本発明は、リゾホスファチジン酸をアシ� ��化して、ホスファチジン酸を生成させるこ� ��を特徴とする、Mortierella属由来の新規なリ� �ホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子� �関する。

 本発明のリゾホスファチジン酸アシル基� ��移酵素(LPAAT)は、リゾホスファチジン酸をア シル化してホスファチジン酸を生成する反応 を触媒する酵素である。アシル基供与体は、 通常アシルCoAであるが、これに限定されない 。また、本発明に係るタンパク質が作用する アシル基転移反応のアシル基受容体はLPAに限 定されず、様々なリゾリン脂質がアシル基受 容体になり得る。

 本発明に関するLPA(1-アシル-sn-グリセロー ル-3-リン酸ともいう)はグリセロリン脂質の1� ��である。LPAは、グリセロール-3-リン酸(sn-グ リセロール-3-リン酸ともいう)の1位(α位)のヒ ドロキシル基のアシル化により生成する、脂 肪酸を1つしかもたないリゾリン脂質である� �LPAは、脂質生合成の中間体であるだけでな� �、細胞増殖、血小板凝集効果、平滑筋収縮� �果、がんの浸潤促進効果等非常に多岐にわ� �る生物学的、薬理的作用を有する脂質性の� �胞内及び細胞間メディエーターである。

  本発明のリゾホスファチジン酸ア シル基転移酵素をコードする核酸
本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移 酵素(LPAAT)には、LPAAT3及びLPAAT4が含まれる。LP AAT3及びLPAAT4をコードする核酸のcDNA、CDS、ORF� ��びアミノ酸配列の対応関係を以下の表1に整 理して記載した。

 つまり、本発明のLPAAT3に関連する配列とし� ��は、LPAAT3のアミノ酸配列である配列番号2、 LPAAT3のORFの領域を示す配列である配列番号36� ��そして、そのCDSの領域を示す配列である配� ��番号8、及びそのcDNAの塩基配列である配列� �号1があげられる。このうち、配列番号8は配 列番号1の第158~1147番目の塩基配列に相当し、 配列番号36は配列番号1の第158~1144番目の塩基� ��列、及び、配列番号8の第1~987番目の塩基配� ��に相当する。

 同様に、LPAAT4に関連する配列としては、L PAAT4のアミノ酸配列である配列番号4、LPAAT4の ORFの領域を示す配列である配列番号37、そし� ��、そのCDSの領域を示す配列である配列番号2 3、及びそのcDNAの塩基配列である配列番号3が あげられる。ここで、配列番号23は配列番号3 の第55~996番目の塩基配列に相当し、配列番号 37は、配列番号3の第55~993番目の塩基配列、及 び、配列番号23の第1~939番目の塩基配列に相� �する。

 本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のD NAのほか、そのRNA相補体も含み、天然由来の� ��のであっても、人工的に作製したものであ� ��てもよい。DNAには、例えば、ゲノムDNAや、� ��記ゲノムDNAに対応するcDNA、化学的に合成さ れたDNA、PCRにより増幅されたDNA、及びそれら の組み合わせや、DNAとRNAのハイブリッドがあ げられるがこれらに限定されない。

 本発明の核酸の好ましい態様としては、( a)配列番号36若しくは配列番号37で示される塩 基配列、(b)配列番号2若しくは4で示されるア� ��ノ酸配列からなるタンパク質をコードする� ��基配列、(c)配列番号1若しくは3で示される� �基配列等があげられる。

 配列番号36若しくは配列番号37で示される 塩基配列及び配列番号2若しくは4で示される� ��ミノ酸配列からなるタンパク質をコードす� ��塩基配列、及び、配列番号1若しくは3で示� �れる塩基配列は、表1に記載したとおりであ� ��。

 上記塩基配列を得るためには、LPAAT活性� �有する生物のESTやゲノムDNAの塩基配列デー� �から、既知のLPAAT活性を有するタンパク質と 同一性の高いタンパク質をコードする塩基配 列を探索することもできる。LPAAT活性を有す� ��生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂� ��生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、こ れに限定されない。

 EST解析を行う場合には、まず、cDNAライブラ リーを作製する。cDNAライブラリーの作製方� �については、『Molecular Cloning, A Laboratory Ma nual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参 照することができる。また、市販のcDNAライ� �ラリー作製キットを用いてもよい。本発明� �適するcDNAライブラリーの作製方法としては� ��例えば以下のような方法があげられる。す� ��わち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株 を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養す る。この前培養に適する培養条件としては、 例えば、培地組成としては、1.8%グルコース� �1%酵母エキス、pH6.0があげられ、培養期間は3 日間、培養温度は28℃である条件があげられ� ��。その後、前培養物を適当な条件にて本培� ��に供する。本培養に適する培地組成として� ��、例えば、1.8%グルコース、1%大豆粉、0.1%オ リーブ油、0.01%アデカノール、0.3%KH ₂ PO ₄ 、0.1% Na ₂ SO ₄ 、0.05% CaCl ₂ ・2H ₂ O、0.05% MgCl ₂ ・6H ₂ O、pH6.0があげられる。本培養に適する培養条 件としては、例えば、300rpm、1vvm、26℃で8日� �通気攪拌培養する条件があげられる。培養� �間中に適当量のグルコースを添加してもよ� �。本培養中に適時培養物を採取し、そこか� �菌体を回収して、全RNAを調製する。全RNAの� �製には、塩酸グアニジン/CsCl法等の公知の方 法を用いることができる。得られた全RNAから 市販のキットを用いてpoly(A) ⁺ RNAを精製することができる。さらに、市販の キットを用いてcDNAライブラリーを作製する� �とができる。その後、作製したcDNAライブラ� ��ーの任意のクローンの塩基配列を、ベクタ� ��上にインサート部分の塩基配列を決定でき� ��ように設計されたプライマーを用いて決定� ��、ESTを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA  GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)でcDNAライブ� ��リーを作製した場合は、ディレクショナル� ��ローニングを行うことができる。

 LPAAT3及びLPAAT4のORF間の塩基配列の同一性� ��66.6%である。一方、M. alpina由来のLPAATとし� �公知のLPAAT1とLPAAT2がある。この2つのホモロ� ��と本発明の2つのホモログとの関係を図1の� �統樹に示す。本発明のLPAAT3と公知のLPAAT1及� �LPAAT2とのORFの塩基配列の同一性は、各々34.3% 、47.0%であり、LPAAT4と公知のLPAAT1及びLPAAT2と� ��ORFの塩基配列の同一性は各々34.6%、47.3%であ る。図1から明らかなように、本発明のLPAAT3� �び4は、進化的分類としては公知のLPAATから� �かなり離れており、その機能も異なる。す� �わち、以下に説明するように、本発明のLPAAT 3及び4は、公知のLPAATが発現した宿主が産生� �る脂肪酸組成物とは異なる組成の脂肪酸組� �物を宿主中に産生させることができ、かつ� �本発明のLPAATが発現した宿主細胞内のアラキ ドン酸含有率が、本発明のLPAATが発現してい� ��い宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも� ��いという、公知のLPAATとは全く異なる機能� �有する。

 なお、本発明のLPAAT3をコードする塩基配� ��及びLPAAT4をコードする塩基配列をそれぞれB LASTX解析した結果、最もE-valueの低かったUstila go maydis 521由来の推定タンパク質(図1)(UM06426. 1, GB accession No. EAK87199)をコードする塩基配 列(GB accession No.XM_757480)との同一性はそれぞ� ��49.2%、51.3%である。

 同様に、LPAAT3とLPAAT4との間のアミノ酸配� ��の同一性は69.1%であり、LPAAT3と公知のLPAAT1� �びLPAAT2との同一性はそれぞれ12.3%、17.3%、LPAA T4と公知のLPAAT1及びLPAAT2との同一性はそれぞ� ��12.5%、15.5%である。なお、本発明のLPAAT3のア ミノ酸配列及びLPAAT4のアミノ酸配列をそれぞ れBLASTP解析した結果、最もE-valueの低かったUs tilago maydis 521由来の推定タンパク質(図1)(UM06 426.1, GB accession No. EAK87199)との同一性はそ� �ぞれ36.2%、36.7%である。

 本発明はまた、上記配列番号36及び37で示さ れる塩基配列(「本発明の塩基配列」と記載� �る場合もある)、並びに、配列番号2及び4で� �されるアミノ酸配列(「本発明のアミノ酸配� ��」と記載する場合もある)からなるタンパク 質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の 機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有 する」とは、本発明の塩基配列がコードする タンパク質及び本発明のアミノ酸配列からな るタンパク質が、LPAAT活性を有することを意� ��する。LPAAT活性は、公知の方法を用いて測� �できるが、例えば、以下のような方法があ� �られる。すなわち、本発明のLPAATを発現させ た酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)� �記載の方法等によりミクロソーム画分を調� �する。そして、反応液である、0.44mM LPA、0.3 6mMアシル-CoA、0.5mM DTT、1mg/ml BSA、2mM MgCl ₂ 、Tris-HCl(pH7.5)に上記ミクロソーム画分を添加 し、28℃で適当な時間反応させ、クロロホル� ��:メタノールを添加して反応を停止させた後 、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層ク ロマトグラフィー等により分画し、上記反応 により生成したPA量を定量することができる� ��その結果、生成したPA量が多ければ、LPAATと しての活性が高いと判断できる。例えば、本 方法によりLPAAT3やLPAAT4を発現させた株では、 上記反応において、アシル-CoAとしてリノオ� �オイル-CoAを用いた場合、PA画分に取り込ま� �るリノール酸(18:2)量が増加することが分か� �ている。そのため、LPAAT3およびLPAAT4は、LPAAT 活性を有するといえる。

 また、このLPAAT活性に加えて、本発明の塩� �配列がコードするタンパク質、又は、本発� �のアミノ酸配列からなるタンパク質が発現� �ている宿主の脂肪酸組成において、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するパルミトレ� ��ン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸 含有量の比率、並びに
iv) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ� ��酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、上記タンパ ク質を発現していない宿主の脂肪酸組成より も高い比率である脂肪酸組成を形成できるよ うな活性を有するタンパク質(以下、「本発� �のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性を有す るタンパク質」という場合もある)である場� �も含まれる。

 具体的には、上記本発明の塩基配列等を発� ��ベクターpYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221 -1228, 1995)に挿入したものを、酵母Saccharomyces� �cerevisiae EH13-15株(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30,  515-520, 1989)を宿主として形質転換させ、得� ��れた形質転換体を培養して回収した菌体を� ��以下の実施例7に記載の方法で脂肪酸解析を した場合の上記本発明のLPAATの脂肪酸組成が� ��具体的に、以下の
i) オレイン酸含有量が52%以上;
ii) パルミチン酸含有量に対するパルミトレ� ��ン酸含有量の比率が7.25以上;
iii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸 含有量の比率が9.94以上;及び
iv) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ� ��酸及びオレイン酸の含有量の比率が10.72以� �という数値である脂肪酸組成を形成できる� �うな活性を有するタンパク質をコードして� �る塩基配列を含む核酸である。さらに好ま� �くは、本発明の塩基配列等は、LPAAT活性及び 上記本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる� ��性を有するタンパク質をコードする塩基配� ��を含む核酸である。なお、これらの脂肪酸� ��成については、上記実施例7に記載の方法と は異なる形質転換体の培養条件を用いて培養 した場合には、その組成に多少の変化を生じ る場合がある。上記培養条件とは、例えば、 温度や培養時間があげられる。

 さらに、上記「同等の機能を有する」に� ��、本発明の塩基配列がコードするタンパク� ��及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパ� ��質がLPAAT活性及び本発明のLPAATの脂肪酸組成 を形成できる活性に加えて、本発明の塩基配 列がコードするタンパク質、又は、本発明の アミノ酸配列からなるタンパク質が発現して いる宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前 記タンパク質を発現していない宿主細胞内の アラキドン酸含有率よりも高いような活性を 有するタンパク質(「本発明の細胞内アラキ� �ン酸含有率を高める活性を有するタンパク� �」といういう場合もある)である場合も含ま� ��る。

 アラキドン酸については、「本発明の脂� ��酸組成物」の項で説明する。そのような核� ��は、具体的には、上記同様、本発明の塩基� ��列等を発現ベクターpYE22mに挿入したものを� ��酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499株にδ12脂肪酸 不飽和化酵素、δ6脂肪酸不飽和化酵素、δ6脂 肪酸鎖長延長酵素およびδ5脂肪酸鎖長延長酵 素を導入し発現させたアラキドン酸を生産す る酵母、ARA3-1株を宿主として形質転換させ、 得られた形質転換体を培養して回収した菌体 を、以下の実施例7に記載の方法で脂肪酸解� �をした場合、細胞内のアラキドン酸含有率� �、上記タンパク質を発現していない宿主よ� �も高い比率である脂肪酸組成を形成できる� �うな活性を有するタンパク質をコードする� �基配列を含む核酸である。さらに好ましく� �、本発明の塩基配列等は、LPAAT活性及び本発 明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性 を有するタンパク質をコードする塩基配列を 含む核酸である。

 このような本発明の核酸と同等の機能を� ��する核酸としては、以下の(a)~(e)のいずれか に記載の塩基配列を含む核酸があげられる。 なお、以下にあげる塩基配列の記載において 、「本発明の上記活性」とは、上記の「LPAAT� ��性及び/又は上記本発明のLPAATの脂肪酸組成� ��形成できる活性及び/又は本発明の細胞内ア ラキドン酸含有率を高める活性」を意味する 。

 (a)配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列� �おいて1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、� ��換若しくは付加されたアミノ酸配列からな� ��、かつ、本発明の上記活性を有するタンパ� ��質をコードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2又は4で示されるアミノ酸配列において1� ��しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若し� ��は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ� ��本発明の上記活性を有するタンパク質をコ� ��ドする塩基配列を含む。

 具体的には、
 (i) 配列番号2又は4に示すアミノ酸配列のう ち1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例� �ば、1~100個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~ 15個、1~10個、さらに好ましくは1~5個))のアミ� ��酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号2又は4に示すアミノ酸配列のう� ��1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例え ば1~100個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15� �、1~10個、さらに好ましくは1~5個))のアミノ� �が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号2又は4に示すアミノ酸配列にお いて1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(� �えば1~100個、1~50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~ 15個、1~10個、さらに好ましくは1~5個))の他の� ��ミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)~(iii)を組み合わせたアミノ酸配列 からなるタンパク質であって、かつ、本発明 の上記活性を有するタンパク質をコードする 塩基配列である。

 上記のうち、置換は、好ましくは保存的� ��換である。保存的置換とは、特定のアミノ� ��残基を類似の物理化学的特徴を有する残基� ��置き換えることであるが、もとの配列の構� ��に関する特徴を実質的に変化させなければ� ��かなる置換であってもよく、例えば、置換� ��ミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを� ��壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種� ��の二次構造を破壊したりしなければいかな� ��置換であってもよい。

 保存的置換は、一般的には、生物学的系� ��成や化学的ペプチド合成で導入されるが、� ��ましくは、化学的ペプチド合成による。こ� ��場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が� ��まれていてもよく、ペプチド模倣体や、ア� ��ノ酸配列のうち、置換されていない領域が� ��転している逆転型又は同領域が反転してい� ��反転型も含まれる。

 以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ご� ��に分類して例示するが、置換可能なアミノ� ��残基は以下に記載されているものに限定さ� ��るものではない。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン� ��バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノ� �タン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブ� ��ルグリシン、t-ブチルアラニン及びシクロ� �キシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソア� ��パラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノ� �ジピン酸及び2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン及びグルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジ アミノブタン酸及び2,3-ジアミノプロピオン� �
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン及び4-ヒ ドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン及びホモセリン
G群:フェニルアラニン及びチロシン
 非保存的置換の場合は、上記種類のうち、� ��る1つのメンバーと他の種類のメンバーとを 交換することができるが、この場合は、本発 明のタンパク質の生物学的機能を保持するた めに、アミノ酸のヒドロパシー指数(ヒドロ� �シーアミノ酸指数)を考慮することが好まし� ��(Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982))。

 また、非保存的置換の場合は、親水性に� ��づいてアミノ酸の置換を行うことができる� ��

 本明細書及び図面において、塩基やアミ� ��酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Bioc hemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、I mmunology--A Synthesis(第2版, E.S. Golub及びD.R. Gre n監修, Sinauer Associates,マサチューセッツ州サ ンダーランド(1991))等に記載されているよう� �、当業界で慣用されている略語に基づく。� �たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場� �は、特に明示しなければL体を示す。

 D-アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異� �体、α,α-二置換アミノ酸等の非天然アミノ� �、N-アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の 非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパ ク質を構成する要素となりうる。

 なお、本明細書で用いるタンパク質の表� ��法は、標準的用法及び当業界で慣用されて� ��る標記法に基づき、左方向はアミノ末端方� ��であり、そして右方向はカルボキシ末端方� ��である。

 同様に、一般的には、特に言及しない限� ��、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5’ 端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左 方向を5’方向とする。

 当業者であれば、当業界で公知の技術を用� ��て、本明細書に記載したタンパク質の適当� ��変異体を設計し、作製することができる。� ��えば、本発明のタンパク質の生物学的活性� ��さほど重要でないと考えられる領域をター� ��ティングすることにより、本発明のタンパ� ��質の生物学的活性を損なうことなくその構� ��を変化させることができるタンパク質分子� ��の適切な領域を同定することができる。ま� ��、類似のタンパク質間で保存されている分� ��の残基及び領域を同定することもできる。� ��らに、本発明のタンパク質の生物学的活性� ��は構造に重要と考えられる領域中に、生物� ��的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポ� ��ペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的� ��ミノ酸置換を導入することもできる。特に� ��本発明では、図6中に二重下線で示したよう に、本発明の2つのLPAATのアミノ酸配列中に、 保存モチーフである「HXXXXD(HX ₄ D)」(保存されているアミノ酸残基を*印で示� �)が存在する。本モチーフは、グリセロリン� ��質アシル基転移酵素(Glycerolipid acyltransferase) に必須のモチーフであり(J. Bacteriology, 180, 1 425-1430, 1998)、本発明のLPAATにとっても重要な モチーフである。従って、本発明の変異体は 上記保存モチーフが保存され、かつ、本発明 の上記活性が損なわれない限り、いかなる変 異体であってもよい。なお、上記保存モチー フ中で、Xはいかなるアミノ酸残基であって� �よいことを示している。

 当業者であれば、本発明のタンパク質の� ��物学的活性又は構造に重要であり、同タン� ��ク質のペプチドと類似するペプチドの残基� ��同定し、この2つのペプチドのアミノ酸残基 を比較して、本発明のタンパク質と類似する タンパク質のどの残基が、生物学的活性又は 構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ 酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造 -機能研究を行うことができる。さらに、こ� �ように予測したアミノ酸残基の化学的に類� �のアミノ酸置換を選択することにより、本� �明のタンパク質の生物学的活性が保持され� �いる変異体を選択することもできる。また� �当業者であれば、本タンパク質の変異体の� �次元構造及びアミノ酸配列を解析すること� �できる。さらに、得られた解析結果から、� �ンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸� �基のアラインメントを予測することもでき� �。タンパク質表面上にあると予測されるア� �ノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用� �関与する可能性があるが、当業者であれば� �上記したような解析結果に基づいて、この� �うなタンパク質表面上にあると予測される� �ミノ酸残基を変化させないような変異体を� �製することができる。さらに、当業者であ� �ば、本発明のタンパク質を構成する各々の� �ミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基の� �を置換するような変異体を作製することも� �きる。このような変異体を公知のアッセイ� �法によりスクリーニングし、個々の変異体� �情報を収集することができる。それにより� �ある特定のアミノ酸残基が置換された変異� �の生物学的活性が、本発明のタンパク質の� �物学的活性に比して低下する場合、そのよ� �な生物学的活性を呈さない場合、又は、本� �ンパク質の生物学的活性を阻害するような� �適切な活性を生じるような場合を比較する� �とにより、本発明のタンパク質を構成する� �々のアミノ酸残基の有用性を評価すること� �できる。また、当業者であれば、このよう� �日常的な実験から収集した情報に基づいて� �単独で、又は他の突然変異と組み合わせて� �本発明のタンパク質の変異体としては望ま� �くないアミノ酸置換を容易に解析すること� �できる。

 上記したように、配列番号2又は4で表され� �アミノ酸配列において1若しくは複数個のア� ��ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ� ��酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cl oning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Har bor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular  Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel ( 1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel� �(1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位 特異的変異誘発法等の方法に従って調製する ことができる。このようなアミノ酸の欠失、 置換若しくは付加等の変異がなされた変異体 の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等� ��公知手法により、部位特異的突然変異誘発� ��を利用した変異導入用キット、例えばQuikCha nge ^TM  Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社� �)、GeneTailor ^TM  Site-Directed Mutagenesis System(インビトロジェ� �社製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan- K、Mutan-Super Express Km等:タカラバイオ社製)等 を用いて行うことができる。

 なお、タンパク質のアミノ酸配列に、そ� ��活性を保持しつつ1又は複数個のアミノ酸の 欠失、置換、若しくは付加を導入する方法と しては、上記の部位特異的変異誘発の他にも 、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝 子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチ ドを除去、置換若しくは付加した後に連結す る方法があげられる。

 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好� ��しくは、配列番号2又は4で示されるアミノ� �配列において1~10個のアミノ酸が欠失、置換� ��しくは付加されたアミノ酸配列からなり、� ��つ、LPAAT活性を有するタンパク質をコード� �る塩基配列である。

 また、本発明の核酸に含まれる塩基配列� ��は、配列番号2又は4において1~10個のアミノ� ��が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸� ��列からなり、かつ、本発明の上記活性を有� ��るタンパク質をコードする塩基配列も含ま� ��る。

 本発明のタンパク質におけるアミノ酸の� ��異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の� ��位は、LPAAT活性、又は本発明のLPAATの脂肪酸 組成を形成できる活性、又は本発明の細胞内 アラキドン酸含有率を高める活性が保持され る限り制限はない。

 本発明のLPAAT活性、又は本発明のLPAATの脂 肪酸組成を形成できる活性、又は本発明の細 胞内アラキドン酸含有率を高める活性は、公 知の方法を用いて測定することが可能である 。例えば、以下の文献:J.B.C., 265, 17215-17221,  1990を参照することができる。

 例えば、本発明の「LPAAT活性」は以下の通� �測定してもよい。本発明のLPAATを発現させた 酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に� �載の方法等によりミクロソーム画分を調製� �る。そして、反応液である、0.44mM LPA、0.36mM アシル-CoA、0.5mM DTT、1mg/ml BSA、2mM MgCl ₂ 、50mMTris-HCl(pH7.5)に上記ミクロソーム画分を� �加し、28℃で適当な時間反応させ、クロロホ ルム:メタノールを添加して反応を停止させ� �後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄� �クロマトグラフィー等により分画し、生成� �たPA量を定量することができる。

 また、本発明の「LPAATの脂肪酸組成を形� �できる活性」は、例えば以下のように測定� �てもよい。本発明の脂肪酸組成物の製造方� �により得られた凍結乾燥した菌体に、適当� �比率で調整したクロロホルム:メタノールを� ��加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理� ��する。さらに遠心分離により菌体を分離し� ��、溶媒を回収することを数回繰り返す。そ� ��後、適当な方法を用いて脂質を乾固させて� ��ら、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質� ��溶解する。この試料を適当量分取して、塩� ��メタノール法により菌体の脂肪酸をメチル� ��ステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し� ��ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグ� ��フィーで分析を行う。また、本発明の「細� ��内アラキドン酸含有率を高める活性」も上� ��方法にてアラキドン酸の含有量を分析する� ��とにより測定できる。

 (b)配列番号36又は配列番号37からなる塩基配 列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし 、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク 質をコードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号36又は配列番号37からなる塩基配列に対し 相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、 本発明の上記活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列を含む。配列番号36又は配列� ��号37及びLPAAT活性については上記のとおりで ある。

 上記塩基配列は、当業者に公知の方法で� ��当な断片を用いてプローブを作製し、この� ��ローブを用いてコロニーハイブリダイゼー� ��ョン、プラークハイブリダイゼーション、� ��ザンブロット等の公知のハイブリダイゼー� ��ョン法により、cDNAライブラリー及びゲノム ライブラリー等から得ることができる。

 ハイブリダイゼーション法の詳細な手順� ��ついては、『Molecular Cloning, A Laboratory Manu al 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001);特にSe ction 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biolog y』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3- 6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical� �Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);ハイブ� ��ダイゼーション条件については特にSection2.1 0) 等を参照することができる。

 ハイブリダイゼーション条件の強さは、� ��としてハイブリダイゼーション条件、より� ��ましくは、ハイブリダイゼーション条件及� ��洗浄条件によって決定される。本明細書に� ��ける「ストリンジェントな条件」には、中� ��度又は高度にストリンジェントな条件が含� ��れる。

 具体的には、中程度にストリンジェント� ��条件としては、例えばハイブリダイゼーシ� ��ン条件として、1×SSC~6×SSC、42℃~55℃の条件� ��より好ましくは、1×SSC~3×SSC、45℃~50℃の条� ��、最も好ましくは、2×SSC、50℃の条件があ� �られる。ハイブリダイゼーション溶液中に� �例えば、約50%のホルムアミドを含む場合に� �、上記温度よりも5ないし15℃低い温度を採� �する。洗浄条件としては、0.5×SSC~6×SSC、40℃ ~60℃があげられる。ハイブリダイゼーション 及び洗浄時には、一般に、0.05%~0.2%、好まし� �は約0.1%SDSを加えてもよい。

 高度にストリンジェント(ハイストリンジ ェント)な条件としては、中程度にストリン� �ェントな条件よりも高い温度及び/又は低い� ��濃度でのハイブリダイゼーション及び/又は 洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーショ ン条件として、0.1×SSC~2×SSC、55℃~65℃の条件� ��より好ましくは、0.1×SSC~1×SSC、60℃~65℃の� �件、最も好ましくは、0.2×SSC、63℃の条件が� ��げられる。洗浄条件として、0.2×SSC~2×SSC、5 0℃~68℃、より好ましくは、0.2×SSC、60~65℃が� ��げられる。

 特に本発明に用いられるハイブリダイゼ� ��ション条件としては、例えば、5×SSC、1%SDS� �50mM Tris-HCl(pH7.5)及び50%ホルムアミド中42℃の 条件でプレハイブリダイゼーションを行った 後、プローブを添加して一晩42℃に保ってハ� ��ブリッド形成させ、その後、0.2×SSC、0.1%SDS� ��、65℃で20分間の洗浄を3回行うという条件� �あげられるが、これらに限定されない。

 また、プローブに放射性物質を使用しな� ��市販のハイブリダイゼーションキットを使� ��することもできる。具体的には、DIG核酸検� ��キット(ロシュ・ダイアグノス社)、ECL direct  labeling & detection system(Amersham社製)を使� �したハイブリダイゼーション等があげられ� �。

 本発明に含まれる塩基配列としては、好� ��しくは、配列番号36又は配列番号37からなる 塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核 酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズし� ��かつ、LPAAT活性を有するタンパク質をコー� �する塩基配列があげられる。

 (c)配列番号36又は配列番号37からなる塩基配 列と同一性が67%以上の塩基配列からなり、か つ、本発明の上記活性を有するタンパク質を コードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号36又は37に示される核酸配列に対して少な くとも67%以上の塩基配列からなり、かつ、本 発明の上記活性を有するタンパク質をコード する塩基配列を含む。

 好ましくは、配列番号36又は37に示される 核酸配列に対して少なくとも70%、さらに好ま しくは75%、さらに一層好ましくは80%(例えば� �85%以上、より一層好ましくは90%以上、さら� �は95%、98%又は99%)の同一性を有する塩基配列� ��含む核酸であって、かつ、本発明の上記活� ��を有するタンパク質をコードする塩基配列� ��あげられる。上記したように、LPAAT3(配列番 号36)及びLPAAT4(配列番号37)の同一性は66.6%であ る。本発明の核酸は、配列番号36又は37に示� �れる核酸配列に対して少なくとも67%以上で� �り、両者に類似するものを含む。

 2つの核酸配列の同一性%は、視覚的検査� �数学的計算により決定することができるが� �コンピュータープログラムを使用して2つの� ��酸の配列情報を比較することにより決定す� ��のが好ましい。配列比較コンピュータープ� ��グラムとしては、例えば、米国国立医学ラ� ��ブラリーのウェブサイト:http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプロ� �ラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 40 3-10):バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリ� �ム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準 的なデフォルトパラメーターの設定は、以下 のインターネットサイト:http://blast.wustl.eduに� ��載されているものを用いることができる。

 (d)配列番号2又は配列番号4からなるアミノ� �配列と同一性が69%以上のアミノ酸配列をコ� �ドし、かつ、本発明の上記活性を有するタ� �パク質をコードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2又は配列番号4からなるアミノ酸配列と� �一性が69%以上のアミノ酸配列をコードし、� �つ、本発明の上記活性を有するタンパク質� �コードする塩基配列を含む。本発明の核酸� �コードするタンパク質は、本発明の上記活� �を有するタンパク質と同等の機能を有する� �り、LPAAT3又はLPAAT4のアミノ酸配列と同一性� �あるタンパク質でもよい。

 具体的には、配列番号2又は配列番号4で� �されるアミノ酸配列と70%以上、好ましくは75 %以上、より好ましくは80%、さらに好ましく� �85%以上、より一層好ましくは、90%(例えば、9 5%、さらには、98%)以上の同一性を有するアミ ノ酸配列等があげられる。上記したように、 LPAAT3(配列番号2)とLPAAT4(配列番号4)の間のアミ ノ酸配列の同一性は69.1%である。本発明の核� ��がコードするタンパク質は、配列番号2又は 4に示されるアミノ酸配列に対して少なくと� �69%以上であり、両者に類似するものを含む� �

 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好� ��しくは、配列番号2又は配列番号4からなる� �ミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配� �をコードし、かつ、本発明の上記活性を有� �るタンパク質をコードする塩基配列である� �さらに好ましくは、配列番号2又は配列番号4 からなるアミノ酸配列と同一性が95%以上のア ミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記 活性を有するタンパク質をコードする塩基配 列である。

 2つのアミノ酸配列の同一性パーセントは 、視覚的検査及び数学的計算によって決定す ることができる。また、コンピュータープロ グラムを用いて同一性パーセントを決定する こともできる。そのようなコンピュータープ ログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA(Altschu lら、 J. Mol. Biol., 215:403-410(1990))、及びClusta lW等があげられる。特に、BLASTプログラムに� �る同一性検索の各種条件(パラメーター)は、 Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)� �記載されたもので、米国バイオテクノロジ� �情報センター(NCBI)やDNA Data Bank of Japan(DDBJ) のウェブサイトから公的に入手することがで きる(BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Beth esda, MD 20894;Altschulら)。また、遺伝情報処理� ��フトウエアGENETYX Ver.7(ゼネティックス)、DIN ASIS Pro(日立ソフト)、Vector NTI(Infomax)等のプ� �グラムを用いて決定することもできる。

 複数のアミノ酸配列を並列させる特定の� ��ラインメントスキームは、配列のうち、特� ��の短い領域のマッチングをも示すことがで� ��るため、用いた配列の全長配列間に有意な� ��係がない場合であっても、そのような領域� ��おいて、特定の配列同一性が非常に高い領� ��を検出することもできる。さらに、BLASTア� �ゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマト リックスを用いることができるが、選択パラ メーターとしては、以下のものを用いること ができる:(A)低い組成複雑性を有するクエリ� �配列のセグメント(Wootton及びFederhenのSEGプロ� ��ラム(Computers and Chemistry, 1993)により決定さ れる;Wootton及びFederhen, 1996「配列データベー� ��における組成編重領域の解析(Analysis of comp ositionally biased regions in sequence databases)」Met hods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい)、又は 、短周期性の内部リピートからなるセグメン ト(Claverie及びStates(Computers and Chemistry, 1993)� �XNUプログラムにより決定される)をマスクす� ��ためのフィルターを含むこと、及び(B)デー� ��ベース配列に対する適合を報告するための� ��計学的有意性の閾値、又はE-スコア(Karlin及� ��Altschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって 、単に偶然により見出される適合の期待確率 ;ある適合に起因する統計学的有意差がE-スコ ア閾値より大きい場合、この適合は報告され ない。

 (e)配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列� �らなるタンパク質をコードする塩基配列に� �し相補的な塩基配列からなる核酸とストリ� �ジェントな条件下でハイブリダイズし、か� �、本発明の上記活性を有するタンパク質を� �ードする塩基配列
 本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列� ��号2又は4で示されるアミノ酸配列からなる� �ンパク質をコードする塩基配列に対し相補� �な塩基配列からなる核酸とストリンジェン� �な条件下でハイブリダイズし、かつ、本発� �の上記活性を有するタンパク質をコードす� �塩基配列を含む。

 配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列� �らなるタンパク質及びハイブリダイズの条� �は上記のとおりである。本発明の核酸に含� �れる塩基配列としては、配列番号2又は4で示 されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコ ードする塩基配列に対し相補的な塩基配列か らなる核酸とストリンジェントな条件下でハ イブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列があ げられる。

 また、本発明の核酸には、配列番号36又は� �列番号37からなる塩基配列において1若しく� �複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加さ� �た塩基配列からなり、かつ、本発明の上記� �性を有するタンパク質をコードする塩基配� �を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号36又は37に示す塩基配列のうち1� �又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば� �1~300個、1~250個、1~200個、1~150個、1~100個、1~50 個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~10個、さ� ��に好ましくは1~5個))の塩基が欠失した塩基� �列、
(ii) 配列番号36又は37に示す塩基配列のうち1� ��又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば1 ~300個、1~250個、1~200個、1~150個、1~100個、1~50� �、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~10個、さら に好ましくは1~5個))の塩基が他の塩基で置換� ��れた塩基配列、
(iii) 配列番号36又は37に示す塩基配列におい� ��1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例え ば1~300個、1~250個、1~200個、1~150個、1~100個、1~ 50個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~10個、� �らに好ましくは1~5個))の他の塩基が付加され た塩基配列、又は
(iv) 上記(i)~(iii)を組み合わせた塩基配列であ って、かつ、本発明の上記活性を有するタン パク質をコードしている塩基配列を含む核酸 を用いることもできる。

 本発明の核酸の好ましい態様としては、以� ��の(a)~(c)のいずれかに記載の塩基配列または そのフラグメントを含む核酸も含まれる。
(a)配列番号36若しくは配列番号37で示される� �基配列
(b)配列番号2若しくは4で示されるアミノ酸配� ��からなるタンパク質をコードする塩基配列
(c)配列番号1若しくは3で示される塩基配列
 (a)配列番号36若しくは配列番号37で示される 塩基配列、(b)配列番号2若しくは4で示される� ��ミノ酸配列からなるタンパク質をコードす� ��塩基配列、(c)配列番号1若しくは3で示され� �塩基配列については、表1に記載したとおり� ��ある。上記配列のフラグメントとは、上記� ��基配列に含まれるORF、CDS、生物学的活性を� ��する領域、以下に記載するようなプライマ� ��として用いた領域、プローブとなりうる領� ��が含まれ、天然由来のものであっても、人� ��的に作製したものであってもよい。

  本発明のリゾホスファチジン酸ア シル基転移酵素タンパク質
 本発明のタンパク質は、配列番号2又は4で� �されるアミノ酸配列からなるタンパク質及� �前記タンパク質と同等の機能を有するタン� �ク質を含み、天然由来のものであっても、� �工的に作製したものであってもよい。配列� �号2又は4で示されるアミノ酸配列からなるタ ンパク質については、上記のとおりである。 「同等の機能を有するタンパク質」とは、上 記『本発明のリゾホスファチジン酸アシル基 転移酵素をコードする核酸』の項で説明した とおり、「本発明の上記活性」を有するタン パク質を意味する。

 本発明において、配列番号2又は4で示さ� �るアミノ酸配列からなるタンパク質と同等� �機能を有するタンパク質としては、以下の(a )又は(b)のいずれかに記載のタンパク質があ� �られる。

 (a)配列番号2又は4において1若しくは複数個� ��アミノ酸が欠失、置換若しくは付加された� ��ミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記� ��性を有するタンパク質
 (b)配列番号2又は配列番号4からなるアミノ� �配列と同一性が69%以上のアミノ酸配列から� �るタンパク質であり、かつ、本発明の上記� �性を有するタンパク質
 上記のうち、配列番号2又は4において1若し� ��は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは� ��加されたアミノ酸配列、又は、配列番号2又 は配列番号4からなるアミノ酸配列と同一性� �69%以上のアミノ酸配列については、上記、� �本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転� �酵素をコードする核酸』の項で説明したと� �りである。また、上記「本発明の上記活性� �有するタンパク質」は、配列番号36若しくは 配列番号37の塩基配列を含む核酸によってコ� ��ドされるタンパク質の変異体、又は、配列� ��号2又は4に示されるアミノ酸配列において1� ��又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しく� ��付加等の多くの種類の修飾により変異した� ��ンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾� ��れている修飾タンパク質、他のタンパク質� ��の融合タンパク質であって、かつ、LPAAT活� �を有するタンパク質であるか、及び/又は、� ��発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性� �有するタンパク質であるか、及び又は本発� �の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性� �有するタンパク質も含まれる。

 また、本発明のタンパク質は、人工的に� ��製したものであってもよく、その場合は、F moc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル� �)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の� �学合成法によっても製造することができる� �また、アドバンスドケムテック社製、パー� �ンエルマー社製、ファルマシア社製、プロ� �インテクノロジーインストゥルメント社製� �シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社� �、島津製作所社製等のペプチド合成機を利� �して化学合成することもできる。

  LPAATの核酸のクローニング
 本発明のLPAATの核酸は、例えば、適切なプ� �ーブを用いてcDNAライブラリーからスクリー� ��ングすることにより、クローニングするこ� ��ができる。また、適切なプライマーを用い� ��PCR反応により増幅し、適切なベクターに連� ��することによりクローニングすることがで� ��る。さらに、別のベクターにサブクローニ� ��グすることもできる。

 例えば、pBlue-Script  ^TM  SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco- BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の 市販のプラスミドベクターを用いることがで きる。また、PCR反応で増幅する場合、プライ マーは、上記の配列番号1又は3等に示される� ��基配列のいずれの部分も用いることができ� ��が、例えば、配列番号1に対しては、
上流側用プライマーとしてI-1:5’-GGATGTCATCAATGT CATCAATAGAG-3’(配列番号9)を、
下流側プライマーとして、I-2: 5’-CTAACCCCCTCTT CCTCCACCAC-3’(配列番号10)を、
配列番号3に対しては、
上流側用プライマーとしてB-1:5’-CCTCGCAAAATGTAT CGTGG-3’(配列番号15)を、
下流側プライマーとして、B-2:5’-GATGGGAAGTTGAGC TTGAATG-3’(配列番号16)等を、
各々用いることができる。そして、M. alpina  菌体から調製したcDNAに、上記プライマー及� �耐熱性DNAポリメラーゼ等を作用させてPCR反� �を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A La boratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press ( 2001))』等に従い、当業者であれば容易に行う ことができるが、本発明のPCR反応の条件とし ては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度:90~95℃
アニーリング温度:40~60℃
伸長温度:60~75℃、
サイクル数:10回以上
 得られたPCR産物の精製には公知の方法を用� ��ることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ )、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE ヘルスケアバイオサイエンス)等のキットを� �いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法 、透析チューブを用いる方法等がある。アガ ロースゲルを用いる場合には、アガロースゲ ル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロー スゲルより切り出して、GENECLEAN(フナコシ)、Q IAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ&� �クイーズ法等により精製することができる� �

 クローニングした核酸の塩基配列は、塩� ��配列シーケンサーを用いて決定することが� ��きる。

  LPAAT発現用ベクター構築及び形質� ��換体の作製
 本発明はまた、本発明のLPAAT3及び4をコード する核酸を含有する組換えベクターを提供す る。本発明は、さらに、上記組換えベクター によって形質転換された形質転換体も提供す る。

 このような組換えベクター及び形質転換� ��は以下のようにして得ることができる。す� ��わち、本発明のLPAATをコードする核酸を有� �るプラスミドを制限酵素を用いて消化する� �用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、Kpn I、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに� �定されない。なお、末端をT4ポリメラーゼ処 理することにより平滑化してもよい。消化後 の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動に より精製する。この塩基配列断片を、発現用 ベクターに公知の方法を用いて組み込むこと により、LPAAT発現用ベクターを得ることがで� ��る。この発現ベクターを宿主に導入して形� ��転換体を作製し、目的とするタンパク質の� ��現に供する。

 このとき、発現ベクター及び宿主は、目� ��とするタンパク質を発現できるものであれ� ��特に限定されず、例えば、宿主として、真� ��や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞� ��があげられる。真菌として、脂質生産菌で� ��るM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セ レビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があ げられる。また細菌として、大腸菌(Escherichia  coli)やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等があげられる。さらに植物としては、ナタ ネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧 植物があげられる。

 脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol .XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を 使用することができ、具体的には、モルティ エレラ(Mortierella)属に属する微生物、例えば� �モルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elonga ta)IFO8570、モルティエレラ・エキシグア(Mortier ella exigua)IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフ� ��ラ(Mortierella hygrophila)IFO5941、モルティエレ� �・アルピナ(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、A TCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53� �CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70� �CBS754.68等のモルティエレラ亜属(subgenus Mortie rella)に属する微生物、又はモルティエレラ・ イザベリナ(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336� ��IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884� ��モルティエレラ・ナナ(Mortierella nana)IFO8190� �モルティエレラ・ラマニアナ(Mortierella ramann iana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、I FO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィ� ��セア(Mortierella vinacea)CBS236.82等のマイクロム コール亜属(subgenus Micromucor)に属する微生物� �があげられる。とりわけ、モルティエレラ� �アルピナ(Mortierella alpina)が好ましい。

 真菌類を宿主として用いる場合は、本発� ��の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、� ��しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構� ��であることが好ましい。それと同時に、プ� ��モーター、ターミネーターを含む構成であ� ��ことが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用 する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4 、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモータ� �としては、宿主中で発現できるものであれ� �いかなるプロモーターを用いてもよく、例� �ば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH(グリ� ��ルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ)遺� ��子プロモーター、TEF(Translation elongation facto r)遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来 するプロモーターが用いられる。

 M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの 導入方法としては、例えば、エレクトロポレ ーション法、スフェロプラスト法、パーティ クルデリバリー法及び核内へのDNAの直接マイ クロインジェクション等があげられる。栄養 要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養 素を欠いた選択培地上で生育する株を選択す ることで、形質転換株を取得することができ る。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝 子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培 地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロ ニーを得ることができる。

 酵母を宿主として用いる場合は、発現ベ� ��ターとして、例えば、pYE22m等があげられる� ��また、pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販� �酵母発現用ベクターを、用いてもよい。ま� �本発明に適する宿主としては、Saccharomyces ce revisiae EH13-15株(trp1, MATα)等があげられるが� �れらに限定されない。プロモーターとして� �、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモー� �ー、gal10プロモーター等の酵母等に由来する プロモーターが用いられる。

 酵母への組換えベクターの導入方法とし� ��は、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロ� ��レーション法、スフェロプラスト法、デキ� ��トラン仲介トランスフェクション、リン酸� ��ルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフ� ��クション、プロトプラスト融合、リポソー� ��中のポリヌクレオチド(単数又は複数)の被� �、及び核内へのDNAの直接マイクロインジェ� �ション等があげられる。

 大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合� ��、発現ベクターとしては、例えばファルマ� ��ア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモー� ��ーとしては、例えば、trpプロモーター、lac� �プロモーター、PLプロモーター、PRプロモー� ��ー等の大腸菌やファージ等に由来するプロ� ��ーターが用いられる。細菌への組み換えベ� ��ターの導入方法としては、例えばエレクト� ��ポレーション法や塩化カルシウム法を用い� ��ことができる。

  本発明の脂肪酸組成物の製造方法
 本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組� ��物を製造する方法を提供する。すなわち、� ��記形質転換体を培養して得られる培養物か� ��脂肪酸組成物を製造する方法である。具体� ��には、以下の方法で製造することができる� ��しかし、本製造方法に関しては、当該方法� ��限られず、一般的な公知の他の方法を用い� ��行うこともできる。

 LPAATを発現させた生物の培養に用いる培� �は、適当なpH及び浸透圧を有し、各宿主の増 殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物 質等の生物材料を含んでいる培養液(培地)で� ��れば、いかなる培養液も用いうる。例えば� ��酵母を形質転換してLPAATを発現させた場合� �、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いるこ� ��ができるが、これらに限定されない。具体� ��な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する:1L� ��たり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー(アデ� ��ン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギ� ��酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロ� �シン1.8g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェ� �ルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、 バリン4.5g、スレオニン6g、ウラシル0.6gを混� �したもの)1.3g)。

 培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生� ��した酵素が安定に保たれるのに適当な条件� ��あればいかなる条件でもよいが、具体的に� ��、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培� ��又は振盪培養等の個々の条件を調節するこ� ��ができる。培養方法は、同一条件での培養( 1段階培養)でもよく、2以上の異なる培養条件 を用いる、いわゆる2段階培養若しくは3段階� ��養でもよいが、大量培養をする場合には、� ��養効率がよい2段階培養等が好ましい。

 以下に、本発明の脂肪酸組成物の具体的� ��製造方法として、宿主として酵母を用いて2 段階培養を行った場合を例示して説明する。 すなわち、前培養として、上記で得られたコ ロニーを、例えば上記のSC-Trp培地等に植菌し て、30℃で2日間振盪培養を行う。その後、本 培養として、YPD5(2%酵母エキス、1%ポリペプト ン、5%グルコース)培地10mlに前培養液を500μl� �加し、30℃で2日間振盪培養を行う方法であ� �。

  本発明の脂肪酸組成物
 本発明はまた、本発明のLPAAT3又は4が発現し ている細胞における1又はそれ以上の脂肪酸� �集合体である脂肪酸組成物を提供する。好� �しくは、本発明のLPAAT3又は4が発現している� ��質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物� ��ある。脂肪酸は、遊離脂肪酸でもよいし、� ��リグリセリド、リン脂質等でもよい。特に� ��本発明の脂肪酸組成物は、その脂肪酸組成� ��おいて、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するパルミトレ� ��ン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸 含有量の比率、並びに
iv) パルミチン酸含有量に対する、ステアリ� ��酸及びオレイン酸の合計含有量の比率のう� ��の少なくとも一つ以上が、本発明の組換え� ��クターで形質転換されていない宿主を培養� ��て得られる培養物の前記比率より高いこと� ��又は、本発明の脂肪酸組成物におけるアラ� ��ドン酸含有率が、前記組換えベクターで形� ��転換されていない宿主を培養して得られる� ��養物より高いことを特徴とする。ここで、� ��本発明の組換えベクターで形質転換されて� ��ない宿主」とは、例えば、本明細書中の「� ��発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移� ��素をコードする核酸」の項目で記載した核� ��が組み込まれていないベクター(空ベクター )で形質転換された宿主である。なお、上記� �肪酸組成物については、上記「本発明のリ� �ホスファチジン酸アシル基転移酵素をコー� �する核酸」の項目でも説明したように培養� �件を変化させた場合には、その脂肪酸組成� �多少変化する場合もある。

 本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸� ��しては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐� ��のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリス� ��ン酸(テトラデカン酸)(14:0)、ミリストレイ� �酸(テトラデセン酸)(14:1)、パルミチン酸(ヘ� �サデカン酸)(16:0)、パルミトレイン酸(9-ヘキ� ��デセン酸)(16:1)、ステアリン酸(オクタデカ� �酸)(18:0)、オレイン酸(cis-9-オクタデセン酸)(1 8:1(9))、バクセン酸(11-オクタデセン酸)(18:1(11) )、リノール酸(cis, cis-9,12 オクタデカジエン 酸)(18:2(9,12))、α-リノレン酸(9,12,15-オクタデ� �ントリエン酸)(18:3(9,12,15))、γ-リノレン酸(6,9 ,12-オクタデカントリエン酸)(18:3(6,9,12))、ス� �アリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン 酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸(イコサン酸)( 20:0)、(8,11-イコサジエン酸)(20:2(8,11))、ミード 酸(5,8,11-イコサトリエン酸)(20:3(5,8,11))、ジホ� ��γ-リノレン酸(8,11,14-イコサトリエン酸)(20:3( 8,11,14))、アラキドン酸(5,8,11,14-イコサテトラ� ��ン酸)(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸( 5,11,14,17-イコサテトラエン酸)(20:4(5,11,14,17)、� ��イコサペンタエン酸(5,8,11,14,17-イコサペン� �エン酸)(20:5(5,8,11,14,17))、ベヘン酸(ドコサン� ��)(22:0)、(7,10,13,16-ドコサテトラエン酸)(22:4(7, 10,13,16))、(4,7,13,16,19-ドコサペンタエン酸)(22:5 (4,7,13,16,19))、(4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸) (22:5(4,7,10,13,16))、(4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサ� �ン酸)(22:6(4,7,10,13,16,19))、リノグリセリン酸(� ��トラドコサン酸)(24:0)、ネルボン酸(cis-15-テ� ��ラドコサン酸)(24:1)、セロチン酸(ヘキサド� �サン酸)(26:0)等があげられるが、これらに限� ��されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学� �名法で定義された慣用名であり、組織名及� �、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、� �ッコ内に記載した。

 本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つとして� ��アラキドン酸含有率が高いことがあげられ� ��。アラキドン酸は、化学式C ₂₀ H ₃₂ O ₂ で示される、分子量304.47の物質で、4つの二� �結合を含む20個の炭素鎖からなるカルボン酸 (〔20:4(n-6)〕)で、(n-6)系に分類される。アラ� �ドン酸は、動物の細胞膜中の重要なリン脂� �(特にホスファチジルエタノールアミン・ホ� ��ファチジルコリン・ホスファチジルイノシ� ��ール)として存在し、脳に多く含まれる。ま たアラキドン酸は、アラキドン酸カスケード により生成するプロスタグランジン・トロン ボキサン・ロイコトリエンなど一連のエイコ サノイドの出発物質であり、細胞間のシグナ ル伝達におけるセカンドメッセンジャーとし ても重要である。一方、アラキドン酸は、動 物ではリノール酸を原料として体内で合成さ れる。しかし、動物の種あるいは年齢等によ っては、この機能が十分でないため必要な量 を生産することかできないか、あるいは全く 生産する機能がないため、食物からアラキド ン酸を摂取しなければならず、アラキドン酸 は必須脂肪酸であるといえる。

 本発明の脂肪酸組成物中のアラキドン酸� ��有率は、例えば、以下のように測定するこ� ��ができる。すなわち、本発明のLPAAT3又は4の プラスミドを、例えば、実施例9に記載の方� �によりpDuraSCやpDura5MCS等のベクターに挿入し� ��M. alpina株で形質転換して得られた形質転換 体を発現させて、実施例9に記載した培養方� �等に従って得られた培養菌体を用いて菌体� �の脂肪酸含有率や培地あたりのアラキドン� �の含有量等を測定する方法である。アラキ� �ン酸の含有量等の分析方法としては、例え� �、得られた培養菌体の脂肪酸を塩酸メタノ� �ル法により脂肪酸メチルエステルに誘導し� �あと、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留� �してから、ガスクロマトグラフィーで行う� �法があげられる。これによれば、本発明のLP AAT3又は4をM. alpinaで形質転換させた場合は、 菌体内の脂肪酸含有率も培地あたりのアラキ ドン酸生産量も高いことが示されている。こ のように、アラキドン酸含有率が高い本発明 の脂肪酸組成物は、アラキドン酸を効率よく 摂取できるため、好ましい。

 本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸� ��うち、1またそれ以上の脂肪酸の組み合わせ であれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪 酸からなる組成物でもよい。

 このような本発明の脂肪酸組成物が得ら� ��たこと、つまり、本発明のLPAAT3又は4が発現 したことの確認は、公知の一般的な方法を用 いて行うことができる。例えば、酵母でLPAAT� ��発現させた場合は、脂肪酸組成の変化とし� ��確認することができる。すなわち、上記本� ��明の脂肪酸組成物の製造方法により得られ� ��凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整し� ��クロロホルム:メタノールを添加して攪拌し た後、適当な時間、加熱処理をする。さらに 遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収 することを数回繰り返す。その後、適当な方 法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホ ルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。こ の試料を適当量分取して、塩酸メタノール法 により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導 した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留 去してから、ガスクロマトグラフィーで分析 を行う。

 その結果、上記の脂肪酸組成を有する脂� ��酸組成物及び/又はアラキドン酸含有率が高 い脂肪酸組成物が得られた場合は、本発明の 脂肪酸組成物が得られたと判断することがで きる。なお、本発明のLPAATは、公知のLPAAT脂� �酸組成物の脂肪酸組成とは脂肪酸組成が異� �ることから、本発明のLPAATは公知のLPAATと基� ��特異性が異なることが示される。

  本発明の脂肪酸組成物を含む食品 等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食 品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常 法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業 原料(化粧料、医薬(例えば、皮膚外用薬)、石 鹸等の原料)の製造等の用途に使用すること� �できる。化粧料(組成物)又は医薬(組成物)の� ��型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状� ��固体状、粉末状等任意の剤型をあげること� ��できるが、これらに限定されない。また、� ��品の形態としては、カプセル等の医薬製剤� ��形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量� ��素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明� ��脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半� ��化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤� ��経腸栄養剤等の加工形態があげられる。

 さらに、本発明の食品の例としては、栄� ��補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用� ��品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人� ��食品等があげられるが、これらに限定され� ��い。本明細書においては、食品とは、固体� ��流動体、及び液体、並びにそれらの混合物� ��あって、摂食可能なものの総称をいう。

 栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強� ��されている食品をいう。健康食品とは、健� ��的な又は健康によいとされる食品をいい、� ��養補助食品、自然食品、ダイエット食品等� ��含まれる。機能性食品とは、体の調節機能� ��果たす栄養成分を補給するための食品をい� ��、特定保健用途食品と同義である。幼児用� ��品とは、約6歳までの子供に与えるための食 品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と 比較して消化及び吸収が容易であるように処 理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約 1歳までの子供に与えるための調製乳をいう� �未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月� ��なるまで与えるための調製乳をいう。

 これらの食品としては、肉、魚、ナッツ� ��の天然食品(油脂で処理したもの);中華料理� ��ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加え� ��食品;天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン 、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油 脂を用いた食品;バター、マーガリン、マヨ� �ーズ、ドレッシング、チョコレート、即席� �ーメン、キャラメル、ビスケット、クッキ� �、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又� �加工時に油脂を加えた加工食品;おかき、ハ� ��ドビスケット、あんパン等の加工仕上げ時� ��油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげるこ� ��ができる。しかしながら、本発明の食品は� ��油脂を含む食品に限定されるわけではなく� ��例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類(キャ ンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓 子)、豆腐及びその加工品等の農産食品;清酒� ��薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発� ��食品;ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセ ージ等の畜産食品;かまぼこ、揚げ天、はん� �ん等の水産食品;果汁飲料、清涼飲料、スポ� ��ツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられ� ��。

 本発明のLPAATをコードする核酸又はLPAATタン パク質を用いた菌株の評価・選択方法
 本発明はまた、本発明のLPAATをコードする� �酸又はLPAATタンパク質を用いて、脂質生産菌 の評価や選択を行う方法を提供する。具体的 には以下のとおりである。

 (1)評価方法
 本発明の一態様として、本発明のLPAATをコ� �ドする核酸又はLPAATタンパク質を用いて、脂 質生産菌の評価を行う方法があげられる。本 発明の上記評価方法としては、まず、本発明 の塩基配列に基づいて設計したプライマー又 はプローブを用いて、被検菌株である脂質産 生菌株の本発明の上記活性について評価する 方法があげられる。このような評価方法の一 般的手法は公知であり、例えば、国際特許出 願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号� �報などに記載されている。以下、この評価� �法について簡単に説明する。

 まず、被検菌株のゲノムを調製する。調� ��方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、� �かなる公知の方法をも用いることができる(� ��えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harb or Laboratory Press, p130 (1990)参照)。

 本発明の塩基配列、好ましくは、配列番� ��36又は37に基づいてプライマー又はプローブ を設計する。上記プライマー又はプローブは 本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いる ことができ、またその設計は公知の手法を用 いて行うことができる。プライマーとして用 いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10� ��基以上であり、15~25塩基であることが好ま� �い。また、挟み込む部分の塩基数は、通常� �300~2000塩基が適当である。

 上記で作製したプライマー又はプローブ� ��用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明� ��塩基配列と特異的な配列が存在するか否か� ��調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列� ��検出は、公知の手法を用いて行うことがで� ��る。例えば、本発明の塩基配列に特異的配� ��の一部または全部を含むポリヌクレオチド� ��たは上記塩基配列に対して相補的な塩基配� ��を含むポリヌクレオチドを一つのプライマ� ��として用い、もう一方のプライマーとして� ��の配列よりも上流あるいは下流の配列の一� ��または全部を含むポリヌクレオチド、又は� ��記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含� ��ポリヌクレオチドを用いて、例えば、PCR法� ��によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物� ��有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定� ��ることができる。

 本発明の方法に適するPCR法の反応条件は、� ��に限定されないが、例えば、以下の条件が� ��げられる。
変性温度:90~95℃
アニーリング温度:40~60℃
伸長温度:60~75℃、
サイクル数:10回以上
などの条件である。得られた反応生成物であ る増幅産物を、アガロースゲルなどを用いた 電気泳動法等により分離して、増幅産物の分 子量を測定することができる。これにより、 増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異 的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか 否かを確認することにより、被検菌株の本発 明の上記活性を予測又は評価することができ る。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方 法等で解析することによって、さらに本発明 の上記活性をより正確に予測又は評価するこ とができる。なお、本発明の上記活性の評価 方法は、上記のとおりである。

 また、本発明の上記評価方法としては、� ��検菌株を培養し、配列番号36又は37等の本発 明の塩基配列がコードするLPAATの発現量を測� ��することによって、被検菌株の本発明の上� ��活性を評価することもできる。なお、LPAAT� �発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し� �LPAATのmRNA又はタンパク質を定量することに� �り測定できる。mRNA又はタンパク質の定量は� ��公知の手法を用いて行うことができる。mRNA の定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼ ーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質 の定量は、例えば、ウエスタンブロッティン グによって行うことができる(Current Protocols  in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003 )。また、上記活性の評価方法として、本発� �のLPAATが産生する脂肪酸組成物の組成及び/� �はアラキドン酸含有率を測定する方法をあ� �ることもできる。脂肪酸組成物の組成及び/� ��はアラキドン酸含有率の測定方法は上記の� ��おりである。

 (2)選択方法
 本発明の他の態様として、本発明のLPAATを� �ードする核酸又はLPAATタンパク質を用いて、 脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。 本発明の上記選択方法としては、被検菌株を 培養し、配列番号36又は37等の本発明の塩基� �列がコードするLPAATの発現量を測定して、目 的とする発現量の菌株を選択することにより 、所望の活性を有する菌株を選択することが できる。また、基準となる菌株を設定し、こ の基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株 の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株 の発現量を比較して、所望の菌株を選択する こともできる。具体的には、例えば、基準菌 株および被検菌株を適当な条件で培養し、各 菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検 菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌 株を選択することにより、所望の活性を有す る菌株を選択することができる。所望の活性 には、上記のように、LPAATの発現量及び/又は LPAATが産生する脂肪酸組成物の組成及び/又は アラキドン酸含有率を測定する方法があげら れる。

 また、本発明の上記選択方法としては、� ��検菌株を培養して、本発明の上記活性が高� ��か若しくは低い菌株を選択することにより� ��所望の活性を有する被検菌株を選択するこ� ��もできる。所望の活性には、上記のように� ��LPAATの発現量及び/又はLPAATが産生する脂肪� �組成物の組成及び/又はアラキドン酸含有率� ��測定する方法があげられる。

 被検菌株または基準菌株としては、例え� ��、上記の本発明のベクターを導入した菌株� ��上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株� ��突然変異処理が施された菌株、自然変異し� ��菌株などを用いることができるがこれらに� ��定されない。なお、本発明のLPAAT活性及びLP AATの脂肪酸組成物を形成できる活性及び本発 明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性 は、例えば本明細書中の「本発明のリゾホス ファチジン酸アシル基転移酵素をコードする 核酸」、「本発明の脂肪酸組成物」の項目で 記載した方法によって測定することが可能で ある。突然変異処理としては、例えば、紫外 線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS(� �チルメタンスルホネート)、N-メチル-N-ニト� �ソグアニジンなどの薬剤処理による化学的� �法などがあげられる(例えば、大嶋泰治編著� ��生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、 p.67-75、学会出版センターなど参照)が、これ� ��に限定されない。

 なお、本発明の基準菌株、被検菌株とし� ��用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又� ��酵母等があげられるが、これらに限定され� ��い。具体的には、基準菌株、被検菌株は、� ��なる属や種に属するいかなる菌株を組み合� ��せて用いてもよく、被検菌株は1又はそれ以 上の菌株を同時に用いてもよい。

 以下、実施例により本発明をさらに具体� ��に説明する。但し、本発明は実施例に限定� ��れるものではない。