oxadiazol, Thiadiazole, wie 1 , 2 , 3-Thiadiazol , 1 , 2 , 4-Thiadiazol , 1 , 2 , 5-Thiadiazol oder 1 , 3 , 4-Thiadiazol , Imidazol, Pyrazol, Tri azole, wie insbesondere 1 , 2 , 4-Triazol oder 1 , 2 , 3-Triazol , Tet- razol, mehrkernige Heteroaromaten, wie Chinoline, Isochinoline, Naphthalimid, Benzimidazol, Benzoxazol, Benzothiazol , Benzopy- ridazin, Benzpyrimidin, Chinoxalin, Benzotriazol , Purin, Pteri din, Indolizin und Benzothiadiazol , welche noch mit einer oder mehreren Gruppen R ² wie nachstehend definiert substituiert sein können .

Bevorzugte Heteroarylgruppen sind Oxadiazole und Benzothiazol.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Ar eine mehrkernige Heteroarylgruppe oder eine einkernige Heteroa rylgruppe, welche mit mindestens einer weiteren Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, bevorzugt Phenyl substituiert ist.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist Ar eine Oxadiazolgruppe, insbesondere eine 1, 3, 4-Oxadiazolgruppe, welche bevorzugt mit mindestens einer Phenylgruppe substituiert ist, insbesondere mit einer Phenylgruppe.

In einer weiteren Aus führungs form ist Ar eine Arylgruppe, wel che mit mindestens einen -I oder -M-Substituenten trägt, bevor zugt 1 oder 2, bevorzugt F oder NO2, besonders bevorzugt NO2.

R ¹ steht für N(R ² )2, eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen oder eine verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 20 C-Atomen, oder eine Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 2 bis 20 C-Atomen oder eine verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 20 C-Atomen, wobei die Alkyl-, Alkenyl- oder Alki nylgruppe jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² substituiert sein kann und wobei eine oder mehrere nicht benachbarte CH2- Gruppen durch 0, NR ² , S, R ² C=CR ² , C^c, C=0, C (=0) 0 oder C(=0)NR ² ersetzt sein können, oder eine Arylgruppe oder Heteroarylgrup pe, die jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² substituiert sein kann.

R ² ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden H, D, F, CI, Br, I, N(R ³ ) ₂ , CN, NO2, OR ³ , SR ³ , C (=0) OR ³ , C(=0)N(R ³ ) ₂ , C(=0)R ³ , eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 20 C Atomen oder eine Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 2 bis 20 C-Atomen oder eine verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 20 C-Atomen, wobei die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe jeweils mit einem oder mehreren Resten R ³ substituiert sein kann, wobei eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen durch R ³ C=CR ³ , C^c, C=0, NR ³ , 0, S, C (=0) 0 oder C(=0)NR ³ ersetzt sein können, oder eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, die jeweils mit einem oder mehrere Resten R ³ substituiert sein kann.

R ³ ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden H, D, F, OH, oder ein aliphatischer, aromatischer und/oder heteroaromati- scher organischer Rest, insbesondere eine geradkettige Alkyl gruppe mit 1 bis 20 C-Atomen, in dem auch ein oder mehrere H Atome durch F ersetzt sein können.

In einer bevorzugten Aus führungs form steht R ¹ für N(R ² )2, eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen oder eine ver zweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 10 C-Atomen, wobei die Alkylgruppe jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² sub stituiert sein kann und wobei eine oder mehrere nicht benach barte CH ₂ -Gruppen durch 0, NR ² , S, C=0, C (=0) 0 oder C(=0)NR ² er setzt sein können, oder eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, die jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² substituiert sein können .

R ² ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden H, D, F, CI, Br, I, N(R ³ ) ₂ , CN, N0 ₂ , OR ³ , SR ³ , C (=0) OR ³ , C(=0)N(R ³ ) ₂ , C(=0)R ³ , eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 C Atomen oder eine Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 2 bis 10 C-Atomen oder eine verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 10 C-Atomen, wobei die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe jeweils mit einem oder mehreren Resten R ³ substituiert sein kann, wobei eine oder mehrere nicht benachbarte CH ₂ -Gruppen durch R ³ C=CR ³ , C^c, C=0, NR ³ , 0, S, C (=0) 0 oder C(=0)NR ³ ersetzt sein können, oder eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, die jeweils mit einem oder mehreren Resten R ³ substituiert sein kann.

R ³ ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden H, D, F OH oder eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen, in der auch ein oder mehrere H Atome durch F oder OH ersetzt sein kön nen .

In einer besonders bevorzugten Aus führungs form steht R ¹ für N(R ² ) ₂ , eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen oder eine verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 6 C- Atomen, wobei die Alkylgruppe jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² substituiert sein kann und wobei eine oder mehrere nicht benachbarte Cth-Gruppen durch 0, NR ² , S, C=0, C (=0) 0 oder C(=0)NR ² ersetzt sein können, oder eine Arylgruppe oder Heteroa rylgruppe mit 5 bis 10 aromatischen Ringatomen, die jeweils mit einem oder mehreren Resten R ² substituiert sein kann.

R ² ist bei jedem Auftreten gleich oder verschieden H, D, F, OH,

C (=0) OH, eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen o- der eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 10 aromati schen Ringatomen, in der auch ein oder mehrere an Kohlenstoff gebundene H Atome durch F oder NO2 ersetzt sein können.

Besonders bevorzugt steht R ¹ für eine substituierte oder unsub stituierte Methylgruppe, Ethylgruppe, Propylgruppe, bevorzugt substiuiert mit F oder COOH, oder für N(R ² )2, insbesondere für NHR ² , wobei R ² für eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 10 Ringatomen steht, in der auch ein oder mehrere an Koh lenstoff gebundene H Atome durch F, OH, NH2 oder NO2 ersetzt sein können. Insbesondere bevorzugt steht R ¹ für Methyl, CH2- COOH oder NH-Phenyl, wobei das N an die SC^-Gruppe gebunden ist.

In einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung basiert min destens ein Makromer auf Poly (meth) acrylate wie Po- ly (meth) acrylamide, Poly (meth) acrylsäure, PolyHPMA oder PolyHE- MA, Polyethylenglykol (PEG) , Polyvinylalkohol (PVA) , Po

lyurethan (PU) , Polyvinylpyrrolidon (PVP) , Polyamide, Po ly ( amidoamine ) (PAMAM) , Polyester, wie Polylactide, Polyglycol- säure (PGA) oder Poly ( lactid-co-glycolid) (PLGA) , Polyanhydri de, Poly (ortho) ester, Polyacetale, Poloxamere (Blockcopolymere aus Ethylenoxid (PEG) und Propylenoxid (PPG) ) wie PEG-Co-PPG- Co-PEG) , Poly-2-oxazoline, Polyphosphazene, Polyglycerin, Poly- amine wie Polylysin oder Polyethylenimin (PEI), Polycarbonate, Polyglutaminsäure, insbesondere Poly-Gamma-Glutaminsäure, Poly- asparaginsäure (PASA) , Polyphosphonate, und das andere Makromer auf DNA, RNA, Gelatine, Polyhydroxyalkanoate (PHA) , Poly-Gamma- Glutaminsäure, Poly-Gamma-Glutaminsäure, Peptide wie Kollagene, VPM, Albumin oder Fibrin, Polysacccharide wie Agarose, Chitin, Chitosan, Chondroitin, Mannan, Inulin, Dextran, Cellulose, Al ginate oder Hyaluronsäure. Dadurch ist es möglich in das Hydro gel eine biochemische Reaktivität zu integrieren, beispielswei se eine Spaltung oder Abbaufähigkeit, wie beispielsweise durch Estergruppen oder Carbonatgruppen im Makromer oder durch en zymatische Reaktionen. Beispiele für geeignete Peptide sind beispielsweise enzymatisch spaltbare Dithiolpeptide wie VPM (Sequenz: GCRDVPMSMRGGDRCG) .

Bevorzugt werden beide Makromere so eingesetzt, dass die Anzahl der funktionellen Gruppen SH : Ar-SCh-R ¹ der beiden Makromere, die zur Vernetzung beitragen, bei 2:1 bis 1:2 liegt, bevorzugt bei 1,5:1 bis 1:1,5, besonders bevorzugt 1,2:1 bis 1:1,2, insbeson dere bei 1:1. Werden mehrere unterschiedliche Verbindungen mit der jeweiligen funktionellen Gruppe eingesetzt, so beziehen sich die Angaben auf die gesamte Anzahl dieser Gruppen, bei spielsweise bei Verwendung von unterschiedlichen Verbindungen mit Thiolgruppen . So kann beispielsweise eine Thiolverbindung zur Modifikation und eine andere Verbindung zur Vernetzung ver wendet werden.

Bevorzugt liegen beide Makromere in Lösung vor, bevorzugt in wässriger Lösung. Es kann erforderlich sein, den pH-Wert anzu passen, bevorzugt durch Verwendung eines Puffers.

In einer bevorzugten Aus führungs form wird eine erste Lösung mit dem ersten Makromer umfassend Thiolgruppen und eine zweite Lö- sung mit dem zweiten Makromer umfassend die aromatische Sul- fonylgruppe bereitgestellt. Diese beiden Lösungen werden dann miteinander kombiniert.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert der ver wendeten Lösungen der Makromere, insbesondere der Zusammenset zung, bei 6 bis 9 (bei 25 °C) . Bevorzugt wird der pH-Wert durch einen Puffer eingestellt, bevorzugt mit einer Pufferkonzentra tion zwischen 5 mM bis 100 mM. Beispiele für Puffer sind PBS oder HEPES . Durch eine höhere Pufferkonzentration kann der pH- Wert im Gel bei Verwendung von hohen Makromerkonzentrationen stabilisert werden, da die Abgangsgruppe als Säure wirken kann. Bevorzugt ist ein pH-Wert von 6 bis 9, bevorzugt 6,5 bis 8, be sonders bevorzugt 6,6 bis 7,5. Dadurch ist es möglich die Ge lierungszeit zwischen beispielsweise 3 Sekunden (pH 8) bis 3,5 Minuten (pH 6, 6) einzustellen (Gemessen bei 25 °C bei konstan ter Makromerkonzentration) .

Es ist auch möglich die Zusammensetzung bei einem ersten pH- Wert zu konstituieren, um dann die Vernetzungsreaktion durch Änderung des pH-Werts auf einen zweiten pH-Wert zu starten. Be vorzugt ist die Vernetzungsreaktion bei dem ersten pH-Wert min destens stark verlangsamt, so liegt der erste pH-Wert bevorzugt außerhalb der vorstehend genannten Bereiche. Der zweite pH-Wert liegt bevorzugt innerhalb einem der vorstehend genannten Berei che. Die pH-Änderung kann auch dadurch erreicht werden, dass die Zusammensetzung in ein Milieu mit entsprechendem pH-Wert gegeben wird. Bevorzugt liegt der zweite pH-Wert zwischen 6 bis 9, bevorzugt 6,5 bis 8, besonders bevorzugt 6,6 bis 7,5.

Außerdem kann die Reaktion durch Veränderung des pH-Wert ge startet, bzw. beschleunigt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der Gehalt an Makromer in der Zusammensetzung bei 1 bis 30 Gew.%, bevor zugt bei 3 bis 15 Gew.%, besonders bevorzugt bei 3 bis 10

Gew.%, bezogen auf alle eingesetzten Makromere.

Die Temperatur bei der Bildung des Hydrogels liegt bevorzugt zwischen 20 °C und 45 °C, bevorzugt zwischen 20 °C und 40 °C.

Die hier beschriebene Reaktion zur Bildung der Hydrogele zeich net sich durch mehrere Vorteile aus. Im Unterschied zu bekann ten Vernetzungsreaktionen ist sie unter physiologischen Bedin gungen weder besonders schnell, noch besonders langsam, sie ist vielmehr unter anderem über den pH-Wert steuerbar. Dies ermög licht die Einkapselung von Zellen oder anderen Stoffen wie Pep tiden, Enzymen, chemischen Verbindungen oder ähnliches, während der Bildung des Gels. Die Zusammensetzung bleibt während der Bildung des Gels noch länger viskos, so dass sie noch länger mit geringen Scherkräften durchmischt werden kann. Dies ermög licht eine homogene Verteilung der Zellen im Hydrogel ohne, dass weitere Schritte, wie Wenden des Gels während der Aushär tung, erforderlich sind.

Die vorgeschlagene Reaktion ist außerdem bei physiologischen Bedingungen ausreichend schnell. Dies ermöglicht die Verwendung in Zellkulturen, bevorzugt in dreidimensionaler Zellkultur oder sogar in situ. Auch kann die Gelierung über den pH-Wert gesteu ert werden, was die Verwendung zum Aufbau von Gelen in situ, beispielsweise im 3D-Druck oder in einem Organismus ermöglicht wenn eine entsprechende Zusammensetzung injiziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bedingungen so gewählt, dass eine Gelierung innerhalb von 3 Sekunden bis 5 Mi nuten erreicht wird. Die Gelierungszeit kann dabei bevorzugt über die Makromerkonzentration, pH-Wert und Temperatur einge stellt werden. Dies erlaubt außerdem die Einstellung der physi kalischen Eigenschaften der Gele, wie Langzeitstabilität,

Quellverhalten und mechanische Eigenschaften.

Die Reaktion ist außerdem orthogonal zu OH-Gruppen, Aminogrup pen, Carbonsäuregruppen und Acrylatgruppen, welche unter physi ologischen Bedingungen nicht reagieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung trägt die Reaktion der beiden Makromere ausschließlich zur Bildung des Hydrogels bei. Es finden keine anderen Vernetzungsreaktionen statt .

Durch die Wahl der aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe, welche die Sulfonylgruppe trägt, und des pH-Werts kann die Ge schwindigkeit der Reaktion gesteuert werden. So kann die Ge schwindigkeit der Gelierung an die jeweilige Verwendung ange passt werden. Im Unterschied zu anderen Reaktionen muss kein Starter oder Beschleuniger hinzugegeben werden.

Das Verhältnis der beiden Makromere ist bevorzugt so gewählt, dass nach der Reaktion alle funktionellen Gruppen reagiert ha ben. Es kann davon abhängen, ob noch weitere Funktionalisierun- gen durchgeführt werden.

So ist es beispielsweise möglich, durch vorherige Zugabe von thiolhaltigen Verbindungen das zweite Makromer zu modifizieren, ehe die Vernetzung und Bildung des Hydrogels durch Zugabe des ersten Makromers eingeleitet wird. Dadurch kann das Hydrogel mit weiteren Funktionen modifiziert werden. Möglich sind bei spielsweise Fluorophore oder bioaktive Reagenzien. Beispiele für bioaktive Reagenzien sind Gewebewachstumspromoto ren, Chemotherapeutika, Proteine (Glykoproteine, Collagen, Lip oproteine) , Zellbindungsmediatoren, zum Beispiel Fibronectin, Laminin, Collagen, Fibrin, oder integrinbindende Sequenzen (zum Beispiel cyclo (RGDfC) oder cadherinbindende Sequenzen, Wachs tumsfaktoren, Differizierungsfaktoren oder Fragmente der vorge nannten Reagenzien. Beispiele sind epidermaler Wachstumsfaktor EGF, endothelialer Wachstumsfaktor VEGF, Fibroblastenwachstum- tsfaktoren wie bFGF, Insulinähnliche Wachstumgsfaktoren (z. B. IGF-I, IGF-II), transformierende Wachstumsfaktoren (z. B. TGF- a, TGF-ß) , DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, Aptamere oder peptido- mimetica, bevorzugt sind Zellbindungsmediatoren wie VEGF.

Die Modifikation kann beispielsweise dazu genutzt werden, um abhängig von den zu kultivierenden Zellen entsprechende Umge bungen im Hydrogel zu schaffen.

Die Reagenzien werden bevorzugt in wirksamen Konzentrationen eingesetzt, dies kann beispielsweise im Bereich von 0,01 bis 100 mM sein, bevorzugt 0,1 mM bis 50 mM, insbesondere 0,2 mM bis 10 mM, insbesondere 0,5 bis 5 mM bezogen auf das gequollene Gel .

Die Erfindung betrifft außerdem eine Zusammensetzung zur Her stellung eines Hydrogels umfassend mindestens zwei Makromere al) und a2) wie für das Verfahren beschrieben.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Hydrogel erhalten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Hydrogel umfassend eine erste Vielzahl von Makromeren, welche mit einer zweiten Viel zahl von Makromeren vernetzt ist, wobei die Vernetzung über ei- ne Vielzahl von Ar-S-Bindungen erfolgt, wobei Ar eine aromati sche oder heteroaromatische Gruppe ist.

Eine solche Bindung kann wie vorstehend beschrieben aus der nukleophilen Substitution durch Thiole an elektronenarmen Aro- maten erhalten werden. Vorteilhafte Ausführungsformen werden für das Verfahren beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Hydrogele sind lange Zeit stabil, bevor zugt bis zu 6 Wochen. Sie können auf einfache Weise und unter physiologischen Bedingungen modifiziert und erhalten werden.

Sie eignen sich insbesondere zur Verkapselung von Zellen, für dreidimensionale Zellkulturen, Organoide, Biomaterialien, inji zierbare Biomaterialien, Zelltherapien, Gewebemodifizierung, Geweberegeneration, Gewebetransplantation, regenerative Medi zin, 3D Druck, 3D Bioprinting, Wundverbände oder Wundbehand lung, Transportmittel für Wirkstoffe, In-vitro-Modelle zum Un tersuchen oder Testen von Diagnostika oder Therapeutika oder Zelltransplantationen .

Durch die Reaktion unter physiologischen Bedingungen ist die genannte Reaktion insbesondere im biologischen Bereich anwend bar. So ist es beispielsweise denkbar, dass die beiden mitei nander reagierenden Makromere erst in situ miteinander kombi niert oder vermischt werden. Dies kann beispielsweise durch ei ne Mehrkomponentenspritze geschehen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umhüllung von Zellen, wobei das Hydrogel in Gegenwart der Zellen gebildet wird, um die Zellen zu umhüllen. Dies kann beispielsweise zur Zellkul tur, insbesondere zur dreidimensionalen Zellkultur verwendet werden . Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Herstellung eines Hydrogels umfassend die Makromere al) und a2) wie für das Ver fahren beschrieben.

Die beschriebene Reaktion eignet sich auch, um vorhandene Gele zusätzlich zu vernetzen. In einem solchen Verfahren wird ein Gel umfassend mindestens zwei der funktionalen Gruppen der Kom ponente al) oder a2), wie beispielsweise aus A. Farrukh, J. I. Paez, M. Salierno, A. del Campo, Angew. Chem. Int. Ed. 2016,

55, 2092- 2096 durch Einpolymerisierung entsprechender Monomere in Polyacrylamidgele bekannt, bereitgestellt und mit einem Mak- romer mit entsprechenden funktionellen Gruppen gemäß dem Makro- mer al) oder a2) umgesetzt, wobei in diesem Fall die Makromere al) oder a2) mindestens zwei der funktionellen Gruppen aufwei sen, so dass es zur Vernetzung des Gels durch diese Reaktion kommt .

Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Modifikati on von Gelen, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines Gels oder einer Vorstufe davon, umfas send mindestens zwei funktionelle Gruppen gemäß Komponente al) oder mindestens zwei funktionelle Gruppen gemäß Kompo nente a2 ) ;

b) Zugabe einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Mak- romer gemäß der jeweils anderen Komponente, wobei das Mak- romer mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist;

c) Modifikation des Gels oder der Vorstufe davon durch Reakti on der funktionellen Gruppen.

Bevorzugt wird das Verfahren nach der Herstellung des Gels zur nachträglichen Modifikation verwendet. Dadurch ist es möglich, das Gel unter physiologischen Bedingungen zu modifizieren, um beispielsweise seine mechanischen Parameter anzupassen.

Durch die pH-Abhängigkeit und/oder Temperatur der Reaktion ist es beispielsweise möglich, dass diese Modifikation erst bei ei ner bestimmten Änderung der Bedingungen eintritt.

Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfol genden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweili gen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt.

So umfassen beispielsweise Bereichsangaben stets alle - nicht genannten - Zwischenwerte und alle denkbaren Teilintervalle.

Beispiele

Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren dargestellt. In den Beispielen werden die Makromere als Polymere bezeichnet.

Fig. 1 Schematische Darstellung der Herstellung eines Hydro gels gemäß der Erfindung;

Fig . 2 a) Foto eines PEG-Thiol-MS Hydrogels (5 Gew.% Polymer konzentration in 10 mM HEPES Puffer) ; b) Schermodule während der Gelierung (5 Gew.% Polymer, 10 mM HEPES Puffer pH 6,6, T= 25 °C) ;

Fig. 3a Schermodule während der Gelierung der verschiedenen

Hydrogele bei 25 °C (jeweils 5 Gew.%; 10 mM HEPES Puf fer; pH 8 ) ;

Fig. 3b Schermodule während der Gelierung der verschiedenen

Hydrogele bei 37 °C (jeweils 5 Gew.%; 10 mM HEPES Puf fer; pH 8 ) ; Fig. 4 Wirkung des pH-Wertes (bei 5 Gew.% Polymergehalt,

25°C) auf die Vernetzungskinetik und die Schermodule (a) Thiol-Mal , Thiol-MS, b) Thiol-VS) ;

Fig . 5 Schermodul in Abhängigkeit von Temperatur (Bedingun gen: bei 30 min, 5 Gew.%, pH 7,0);

Fig . 6 Einfluss von Polymergehalt und HEPES-

Pufferkonzentration auf die mechanischen Eigenschaften (Säulen, linke Skala) und den pH-Wert (Quadrate, rech te Skala) der hergestellten Thiol-MS-Gele . Bedingun gen: pH = 7,5, T = 25°C, bei 60 min;

Fig . 7 Vergleich der normierten Masse von geschwollenen Thi- ol-X-Gelen. Gele wurden über 6 Wochen, bzw. 4 Wochen lang im Zellkulturmedium bei 37°C inkubiert (a) 10

Gew.% Polymeranteil, pH 8,0; b) 5 Gew.% Polymergehalt bei pH 7,0) . Unter diesen Bedingungen hergestellte Thiol-MS-Gele sind auch nach 6 Wochen Inkubation im Zellkulturmedium hydrolysestabil ;

Fig . 8 Fibroblast L929 verkapselt in den verschiedenen en

zymatisch spaltbaren Thiol-X-Hydrogelen . Lebend / tot Assay von L929 Fibroblasten-Einzelzellen, die für 1 Tag in den Materialien (a-c) verkapselt waren: Im Ver gleich zu den anderen Systemen zeigten Zellen, die in Thiol-MS-Hydrogelen kultiviert wurden, eine homogenere Verteilung über das gesamte Material (a, Z-Stapel) und eine ähnliche Lebensfähigkeit (c) ;

Fig . 9 (a) Schemata von enzymatisch spaltbaren Gelen, die zur

Verkapselung von Zellsphäroiden verwendet werden, (b- c) Migrationsverhalten von Zellen aus verkapselten Sphäroiden. Die Ergebnisse des Migrationstests nach 3- tägiger Kultur zeigten, dass die Migrationsstrecke in Thiol-MS-Gelen dazwischen lag. Färbung: FITC- Phalloidin (Aktinfasern) , DAPI (Kern) ; Fig. 10 Morphologie einzelner Zellen (Mausfibroblast L929) , die nach 3 Tagen Zellkultivierung in den verschiedenen enzymatisch spaltbaren Thiol-X-Hydrogelen eingeschlos sen sind. Im Vergleich zu den anderen Systemen zeigten Zellen, die in Thiol-MS-Hydrogelen kultiviert wurden, eine homogenere Verteilung, weniger Clusterbildungen oder Aggregationen . Färbung: FITC-Phalloidin (Aktinfa sern) , DAPI (Kern); Der Maßstab ist jeweils 50 pm;

Chemische Synthese

Chemikalien und Lösungsmittel wurden in p.a. Reinheit erworben und direkt eingesetzt, wenn nicht anders beschrieben. 4—(5— (Mehtylsulfonyl) -1, 3, 4-oxadiazol-2-yl) anilin wurde von Ark Pharm USA erworben. 4-armige Polyethyhenglykolpolymere (PEG, 20 kDa auf der Basis von Pentaerythrit) funktionalisiert mit Ma- leimid ( PEG-Mal ) , Vinylsulfon (PEG-VS), Thiol (PEG-SH) und N- Succinimidylcarboxymethylester (NHS-PEG) und lineares methoxy- liertes PEG Polmyer (5 kDa) ebenso jeweils funktionalisiert mit NHS, SH, Mal und VS wurden von Jenkem, USA erworben. Pufferlö sungen wurden frisch hergestellt. 10 mM HEPES (pH 8,0, 7,0, und 6.7) und phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4 und 7,0) wurden verwendet.

Deuterierte Lösungsmittel wurden von der Deutero GmbH Deutsch land (D-56288 Kastellaun) bezogen. Deuterierte Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS) wurde hergestellt, indem die richtige Menge an Dinatriumphosphat, Mononatriumphosphat, Natriumchlorid und Ka liumchlorid in D2O gelöst wurde; gefolgt von einer pD- Einstellung mit 20 %iger DCl-Lösung (Merck) , bis die pD-Werte von 8,0; 7,4; 7,0; 7,0; und 6,0 erreicht wurden. Der pH-Wert wurde mittels pH-Meter überwacht und der folgende Korrekturfak- tor wurde angewendet: pD = pH _0bs + 0,4. (siehe Bates et al Anal. Chemie. 1968 40 (4), 700-706) .

Dünnschichtchromatographie (TLC) -Platten (ALUGRÄM® SIL G/UV254) und Kieselgel für die Säulenchromatographie (60Ä Porengröße, 63-200pm Partikelgröße) wurden von Macherey-Nagel , (52355 Dü ren) Deutschland bezogen. TLC-Platten wurden unter 254 oder 365 nm Licht beobachtet. Die HPLC-Analyse und -Reinigung der Ver bindungen wurde mit einer HPLC JASCO 4000 (Japan) durchgeführt, die mit einem Diodenarray, UV-Vis-Detektor und Fraktionssammler ausgestattet ist. Reprosil C18-Säulen wurden für semi

präparative (250 x 25 mm) und analytische (250 ^c 5 mm) Durch läufe verwendet. Es wurden Lösungsmittelgradienten unter Ver wendung einer Kombination der folgenden Eluenten verwendet: Lö sungsmittel A (MilliQ-Wasser + 0,1% TFA) und Lösungsmittel B (95% ACN/5% MilliQ-Wasser + 0,1% TFA), typischerweise über 40 Minuten. Die Reinigung von modifizierten Polymeren erfolgte ty pischerweise durch Dialyse gegen Aceton und Wasser. Zum Einsatz kamen Spectra/Por 3 Dialyseschläuche (Molekulargewichtsaus schlussgrenze MWCO= 3,5 kDa) von Spectrum Inc..

Die Lösungsspektren ¹ H-NMR und ¹³ C-NMR wurden bei 25 °C auf ei ner Bruker Avance 300 MHz oder auf einer Bruker Avance III Ult- raShield 500 MHz aufgenommen. Letzteres war mit einem He gekühlten 5 mm TCI-CryoProbe, eine protonenoptimierte Dreifach- resonanz-NMR-Inverse-Sonde mit externer Wasserkühlung (CP TCI 500S2, H-C/N-D-05 Z) ausgestattet. Sofern nicht anders angege ben, wurden alle Messungen bei 298K durchgeführt. Tetramethyl silan (TMS) (5= 0 ppm) wurde als interne Referenz verwendet. Die chemischen Verschiebungen sind angegeben in Teile ppm und die Kopplungskonstanten in Hertz. Folgende Abkürzungen werden verwendet: s-singlet, d-doublet, t-triplet, q-quartet, m- multiplet. Der Substitutionsgrad des PEG-Polymers wurde berech net durch Endgruppenbestimmung. Das Integral des Signals, das dem PEG-Backbone entspricht (3,70-3,40 ppm) , wurde auf 440H eingestellt und mit dem Integral der Protonen verglichen, das dem eingearbeiteten Molekül 2 (das aromatische -CHs bei 8,10- 7,70 ppm und das Methylen bei 4,20 ppm) . Funktionalisierungs- grade von >91% und Renditen von >91% wurden in allen Fällen erreicht. Die Daten wurden in MestReNova analysiert.

Massenspektren wurden mit Agilent Technologies 1260 Infinity Liquid Chromatography/Mass aufgezeichnet . Selektiver Detektor (LC/MSD) und 6545 Accurate-Mass Quadrupol Laufzeit (LC/Q-TOF- MS) unter Verwendung der chemischen Ionisierung durch Elektro- spray. UV/VIS-Spektren wurden mit einer Varian Cary 4000 UV/VIS aufgenommen. Spektrometer (Varian Inc. Palo Alto, USA) .

Die rheologischen Eigenschaften von Hydrogelen wurden an einem Discovery HR-3 Rheometer (TA Instruments, USA) , ausgestattet mit 12 mm parallelen Platten und Peltier-Tisch, bei 25 und

37°C. Software war Trios v4. Daten wurden in Origin 9.1 aufge zeichnet und analysiert.

Die folgenden Protokolle wurden mit einigen Modifikationen übernommen: G. Liang et al Chem. Commun. , 2017 , 53, 3567-3570; J. Ling et al ChemBioChem 2018 , 19, 1060. Synthese von tert-Butyl (2- ( (4- (5- (methylsulfonyl) -1, 3, 4- oxadiazol-2-yl ) phenyl ) amino ) -2-oxoethyl ) Carbamat (1) :

Boc-Gly-OH (1 Äq., 2,28 mmol, 0,394 g) wurde in wasserfreiem THF (3 mL) bei 0 °C gelöst. Isobutylchlorameisensäureester (1,2 Äq., 2,85 mmol, 0,314 mL) und N-Methylmorpholin (2,6 Äq., 5,7 mmol, 0, 627 mL) wurden der Lösung mit einer Spritze unter Stickstoffatmosphäre sorgfältig zugegeben und 30 Minuten lang gerührt. Eine Lösung von 4- (5- (Methylsulfonyl) -1, 3, 4-oxadiazol- 2-yl)anilin (0,25 Äq., 0,57 mmol, 0,136 g) in THF (3 mL) wurde der Mischung tropfenweise zugegeben, für weitere 2 h bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Gesättigtes NaHCCL wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (2 x 30 mL) extrahiert. Die kombinierte, organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, verdampft, durch prä parative HPLC aufgereinigt (5B bis 95B 280 nm, Reaktionszeit = 28 min) und ein weißer Feststoff wurde nach der Gefriertrock nung erhalten, 165 mg (Ausbeute= 73%) .

Synthese von 2-Amino-N- (4- (5- (5- (Methylsulfonyl) -1, 3, 4- oxadiazol-2-yl ) phenyl ) acetamid (2) :

Die Verbindung 1 (45 mg) wurde in 1:1 TFA/DCM (2 mL) gelöst, bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt und unter Stickstofffluss verdampft. Das Endprodukt wurde nach der HPLC-Reinigung (5B bis 95B 280 nm, Reaktionszeit = 18 min) erhalten, (Y = >99%) . Die reine Verbindung wurde sofort an das PEG-Polymer gekoppelt, da ansonsten eine Zersetzung innerhalb von 1 Woche nach der Lage rung bei -20°C beobachtet wurde.

Synthese von PEG-MS : Die frisch zubereitete Verbindung 2 (50 pmol, 15 mg) und N-

Methylmorpholin (18 pmol, 20 pL) wurden in trockenem DMF (2 mL) gelöst, mit Stickstoff gespült und für 15 min gerührt. 20 kDa, 4-armiges PEG-NHS (100 mg, 5 pmol) wurde in trockenem DMF (1 mL) gelöst und unter Stickstoffström zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter inerter Atmosphäre gerührt, dann in Aceton und Wasser dialysiert und gefrierge trocknet. Ein weißes festes Polymer wurde erhalten und mittels ¹ H-NMR in DCM-d2 charakterisiert. Ein Funktionalisierungsgrad von >91% und eine Ausbeute von >90% wurden berechnet.

Die 2- (Methylsulfonyl ) -5-phenyl-l, 3, 4-oxadiazolgruppe wurde als MS-Substrat für die Thiolkupplung ausgewählt. Unter den be schriebenen heteroaromatischen MS-Ringen reagiert dieses Sub strat mit Thiolen unter hohem Umsatz und mittlerer Reaktionsge schwindigkeit. [N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem. , Int. Ed. 2013, 52, 12592-12596. X. Chen, H. Wu, C.-M. Park, T. H. Poole, G. Keceli, N. 0. Devarie-Baez , A. W. Tsang, W. T. Lowther, L. B. Poole, S. B. King, M. Xian, C. M. Furdui, ACS Chemical Biology 2017, 12, 2201-2208.] 4-armige PEG-MS- Makromere (20 kDa) wurden im 500-mg Maßstab in guter Ausbeute (Substitutionsgrad >91%) innerhalb von drei Syntheseschritten synthetisiert .

Rheologische Messungen an Hydrogelen

Die Gelierung des 4-Arm-PEG-MS und 4-Arm-PEG-Thiol-Gemisch wur de untersucht. Angewandte Vernetzungsbedingungen betrugen 5 Gew.% Polymergehalt in 10 mM HEPES-Puffer, pH 6,6, bei 25°C.

Ein MS : Thiol-Verhältnis von 1:1 wurde für die Experimente ver wendet. Studien zeigten, dass Thiol-MS-Gele ein vernetztes Gel innerhalb von 3-4 min bildeten (siehe Tabelle 1) . Dies ent spricht einer günstigen Vernetzungszeit, die ein einwandfreies Mischen und eine Homogenisierung von Vorläuferlösungen ermög licht. Rheologische Untersuchungen ergaben, dass die vernetzten Gele ein Scherspeichermodul von G'~l kPa erreichen (Figur 2b) . Ein gequollenes PEG-Thiol-MS-Hydrogels (5 Gew.% Polymerkonzent ration in 10 mM HEPES-Puffer zeigt Figur 2a.

20 kDa, 4-armige PEG-X Polymerlösungen wurden frisch herge stellt und für diese Studien verwendet. Das Polymer wurde in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst, mithilfe eines Vor- texers gemischt, in ein Ultraschallbad gehalten und zentrifu giert, um Blasen zu entfernen. 21 pL einer 5% w/v PEG-X-Lösung wurde auf die Peltier-Unterplatte des Rheometers aufgetragen, gefolgt von 21 pL einer 5% w/v PEG-Thiol-Lösung und dem Mischen mit der Pipettenspitze direkt auf der Platte. Die obere Platte wurde angenähert, um die Probe zwischen die beiden Platten zu legen, und anschließend wurde die Probe mit Paraffinöl versie gelt, um eine Verdampfung während der Messung zu vermeiden. Die Gesamtzeit für die Probenbeladung mitsamt dem Start der Messung betrug ca. 2-3 min.

Die Gelierzeit und der Endschermodul des Hydrogels wurden rheo- metrisch bestimmt. Dehnungsdurchläufe (0,1 bis 1000% Dehnung bei Frequenz = 1 Hz) und Frequenzdurchläufe (0,01 bis 100 Hz bei Dehnung = 1%) wurden durchgeführt, um das lineare, viskoelastische Regime zu bestimmen. Die Zeitdurchläufe wurden innerhalb des linearen viskoelastischen Regimes mit folgenden Parametern durchgeführt: Spalt 300 pm, Axialkraft (0,0±0,1 N) , Frequenz 1Hz, Dehnung 1%, Temperatur = 25 oder 37 °C. Hydrogele wurden bei 5 Gew.% Polymergehalt, HEPES-Puffer pH 8,0 und T = 25°C (Figur 3a) und T- 37 °C (Figur 3b) hergestellt.

Figur 3a vergleicht die Vernetzungskinetik von Thiol-MS mit der von Thiol-Mal- und Thiol-VS-Systemen . Die Experimente wurden unter zellkulturtypischen Bedingungen durchgeführt (5 Gew.% Po lymer, in 10 mM HEPES-Puffer pH 8,0, bei 25°C) . [E. A. Phelps, N. 0. Enemchukwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012 , 24, 64-70. A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Func- tional Materials 2019 , 29, 1807734.] Unter diesen Bedingungen bildete sich das Thiol-MS-Gel in 3-4 s (Tabelle 1) . Dies ent spricht einer kurzen Vernetzungszeit, ist aber akzeptabel zum Mischen und Homogenisieren von Gelvorläufern. Im Vergleich dazu benötigte das Thiol-Mal-Gel 1 s zur Vernetzung und es wurden inhomogene Gele erhalten, während das Thiol-VS-System eine Ge lierungszeit von ca. 10 min aufwies und ca. 2 h brauchte, um die Vernetzung zu vervollständigen. Diese Ergebnisse zeigen den folgenden Trend in der Gelierungsrate: Thiol-Mal > Thiol-MS > Thiol-VS, in Übereinstimmung mit den angegebenen Reaktionsraten für Modellverbindungen, [X. Chen, H. Wu, C.-M. Park, T. H. Poo- le, G. Keceli, N. 0. Devarie-Baez, A. W. Tsang, W. T. Lowther, L. B. Poole, S. B. King, M. Xian, C. M. Furdui, ACS Chemical Biology 2017 , 12, 2201-2208. F. Saito, H. Noda, J. W. Bode, ACS Chemical Biology 2015 , 10, 1026-1033. H. Wang, F. Cheng, M. Li, W. Peng, J. Qu, Langmuir 2015 , 31, 3413-3421.] wie in Tabelle 2 gezeigt .

Die Werte des Schermoduls der vernetzten Gele nach 1 h betrugen jeweils G'25 _°c = 2000 Pa für Thiol-VS, 1000 Pa für Thiol-MS und 470 Pa für Thiol-Mal. Die höhere Steifigkeit von Thiol-MS-Gelen ist wahrscheinlich auf eine höhere Homogenität des Systems als Folge der langsameren Gelierungskinetik zurückzuführen, was zu weniger Netzwerkdefekten und zu einem höheren Vernetzungsgrad führt .

Dieses Ergebnis widerspricht früheren Reaktivitätsstudien von Thiol-Mal- und Thiol-MS-Kupplungen an kleinen Modellmolekülen, bei denen ähnliche Reaktionsumsätze in Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS) pH 7,4 [N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, An- gew. Chem. , Int. Ed. 2013 , 52, 12592- 12596.] gezeigt wurden. Wir nahmen an, dass die Hydrolyse von Mal-Gruppen, die bei ba sischem pH auftritt, der Grund für die geringeren mechanischen Eigenschaften von Thiol-Mal sein könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Stabilität einer 4 Gew.% PEG-Mal-Lösung in deuteriertem PBS bei pD 8,0 durch ¹ H-NMR untersucht.

Die Hydrolyse von Mal-Gruppen wurde nach 2 Stunden nachgewie sen. Es wird daher nicht erwartet, dass die Hydrolyse von Mal- Gruppen die mechanischen Eigenschaften von Thiol-Mal innerhalb des Bereichs der getesteten Bedingungen signifikant beein flusst. Thiol-VS erreichte den höchsten Schermodul; Dies hängt mit einer höheren Umwandlung oder der langsamsten Aushärtung zusammen, die ein Netzwerk mit weitaus weniger Fehlern gewähr leisten. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Thiol-MS- Vernetzung eine Zwischenkinetik zwischen dem sehr schnell ver netzenden Thiol-Mal und den langsamen Thiol-VS-basierten Mate rialien darstellt. Die beobachtete Vernetzungszeit im Bereich von wenigen Sekunden ermöglicht ein komfortables Mischen und Pipettieren der Komponenten bei geringen Scherkräften und dürf te für die Zellverkapselung geeignet sein.

Abhängigkeit vom pH-Wert Die Gelierung des 4-Arm-PEG-MS und 4-Arm-PEG-Thiol-Gemisch wur de untersucht (Figur 1) . Angewandte Vernetzungsbedingungen be trugen 5 Gew.% Polymergehalt in 10 mM HEPES-Puffer, pH 6,6, bei 25°C. Ein MS : Thiol-Verhältnis von 1:1 wurde für die Experimente verwendet. Die Gelierungszeit im Bulk für die Thiol-X-Hydrogele wurde bei unterschiedlichen pH-Werten bestimmt. Die Experimente wurden bei 5 Gew.% Polymerlösung, in 10 mM HEPES-Puffer, T = 25°C durchgeführt. Die Gelierzeit wurde als Zeitspanne zwischen dem Mischen der Komponenten und dem Zeitpunkt geschätzt, bei dem das Pipettieren zu der Mischung nicht mehr möglich war. Studien zeigten, dass Thiol-MS-Gele ein vernetztes Gel inner halb von 3-4 min bildeten (siehe Tabelle 1) . Dies entspricht einer günstigen Vernetzungszeit, die ein einwandfreies Mischen und eine Homogenisierung von Vorläuferlösungen ermöglicht.

Die Reaktionsgeschwindigkeit der polaren Thiol-X-Kopplung ist abhängig vom pH-Wert im pH-Bereich zwischen 6 und 9. Dies ist auf die Deprotonierung der Thiolgruppe (pKa ' 8) zum Thiola- tanion zurückzuführen, das bei diesen Reaktionen als Nukleophil wirkt [M. H. Stenzei, ACS Macro Leiters 2013 , 2, 14-18.] Dieses Merkmal bietet eine interessante Möglichkeit für pH-gesteuerte Härtungskinetiken unter physiologisch relevanten Bedingungen. Es wurde die Thiol-MS-Vernetzung im pH-Bereich von 8, 0-6, 6 ana lysiert. Eine Abnahme der Vernetzungsrate wurde bei sinkendem pH-Wert beobachtet (Figuren 4a und 4b und Tabelle 1) . Bemer kenswert ist, dass die pH-Änderung von 8,0 auf 6,6 eine Abstim mung der Gelierzeit von einigen Sekunden auf ein paar Minuten ermöglichte (Tabelle 1), was ein ideales experimentelles Zeit fenster für 3D-Zellverkapselungsanwendungen bietet. Im Gegen satz dazu variierte die Gelierzeit von Thiol-Mal nur innerhalb weniger Sekunden, während Thiol-VS zwischen einigen Minuten und einigen Stunden lag. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Vortei le von Thiol-MS-Gelen in Bezug auf Handhabung und Anpassungsfä- higkeit an die Anwendungsanforderungen gegenüber Thiol-Mal und Thiol-VS .

Der Schermodul von Thiol-MS-vernetzten Hydrogelen wurde durch den pH-Wert leicht beeinflusst: Bei pH 8,0 zeigten sie einen niedrigeren G', wahrscheinlich aufgrund des Auftretens der sehr schnellen Vernetzung, die zu einigen Inhomogenitäten und Defek ten im Netzwerk führte. Dies war nicht der Fall bei Thiol-MS- Gelen, die bei pH 7, 5-6, 6 gebildet wurden, in denen ähnliche endgültige G's erhalten wurden. Daher scheint dies das optimale Intervall zu sein, in dem die Vernetzungsrate eingestellt wer den kann, ohne die Qualität und mechanische Stabilität des Gels zu beeinträchtigen. Im Vergleich dazu zeigte das Thiol-Mal- System einen Rückgang der mechanischen Eigenschaften bei pH > 7,5, aber einen ähnlichen endgültigen Schermodul bei pH = 7,0- 6, 6, während Thiol-VS einen klaren Trend zu einer langsameren Gelierungskinetik und einen leicht verringerten Schermodul bei abnehmendem pH-Wert zeigte. Dazu wurden Messungen in 10 mM HEPES-Puffer bei pH-Werten von 8,0; 7,5; 7,0 und 6,6 bei 5 Gew.% Polymergehalt und bei 25 °C durchgeführt. Dabei ist zu beachten, dass die am schnellsten aushärtenden Systeme (Mal bei pH > 7.0 und MS bei pH > 7.5) unter Beladung des Rheometers so fort aushärten. (Figuren 4a und 4b)

Einfluss der Temperatur auf die Gelierzeit

20 kDa, 4-armige PEG-X Polymerlösungen wurden frisch herge stellt und für diese Studien verwendet. Das Polymer wurde in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst, mithilfe eines Vor- texers gemischt, in ein Ultraschallbad gehalten und zentrifu giert, um Blasen zu entfernen. 30 pL einer 5%-igen w/v PEG-X- Lösung wurde in ein Kunststoff-Eppendorf-Röhrchen gegeben, ge folgt von 30 pL einer 5%-igen w/v PEG-Thiol-Lösung unter konti- nuierlichem Mischen mit der Pipette. Die Gelierzeit "im Bulk" wurde als die Zeit registriert, in der die Härtemischung nicht mehr länger floss und ein kontinuierliches Pipettieren nicht möglich war. Die Temperatur wurde mit einem Wasserbad mit Tem peraturregelung kontrolliert.

Die Temperatur kann auch zur Einstellung der Thiol-MS- Geleigenschaften verwendet werden. Die Temperaturabsenkung im Bereich von 45°C bis 25°C ermöglichte eine Abnahme des Schermo duls (Figur 5) und eine Verlängerung der Gelierzeit (siehe Ta belle 3) .

Einfluss von Polymergehalt und HEPES-Pufferkonzentration auf Thiol-MS-Hydrogele

Es wurden Hydrogele mit steigenden Polymergehaltswerten von 1,3; 2,5; 5,0; 7,5; und 10,0 Gew.%; bei konstantem pH = 7,5 und T = 25°C, entweder mit 10 mM oder 50 mM HEPES- Pufferkonzentration hergestellt. Der pH-Wert der präparierten Hydrogele wurde mit einem pH-Meter mit ebener Oberflächenelekt rode (PH100 Waterproof ExStik®, Extech Instruments, USA) gemes sen .

Schließlich wurde der Einfluss des Polymergehalts auf die Thi- ol-MS-Hydrogel-Vernetzungskinetik und den Schermodul untersucht (Figur 6a, 6b) . Die Gelierzeit bei steigendem Polymergehalt war kürzer (im Bereich von 18-2 s, siehe Tabelle 4) . Darüber hinaus stieg G' mit einem Anstieg der Polymerkonzentration von 1,3 auf 7,5 Gew.% und sank bei Polymerkonzentrationen über 10 Gew.%. Dieses Ergebnis war überraschend, da bereits bei 10 Gew.% Vor läuferlösungen richtig homogenisiert werden konnten; daher wur de nicht erwartet, dass ein schlechter Vermischungseffekt für dieses Verhalten verantwortlich ist. Zur Untersuchung des Reaktionsmechanismus wurde der pH-Wert der resultierenden Gele gemessen (siehe Figur 6a, 6b) . Es stellte sich heraus, dass der pH-Wert von frisch hergestellten Thiol- MS-Gelen mit zunehmender Polymerkonzentration abnahm. Gele zwi schen 1,3-7, 5 Gew.% zeigten einen pH-Wert zwischen 7, 5-6, 5, während Gele bei 10 Gew.% einen pH-Wert in der Nähe von 5,1 hatten. Dies lässt sich durch die Freisetzung einer Methansul- finsäure als Abgangsgruppe bei der Thiol-MS-Kopplung erklären. Bei hohem Polymeranteil wird die Abgangsgruppe in größeren Kon zentrationen produziert, was zu einer pH-Wert-Absenkung des Vernetzungsmediums und damit zu einer Abnahme des erreichten Endschermoduls führt. Dieser Effekt kann durch Erhöhung der Pufferkapazität des Vernetzungsmediums gesteuert werden, was durch Erhöhung der HEPES-Pufferkonzentration von 10 mM auf 50 mM erreicht wird (siehe Figur 6) . Letzteres ist bekanntlich noch zytokompatibel . Diese Ergebnisse zeigen, dass der Gehalt an Polymer auch dazu verwendet werden kann, die mechanischen Eigenschaften des Gels zu steuern. Bei höherer Konzentration (10 Gew.%), sollte der pH-Wert durch Erhöhung der Pufferkapazi tät kontrolliert werden.

Quellungsmessungen an Thiol-X-Hydrogelen

Für diese Studien wurden Vorläuferlösungen von 5% w/v verwen det, welche in 10 mM HEPES-Puffer pH 7,0 hergestellt, und zuvor im Eisbad gekühlt wurden. 50 pL einer 5% w/v PEG-X-Lösung wurde in eine flexible PDMS-Zylinderform (0,75 cm Durchmesser) gege ben, schnell mit 50 pL einer 5% w/v PEG-Thiol-Lösung gemischt und in einer feuchten Kammer bei 37°C für 4h vernetzt. Die re sultierenden Hydrogele wurden sorgfältig entfernt, 24 Stunden lang in Milli-Q-Wasser gequollen und anschließend die Masse des gequollenen Gels bestimmt (M _s) . Das Gel wurde im Ofen bei 37 °C für 48h getrocknet und die Masse des trockenen Hydrogels bestimmt (M _d ) . Der Quellungsgrad (SR) wurde nach folgender Formel berechnet:

Die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden mitgeteilt.

Der Quellungsgrad (SR) von 5% Thiol-MS-Gelen wurde in Wasser bei pH 7,0 gemessen. Es wurde eine Quellung von 33,6 mg Was- ser/mg Polymer erhalten (siehe Tabelle 5) . Thiol-VS-Gele zeig ten ähnliche SR-Werte, während Thiol-Mal ca. 1,5-fach mehr an- stieg. Diese Ergebnisse deuten auf einen ähnlichen Vernetzungs grad von Thiol-MS- und Thiol-VS-Netzwerken und eine geringere Vernetzung von Thiol-Mal-Gelen hin.

Die hydrolytische Stabilität ist eine relevante Materialeigen schaft für Hydrogele, die in der 3D-Zellkultur verwendet wer den .

Daher wurde die hydrolytische Stabilität von 5 Gew.% Thiol-MS- Gelen durch gravimetrische Analyse des geschwollenen Gels nach der Inkubation im Zellkulturmedium bei 37°C für unterschiedli che Zeitpunkte über 4 Wochen bestimmt (Figur 7a) . Die Masse der geschwollenen Thiol-MS-Gele erreichte in den ersten zwei Wochen das 1,2-fache der Ausgangsmasse, was auf geringe Gelerosion und hohe hydrolytische Stabilität der Thiol-MS-Gele hinweist. Es ist zu beachten, dass die Langzeitstabilität der Gele für die Langzeitzellkultur von Vorteil ist und eine Feinabstimmung der Abbaueigenschaften durch Copolymerisation mit spezifischen ab baubaren Sequenzen ermöglicht. [E. A. Phelps, N. 0. Enemchukwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012, 24, 64-70.] Die Stabili ^¬ tät des Thiol-MS-Systems war ähnlich wie bei Thiol-VS, das ty ^¬ pischerweise für Langzeitkulturen verwendet wird, [ M. P. Lutolf, G. P. Raeber, A. H. Zisch, N. Tirelli, J. A. Hubbell, Advanced Materials 2003 , 15, 888-892.] und viel höher als bei Thiol-Mal- Gelen (1,2-fach in 2 Tagen und Hydrogelzerfall am Tag 18) . [ N. Boehnke, C. Cam, E. Bat, T. Segura, H. D. Maynard, Biomacromol- ecules 2015 , 16, 2101-2108.] Die Hydrolyse von Thiol-Mal-Gelen wird auf die geringe Stabilität der Thioether-Succinimid- Bindung zurückgeführt, die Retro-Michael- und Austauschreaktio ^¬ nen in Gegenwart anderer löslicher Thiole in Zellkulturmedien durchlaufen kann. Die Ergebnisse stimmen mit den Studien mit Modell-MS-Verbindungen überein, die eine überlegene Stabilität von thio-heteroaromatischen Konjugaten zeigen, die aus der Thi- ol-MS-Kopplung gegenüber Thiol-Mal-Verbindungen unter therapeu tisch relevanten Bedingungen resultieren. [N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem. , Int. Ed. 2013 , 52, 12592- 12596.] Schließlich zeigten Experimente, die mit Gelen mit 10 Gew.% durchgeführt wurden, dass Thiol-MS-Gele mehr als 6 Wochen hyd ^¬ rolytisch stabil blieben (siehe Figur 7b) .

Verwendung zur Zellverkapselung

PEG Hydrogel-Präparation für 3D-Zellkultur

3D-PEG-Hydrogele wurden durch Anpassung des beschriebenen Pro tokolls hergestellt (Phelps et al Advanced Materials 2012 , 24, 64-70; und Farrukh et al Adv. Funct. Mater. 2018 ) . Die Vorläu ferlösung von 20 kDa 4-Arm PEG Mal/VS/MS (100 mg imLr ¹ , 10% w/v) wurde durch Lösen im HEPES-Puffer (10 mM, pH 8,0) im sterilen Laminarstrom hergestellt. Lösungen von Cyclo (RGDfC) (3,45 mg imLr ^! , 5 mM) und VPM-Peptid ( GCRDVPMSMRGDRCG, 26,6 mg imLr ¹ , 15,68 mM) wurden ebenfalls im sterilen HEPES-Puffer (pH 8,0) zuberei- tet. Diese Konzentrationen wurden während aller Zellversuche konstant gehalten.

4-Arm-PEG Mal/MS/VS-Stammlösung (10% w/v) wurde im Volumenver hältnis 2:1 mit 5 mM cyclo (RGDfC) gemischt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Zellsuspension (10xl0 ⁶ Zellen/mlr ¹ ) im RPMI- Medium (2 pL) wurde der obigen Lösung zugegeben und 8 pL Trop fen der resultierenden Mischung wurden in je eine Ibidi 15-p- Titerplatte Angiogenese-Dia gegeben. Sofort wurde die Lösung des VPM-Peptids (2 pL, 15,8 mM) in jede p-Titerplatte gegeben, sorgfältig mit der Pipettenspitze vermischt und vernetzt. 15 Minuten lang wurde die Polymerisation der Mal- und MS-3D- Hydrogele durchgeführt, während VS-Hydrogele 45 Minuten lang bei 37 °C und 5% CO2 polymerisiert wurden. Nach der Gelierung wurde das RPMI-Medium zugegeben und die Kultur für 1-3 Tage beibehalten. Alternativ wurde für die Sphäroidkultur das RPMI- Medium (2 pL) mit der cyclo (RGDfC) -modifizierten PEG- Vorläuferlösung (6 pL, wie oberhalb beschrieben) gemischt und jeweils (8 pL) in die p-Titerplatte gegeben. Jeder Titerplatte wurde ein Fibringerinnsel hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 15,8 mM VPM-Peptid (2 pL) , das bei 37°C 15-45 min lang ge liert werden konnte. Das Medium wurde jeder Titerplatte zugege ben und alle 24 Stunden während der Zellkultur durch frisches Medium ersetzt.

Bei diesem Verfahren wird die PEG-MS-Komponente zunächst mit dem cyclo (RGDfC) -Peptid funktionalisiert , dann mit L929- Fibroblasten vermischt und schließlich mit einem enzymatisch spaltbaren Dithiolpeptid (VPM) vernetzt. Eine Zusammensetzung von 4 Gew.% PEG-MS, 1 mM RGD-Peptid und 3,14 mM VPM wurden ver wendet. [E. A. Phelps, N. 0. Enemchukwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012 , 24, 64-70. A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Cam- po, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734.] Nach dem

Mischen blieb die Lösung dünnflüssig, was eine Homogenisierung der Mischung durch Pipettieren bei geringen Scherkräften ermög lichte. Ein stabiles Gel bildete sich innerhalb von 15 min, sichtbar mit bloßem Auge. Die Verteilung der Zellen innerhalb des Hydrogels wurde mittels Z-Stapel-Imaging an einem Konfokal- mikroskop analysiert. Eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Dicke des Hydrogels wurde beobachtet (Figur 8a) .

Zellkulturbedingungen

Die Fibroblast L929 Zelllinie (ATCC) wurde bei 37 °C und 5% CO2 im RPMI 1640 Medium (Gibco, 61870-010), ergänzt mit 10% FBS (Gibco, 10270) und 1% P/S ( Invitrogen) , kultiviert. Für suspen dierte Zellkulturen wurden L929-Zellen (10*10 ⁶ Zellen imLr ¹ ) di rekt in der PEG-Vorläuferlösung während der Polymerisation sus pendiert .

Für die Sphäroidenkultur wurde ein Fibringerinnsel der Zellli ^¬ nie Fibroblast L929 mittels folgender Literaturberichte herge ^¬ stellt. (J. L. West, Biomaterials 2008, 29, 2962-2968; C. A.

DeForest, K. S. Anseth, Nature Chemistry 2011, 3, 925-931) .

Zusammengefasst, wurde ein Pellet von 10*10 ⁶ Zellen imLr ¹ in Fib ^¬ rinogen dissoziiert (10 mg imLr ¹ in PBS) und 2 pL Tropfen wurden auf einen hydrophoben, mit Sigmacote beschichteten Glasträger aufgebracht. 1 pL Thrombinlösung (5 UN imLr ¹ in PBS) wurde zu je dem Tropfen Fibrinogen hinzugegeben und die Zellen wurden in einen Inkubator für 15 min gestellt, um ein Fibringerinnsel zu erhalten .

Fixierung und Färbung 3D PEG-Hydrogel-Proben wurden mit 4%-iger PFA-Lösung für 2 h bei Raumtemperatur fixiert und mit PBS gewaschen. Die Proben wurden mit 1%-iger BSA-Lösung für 1 h blockiert, gefolgt von einer Permeabilisierung mit 0,5% Triton X-100 für 1 h. FITC- Phalloidin (1:200 in Wasser, Thermo Fisher Scientific) wurde zum Färben von Aktinfasern und DAPI (1:500 in Wasser, Life Technology) zum Färben von Kernen verwendet. Die Proben wurden für 5 h bei RT mit Antikörpern inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen.

Lebend-Tot-Assay

Das Zellkulturmedium wurde entfernt und die Proben wurden für 5 min mit Fluoreszeindiacetat (40 pg imLr ¹ ) und Propidiumiodid (30 pg imLr ¹ ) in PBS inkubiert. Die Proben wurden zweimal mit PBS ge ^¬ waschen und mit dem Konfokalmikroskop Zeiss LSM 880 aufgenom ^¬ men .

Lebend/Tot-Assays an Zellen, die für 1 Tag in Thiol-MS-Gelen verkapselt wurden, beweisen die Zytokompatibilität des erfin ^¬ dungsgemäßen Materials (>90% Lebensfähigkeit, Figur 8a, 8b,

8c) . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Vernetzungs ^¬ kinetik des Systems ideal ist, um homogene Konstrukte unter komfortablen und zytokompatiblen Versuchsbedingungen zu erhal ten .

Umgekehrt führten Thiol-Mal-Hydrogele zu einer sofortigen Aus ^¬ härtung beim Mischen von Vorläuferlösungen, was die korrekte Homogenisierung erschwerte und zu einer Zellagglomeration im oberen Teil des Gels führte. Andererseits ermöglichte das Thi- ol-VS-System eine gute Vermischung, aber die langsame Gelie rungskinetik führte zu einer Zellsedimentation an der Untersei te des Gels. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Berichten von Peyton et al . über den Effekt der Vernetzungsrate bei der Verteilung von fluoreszierenden Perlen, die in Thiol- Mal-Hydrogelen verkapselt sind, [L. E. Jansen, L. J. Negrön- Piheiro, S. Galarza, S. R. Peyton, Acta Biomaterialia 2018, 70,

120-128.] und von Shikanov et al . , die auf die Notwendigkeit hinwiesen, Thiol-VS-Gele während der Aushärtung umzudrehen, um Zellablagerungen zu vermeiden. [J. Kim, Y. P. Kong, S. M. Niedzielski, R. K. Singh, A. J. Putnam, A. Shikanov, Soft Mat ter 2016, 12, 2076-2085.] In diesem Zusammenhang zeigen Thiol-

MS-Hydrogele eine angemessenere Kinetik und überwinden diese Unannehmlichkeiten .

Migrationsassay

Um zu beweisen, dass Zellen, die in Thiol-MS-Hydrogelen gezüch tet wurden, funktionsfähig bleiben, wurde ein Migrationsassay durchgeführt. L929 Fibroblasten-Sphäroide wurden in den abbau baren Thiol-MS-Hydrogelen verkapselt, [ A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734.] 3 Tage lang kultiviert, fixiert und gefärbt. Der Zellmigrati onsabstand vom Sphäroid wurde als Indikator für Degradation des Geles und Möglichkeit der Zelle zu Bewegung innerhalb des Geles quantifiziert (Figur 9a-c) . Die Zellen legten eine Strecke von d ~425 gm zurück. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die für Thiol-Mal und Thiol-VS als Materialien für die 3D-Zellverkapselung erhalten wurden. Die Migrationsdistanz betrug ~470 gm für Mal und ~360 pm für VS-Systeme (Figur 9c) . Dieses Ergebnis ist auf die Unterschiede im Vernetzungsgrad (G ^T 37 _°c = VS > MS > Mal, siehe Figur 3b)) und in der hydrolyti schen Stabilität (MS = VS >> Mal, Figur 7) zurückzuführen. Eine geringere Vernetzung oder ein schnellerer Abbau schafft Frei raum für die Zellen, d.h. führt zu längeren Wanderwegen. Weiterhin waren die in Thiol-MS-Hydrogelen kultivierten Zellen nach 3 Tagen Inkubation homogener im Gel verteilt und zeigten weniger Clusterbildungen als in den beiden anderen Systemen (siehe Figur 10) .

Die Thiol-MS-Reaktion eignet sich zur Vernetzung von Hydrogelen bei der Zellverkapselung. Diese Reaktion erzielt Kinetiken zwi schen Thiol-Mal- und Thiol-VS-Systemen und erreicht eine hohe Umwandlung. Die daraus resultierenden vernetzten Einheiten wei sen eine gute hydrolytische Stabilität und Zytokompatibilität auf. Unter wässrigen milden Bedingungen ist die MS- Thiolreaktion orthogonal zu Alkoholen, Aminen, Carbonsäuren und Acrylat-Funktionsgruppen, [D. Zhang, N. 0. Devarie-Baez , Q. Li, J. R. Lancaster, M. Xian, Organic Leiters 2012, 14, 3396-3399. A. Farrukh, J. I. Paez, M. Salierno, A. del Campo, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2092- 2096. A. Farrukh, J. I. Paez, M. Sa lierno, W. Fan, B. Berninger, A. del Campo, Biomacromolecules 2017, 18, 906-913.] was die Anwendung dieses Vernetzungsmecha nismus auf fast jedes natürliche polymere Grundgerüst von Inte resse im biomedizinischen Bereich ermöglicht. Die Reaktivität des Thiol-MS-Paares kann durch den verwendeten pH und der Aus wahl verschiedener MS-aromatischer Substrate reguliert werden. [N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592- 12596.] Die Kombinationen all dieser Eigenschaften machen Thiol-MS zu einer überlegenen Alternative zu anderen re aktiven Chemikalien für die 3D-Zellverkapselung . Tabelle 1: Gelierungszeiten von verschiedenen Gelen gemessen in lOmM HEPES Puffer, T= 25°C, pH= 8-6,6

Tabelle 2: Berichtete Reaktionsraten zweiter Ordnung für ausge wählte nukleophile Thiol-X-Kopplungen unter milden wässrigen

Bedingungen .

Tabelle 3: Ermittelte Gelierungszeit im Bulk für Thiol-MS Hyd rogele bei unterschiedlichen Temperaturen (5 Gew.% in 10 mM

HEPES-Puffer) .

Tabelle 4: Ermittelte Gelierungszeit im Bulk für Thiol-MS Hyd- rogele bei unterschiedlichem Polymergehalt (10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, T = 25 °C)

Tabelle 5: Quellverhältnis in Wasser von Thiol-X-Hydrogelen (5

Gew.% Polymeranteil; n= 3) .