一种新型的连接子及其制备方法和用途 技术领域

本发明属于生物制药及生物技术领域， 具体涉及新型的耦联功能连接子 (linker, 又称耦联剂） 及其制备， 及其应用于小分子化合物、 核酸、 核酸类似 物、 示踪分子等以位点特异的方式稳定地耦联到蛋 白质、 多肽的 N端或 C端的 方法。本发明涉及的连接子及耦联方法可用于 制备肿瘤靶向治疗药物、靶向示踪 诊断试剂和特定细胞种类高效投送试剂等。

背景技术

将小分子化合物、 蛋白质及肽类、 核酸分子、 核酸分子类似物、 示踪分子等 靶向输入特定细胞或组织是生物学研究和临床 治疗及诊断关键的技术，也是主要 的挑战之一。 最重要的应用是在癌症治疗领域开发具有高度 靶向性的抗体 -药物 耦联物 （ADC)， FDA已分别于 2011年和 2013年批准 2个 ADC药物上市， 用 于癌症治疗 （参见 Seattle Genetics 公司的新药 Adcetris 和罗氏公司的新药 Kadcyla)。

抗体 -药物耦联物 （Antibody-Drug Conjugates, ADC) 是在单抗药物基础上 研发的新一代兼具抗体的靶向作用和传统细胞 毒药物的强效抗肿瘤药物，由抗体 ( antibody ) 连接子 （linker) 和细胞毒素 （toxin) 三部分组成。 其中， 抗体决 定药物作用的细胞类型和靶点； 连接子是 ADC药物设计的最核心部分， 是实现 靶向释药的关键； 细胞毒素可以是可致细胞死亡、引诱细胞死亡 或减少细胞生存 力的任何化合物。 ADC 药物最核心的技术是耦联方式的设计， 是实现靶向释药 的关键。 目前连接子的设计有很多种， 包括基于化学耦联、抗体非天然氨基酸改 造、 生物酶催化等方法， （参见 Seattle Genetics, Immunogene, Mersana, Ambrx, Pfizer等公司开发的技术）， 但都存在药物耦联抗体的位点及数目不固定、 制备 工艺复杂等多方面的问题， 这会导致药代动力学、 药物稳定性及药效可控性低。 位点特异的高度均质性耦联是理想 ADC药物的发展方向。

反义 （Antisen _Se )、 小干扰核酸 （siRNA) 等核酸及核酸类似物药物在癌症 治疗等领域具有独特的优势， 预计将成为下一代生物药的主体。 目前进入临床 II/III 期阶段的核酸及核酸类似物药物主要靠脂质体 等纳米材料包裹， 缺乏靶向 特异性； 也有使用抗体输送 siRNA的报道， 但 siRNA普遍与抗体以非共价方式 说 明 书

结合 （ YaoY-D et al， Sci Transl Med. 2012 , 4(130): 130ra48), 这导致 siRNA-抗体 复合物比例高度不均一， 因而导致药代动力学、药物稳定性及药效可控 性低， 难 以应用于临床。 理想的靶向输送需要在抗体固定位点共价耦联 siRNA等治疗分 子。

对培养细胞进行 RNA干扰实验已成为生物医学研究中的重要技术 ， 目前一 般使用转染试剂将 siRNA输送入细胞 （参见 Invitrogen及 Roche公司的转染试 剂）， 这种方法对细胞毒性较大， 对很多种细胞效率低， 因此迫切需要一种高效、 简便的投送方法。

Sortase 酶是存在于革兰氏阳性菌中的一类酶， 因其介导高度特异性的蛋白 质连接， 已被成功应用于蛋白质与肽类、类核酸、糖类 等活性物质的连接及活细 胞标记等。 已有将 Sortase酶应用于蛋白质分子特定位点标记的报� �（Mohlmann et al, Chembiochem. 2011,12(11): 1774-80;； Madej MP et al, Biotechnol Bioeng. 2012 , 109(6): 1461-70; Swee LK et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110(4): 1428-33; ), 通过基因工程改造的各类 Sortase酶也有报道， 呈现出不同的 催化特征。 但将此方法成功应用于抗体-药物、 抗体-毒素、 抗体 -siRNA或抗体- 寡核苷酸耦联物的制备，在技术上还未实现， 主要原因在于符合以上制备要求的 连接子的设计与相应的耦联方法的开发具有巨 大挑战性。 发明内容

本发明的目的是提供一个完善的耦联系统， 解决目前在 ADC药物制备、靶 向核酸药物制备、 靶向示踪诊断试剂制备以及高效细胞投送等领 域存在的问题。

1.连接子

本发明涉及一系列具有双向耦联功能的连接子 ， 其特征在于， 由蛋白耦联 区 （Protein Conjugation Area, PC A), 连接区 （Linker Area, LA) 以及化学耦联 区 (Chemical Conjugation Area, CCA)3部分组成， 结构示意为

PCAl -(LA) _a -CCAl (I)

或

CCA2- (LA) _a -PCA2 (II)

对于靶向物质为蛋白质、抗体等， PCA为一段短肽序列，代表了天然 Sortase 说 明 书

酶（包括 A,B,C,D， L. plantarum的 Sortase 等， 详见专利 US20110321183A1 )及 改造的 Sortase酶的底物序列 （如， Chen I et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(28): 11399-404 ) o 具体情形为：

式（I)为第一类连接子， 其中 PCA1可以为适宜的 Sortase酶受体底物寡聚 甘氨酸（Gly )序列 Gn ( n通常为 1一 100)， 其 C端氨基酸的 α位羧基应用于与 LA耦联；式（I)中 PCA1也可以为其他适宜的受体底物序列，如寡� �丙氨酸（Aln) 序列或者寡聚甘氨酸 /丙氨酸混合序列。

式 （II) 为第二类连接子， 其中 PCA2为相应 Sortase酶的供体底物的识别 序列。 Staphylococcus aureus的 Sortase A为 LPXTG, Staphylococcus aureus的 Sortase B为 PQTN, Bacillus anthracis的 Sortase B为 PKTG, Streptococcus pyogenes的 Sortase A为 LPXTG, Streptomyces coelicolor的 Sortase subfamily5 为 LAXTG, Lactobacillus plantarum的 Sortase为 LPQTSEQ。

PCA2序列为： X1X2X3TX4X5X6, 其中 XI代表亮氨酸（Leu)或天冬酰胺 ( Asn) , X2代表脯氨酸 （Pro) 或丙氨酸 （Ala) , X3代表任何一个氨基酸， X4 代表苏氨酸 （Thr)， X5代表甘氨酸 (Gly)、 丝氨酸 （Ser) 或天冬酰胺 （Asn)， X6代表任何一个氨基酸或不存在。 PCA2通过其 N端氨基酸的 α位伯胺与 LA 相连。

需特别说明， 对于靶向物质为短肽的类型， 式 （I) 或式 （Π) 连接子中的 PCA部分既可以参照上述相应的设计， 也可以直接使用靶向肽自身序列。

式 （I)与式 （II) 中 PCA部分的氨基酸序列中除甘氨酸外的其他氨基 酸均 为 L型。

LA是 PCA与 CCA的衔接部， a为 0或 1， 即指, LA可存在或不存在， LA 的结构如下式所示：

H2-R1-P-R2- ( C=0) -OH

一方面， P可代表式（OCH2CH2 ) m的聚乙二醇单元，其中 m为 0或 1-1000 的整数； Rl、 R2可以代表11、 具有 1-6个碳原子的线性垸基、 具有 3至 6个碳 原子的支化或环状垸基、 具有 2-6个碳原子的线性、 支化或环状烯基或炔基； 上 述式 LA可通过末端胺基、 末端羧基分别与 PCA及 CCA通过酰胺键共价连接。

另一方面， P可代表长度在 1-100个氨基酸之间的肽单元； Rl、 R2可以代 说 明 书

表 H、 具有 1-6个碳原子的线性垸基、 具有 3至 6个碳原子的支化或环状垸基、 具有 2-6个碳原子的线性、支化或环状烯基或炔基； 上述式 LA可通过末端胺基、 末端羧基分别与 PCA及 CCA通过酰胺键共价连接。

线性垸基的实例包括甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 戊基和己基。 具有 3至 6 个碳原子的支化或环状垸基的实例包括异丙基 、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、 己基、 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。

具有 2至 6个碳原子的线性烯基的实例包括乙烯基、 丙烯基、 丁烯基、 戊 烯基、 己烯基。 具有 2至 6个碳原子的支化或环状烯基的实例包括异丁� �基、异 戊烯基、 2-甲基 -1-戊烯基、 2-甲基 -2-戊烯基。

具有 2至 6个碳原子的线性炔基的实例包括乙炔基、 丙炔基、 丁炔基、 戊 炔基、 己炔基。 具有多至 6个碳原子的支化或环状炔基的实例包括 3-甲基 -1-丁 炔、 3-甲基 -1-戊炔、 4-甲基 -2-己炔。

CCA含有适当的官能团， 可通过酰胺键、 二硫键、 硫醚键、 硫酯键、 肽键、 腙键、 酯键、 醚键或氨基甲酸酯键与小分子化合物、 核酸分子、 示踪分子等共价 耦联。 优选的化学基团包括但不限于： N-琥珀酰亚胺基酯和 N-磺基琥珀酰亚胺 基酯， 适于与伯胺反应； 对硝基苯基酯 （P-nitrophenyl esters ) 二硝基苯基酯

( dinitrophenyl esters )与五氟苯基酉 ( pentafluorophenyl esters ) 等， 适于与胺基 反应； 马来酰亚胺基 （适于与巯基进行反应） ； 羧酸氯化物 （Carboxylic acid chlorides), 适于与与巯基反应； 二硫代吡啶基 （pyridyldithio) 与二硫代硝基吡 啶基 （ Nitropyridyldithio )， 适于与巯基反应形成二硫键； 以及卤代垸基

( alkylhalide ) 或卤代乙酰基 （haloacetyl ) (适于与巯基反应） ； 异氰酸酯基

(isocyanate) (适于与羟基进行反应）； 羧基（适于与羟基缩合成酯键， 与胺基缩 合成酰胺键）。 CCA 中的官能团也包括具有以下反应活性的基团： 通过肟键

( oxime)形成，适于与焼氧基胺基 (alkoxy-amine)反应、 Cu (I)催化以及 strain 促进的胡伊斯 偶极环 ¾Π成 （ ' C ck' 反应 ) , 适于与炔烃基 （alkyne) 或叠氮 （ azide ) 基反应； 反 电子要求 的 HAD 反应 （ inverse electron demand hetero Di els- Alder (HDA)

reaction 、 还可以 ilUi Mkhael反.应， 复分.輕反 ,ί、 (metathesis reactions) 、 过 渡^:属 7：素 ΐ崔 'ί-匕的交―义 '偶. ft反 (transition metal catalyzed cross-couplings ) 、 说 明 书

目由 聚 '合反 '应 ( oxidative couplings ) 、 氧化禺联 ( oxidative couplings ) 、 、 、 ( acyl-transfer reactions )和光 反应 ( photo click reactions )

( Kim CH et al, Curr Opin Chem Biol. 2013 Jun; 17(3):412-9 ) 。

I型连接子的一类优选的 CCA1包含有一段肽序列，氨基酸残基数目 1一 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键， 其中至少含有一个赖氨酸）； 此肽段 氨基端氨基酸残基的 α位胺基与 LA (或直接与 PCA1 ) 形成酰胺键， 此肽段羧 基端以 -C00H或 -C0 H ₂ 结束。依据预期耦联数目的需要，一方面 赖氨酸的 ε位 胺基可直接通过与适当的双功能交联剂 （Heterobifunctional cross-linkers)耦联弓 | 入马来酰亚胺基、二硫代吡啶基、卤代垸基或 卤代乙酰基、异氰酸酯基等官能团。 可选的，所述进一步连接的赖氨酸的 α位及 ε位胺基还可再进一步连接更多的赖 氨酸， 这些再进一步连接的赖氨酸的 α位及 ε位胺基也可连接适当的耦联官能 团。 以此类推， 通过侧链赖氨酸的 α位和 /或 ε位胺基与下一个赖氨酸的 α位羧 基形成酰胺键的连接方式可以形成含有多个赖 氨酸以分支形式连接的侧链赖氨 酸的分支结构，通过增加主链寡聚赖氨酸数目 及拓展侧链赖氨酸的分支结构， 可 使此类 CCA分子中引入的官能团数目实现 1 -1000。 可选的， 在侧链赖氨酸的分 支结构中， 还可包括其他氨基酸， 例如， 一个侧链赖氨酸的 α位或 ε位胺基可以 与甘氨酸的 α位羧基形成酰胺键，然后所述甘氨酸的胺基� ��与下一个赖氨酸的 α 位羧基形成酰胺键。根据需要，在赖氨酸之间 引入的其他氨基酸的数目可以是一 个或多个，所引入的其他氨基酸也可以通过其 侧链与适当的耦联官能团连接， 从 而增加引入的官能团数目。例如， 引入的其他氨基酸可以是半胱氨酸， 所述半胱 氨酸可以通过其侧链巯基连接适当的耦联官能 团。可选的，在侧链赖氨酸的分支 结构中的任何两个氨基酸之间，还可包括其他 非氨基酸结构，例如烃基或环烃基， 这些非氨基酸结构的两端应带有可与氨基酸的 羧基或胺基共价连接的活性基团。 优选的， 在 CCA分子中可引入马来酰亚胺基、 二硫代吡啶基、 卤代垸基或卤代 乙酰基、异氰酸酯基等官能团的双功能交联试 剂包括但不限于，包含马来酰亚胺 基的交联试剂有 4-(Ν-马来酰亚胺基甲基） 环己垸 - 1 -羧酸琥珀酰亚胺酯 (N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane- 1 -carboxylate, SMCC) SMCC 的 "长链"类似物 Ν-( α -马来酰亚胺基乙酰氧基；) -琥珀酰亚胺酯 (N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester, AMAS)、 4-马来酰亚胺基丁酸 N- 说 明 书

琥珀酉先亚胺酉 (N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, GMBS)、 m-马来 酰亚胺苯 甲 酰基 -N-羟基琥珀酰亚胺酯（3-MaleiMidobenzoic acid N-hydroxysucciniMide ester,MBS)、 ε -马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯 (6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS) 4-(4-马来酉先亚胺基 苯基)丁酸琥珀酰亚胺酉^ N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB) 琥珀酰亚胺基 -6-( β - 马来酰亚胺基丙酰氨基） 己酸酯（Succinimidyl 6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoate, SMPH]、 琥珀酰亚胺基 -[4-(N-马来酰 亚 胺 甲 基 ）] - 环 己 垸 -1- 甲 酸 -(6- 氨 基 己 酸 酯 ） （Succinimidyl

4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate),L C-SMCC)、 11- 马 来 酰 亚 胺 基 —— 酸 N- 琥 珀 酰 亚 胺 基 酯 （N-Succinimidyl 11 -(maleimido)undecanoate, KMUS) 、 包含 N-羟基琥珀酰亚胺- (聚乙二醇） n - 马来酰亚胺的双功能交联剂 （SM (PEG) n)， 此处 n代表 2， 4， 6， 8， 12或 24 个聚乙二醇 （PEG) 单位； 包含卤代乙酰基为基础的部分的交联试剂有 N-琥珀 酰亚胺基 (4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酉^ Succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, SIAB)、 碘乙酸 N-琥珀酰亚胺基酉^ Succinimidyl iodoacetate, SIA)、 溴乙酸 N-琥 珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl bromoacetate, SBA)禾 P 3- (溴乙酰氨基)丙酸 N-琥珀 酰亚胺酯 (N-Succinimidyl 3-(Bromoacetamido)propionate,SBAP) _; 包含二硫代吡啶 基的交联试剂有 3-(2-吡啶基二硫基)丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 (N-SucciniMidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionate, SPDP),磺基琥珀酰亚胺基 -6-(α-甲基 -α-[2-二硫基吡 啶基] -苯甲酸酰胺基）己酸酯 （ sulfosuccinimidyl-6-[(-methyl-(-(2-pyridyldithio) toluamido]hexanoate, S-LC-SMPT), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(3'-[2-二硫基吡啶基] -丙 酸酉先胺基)己酸酉 ^ ( sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexano ate.

5- LC-SPDP)。 满足以上要求的连接子， 优选的分子通式示例如图 1-12所示， 但 不限于此。

I型连接子中另一类优选的 CC A1含有一段肽序列， 氨基酸残基数目 1一 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键，其中至� ��含有一个半胱氨酸，此肽段 氨基端氨基酸残基的 α位胺基与 LA (或直接与 PCA1 ) 形成酰胺键， 此肽段羧基 端以 -COOH或 -CO H ₂ 结束。 半胱氨酸侧链巯基则与包含马来酰亚胺基或二 硫代 吡啶基或卤代乙酰基或卤代垸基的双功能交联 试剂耦联。此类优选交联剂可分为 说 明 书

2组。第 1组应用在与含有伯胺的小分子化合物、核酸� �子、示踪分子等共价耦联， 与半胱氨酸侧链巯基相连的双功能交联剂包括 但不限于：包含马来酰亚胺基的交 联试剂有 4-(N-马来酰亚胺基甲基） 环己垸 -1-羧酸琥珀酰亚胺酯 (N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate,SMCC) SMCC 的"长链"类似物 _Ν -( α -马来酰亚胺基乙酰氧基) -琥珀酰亚胺酯

(N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester, AMAS)、4-马来酰亚胺基丁酸 N-琥 珀酉先亚胺酉 (N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, GMBS)、 m-马来酉先 亚胺苯甲酰基 -N-羟基琥珀酰亚胺酯 (3-MaleiMidobenzoic acid

N-hydroxysucciniMide ester,MBS) ε -马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯

(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS) 4-(4-马来酉先亚胺基 苯基)丁酸琥珀酰亚胺酉^ N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB) 琥珀酰亚胺基 -6-( β - 马来酰亚胺基丙酰氨基） 己酸酯 (Succinimidyl

6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoate, SMPH]、 琥珀酰亚胺基 -[4-(N-马来酰 亚胺甲基)] -环己垸 -1-甲酸 -(6-氨基己酸酯）（Succinimidyl

4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate),L C-SMCC) 11- 马来酰亚胺基 ^一酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl

ll-(maleimido)undecanoate, KMUS) 、 包含 N-羟基琥珀酰亚胺- (聚乙二醇） n - 马来酰亚胺的双功能交联剂 （SM (PEG) n)， 此处 n代表 2， 4， 6， 8， 12或 24个 聚乙二醇 （PEG) 单位 ； 包含二硫代吡啶基的交联试剂有 3-(2-吡啶基二硫基；） 丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （N-SucciniMidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionate, SPDP), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(α-甲基 -α-[2-二硫基吡啶基] -苯甲酸酰胺基;)己酸酯 ( sulfosuccinimidyl-6-[(-methyl-(-(2-pyridyldithio)toluamido]h exanoate,

5- LC-SMPT), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(3'-[2-二硫基吡啶基] -丙酸酰胺基)己酸酯 ( sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexano ate, S-LC-SPDP); 包含卤代乙酰基的交联试剂有 N-琥珀酰亚胺基 (4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯 (Succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, SIAB)、 碘乙酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (Succinimidyl iodoacetate, SIA)、 溴乙酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl bromoacetate, SB A) 禾口 3- (溴乙酰氨基)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯 (N-Succinimidyl 3-(Bromoacetamido)propionate,SBAP 第 2组应用在与含有羟基官能团的小分子 说 明 书

化合物、核酸分子、 示踪分子等共价耦联， 与半胱氨酸侧链巯基相连的双功能交 联剂包括但不限于： N-(对- 马来酰亚氨基苯基) - 异氰酸酯

(N-(p-Maleimidophenyl isocyanate) , ΡΜΡΙ)。 满足以上要求的连接子， 优选的分 子通式示例如图 13-18所示， 但不限于此。

I型连接子的另一类优选的 CCA1包含有一段肽序列， 氨基酸残基数目 1一 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键， 其中至少含有一个化学活跃的 非天然氨基酸残基，化学活跃的非天然氨基酸 残基也可在氨基酸侧链基团上（如 胺基、 羧基、 巯基、 羟基等） 引入， 可选择通过肟键 （oxime) 形成、 Cu (I)催 化以及的 strain促进的胡伊斯根 1,3 - 偶极环加成 （'Click' 反应 ）、 反电子要求 的 HAD反应 ( inverse electron demand hetero Diels-Alder (HDA) reaction )、 Michael反应、复分解反应（metathesis reactions ) 过渡金属元素催化的交叉偶联 反应 (transition metal catalyzed cross-couplings ) 自由基聚合反应

( oxidative couplings ) 氧化親联反应 ( oxidative couplings ) 乙酉先基转移反应 (acyl-transfer reactions )和光链接反应 (photo click reactions)等实现与含有 合适官能团的小分子化合物、核酸分子、 示踪分子等共价耦联； 此肽段氨基端氨 基酸残基的 α位胺基与 LA (或直接与 PCA1 )形成酰胺键，此肽段羧基端以 -COOH 或 -CO H ₂ 结束。 依据预期耦联数目的需要， 可引入合适数目的非天然氨基酸残 基。 满足以上要求的连接子， 优选的分子通式示例如图 19-25所示， 但不限于此。 以上几类优选的 CCA1设计特征可组合到一起使用， 即在一个 CCA1分子中 同时包含多个不同特征的官能团， 实现多个不同小分子化合物、核酸分子、 示踪 分子等的共价耦联。

II型连接子中的一类优选的 CCA2包含有一段肽序列， 氨基酸残基数目 1 - 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键， 其中至少含有一个赖氨酸， 此 肽段羧基端的 α位羧基与 LA (或直接与 PCA2) 形成酰胺键。 依据预期耦联数目 的需要， 一方面赖氨酸的 ε位胺基可直接通过与适当的双功能交联剂

(Heterobifunctional cross-linkers)耦联引入马来酰亚胺基、 二硫代吡啶基、 卤代 垸基或卤代乙酰基、 异氰酸酯基等官能团；另一方面 ε位胺基可用于与另外的赖 氨酸的 α位羧基形成酰胺键， 形成支链，进而支链的赖氨酸的 α位及 ε位胺基可 说 明 书 直接通过适当的双功能交联剂引入马来酰亚胺 基、二硫代吡啶基、 卤代垸基或卤 代乙酰基、 异氰酸酯基等官能团， 此种方法引入的官能团数目为寡聚赖氨酸数 目的 2倍。 可选的， 所述进一步连接的赖氨酸的 α位及 ε位胺基还可再进一步连 接更多的赖氨酸，这些再进一步连接的赖氨酸 的 α位及 ε位胺基也可连接适当的 偶联官能团。 以此类推，通过增加主链寡聚赖氨酸数目及拓 展侧链赖氨酸的分支 结构， 可使此类 CCA分子中引入的官能团数目实现 1-1000。 如前所述， 侧链赖氨 酸的分支结构中还可包含一个或多个其他氨基 酸或者一个或多个其他非氨基酸 结构。 优选的， CCA2中可引入马来酰亚胺基、 二硫代吡啶基、 卤代垸基或卤代 乙酰基、异氰酸酯基等官能团的双功能交联试 剂包括但不限于，包含马来酰亚胺 基的交联试剂有 4-(Ν-马来酰亚胺基甲基）环己垸 -1-羧酸琥珀酰亚胺酯

(N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane- 1 -carboxylate, SMCC) SMCC 的"长链"类似物 N-( α -马来酰亚胺基乙酰氧基) -琥珀酰亚胺酯

(N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester, AMAS)、4-马来酰亚胺基丁酸 N-琥 珀酉先亚胺酉 (N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, GMBS)、 m-马来酉先 亚胺苯甲酰基 -N-羟基琥珀酰亚胺酯 (3-MaleiMidobenzoic acid

N-hydroxysucciniMide ester,MBS) ε -马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯

(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS) 4-(4-马来酉先亚胺基 苯基)丁酸琥珀酰亚胺酉^ N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB) 琥珀酰亚胺基 -6-( β - 马来酰亚胺基丙酰氨基） 己酸酯 (Succinimidyl

6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoate, SMPH]、 琥珀酰亚胺基 -[4-(N-马来酰 亚胺甲基)] -环己垸 -1-甲酸 -(6-氨基己酸酯）（Succinimidyl

4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate) ,LC-SMCC) 11- 马来酰亚胺基 ^一酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl

ll-(maleimido)undecanoate, KMUS) 、 包含 N-羟基琥珀酰亚胺- (聚乙二醇） n - 马来酰亚胺的双功能交联剂 （SM (PEG) n)， 此处 n代表 2， 4， 6， 8， 12或 24个 聚乙二醇（PEG)单位 ； 包含卤代乙酰基为基础的部分的交联试剂有 N-琥珀酰 亚胺基 (4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯 (Succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, SIAB)、 碘乙酸 N-琥珀酰亚胺基酉^ Succinimidyl iodoacetate, SIA)、 溴乙酸 N-琥珀 酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl bromoacetate, SBA)禾 P3- (溴乙酰氨基)丙酸 N-琥珀酰 说 明 书 亚胺酯 (N-Succinimidyl 3 -(Bromoacetamido)propionate, SB AP)； 包含二硫代吡啶基 的交联试剂有 3-(2-吡啶基二硫基)丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 (N-SucciniMidyl

3- (2-Pyridyldithio)propionate, SPDP),磺基琥珀酰亚胺基 -6-(α-甲基 -α-[2-二硫基吡 啶基] -苯甲酸酰胺基)己酸酯

( sulfosuccinimidyl-6-[(-methyl-(-(2-pyridyldithio)toluamido]h exanoate,

5- LC-SMPT), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(3'-[2-二硫基吡啶基] -丙酸酰胺基)己酸酯

( sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexano ate, S-LC-SPDP)。 满足以上要求的连接子， 优选的分子通式示例如图 26-31， 但不限于此。

II型连接子中另一类优选的 CC A2含有一段肽序列， 氨基酸残基数目 1一 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键，其中至� ��含有一个半胱氨酸，此肽段 羧基端的 α位羧基与 LA (或直接与 PCA2) 形成酰胺键。 半胱氨酸侧链巯基则与 包含马来酰亚胺基或二硫代吡啶基或卤代乙酰 基或卤代垸基的双功能交联试剂 耦联。此类优选交联剂可分为 2组。第 1组应用在与含有伯胺的小分子化合物、 核 酸分子、示踪分子等共价耦联， 与半胱氨酸侧链巯基相连的双功能交联剂包括 但 不限于： 包含马来酰亚胺基的交联试剂有 4-(Ν-马来酰亚胺基甲基）环己垸 -1-羧 酸琥珀酰亚胺酯 (N-Succinimidyl

4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate,SMCC) SMCC 的"长链"类似物 _Ν -( α -马来酰亚胺基乙酰氧基) -琥珀酰亚胺酯

(N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester, AMAS)、4-马来酰亚胺基丁酸 N-琥 珀酉先亚胺酉 (N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, GMBS)、 m-马来酉先 亚胺苯甲酰基 -N-羟基琥珀酰亚胺酯 (3-MaleiMidobenzoic acid

N-hydroxysucciniMide ester,MBS) ε -马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯

(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS) 4-(4-马来酉先亚胺基 苯基)丁酸琥珀酰亚胺酉^ N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB) 琥珀酰亚胺基 -6-( β - 马来酰亚胺基丙酰氨基） 己酸酯 (Succinimidyl

6- [(beta-maleimidopropionamido)hexanoate, SMPH]、 琥珀酰亚胺基 -[4-(N-马来酰 亚胺甲基)] -环己垸 -1-甲酸 -(6-氨基己酸酯）（Succinimidyl

4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxy-(6-amidocaproate) ,LC-SMCC) 11- 马来酰亚胺基 ^一酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl 说 明 书

l l-(maleimido)undecanoate, KMUS) 、 包含 N-羟基琥珀酰亚胺- (聚乙二醇） n - 马来酰亚胺的双功能交联剂 （SM (PEG) n)， 此处 n代表 2， 4， 6， 8， 12或 24个 聚乙二醇 （PEG) 单位 ； 包含二硫代吡啶基的交联试剂有 3-(2-吡啶基二硫基；） 丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （N-SucciniMidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionate, SPDP), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(α-甲基 -α-[2-二硫基吡啶基] -苯甲酸酰胺基;)己酸酯

( sulfosuccinimidyl-6-[(-methyl-(-(2-pyridyldithio)toluamido]h exanoate,

S-LC-SMPT), 磺基琥珀酰亚胺基 -6-(3'-[2-二硫基吡啶基] -丙酸酰胺基)己酸酯

( sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexano ate, S-LC-SPDP); 包含卤代乙酰基的交联试剂有 N-琥珀酰亚胺基 (4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯 (Succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, SIAB)、 碘乙酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (Succinimidyl iodoacetate, SIA)、 溴乙酸 N-琥珀酰亚胺基酯 (N-Succinimidyl bromoacetate, SB A) 禾口 3- (溴乙酰氨基)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯 (N-Succinimidyl 3-(Bromoacetamido)propionate,SBAP 第 2组应用在与含有羟基官能团的小分子 化合物、核酸分子、 示踪分子等共价耦联， 与半胱氨酸侧链巯基相连的双功能交 联剂包括但不限于： N-(对- 马来酰亚氨基苯基) - 异氰酸酯

(N-(p-Maleimidophenyl isocyanate), PMPI)。

II型连接子的另一类优选的 CC A2包含有一段肽序列， 氨基酸残基数目 1一 200， 通过 α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键， 其中至少含有一个化学活跃的 非天然氨基酸残基，化学活跃的非天然氨基酸 残基也可在氨基酸侧链基团上（如 胺基、 羧基、 巯基、 羟基等） 引入， 可选择通过肟键 （oxime) 形成、 Cu (I)催 化以及的 strain促进的胡伊斯根 1,3 - 偶极环加成 （'Click' 反应 ； 、 反电子要求 的 HAD反应 ( inverse electron demand hetero Diels-Alder (HDA) reaction) 、 Michae反应、 复分解反应 ( metathesis reactions) , 过渡金属元素催化的交叉偶 联反应 (transition metal catalyzed cross-couplings) 、 自由基聚合反应

(oxidative couplings ) 、 氧化耦联.反应 (oxidative couplings) 、 乙魏基转移反 应 ( acyl-transfer reactions )和光链接反应 ( photo click reactions)等实现与含 有合适官能团的小分子化合物、核酸分子、示 踪分子等共价耦联； 此肽段羧基端 的 α位羧基与 LA (或直接与 PCA2) 形成酰胺键。 依据预期耦联数目的需要， 可 引入合适数目的化学活跃的非天然氨基酸残基 。满足以上要求的连接子，优选的 说 明 书

分子通式示例如图 32-35所示， 但不限于此。 以上几类优选的 CCA2设计特征可组合到一起使用， 即在一个 CCA2分子中 同时包含多个不同特征的官能团， 实现多个不同小分子化合物、核酸分子、 示踪 分子等的共价耦联。 需特别指出， 图 1-35所示连接子分子中的 PCA1及 PCA2依据来源于

Staphylococcus aureus的 Sortase A酶的最佳识别序列设计，本发明所述的连接� �中 的 PCA1及 PCA2可以是任意适当的 Sortase酶或 Sortase改造酶或经筛选后的优选 酶的识别序列， 也可以是任意具靶向特征的天然或修饰肽序列 。

本发明中连接子的合成采用标准的固相肽合成 流程， 基于 Fmoc保护策略。 基本方法如下：

(1) 树脂的选择：使用预载有连接子的 C末端氨基酸残基的王树脂 (Wang resin) 或 Rink amide resin进行固相合成， 根据树脂不同， 合成的连接子的 C末端分别是 羧基或酰胺基。

(2) 树脂的溶胀： 根据合成的目标摩尔数计算用于反应的树脂， 估计反应 的难易度以及纯化的损失情况酌情过量称取树 脂。树脂加入 DCM(Di _C lor ₀ methan _e ) 浸泡过的反应柱中， DCM洗涤 2次后， 加入 DMF(N,N,-Dimethylformamide)浸泡 30min,以活化树脂。

(3 ) Fmoc的脱除： 将浸泡树脂的 DMF压滤除去， 加入 20%哌啶 (Piperridine;) 的 DMF溶液， 氮气搅拌下反应 lOmin,抽滤除去， 再加入上述溶液反应 15min， 彻 底脱除保护 a-氨基的 FMOC基团， 露出活性位点以便连接下一个氨基酸的羧基。 抽滤， DCM洗涤两次， DMF洗涤三次， 而后用茚三酮法检测树脂应成深蓝色。

(4) 氨基酸的连接： 按照目标摩尔数 2-5倍量称取需要缩合的下一个氨基 酸， 加入 DMF使其刚好溶解。 在此溶液中加入合适当量的缩合剂 DIC(Diisopropylcarbodiimide)/

HB TU(2-( 1 H-B enzotri azol e- 1 -yl)- 1 , 1 ,3 ,3 -tetramethylaminium hexafluorophosphate)， 加入反应柱中室温下氮气搅拌反应 2h。反应完毕后用茚三酮法检测树脂应成接近 说 明 书

无色。 反应完全后以 DCM洗涤两次， 然后用 DMF洗涤三次。

( 5 ) 树脂上的活性位点的封闭 为保证最终产物纯度， 需要对未完全反应 的少量活性氨基进行封端。将 20%的醋酸酐加入树脂复合物中， 氮气搅拌充分反 应 10-30min。 反应完全后以 DCM洗涤两次， 然后用 DMF洗涤三次。

(6) 反应进程中的检测： 每次酰胺键合反应后， 取少量树脂加入茚三酮溶 液中， 检测自由氨基。 若树脂无色， 说明一级胺反应己基本完全。 若树脂呈紫色 或黑色的阳性反应，说明仍有氨基未反应完全 ，需要加入羧基组分重复缩合反应。

(7) 连接其余氨基酸： 重复步骤 3-6， 直到序列连接完成。 合成过程中也 可使用适宜的连接方法引入其他中间体 （如， 聚乙二醇）。

(8)官能团的柱上耦联反应： 将相应氨基酸侧链的保护基团（如， 赖氨酸的 ε 位胺基） 脱保护， 并与适量的双功能耦联试剂反应。 （此步为可选项， 也可根据 需要将此耦联步骤放在第 9步 "切割"完成后再进行）

(9)切割： 当最后一个氨基酸被接上且去除了其 Fmoc保护基后， 用氮气将树 脂复合物吹干， 加入 50ml小烧瓶中。 按 TFA/phenol/H20/EDT/TIS (85/5/5/3/2)的 比例配成混和切割试剂。 0-5 °C下密闭磁力搅拌反应 2h后， 过滤。 滤液加入 30倍 体积的冰乙醚中， 放置冰箱 2h。 离心收集沉淀， 用超纯水溶解后真空冷冻干燥即 得粗肽。

( 10) 纯化及质谱鉴定 粗肽溶解于适当比例的乙腈水溶液， 经反相分析色 谱分析其纯度， 根据出峰时间及粗产物纯度， 确定制备色谱的流动相梯度。 纯化 后的小肽再次经高压液相色谱分析， 收集纯度超过 95%的组分， ES-MS鉴定其分 子量是否与理论值一致。 必要时进一步进行熔点、 NMR检测。

2.小分子化合物、 核酸分子或示踪分子

本发明中小分子化合物主要是指细胞毒药物， 包括可致细胞死亡、引诱细胞 凋亡或抑制细胞活力的任何化合物。其中所述 细胞毒药物包括但不限于： 微管抑 制剂如紫杉醇（Paclitaxel)及其衍生物，奥利斯� ��汀（Auristatins)衍生物如 MMAE、 MMAF等， 美登木素（Maytaine)及其衍生物，埃博霉素 (Epothilone)及其类似物， 长春碱类化合物如长春碱 （Vinblastine^ 长春新碱 （Vincristine)、 长春地辛 说 明 书

(Vindesine) 、 长春瑞滨 CVinorelbine；)、 长春氟宁 （Vinflunine；)、 长春甘酯

(Vinglycinate)脱水长春碱 (anhy-drovinblastine), 海兔毒素 （Dolastatins) 及其类 似物， 软海绵素 B (Halichondrin), 美妥替哌 (Meturedopa)和乌瑞替哌 (Uredopa), 喜树碱 （Camptothecine) 及其衍生物， 苔藓抑素 （Bryostatin), 海绵多聚乙酰

(Callystatin), 美法仑 (Melphalan), 亚硝基脲类如卡莫司汀 (Carmustine)、 福 莫司汀 （Fotemustine)、 洛莫司汀 （Lomustine)、 尼莫司汀 （ Nimustine )、 乌拉莫 司汀 (Uramustine)、 雷莫司汀 (Ranimustine), 新制癌菌素 ( Neocarzinostatin ) 方文线菌素 (Dactinomycin)、泊非霉素 (Porfiromycin) 安曲霉素 ( Anthramycin) 偶氮丝氨酸 （Azaserine)、 依索比星 (Esorubicin)、 博来霉素 （Bleomycin)、 卡拉 比星 (Carabicin)、 依达比星 （Idarubicin)、 诺拉霉素 （Nogalamycin)、 嗜癌霉素 (Carzinophilin) 洋红霉素 （Carminomycin)、 达内霉素 (Dynemicin)、 埃斯培拉霉 素 (Esperamicin)、 表柔比星 (Epirubicin) 丝裂霉素 （Mitomycin)、 橄榄霉素 (Olivomycin) 培洛霉素 （Peplomycin)、 嘌罗霉素 (Puromycin)、 麻西罗霉素

(Marcellomycin) 罗多比星 （Rodorubicin)、 链黑霉素 （ Streptonigrin)、 乌苯美 司（Ubenimex)、佐柔比星（Zorubicin), 叶酸类似物如甲氨蝶吟（ Methotrexate )、 二甲叶酸 (Denopterin；)、 蝶罗吟 （Pteropterin)、 三甲曲沙 （Trimetrexate); 硫咪嘌 吟 （Thiamiprine)、 氟达拉滨 （Fludarabine)、 硫鸟嘌吟 （Thioguanine) 等嘌吟类 似物， 嘧啶类似物如安西他滨（Ancitabine)、 阿扎胞苷（ Azacitidine)、 阿糖胞苷

(Cytarabine)、 二脱氧尿苷 （Dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷

( 5'-Deoxy-5-fluorouridine) 依诺他滨 (Enocitabine)、 氟尿苷 (Floxuridin), 雄激 素类如卡普睾酮（ Calusterone )、屈他垸酮（ Drostanolone )、环硫雄醇（ Epitiostanol )、 美雄垸 (Mepitiostane) 睾内酉 (Testolactone), 醋葡醛内酯 ( Aceglatone), 醛 磷酰胺糖苷 (Aldophosphamide Glycoside), 氨基乙酰丙酸（Aminolevulinic Acid), 比生群 (Bisantrene), 依达曲沙 (Edatrexate), 秋水酰胺 (Colchicinamide), 地 吖酉昆（Diaziquone), 依氟鸟氨酸 (Efl ornithine), 依利醋铵 (Elliptinium Acetate), 氯尼达明 （Lonidamine), 米托胍腙 （Mitoguazone)、 米托蒽醌 (Mitoxantrone), 喷司他丁（Pentostatin), 倍他西佐喃（Betasizofiran),锗螺胺（Spirogermanium) , 细格孢氮杂酸 (Tenuazonic acid),三亚胺醌（Triaziquone), 粘液霉素 A (Verracurin A)、 杆孢菌素 A(Roridin)A和安归啶 (Anguidine), 达卡巴嗪 （Dacarbazine), 甘 说 明 书

露莫司汀 （Mannomustine), 二溴卫矛醇 (Mitolactol), 哌泊溴垸 (Pipobroman), DNA拓扑异构酶抑制剂， 氟他胺 （Flutamide)、 尼鲁米特 （Nilutamide)、 比卡鲁 胺（Bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林（Leuprorelin Acetate)和戈舍瑞林（Goserelin), 蛋白激酶及蛋白酶体抑制剂等。

本发明中小分子化合物也可以是示踪分子， 包括但不限于荧光分子 （如 TMR, Cy3,FITC,Fluorescein等） 或放射性核素等。

本发明中的核酸分子包括但不限于单链和 /或双链 DNA， RNA,核酸类似物等。 优选的核酸分子是 siRNA分子。

3.耦联中间物

本发明中小分子化合物、核酸分子或示踪分子 在制备过程中需在优选的位置 引入巯基、 羟基、 羧基、 胺基、 垸氧基胺基 （alkoxy-amine)、 炔烃基 （alkyne)、 叠氮 （azide)基、 四嗪 （Tetrazine ) 等修饰， 然后分别与连接子 I或 II的相应官能 团共价连接。 耦联后的中间物如下式所示：

PCA1— (LA) _a — CCA1— Payload _h (III)

或

Payload _h - CCA2- (LA) _a — PCA2 (IV)

其中，

Payload专指小分子化合物、 核酸分子或示踪分子

a为 0或 1

h为每个连接子分子耦联的小分子化合物、 核酸分子或示踪分子的数目， 可为 1 至 1000的整数， 对于 h>l的情形， payload可以为相同的分子， 也可为不同的分 子。 耦联中间物的制备，通常是先完成连接子的固 相合成与结构表征确认， 然后 与待耦联的小分子化合物、核酸分子或示踪分 子在适宜的液相反应条件中完成耦 联。根据选用的耦联官能团特征， 可选择适宜的酸碱度的水相或有机相溶液。制 备的耦联中间物经反相分析色谱分析其纯度， 根据出峰时间及粗产物纯度， 确定 制备色谱的流动相梯度。 制备色谱纯化后的耦联中间物进行 UPLC-MS分析， 必 要时进一步进行熔点、 MR检测。 说 明 书

对部分耦联中间物的制备， 也可根据需要使用一步法进行， 即， 连接子在固 相合成完成后不进行切割，在柱上直接完成与 待耦联的小分子化合物、核酸分子 或示踪分子的耦联， 随后再进行全部脱保护及切割。制备的耦联中 间物经反相分 析色谱分析其纯度， 根据出峰时间及粗产物纯度， 确定制备色谱的流动相梯度。 制备色谱纯化后的耦联中间物进行 UPLC-MS分析， 必要时进一步进行熔点、 MR检测。

4.靶向性物质

本发明中涉及的靶向性质的物质优选为重组制 备的抗体及抗体类似物 （如 Fab , ScFv, minibody, diabody, nanobody等）， 但也包括非抗体类蛋白质， 包 括但不限于， 干扰素、 淋巴因子 (例如， 白细胞介素)、 激素 (例如胰岛素)、 生长 因子 (；例如, EGF、 TGF-o FGF和 VEGF)， 也包括靶向性的肽 （天然肽， 如 GPCR 配体肽， 及非天然氨基酸修饰肽） 。

依据蛋白质的结构信息， 确定在蛋白质、肽的 N或 C端进行位点特异耦联， 确 保蛋白质功能不受耦联影响：

蛋白质 N端耦联时使用式 （III) 所示的耦联中间物。 为了保证 sortase酶催 化连接反应的位点特异性， 需要在蛋白质 N端引入适宜的 Sortase酶或其他经筛 选后的优选酶的底物识别序列， 如， 寡聚甘氨酸。 为达到此目的， 一方面可以在 蛋白质的 N端起始甲硫氨酸后引入合适的蛋白酶识别序� � （如， TEV酶， 凝血 酶等） 串联适宜的 Sortase酶底物识别序列， 使蛋白质经蛋白酶处理后暴露出适 宜的 Sortase酶底物识别序列如， 寡聚甘氨酸； 另一方面， 也可以在蛋白质 N末 端起始甲硫氨酸后引入适宜的 Sortase酶底物识别序列如寡聚甘氨酸序列， 然后 利用表达宿主细胞内内源性的或经改造的甲硫 氨酰氨基肽酶 （methionyl aminopeptidase) 活性切掉 N末端的甲硫氨酸。

对于肽的 N端耦联的情形， 可以在肽合成过程中直接于 N端合成寡聚甘氨 酸。

蛋白质 C端耦联时使用式 （IV) 所示的耦联中间物。 为了保证 sortase酶催 化连接反应的位点特异性， 需要在蛋白质的 C端引入适宜的 Sortase酶或其他经 筛选后的优选酶的底物识别序列如， Sortase A酶的底物识别序列 LPXTGG, X 为任何天然氨基酸。 说 明 书 对于肽的 C 端耦联的情形， 可以在肽合成过程中直接于 C 端引入适宜的 Sortase酶或其他经筛选后的优选酶的底物识别� �列。

5. 靶向性物质与耦联中间物定向连接形成耦联终 产物

按照 4所述条件制备的靶向抗体、 蛋白质、 肽等靶向性物质与 3所述的耦联中 间物混合，加入适当的任何来源的 Sortase酶或其他经筛选后的优选酶进行定向连 接反应。 优选的缓冲体系为 PH5-10之间， Nacl浓度在 Ο-lOOOmM之间， Ca浓度在 0-50mM之间。 优选的反应温度在 4-45摄氏度之间， 优选的反应时间在 10分钟 -20 小时之间。 连接反应完成后， 连接产物可通过 SDS-PAGE、 HPLC、 ESI-MS等手 段分析连接效率， 预期连接产物可通过凝胶阻滞 FPLC、制备型 HPLC等手段分离 纯化。

连接反应示意图如图 36所示， 连接反应可以得到如式（V)或（VI)所示的 细胞结合剂和被靶向输送的试剂的耦联物：

T-PC A 1 -(LA)a-CC Al -payload _h (V)

Payload _h -CCA2-(LA)a-PCA2-T (VI)

其中：

T指具有靶向性的物质

Payload专指小分子化合物、 核酸分子或示踪分子

a为 0或 1

h为为每个连接子分子耦联的小分子化合物、 核酸分子或示踪分

子的数目， 为 1-1000的整数， 对于 h>l 的情形， payload可以为相同的分 子， 也可为不同的分子。 附图说明

图 1 : 连接子通式 1化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 2: 连接子通式 2化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 3 : 连接子通式 3化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 4: 连接子通式 4化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 说 明 书

图 5: 连接子通式 5化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 6: 连接子通式 6化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 7: 连接子通式 7化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 8: 连接子通式 8化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 9: 连接子通式 9化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任意 整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 10: 连接子通式 10化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 11 : 连接子通式 11化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 12: 连接子通式 12化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 13 : 连接子通式 13化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 14: 连接子通式 14化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 15: 连接子通式 15化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 16: 连接子通式 16化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 17: 连接子通式 17化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 18: 连接子通式 18化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 19: 连接子通式 19化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 20: 连接子通式 20化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 21 : 连接子通式 21化学结构图 （n为 1-100之间的整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 图 22: 连接子通式 22化学结构图 （n为 1-100之间的整数：，， X为 -OH或 -NH ₂ 基团） 说 明 书

图 23 : 连接子通式 23化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 24: 连接子通式 24化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 25: 连接子通式 25化学结构图 （n为 1-100之间的整数， m为 0或 1-1000之间的任 意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 26: 连接子通式 26化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 27:连接子通式 27化学结构图（m为 0或 1-1000之间的任意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 28: 连接子通式 28化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 29: 连接子通式 29化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 30: 连接子通式 30化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 31 : 连接子通式 31化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 32: 连接子通式 32化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 33 :连接子通式 33化学结构图（m为 0或 1-1000之间的任意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 34: 连接子通式 34化学结构图 （X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 35:连接子通式 35化学结构图（m为 0或 1-1000之间的任意整数， X为 -OH或 -NH ₂ 基团）

图 36: 抗体 -药物耦联物及抗体 -siRNA耦联物制备示意图

图 37: 连接子 1化学结构图

图 38: 连接子 1的 UPLC分析

图 39: 连接子 1的 ESI-MS分析

图 40: 美登木素衍生物 DM1分子的 UPLC分析

图 41 _: 美登木素衍生物 DM1分子的 ESI-MS分析

图 42: 连接子 1-美登木素衍生物 DM1耦联中间物化学结构图

图 43 : 连接子 1-美登木素衍生物 DM1耦联中间物制备的 UPLC-MS分析 图 44: 连接子 26化学结构图

图 45： 连接子 26的 HPLC分析 说 明 书

图 46: 连接子 26的 ESI-MS分析

图 47: GAPDH siRNA-连接子 26耦联中间物结构示意图

图 48 : GAPDH siRNA与连接子 26耦联效率的 PAGE检测 其中 M: DNA marker, 1： GAPDH siRNA, 2： 耦联中间物 GAPDH siRNA-连接子 26 图 49: GAPDH siRNA-连接子 26-GFP耦联物的结构示意图

图 50： GAPDH siRNA-连接子 26与 GGG-GFP耦联效率的 native-PAGE检测 其 中， 1 : GAPDH siRNA-连接子 26， 2： 耦联反应 0分钟， 3 : 耦联反应 60分钟，

4：耦联反应 120分钟； *:耦联终产物 siRNA-GFP, **:耦联中间物 GAPDH siRNA- 连接子 26

图 51 : 连接子 2化学结构图

图 52: 连接子 2的 HPLC分析

图 53 : 连接子 2的 ESI-MS分析

图 54: 连接子 3化学结构图

图 55 : 连接子 3的 HPLC分析

图 56: 连接子 3的 ESI-MS分析

图 57: 连接子 9化学结构图

图 58 _: 连接子 9的 HPLC分析

图 59: 连接子 9的 ESI-MS分析 具体实施例

1.连接子 1的制备方法

在连接子通式 1中， 当 n=5， X为 -OH时， 连接子 1的化学结构图如图 37 所示。 通过标准的 Fmoc固相肽合成方法在王树脂 （Wang Resin) 上进行连接子 1的合成， 先将赖氨酸侧链的 ε位氨基脱保护， 与 4- (马来酰亚胺基甲基） 环己垸 羧酸 Ν- 琥珀酰亚氨基酯 (SMCC)进行化学耦联， 耦联完成后进行全部脱保护 ( golobal deprotection) ,以及从 resin上的切割。回收合成的连接子 1， 反相 HPLC 纯化， 并进行 ESI-MS分析。 如图 38所示， 所制备的连接子 1纯度达 95.49%。 连接子 1预期分子量为 707， ESI-MS实际检测分子量为 708.5 (M+1 ) 如图 39 所示。 所制备的连接子 1可用于与小分子化合物、 核酸分子或示踪分子的耦联。 说 明 书

2.连接子 1-美登木素衍生物 DM1耦联中间物的制备

美登木素衍生物 DM1分子购自江苏省江阴康诺太生物科技有限公 司。 如图 40所示， UPLC分析显示其纯度为 91.43%; 预期分子量为 738， ESI-MS实际检 测分子量为 738.5， 结果如图 41所示。

将合成的连接子 1与美登木素衍生物 DM1分子分别溶于适宜的溶剂中， 以 等摩尔比混合， 室温孵育。 连接子 1-美登木素衍生物 DM1耦联中间物化学结构 如图 42所示。 对此耦联中间物进行 UPLC-MS分析， 结果如图 43所示， 连接子 1与美登木素衍生物 DM1的耦联效率为 100%， 预期分子量为 1447， ESI-MS检 测结果为 1447。

制备的连接子 1-美登木素衍生物 DM1耦联中间物可与肿瘤靶向性的抗体或 抗体类似物进行定向耦联， 所获得的抗体药物耦联物 （ADC) 具有高度均质性， 即药物耦联位点与耦联数目高度均一，可应用 于多种肿瘤的靶向治疗，包括但不 限于乳腺癌、 胃癌、 肺癌、 卵巢癌、 白血病等。 对比目前已上市的 ADC类药物， 本方法制备的抗体药物耦联物在药效稳定性及 安全可控性上优势更为明显。

3.连接子 26的制备

在连接子通式 26中，当 X为 -OH时，连接子 26的化学结构图如图 44所示。 参照连接子 1制备的方法， 进行适当调整， 完成连接子 26的制备， 样品回 收后， 反相 HPLC纯化， 并进行 ESI-MS分析。 如图 45所示， 所制备的连接子 26纯度达 99%以上； 预期分子量为 765， ESI-MS实际检测分子量为 764 (M-1 ), 如图 46所示。

所制备的连接子 26可用于与小分子化合物、 核酸分子或示踪分子的耦联。

4. siRNA-连接子 26中间耦联物的制备

正义链 5'-末端巯基修饰的小鼠 GAPDH siRNA购自吉玛基因有限公司， 其 序列为：

5 ' -GUAUGAC AAC AGCCUC AAGdTdT-3 '

3 ' -dTdTCAUACUGUUGUCGGAGUUC-5 '

siRNA与过量的连接子 26在 1 XPBS缓冲液（pH7.4) 中室温反应 1小时至 过夜。 连接产物经超滤， 除去过量的连接子 26， 获得 siRNA-连接子 26耦联物。 GAPDH siRNA-连接子 26耦联中间物化学结构示意图如图 47所示。 PAGE电泳 说 明 书

检测结果表明， GAPDH siRNA与连接子 26的耦联效率达到 90%以上， 如图 48 所示。

5. 酶催化的 siRNA与 GFP定点连接

通过镍柱亲和纯化法制备重组 GFP蛋白， 使用 TEV酶进行酶切处理， 使 重组 GFP蛋白的 N端暴露出 Sortase A酶的识别位点寡聚甘氨酸序列，回收截短 后的目的蛋白 GGG-GFP。

将过量的 GAPDH siRNA-连接子 26耦联中间物与 GGG-GFP蛋白在 Sortase A改造酶的作用下， 在 I X缓冲液 （含有 Tris pH8.0， NaCL, CaCl ₂ ) 中 37°C耦 联 2小时， 不同反应时间取样用于分析。 耦联终产物 siRNA-GFP的结构示意图 如图 49所示。 15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示， 经过 2小时耦联反应， GAPDH siRNA-连接子 26与 GGG-GFP的耦联效率可达 80%以上，如图 50 所示。

本方法实现了 siRNA与蛋白质的高效定点耦联。 此方法的一个重要应用是 将肿瘤靶向性的抗体或抗体类似物与具有治疗 价值的 siRNA定点耦联， 从而实 现新一代靶向小干扰 RNA药物的制备。 此方法的另一个重要应用是将肿瘤靶向 性的抗体或抗体类似物与具有示踪功能的分子 定点耦联，从而实现新一代靶向肿 瘤示踪剂的制备。

6. 连接子 2、 3、 9的制备

在连接子通式 2中， 当 n=3， X为 -NH ₂ 时， 连接子 2的化学结构如图 51 所示。 参照连接子 1制备的方法， 进行适当调整， 完成连接子 2的制备， 样品回 收后， 反相 HPLC纯化， 并进行 ESI-MS分析。

如图 52所示，所制备的连接子 2纯度达 97.3492%。连接子 2预期分子量为 535， 实际检测分子量为 536 (M+1 ) 如图 53所示。

在连接子通式 3中， 当 n=5， m=4， X为 -OH时， 连接子 3的化学结构如图 54所示。 参照连接子 1制备的方法， 进行适当调整， 完成连接子 3的制备， 样 品回收后， 反相 HPLC纯化， 并进行 ESI-MS分析。 如图 55所示， 所制备的连 接子 3纯度达 99.3650%。 连接子 3预期分子量为 954， 实际检测分子量为 953 (M-1 ) , 如图 56所示。

在连接子通式 9中， 当 n=5， m=4， X为 -OH时， 连接子 9的化学结构如图 57所示。 参照连接子 1制备的方法， 进行适当调整， 完成连接子 9的制备， 样 说 明 书

品回收后， 反相 HPLC纯化， 并进行 ESI-MS分析。 如图 58所示， 所制备的连 接子 9纯度达 99.3650%。连接子 9预期分子量为 1249， 实际检测分子量为 1248 (M-1 ), 如图 59所示。

所制备的连接子 2、 3、 9可用于与小分子化合物、 核酸分子或示踪分子的 耦联， 其中连接子 9具有两个活性官能团， 可与两个小分子化合物、核酸分子或 示踪分子形成耦联中间物。