Les réovirus appartiennent à la famille des Reoviridae .

C'est la famille de virus la plus large et la plus diverse en termes d'espèces d'hôtes. En effet, les virus de cette famille peuvent infecter les plantes, les insectes, les mammifères, les poissons, les oiseaux, les bactéries, les arthropodes et encore bien d'autres espèces. Elle comprend douze genres dont les genres Orthoreovirus, Rotavirus, Seadornavirus et Coltivirus qui peuvent être pathogènes pour l'homme.

La dénomination « réovirus » est l'acronyme de « respiratory enteric orphan virus» proposé en 1959 par Sabin AB. « Reoviruses. A new group of respiratory and enteric viruses formerly classified as ECHO type 10 is described » (Science 1959/130 : 1387-1389) pour désigner des virus isolés des voies respiratoires et digestives de personnes présentant des symptômes respiratoires ou entériques non reliés à une maladie clinique bien définie. Trois principaux sérotypes sont connus, nommés 1, 2 et 3. Les infections aux réovirus sont très fréquentes chez l'homme mais restent le plus souvent asymptomatiques . Cependant, des souches de réovirus ont été isolées de divers cas de maladies symptomatiques chez l'homme, à savoir des maladies du système nerveux central telles que les encéphalites et méningites entraînant parfois la mort du patient. Ces cas sont la preuve que les réovirus peuvent être des agents pathogènes à l'origine de maladies graves.

Le génome est composé de 10 à 12 segments d'ARN double brin selon le genre et peut avoir une taille allant de 18 000 à 30

000 paires de bases (pb) . Chaque segment code pour au moins une protéine. L' ARN génomique porte une coiffe en l'extrémité 5' sur le brin positif, mais ne possède pas de site de polyadénylation en l'extrémité 3' . Les caractères structuraux communs aux Reoviridae sont : l'absence d'enveloppe, la présence d'une capside icosaedrique constituée d'une, deux ou trois couches protéiques dont le diamètre est compris entre 60 et 80 nanomètres (nm) .

Les réovirus de mammifère (MRV) comprennent 10 segments d'ARN double brin, classés en fonction de leur taille et codant chacun pour une protéine excepté le segment Sl qui code pour deux protéines. On distingue trois segments L pour « Large » désignés Ll, L2 et L3, mesurant entre 3854 paires de base (pb) et 3916 pb et codant respectivement pour les protéines λ3, λ2 et λl . Puis, trois segments M pour « Médium » nommés Ml, M2 et M3, de taille comprise entre 2203 pb et 2241 pb et codant respectivement pour les protéines μ2, μl et μNS . Enfin, quatre segments S pour « Small » repartis en S2 (1331 pb) , S3 (1198 pb) , S4 (1196 pb) et Sl codant respectivement pour σ2, σNS, σ3, σl et ois. La taille du segment Sl varie énormément entre les sérotypes et au sein même d'un sérotype. Elle est comprise entre 1368 et 1463 pb . Les onze protéines virales codées par les 10 segments sont organisées en cinq protéines de la capside interne, trois protéines de la capside externe et trois protéines non structurales. Les 8 protéines virales présentes dans les virions de réovirus matures (protéines structurales) sont nécessaires pour l'initiation de l'infection et la synthèse de l'ARNm viral coiffé. Elles pourraient également jouer des rôles régulateurs dans les cellules infectées. Il s'agit des cinq protéines présentes dans l'enveloppe interne (λl, λ2, λ3, μ2 et σ2) et des trois protéines constituant la capside externe du virion (μl, σl et σ3) . La protéine λ2 forme des tourelles pentamériques qui entourent les quintuples axes de la capside interne. De ce fait, elle interagit avec les autres protéines internes et externes. L'analyse des protéines dans les cellules infectées par les réovirus, a révélé la présence de deux autres protéines virales qui ne sont pas présentes dans les virions matures. Ces protéines non structurales sont appelées μNS et σNS . Une autre protéine non structurale ois codée par le second cadre de lecture du segment Sl a été également identifiée.

Les présents inventeurs ont maintenant isolé et caractérisé un nouveau réovirus, dénommé MRV2Tou05. Ce nouveau réovirus a été isolé à partir de trois patients hospitalisés présentant des symptômes respiratoires qui ont rapidement évolués et été diagnostiqués en encéphalites. Il s'agit d'une fille et de son cousin ainsi que de la mère de la fille. Le point commun entre ces membres de la famille est la visite d'un oncle de retour d'un voyage en Indonésie. Différents prélèvements (sérum, urine, liquide céphalo-rachidien, aspirations nasales) ont été testés pour rechercher l'agent étiologique responsable. Les tests de diagnostic basés sur des méthodes de culture cellulaire, de recherche directe d'antigènes et de biologie moléculaire n'ont pas permis de mettre en évidence la présence de virus fréquemment retrouvés dans les cas d'encéphalites.

L'invention a donc pour objet un nouveau réovirus mammifère isolé, dont le génome comprend

(i) une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 1, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 84%, 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 1, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques sont identifiées en SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO :3, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques présentent au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :

2 et SEQ ID NO : 3, ou

(ii) une séquence nucléotidique qui est la séquence complémentaire d'une séquence définie en (i) .

De plus, son génome comprend une séquence nucléotidique choisie parmi : (i) une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 4, une séquence qui présente au moins 80% d'identité, de préférence au moins 83%, 85%, 89%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO :

4, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 5, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 6, une séquence qui présente au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98%, 99% d'identité avec SEQ ID NO : 6, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 7, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 8, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 97%, 98% d'identité avec SEQ ID NO : 8, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 9, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 10, une séquence qui présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 10, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 11, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 12, une séquence qui présente au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 12, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 13, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 14, une séquence qui présente au moins 81% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 14, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 15, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 16, une séquence qui présente au moins 89%, de préférence au moins 90%, 93%, 95%, 98% d'identité, d'identité avec SEQ ID NO : 16, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 17, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 18, une séquence qui présente au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 18, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 19, et une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 20, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 20, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 21, ou

(ii) les séquences nucléotidiques qui sont les séquences complémentaires des séquences définies en (i) .

En particulier son génome consiste en :

(i) une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 1, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 84%, 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 1, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques sont identifiées en SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO :3, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques présentent au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 4, une séquence qui présente au moins 80% d'identité, de préférence au moins 83%, 85%, 89%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 4, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 5, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 6, une séquence qui présente au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98%, 99% d'identité avec SEQ ID NO : 6, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 7, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 8, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 97%, 98% d'identité avec SEQ ID NO : 8, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 9, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 10, une séquence qui présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 10, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 11, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 12, une séquence qui présente au moins 86% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 12, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 13, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 14, une séquence qui présente au moins 81% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 14, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 15, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 16, une séquence qui présente au moins 89%, de préférence au moins 90%, 93%, 95%, 98% d'identité, d'identité avec SEQ ID NO : 16, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 17, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 18, une séquence qui présente au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 18, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 19, et une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 20, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 20, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 21, et/ou

(ii) les séquences nucléotidiques qui sont les séquences complémentaires des séquences définies en (i) .

Réovirus MRVTou05 dont le génome comprend au moins une séquence, au moins deux séquences, au moins trois séquences, au moins quatre séquences, au moins cinq séquences, au moins six séquences, au moins sept séquences, au moins huit séquences, au moins neuf séquences, au moins dix séquences, choisies parmi SEQ ID NOs : 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 et 20, ou Réovirus MRVTou05 dont le génome consiste en SEQ ID NOs : 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 et 20.

Les séquences nucléotidiques listées comme SEQ ID NOs : 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 et 20 correspondent à l'ADNc obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN génomique.

La correspondance entre les différents segments du réovirus, les protéines virales et le listage de séquences est donnée dans le tableau 1 ci-dessous :

Tableau 1

taille des segments ampli fiés

L ' invention a auss i pour obj et - une molécule d'acide nucléique qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique telle que définie ci dessous :

(i) une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 1, une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 84%, 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 1, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques sont identifiées en SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO :3, une séquence qui code pour deux protéines dont les séquences peptidiques présentent au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 4, une séquence qui présente au moins 89% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité avec SEQ ID NO : 4, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 5, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 6, une séquence qui présente au moins 99% d'identité avec SEQ ID NO : 6, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 7, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 8, une séquence qui présente au moins 97%, 98% d'identité avec SEQ ID NO : 8, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 9, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 10, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 10, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 11, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 12, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 12, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 13, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 14, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 14, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 15, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 16, une séquence qui présente au moins 93% d'identité, de préférence au moins 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 16, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 17, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 18, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 18, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 19, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 20, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 20, une séquence qui code pour une protéine dont la séquence peptidique est identifiée en SEQ ID NO : 21, et

(ii) les séquences nucléotidiques qui sont les séquences complémentaires des séquences définies en (i) . une protéine qui comprend ou consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NOs : 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, une séquence qui présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, une séquence peptidique codée par une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 1 ou par une séquence qui présente au moins 83% d'identité, de préférence au moins 84%, 85%, 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 1, une séquence codée par SEQ ID NO : 4 ou par une séquence qui présente au moins 89% d'identité, de préférence au moins 90%, 95%, 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 4, une séquence codée par SEQ ID NO : 6 ou par une séquence qui présente au moins 99% d'identité avec SEQ ID NO : 6, une séquence codée par SEQ ID NO : 8 ou par une séquence qui présente au moins 97% d'identité, de préférence au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 8, une séquence codée par SEQ ID NO : 10 ou par une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 10, une séquence codée par SEQ ID NO : 12 ou par une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 12, une séquence codée par SEQ ID NO : 14 ou par une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO :14, une séquence codée par SEQ ID NO : 16 ou par une séquence qui présente au moins 93%, de préférence au moins 95%, 98% d'identité avec SEQ ID NO : 16 , une séquence codée par SEQ ID NO : 18 ou par une séquence qui présente au moins 98% d'identité, avec SEQ ID NO : 18, une séquence codée par SEQ ID NO : 20 ou par une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 20.

Des amorces ont été définies pour amplifier et/ou détecter les acides nucléiques du nouveau réovirus. Ainsi, l'invention a encore pour objet une paire d'amorces pour amplifier, par exemple par PCR, un réovirus tel que défini précédemment dans laquelle au moins une des amorces a une séquence nucléotidique qui consiste en une séquence de 18 à 30 nucléotides contigus capable de s'hybrider à une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NOs : 1, une séquence qui présente au moins 83% d'identité avec SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, une séquence qui présente au moins 89% d'identité avec SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, une séquence qui présente au moins 99% d'identité avec SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, une séquence qui présente au moins 97% d'identité avec SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, une séquence qui présente au moins 93% d' identité avec SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 et une séquence qui présente au moins 98% d'identité avec SEQ ID NO : 20. En particulier, la paire d'amorces est choisie parmi au moins un des couples suivants :

SEQ ID NO : 22 et SEQ ID NO : 23

SEQ ID NO : 22 et SEQ ID NO : 24 SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26,

SEQ ID NO : 27 et SEQ ID NO : 28,

SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30,

SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32,

SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36,

SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40,

SEQ ID NO : 41 et SEQ ID NO : 42,

SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44,

SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : 46, et SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : 47.

L' invention définit un premier procédé pour amplifier et/ou détecter une souche de réovirus, tel que défini précédemment, dans un échantillon, le procédé comprenant les étapes de : (a) extraire les acides nucléiques de l'échantillon,

(b) amplifier au moins un desdits acides nucléiques extraits, et

(c) déterminer la présence de séquence (s) d'acide nucléique spécifique (s) dudit réovirus, dans lequel l'étape d'amplification est réalisée par RT-

PCR en utilisant au moins une paire d'amorces telles que définie ci-dessus.

Dans ce procédé, l'échantillon peut être du sérum, du plasma, du liquide céphalo-rachidien, un prélèvement de gorge, de l'urine.

Dans un autre procédé pour détecter la souche du réovirus, l'échantillon est mis en contact avec au moins une des protéines de l'invention et on détecte la présence d'au moins un complexe protéine/anticorps par tout moyen connu. Dans ce procédé, l'échantillon peut être du sérum, du plasma, du liquide céphalo-rachidien, de l'urine, et de préférence est le sérum. Le test peut être un Western Blot ou test sandwich. La formation du complexe protéine/anticorps peut être mise en évidence par réaction dudit complexe formée avec un ligand de l'anticorps, par exemple un antigène ou une anti- immunoglobuline humaine, marquée par tout marqueur approprié, par exemple par une enzyme telle que la peroxydase de raifort.

L' invention concerne encore : un kit pour amplifier et/ou détecter le réovirus dans un échantillon, qui comprend au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment; et un kit pour détecter la présence du réovirus de l'invention, dans un échantillon, comprenant au moins une protéine telle que définie ci dessus.

Figures La figure 1 représente un arbre phylogénique qui résulte d'une analyse phylogénique qui a notamment permis de confirmer que le nouveau réovirus est un virus de sérotype 2.

La figure 2 est la visualisation sur gel d' agarose 1%+TBE des résultats du test moléculaire de détection basé sur le segment L3 à partir d'acides nucléiques extraits de cellules infectées avec la souche virale issue des urines du garçon. Le test comprend une étape de transcription inverse, une étape de PCR dans laquelle un fragment de 696 pb est amplifié et une étape de PCR semi-nichée dans laquelle un fragment de 512 pb est amplifié.

Signification des pistes :

1 : contrôle négatif eau PCR

1' : contrôle négatif eau PCR semi-nichée

2 : contrôle négatif cellulaire PCR 2' : contrôle négatif cellulaire PCR semi-nichée

3 : cellules et surnageant infectés PCR

3' : cellules et surnageant infectés PCR semi-nichée

M : marqueur de poids moléculaire La figure 3 représente les résultats d'un Western Blot réalisé avec des sérums d'oies dirigés contre les trois différents sérotypes de réovirus (sérotype 1 : Hall S729, sérotype 2 :

Jones, sérotype 3 : Abney) .

Signification des bandelettes : 1 et 2 : sérum d'oie anti-réovirus sérotype 1

3 et 4 : sérum d'oie anti-réovirus sérotype 2

5 et 6 : sérum d'oie anti-réovirus sérotype 3

7 et 8 : sérum humain sain les numéros impairs correspondent aux bandelettes de cellules infectées et les numéros pairs correspondent aux bandelettes de cellules non infectées.

La figure 4 représente les résultats d'un Western Blot réalisé avec le sérum de la fille prélevé à différents temps après le début des symptômes (A : J+6, B : J+13, C : J+19 : D : sérum négatif) . I, T et M signifient respectivement cellules infectées, cellules témoins non infectées et marqueur de poids moléculaire .

Exemples

Exemple 1 :

Infection de cellules BGM sur plaque de 24 puits

La souche virale utilisée pour l'infection des cellules BGM (Buffalo Green Monkey Kidney) a été obtenue à partir des urines de la fille.

Des cellules BGM (Buffalo Green Monkey Kidney) sont mises en culture 2 jours avant l'infection virale à raison de 0,8 à 1 10 ⁵ cellules par puits, dans 1,5 mL du milieu de croissance décrit ci dessous : EMEM IX avec sels de Earle (CAMBREX réf. : BE121-1235F) (500 mL) 1% de Glutamine 200 Mm (CAMBREX réf.: BE17-605E) (100 mL) 1% d'acides aminés non essentiels 100X (CAMBREX)

2% du mélange Pénicilline-Streptomycine (CAMBREX réf. : DE17- 602E) (10 000 U pénicilline G, 10 000 g streptomycine) sérum de veau fœtal inactivé 7% (CAMBREX réf. : DE14-081F) (500 mL) , inactivé pendant 30 min. à 56°C.

Le milieu de culture est enlevé des puits, le jour de l'infection. Les cellules sont lavées dans du PBS IX. Le stock viral est dilué dans un milieu d' infection (milieu de croissance sans SVF + 0,003% de trypsine à 2.5%) . 100 μL de milieu non infecté sont ajoutés par puits comme contrôle négatif et 100 μL de milieu infecté sont ajoutés dans chacun des autres puits. La plaque est centrifugée à 2370 tours/min., pendant 20 min. à température ambiante. 2 mL de milieu d'infection sont ajoutés par puits. La plaque est incubée pendant 3 heures à 34°C sous atmosphère de CO2 5%. La totalité du milieu est enlevée et remplacée par 2 mL de milieu frais par puits. La plaque est incubée à 34 ⁰ C sous atmosphère de CO2 5%. L'apparition d'effets cytopathiques (ECP) est suivie tous les jours. Le surnageant de culture et les cellules sont récupérés quand il y a environ 60- 80% d'ECP. Des aliquotes de 200 μL sont préparées et le matériel est congelé à -8O ⁰ C.

Exemple 2 :

Infection de cellules BGM en boîtes

La souche virale utilisée pour l'infection est la même que celle de l'exemple 1. Des cellules BGM sont mises en culture 2 jours avant l'infection virale à raison de 1,8 10 ⁶ à 2 10 ⁶ cellules pour une boîte (Flask T75) et 0,6 10 ⁶ pour une boîte (Flask T25) , dans le milieu de croissance décrit ci dessous : EMEM IX avec sels de Earle (CAMBREX réf. : BE121-1235F) (500 mL) 1% de Glutamine 200 Mm (CAMBREX réf.: BE17-605E) (100 mL) 1% d'acides aminés non essentiels 100X (CAMBREX)

2% du mélange Pénicilline-Streptomycine (CAMBREX réf. : DE17- 602E) (10 000 U pénicilline G, 10 000 g streptomycine) sérum de veau fœtal inactivé 7% (CAMBREX réf. : DE14-081F) (500 ml), inactivé pendant 30 min. à 56°C.

Le milieu de culture est enlevé de la boîte, le jour de l'infection. Les cellules sont lavées dans du PBS IX. Le stock viral est dilué dans un milieu d' infection (milieu de croissance sans SVF + 0,003% de trypsine à 2.5%) . 1 mL de milieu infecté est ajouté dans la boîte Flask T25 et un minimum 3 mL pour une boîte Flask T25. Les contrôles négatifs sont préparés dans les mêmes conditions avec du milieu non infecté. Les boîtes sont incubées pendant 2 heures à 34 ⁰ C sous atmosphère de CO2 5%, sous agitation partielle. 4 mL de milieu d'infection sont ajoutés pour une Flask T25 et 10 ml pour une Flask T75. Les boîtes sont incubées pendant 3 heures à 34 ⁰ C sous atmosphère de CO2 5%. La totalité du milieu est enlevée et remplacée par du milieu frais. Les boîtes sont incubées à 34°C sous atmosphère de CO2 5%. L'apparition d'effets cytopathiques (ECP) est suivie tous les jours. Le stock viral issu des cellules et/ou du surnageant de culture est récupéré quand il y a environ 60-80% d'ECP. Les cellules sont décollées et le stock viral est congelé à -8O ⁰ C.

Exemple 3 :

Caractérisation moléculaire du segment Sl

Les ARNs viraux double brin sont extraits des cellules infectées obtenues selon l'exemple 2 et sont soumis à migration sur gel Elchrom™ (Eurogentec) . Le fragment correspondant au segment Sl est récupéré après migration électrophorétique sur le gel et amplifié par RT-PCR « random » dans les conditions suivantes : 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Thermoscript™ (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce « random » T7-N 10 μM TAATACGCATCACTATAGGG (N) 6 (SEQ ID NO : 22), 2 μL de dNTP (10 mM) , 1,4 μL de DMSO et 3,6 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Thermoscript RT (15 UI /μL)

5 μL d'ARN Sl sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. sur glace. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 10 min. à 18°C, 50 min. à 50 ⁰ C, 5 min. à 85°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction. 2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces suivants :

5' -TAATACGCATCACTATAGGG(N) 6-3' T7-N amorce sens, (SEQ ID NO : 22) 5'-TAATACGCATCACTATAGGG-S' T7 amorce anti-sens, Tm : 56°C (SEQ ID NO : 23)

Le mélange comprend 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15mM), 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de T7-N (10 pmol) , 1 μL de T7 (40 pmol), 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 48 μL H ₂ O. 2 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

5 min. à 94°C, 10 min. à 18°C, 2 min. à 72°C 30 sec. à 94 ⁰ C, 1 min. à 55°C, 1 min. à 72°C. (40 cycles) 7 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction . Le produit obtenu est de l'ADNc Sl qui correspond à environ 80% du segment Sl total. Une nouvelle RT-PCR est donc effectuée pour obtenir la séquence de Sl dans sa totalité comme décrit ci- dessous .

L'ARN viral total est extrait des cellules infectées obtenues selon l'exemple 2 et amplifié dans les conditions suivantes : 3. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) L'amorce anti-sens spécifique GSP2 suivante a été synthétisée 5' -ATCTTCGCAATCATTCCCGA-3' Tm :58°C (SEQ ID NO : 24) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce GSP2 (10 pmol/μL) , 1 μL de dNTP (10 Mm) et 7,6 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

2 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1, puis 1,4 μL de DMSO. Le mélange est incubé 5 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C. 4. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High

Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces suivant :

5' -TAATACGCATCACTATAGGG(N) 6-3' T7-N amorce sens, (SEQ ID NO : 22) 5'- ATCTTCGCAATCATTCCCGA-3' GSP2 amorce anti-sens, Tm : 58°C

(SEQ ID NO : 24)

Le mélange comprend 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de T7-N (10 pmol) TAATACGCATCACTATAGGG(N) 6, 1 μL d'amorce GSP2 (40 pmol), 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

5 min. à 94°C, 10 min. à 18°C, 2 min. à 72°C 30 sec à 94 ⁰ C, 1 min. à 55°C, 1 min. à 72°C. (40 cycles) 7 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

Le produit d'amplification obtenu, après clonage et séquençage, est un fragment du segment Sl de 684 pb .

Le segment Sl complet a été caractérisé par RT-PCR.

Un couple d'amorces spécifiques a été synthétisé.

5' -CCGATGTCCGAACTTCAACA-3' amorce sens (SEQ ID NO : 25)

5'-ATGAATTGCCGTCGTGCCG-S' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 26)

L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes : 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Improp II™ - reverse transcriptase (Promega)

Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL),l μL de dNTP (10 mM) et 2,2 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 2,4 μL de MgCl ₂ , 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Improp II.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1 et 1,4 μL de DMSO sont ajoutés. Le mélange obtenu est incubé 8 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4°C. 8,4 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 25°C, 60 min. à 53°C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4°C pour stopper la réaction. L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High

Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du

MgCl ₂ (15mM), 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase

Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

4 min. à 95°C

30 sec à 95 ⁰ C, 30sec. à 59°C, 2 min. à 72°C. (35 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 1423 pb correspond à un segment Sl identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 1.

Exemple 4

Caractérisation moléculaire du segment S2 Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5'-CTATTCGCTGGTCAGTTATG-S' amorce sens (SEQ ID NO : 27) 5'-GATGAATGTGTGGTCAGTCG-S' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 28) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -Rnase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend : 1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL),l μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97°C puis 5 min. à 4°C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High

Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de Tp 10X avec 15 mM de

MgCl ₂ , 1 μL de mélange de dNTP (100 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI /μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

4 min. à 95°C 30 sec à 94 ⁰ C, 30 sec. à 56°C, 2 min. à 72°C. (30 cycles)

10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 1330 pb correspond à un segment S2 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 4.

Exemple 5 Caractérisation moléculaire du segment S3

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5' -TAAAGTCACGCCTGTTGTCG-3' amorce sens (SEQ ID NO : 29)

5' -ACCACCAAGACATCGGCAC-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 30) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL) ,1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97°C puis 5 min. à 4°C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction. L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C 30 sec à 95 ⁰ C, 30 sec. à 56°C, 2 min. à 72°C. (30 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction . La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 1178 pb correspond à un segment S3 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 6.

Exemple 6

Caractérisation moléculaire du segment S4

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5'-GTTGTCGCAATGGAGGTGTG-S' amorce sens (SEQ ID NO : 31)

5' - TCCCACGTCACACCAGGTT-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 32) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL),l μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97°C puis 5 min. à 4°C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction. L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C

30 sec. à 95°C, 30 sec. à *65°C, 1 min. à 72°C (7 cycles)

30 sec à 95 ⁰ C, 30 sec à 58°C, 1 min. à 72°C. (23 cycles)

10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

*signifie que la température diminue de 1°C à chaque cycle.

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 1158 pb correspond à un segment S4 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 8.

Exemple 7

Caractérisation moléculaire du segment Ll

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5' -GCTACACGTTCCACGACAAT-3' amorce sens (SEQ ID NO : 33)

5' -TGAGTTGACGCACCACGACCCA-S' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 34) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes : 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL), 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O.

Le mélange 2 comprend : 4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 8 min. à 97°C puis 5 min. à 4°C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 10X contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C

30 sec. à 95°C, 60 sec. à 59°C, 4 min. à 68°C (30 cycles)

10 min. à 68° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 3852 pb correspond à un segment Ll identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 10. Exemple 8

Caractérisation moléculaire du segment L2

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5' -ATGGCGAACGTTTGGGGAGT-3' amorce sens (SEQ ID NO : 35) 5' -GATGAATTAGGCACGCTCACG-S' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 36) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes : 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL), 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral sont ajoutés au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 8 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C. 2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High

Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du

MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C 30 sec. à 95°C, 30 sec. à 58°C, 4 min. à 68°C (30 cycles) 10 min. à 68° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 3903 pb correspond à un segment L2 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 12.

Exemple 9

Caractérisation moléculaire du segment L3

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5'- TAATCGTCAGGATGAAGCGGA-S' amorce sens (SEQ ID NO : 37)

5' - TGAATCGGCCCAACTAGCAT-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 38) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes : 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL) , 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O.

Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

1 μL d'ARN viral est ajouté au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 8 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 10X contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C

30 sec. à 95°C, 30 sec. à 59°C, 4 min. à 68°C (30 cycles)

10 min. à 68° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 3897 pb correspond à un segment L3 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 14.

Exemple 10 Caractérisation moléculaire du segment Ml

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5' -ATGGCTTACATCGCAGTTCCT-S' amorce sens (SEQ ID NO : 39) 5' - CGTAGTCTTAGCCCGCCCC-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 40) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL), 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral est ajouté au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction. L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 10X contenant du

MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI /μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

4 min. à 95°C 30 sec. à 95°C, 30 sec. à 58°C, 2 min. à 72°C (30 cycles)

10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction . La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 2278 pb correspond à un segment Ml identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 16.

Exemple 11

Caractérisation moléculaire du segment M2

Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5' - TAATCTGCTGACCGTCACTC-3' amorce sens (SEQ ID NO : 41) 5' - GTGCCTGCATCCCTTAACC-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 42) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen)

Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL) , 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O.

Le mélange 2 comprend : 4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III.

5 μL d'ARN viral est ajouté au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15 IΓLM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C

30 sec. à 95°C, 30 sec. à 58°C, 2 min. à 72°C (30 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 2195 pb correspond à un segment M2 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 18.

Exemple 12

Caractérisation moléculaire du segment M3 Les acides nucléiques sont extraits des cellules infectées et du surnageant de culture obtenus selon l'exemple 1 ou l'exemple 2. Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées : 5'-CGTGGTCATGGCTTCATTC-S' amorce sens (SEQ ID NO : 43) 5' -GATGAATAGGGGTCGGGAA-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 44) L'ARN viral est amplifié dans les conditions suivantes :

1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Superscript III™ -RNase H-reverse transcriptase (réf. : 18080) (Invitrogen) Le mélange 1 comprend : 1 μL d'amorce sens (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (10 pmol/μL), 1 μL de dNTP (10 mM) et 5 μL de H ₂ O. Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 1 μL de DTT (0,1M), 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Superscript III. 5 μL d'ARN viral est ajouté au mélange 1. Le mélange obtenu est incubé 8 min. à 97 ⁰ C puis 5 min. à 4 ⁰ C. 7 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 60 min. à 50 ⁰ C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction. L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens (50 pmol/μL) , 5 μL de de tampon 10X contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min. à 95°C 30 sec. à 95°C, 30 sec. à 57°C, 2 min. à 72°C (30 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

La bande obtenue sur gel est de la taille attendue. Après purification, clonage et séquençage le produit d'amplification de 2230 pb correspond à un segment M3 identifié dans le listage de séquence en SEQ ID NO : 20.

Exemple 13

Analyse des différents segments

Après séquençage des 10 segments une interrogation est réalisée sur blastn (NCBI) afin de déterminer pour chaque segment le pourcentage d' identité en nucléotides avec la souche de réovirus la plus proche (pour chaque sérotype) .

Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci dessous :

Tableau 2

Identité (%) des séquences nucléotidiques déterminés pour chaque segment du réovirus de l'invention étudié en comparaison avec les réovirus de sérotype 1, de sérotype 2, de sérotype 3 et du réovirus SC-A isolé du porc.

A défaut de précision tous les réovirus sont des réovirus humains. Isolât SC-A: numéro d'accession DQ911244 Le segment Sl code pour la protéine σl qui détermine le sérotype. Comme cela ressort du tableau 2, Sl présente 82% d'identité avec deux souches humaines de sérotype 2 (isolât 302II numéro d'accession EU049604 et 3021 numéro d'accession EU049603), isolées d'échantillons fécaux de deux enfants à Pékin en 1982. Le segment S3 présente un pourcentage d'identité de 98% avec les souches humaines T1N84 et T2N73. Les autres segments, à l'exception du segment Ml qui présente un % d'identité quasiment identique avec les souches humaines et de porc, sont beaucoup plus proches du réovirus de porc SC-A isolé des selles de porc en Chine que des réovirus humains.

Il s'agit donc d'un réovirus qui a subit des réassortiments entre une souche porcine et une souche humaine. Une analyse phylogénique a permis de confirmer que la souche de réovirus isolée à partir des souches virales appartient au sérotype 2. L'arbre phylogénique est représenté à la figure 1.

Exemple 14

Détection du virus dans des prélèvements de patients

Un test de détection basé sur le segment L3 codant pour une hélicase a été mis en place. Ce test comprend une étape de transcription inverse, une étape d'amplification PCR et une étape de PCR semi-nichée.

Le test a été effectué sur des acides nucléiques (i) extraits des urines du garçon, (ii) extraits des urines de la fille et (iii) extraits du sérum du garçon prélevé 21 jours après le début des symptômes, avec les conditions suivantes.

Les amorces spécifiques suivantes ont été synthétisées :

5' - CAGGATGAAGCGGATTCCAA-3' amorce sens L3-1 (SEQ ID NO : 45)

5'-GGATGATTCTGCCATGAGCT-S' amorce anti-sens L3-2 (SEQ ID NO :

46) 1. Etape de transcription inverse utilisant le kit Improp II Reverse trancripstase (Promega) Le mélange 1 comprend :

1 μL d'amorce sens L3-1 (10 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens L3-2 (10 pmol/μL) et 1 μL de dNTP (10 mM) . Le mélange 2 comprend :

4 μL de tampon de synthèse d'ADNc 5X, 2,4 μL de MgCl ₂ (25mM) , 1 μL de «Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor» et 1 μL de transcriptase inverse Improp II. 7.2 μL d'ARN sont ajoutés au mélange 1, puis 1,4 μL de DMSO. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 97°C puis 5 min. à 4°C. 8,4 μL de mélange 2 sont ensuite additionnés à l'échantillon. Le mélange obtenu est incubé 5 min. à 25°C, 60 min. à 53°C, 10 min. à 72°C puis la température est redescendue à 4°C pour stopper la réaction . L'ADNc obtenu peut être stocké à -20 ⁰ C.

2. Etape d'amplification PCR utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche)

L'amplification est réalisée à l'aide du couple d'amorces défini pour la transcription inverse.

Le mélange comprend 1 μL d'amorce sens L3-1 (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens L3-2 (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15 mM) , 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High Fidelity (3,5 UI/μL) , QSP 45 μL H ₂ O. 5 μL d'ADNc obtenu après transcription inverse sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants :

4 min. à 95°C

30 sec. à 95°C, 30 sec. à 58°C, 1 min. à 72°C (30 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction .

Le produit d'amplification est un fragment de 696 pb . , comme montré à la figure 2A.

3. PCR semi-niché utilisant le kit Expand High Fidelity System™ (réf. : 1732650) (Roche) basée sur le segment L3.

Les amorces suivantes sont utilisées. 5' -CAGGATGAAGCGGATTCCAA-3' amorce sens L3-1 (SEQ ID NO : 45)

5' -CCAACACGCGCAGGATGTTT-3' amorce anti-sens (SEQ ID NO : 47) le mélange suivant a été préparé :

1 μL d'amorce sens L3-1 (50 pmol/μL) , 1 μL d'amorce anti-sens

L3-5 (50 pmol/μL) , 5 μL de tampon 1OX contenant du MgCl ₂ (15mM), 1 μL de mélange de dNTP (10 mM) , 1 μL de polymérase Taq High

Fidelity (3,5 UI /μL) , QSP 45 μL H ₂ O.

5 μL du produit de PCR obtenu à l'étape précédente 2 sont additionnés au mélange ci-dessus et le mélange obtenu est soumis aux cycles de températures suivants : 4 min . à 95 ° C

30 sec. à 95°C, 30 sec. à 59°C, 1 min. à 72°C (35 cycles) 10 min. à 72° C et la température est redescendue à 4 ⁰ C pour stopper la réaction.

Le produit d'amplification obtenu est un fragment de 512 pb . , comme montré à la figure 2B.

Le virus est donc détecté dans l'urine de la fille, dans l'urine du garçon et dans le sérum du garçon prélevé 21 jours après les premiers symptômes.

Exemple 15 Analyse sérologique

L'analyse sérologique est réalisée par Western Blot avec un lysat cellulaire infecté par la souche de réovirus isolée des urines des enfants. Un lysat cellulaire non infecté a été utilisé comme contrôle négatif. Un contrôle positif est réalisé avec trois sérums d'oie dirigés chacun contre le réovirus de sérotype 1 (Hall S729), le réovirus de sérotype 2 (Jones) et le réovirus de sérotype 3 (Abney) . Ces sérums sont utilisés habituellement dans des tests d' inhibition de l' hémagglutination qui permettent de déterminer le sérotype.

Trois bandes ont été observées pour le sérum anti-réovirus de type 1 et deux bandes pour le sérums anti-réovirus de type 2. Une bande de poids moléculaire entre 37 et 5OkDa est observée uniquement pour le sérum anti-reovirus de type 1. Il peut s'agir de l'une des protéines codées par les segments S. En effet, le segment Sl code pour une protéine σl de taille 49 kDa, le segment S2 pour une protéine σ2 de taille 47 kDa et les segments S3 et S4 codent pour deux protéines σNS et σ3 respectivement de taille égale (41 kDa) . Deux bandes de poids moléculaire compris entre 75 kDa et 100 kDa sont observées avec les sérums anti-réovirus de type 1 et 2

(Figure 3) . Elles peuvent correspondre soit à la protéine μlc

(76 kDa) codée par le segment M2, soit à la protéine μ2 (83 kDa) codée par le segment Ml soit à la protéine μNS (80 kDa) codée par le segment M3, ou aux trois protéines codées par les trois segments M.

Le sérum de la fille a été prélevé à différents temps après le début des symptômes (J+6, J+13, J+19) et une recherche d'anticorps IgG anti-réovirus a été réalisée par Western Blot en utilisant en révélation une anti-IgG humaine de chèvre marquée à la peroxydase.

Les 3 sérums de la fille ainsi qu'un sérum contrôle fourni par l'établissement français du sang (EFS) ont été dilués au 1/100e et mis en contact pendant 1 heure.

Les résultats sont illustrés à la figure 4 où une bande d'environ 150 kDa est observée uniquement dans les cellules infectées en contact avec les sérums de la fille malade. Le signal est conservé même après fortes dilutions. Aucun signal n'est observé dans le cas d'un sérum humain négatif.

La bande de 150 kDa peut correspondre soit à la protéine λ3 du segment Ll (142 kDa), à la protéine λ2 du segment L2 (145 kDa) ou à la protéine λl du segment L3 (143 kDa) ou aux trois protéines codées par les trois plus grands segments. Il est intéressant de noter que l'intensité de la bande augmente à 15 jours et 21 jours après le début des symptômes, ce qui suggère une augmentation de la quantité d'anticorps anti-réovirus au cours du temps .

Pour le garçon et la mère, les résultats sont moins significatifs que ceux obtenus pour la fille. Les sérums de la mère (J+7 et J+13) et du garçon (J+6 et J+20) ont été dilués au l/100 ^e et mis en contact pendant 4 heures de temps.

Une bande à environ 150 kDa est observée uniquement dans les cellules infectées en contact avec les sérums de la mère et du garçon, mais l'intensité de la bande est plus faible que celle obtenue avec les sérums de la fille. Les résultats sont synthétisés dans le tableau 3 ci-dessous

Tableau 3

ND : non disponible J : jour

38 sérums de personnes contrôles (donneurs de sang) fournis par l'EFS de Lyon ont été dilués au l/100 ^e et la présence d'anticorps anti-réovirus a été recherchée. Le protocole est le même que celui utilisé pour la recherche d'anticorps chez les patients de 1' étude .

Aucune réaction dirigée contre la souche de réovirus, isolée des patients de l'étude, n'a été observée.

La prévalence des anticorps dirigés contre les souches prototypes de réovirus chez ces 38 donneurs de sang a été étudiée. Des cellules BGM ont été infectées avec les souches de type 1 Lang, de type 2 Jones et de type 3 Dearing (ATCC) . L'analyse sérologique a été réalisée par Western Blot avec un lysat cellulaire infecté à l'aide de ces différentes souches prototypes. Un lysat cellulaire non infecté a été utilisé comme contrôle négatif.

Environ 53% de la population testée possède des anticorps dirigés spécifiquement contre la souche Lang, la souche Jones et/ou la souche Dearing (Tableau 4) , alors qu'aucune réaction spécifique n'a été observée contre le réovirus isolé des patients de l'étude, indiquant ainsi que sa prévalence est beaucoup plus faible.

Tableau 4