Positiv geladene Lipide (J.P.Behr, Biocoujugate Chem. 5, 382-389 (1994)) weiden in Form von Liposomen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substan¬ zen wie Peptiden, Proteinen, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA, RNA, Antisense-DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-, Pflanzen-, Insekten-Zellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende T ansfektionseigeuscliaften zeigen. Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukarioti¬ sche Zellen.

Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppel- strängig), RNA oder verwandte Stoflklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische Zellen einzufuhren, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Trausfektionsmethodeu. Zur Ein¬ führung von Nukleinsäuren in eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum Beispiel die CaPO -Präzipitationsmethode, die DEAE- Dextran-Methode, Methoden, welche die rezeptorvermittelte Endocytose nutzen, Elek- troporation, Mikroinjektion und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benut¬ zen, bekannt. Eine weitere Methode wird Lipofektion (P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 7413 (1987)) genannt. Diese nützt die Tatsache, daß syn¬ thetische kationische Lipide in Form von Liposomen oder als solche mit der negativ ge¬ ladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die Mengenverhältnisse von DNA und kat- ionischem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe eine positive Nettoladung tra¬ gen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man vermutet je- doch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der anioni- schen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zelliiuiere kommt, oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Trausportmecha-

ERSATZBL/YΪT (REGEL 26)

nismus der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt wird.

Liposomen sind kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit „BHayer- Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N.Y. Academy Sciences Meeting: „Liposomes and their use in Biology and Medicine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 10000 um), kleine unilamel- lare Vesikel (SUN, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30000 um) Eine Reihe von Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in ,.Liposome Technology" (Gregoriadis, CFC Press, Ν.Y. 1984) ,iu ,JLiposomes" (Ostro, Marcel Dekker, Ν.Y. 1987) oder in Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Metbods Bio- chem. Anal. 33, 337-462, 1988), Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng 7, 435-68, 1978), oder Szoka und Papahadjopoulos (Ami. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte Methoden sind beispielsweise die „reverse-phase evaporation"-Methode und die Extrusiousmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepresst wird.

Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide wer¬ den in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lö¬ sungsmittels unter einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefäßwand ein dünnei Lipidfilm erzeugt. Zugabe von Wasser oder wässriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird zuletzt mit Ultraschall behandelt.

Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, iu- tranasal, in Liquorräume oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammen¬ hang favorisierte Methode war bis vor einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode besitzt jedoch die Gefahr der Rückmuta¬ tion zu einem pathogenen Virus. Desweiteren wird die eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder eine Rückführung der Zellen in ihren ursprüngüchen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem besitzen virale Carriei Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA. Modifizierte DNA odei RNA wird durch Viren nicht übertragen. Außerdem können nur sich teüeude Zellen auf diesem Wege transfektiert werden.

ERSATZBLAπ (REGEL 26)

Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht un¬ terworfen. Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transferierte DNA oder RNA wird nur für eine bestimmte Zeit exprimieit, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird, sondern nur ins Cytoplasma transportiert und dort durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und reversibel ge¬ macht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und modifi¬ zierte DNA oder RNA kann mittels kationischer Lipide in Zellen eingeschleust werden Auch sich nicht teüende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch kat¬ ionische Lipide transfektiert werden. Während die in vivo- Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus Verfah¬ rensgründen nicht möglich erscheinen, besitzen die CaPO ₄ - und DEAE-Dextran-Metho- den vergüchen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz. Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwi¬ schen Spermin und DNA zur Transfektion ausnützt, in dem das bei einem physiologi- sehen pH- Wert positiv geladene Spermin mit einem hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft wird. Spermiu bildet besonders stabile Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung in dei Furche der DNA gebunden wird. Die ersten solchen Lipoφerminderivate wurden von Behr, J. P.et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; EP 03941 11 synthetisiert. Dabei verknüpften sie Car- boxyspermiu über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten Die Struktur des dabei erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:

DOGS ist als Transfectam™ (Promega) kommerziell erhältlich.

Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylpliosphatidylethanol- amiu-5-carboxyspermylamid (DPPES):

ERSATZBLÄTT (REGEL 26)

wobei R = CH ₃ (CH_), ₅ ist.

Ein weiteres Liposperminderivat wird von P.L.Felguer et al. in WO 91 16024 unter der Bezeichnung L-Speιτnin-5-carboxyl-3-(DL-l,2-dioleoyldimethylaminopiOpy l-ß- hydroxyethyl-amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Speιτnin- 5-carboxyl-3-(DL- l,2-dipahrütoyl-dimethylamύιopiOpyl-ß-hydiOxyethylamin):

Gebeyehu, G. et al. beschreiben üi WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5-Carboxysper- myl)amiuoethyl] N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) l-propanammonium tetra(trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamiu™ (Gibco-BRL:Life Techno¬ logies Inc.) erhältlich ist.

x 4 TFA

Trotz großer Fortschritte auf diesem Gebiet, verbleibt eiu Bedarf an einer größeren Auswahl an kationischen Lipiden. Bis heute wurde kein kationisches Lipid gefunden, daß mit allen Zelltypeu befriedigende Ergebnisse liefert. Da verschiedene Zelltypen sich

in üuer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht verwunderlich, daß ver¬ schiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige Lipidtypen für eine effek¬ tive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.

Von besonderer Bedeutung ist die Metabolisierbarkeit und Toxizität der Lipide und ih- rer Abbauprodukte. Diese sind die bestimmenden Faktoren für die Verträglichkeit der Lipide für die Zellen. Die Metabolisierbarkeit wird hauptsächlich durch die in den Lipi¬ den enthaltenen chemischen Verknüpfungen bestimmt.

Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beach¬ tende Punkte für das Design solcher Lipide sollte ihre Toxizität gegenüber den zu trans¬ ferierenden Zielzellen, desweitereu ihre Stabilität, Metabolisierbarkeit, die Möglichkeit einer in vivo- Anwendung und einfache Synthesewege sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel 1:

die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-,L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, c, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1,2,3,4,5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist und e nur daim 0 ist, wenn f 0 ist, Ri ein Rest der allgemeinen Formel II ist:

⁽ II ⁾

in welcher g 0,1,2,3,4,5 oder 6 ist, h 0,1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wemi h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH-, alle Positionen der Steroid-Substitueuten α- oder ß- konfiguriert sein können, die C-Atome 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, mit der Maßgabe, daß die C- Atome 5 und 8 neben Einfachbindungen jeweils über höchstens eine Doppelbindung mit benachbarten Atomen verknüpft sind, R ₂ und R ₃ unabhängig vonemauder Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweig¬ ter Alkenyl- oder ein substituierter oder uusubstituierter Aryl- oder Aralkylrest sind, R_ _ι H oder Methyl ist, oder Ri ein Rest der allgemeinen Formel III ist:

wobei alle chirale Zentren in D-, L- oder als Racemat vorliegen, m 0, 1,2 oder 3 ist, k 0,1,2,3,4,5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, u, p und q unabhängig voneinander 0,1,2,3,4,5 oder 6 sind, R ₂ wie vorstehend definiert ist, X], X ₂ , und X ₃ unabhängig voneinander o o

-^-^- oder -0-C-NH- sind,

R ₅ und R_ unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenyl- reste mit 5-30 Kohleustoffatomeu sind.

Die erfindungsgemaßen Lipide enthalten also Polyamuie als DNA-affine Kopfgiuppen, die gegebenenfalls ubei emen Spacer an Lipidstruktuieu gebunden smd Die Kopfgruppe wird dabei ubei biologisch abbaubaie Verbindungen an das Restmolekul gebunden, wel¬ ches wiederum aus biologisch abbaubaren Verbindungen aufgebaut ist Eine Vielzahl dei erfindungsgemaßen Lipide laßt sich aus mcht oder nur wenig toxischen Verbindung ein¬ fach duich Aufbau über Amid- und Urethanverknupfungen beistellen Damit eπ eicht man eine Kombination von guter Metabolisierbarkeit, medrigei beziehungsweise gai keiner Toxizität und hoher Stabilität, sowie einen Zugang zu einfach durchführbaren Synthesewegen

Der besondeie Wert der erfindungsgemaßen Lipide hegt in duei Stabilität in Losung, bei gleichzeitiger Metabolisierbarkeit durch die Zelle, da die Lipide zu emera wesentlichen Auteil aus Amidverknupfüngen aufgebaut sind

Von ganz besondei ein Inteiesse sind Lipopolyamine dei Foπnel I, worin a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 sind.

Von ganz besonderem Inteiesse smd außerdem Verbindungen dei Formel I, wobei a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 sind, R _. die Formel II aufweist, wobei die Reste und Indizes wie vorstehend definiert sind und direkt oder über einen Spacei, wie zum Beispiel Ami¬ nosäuren, verknüpft sem können Dies entspncht Verbindungen dei Foπnel II, wobei h = 0 odei 1, g (falls h = 1 ist) 1,2,3,4,5 oder 6, R ₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, l-( l-Methyl-) piopyl odei Benzyl und

odei oder

Weiterhin von besonderem Interesse sind Verbindungen der Foπnel I, wobei a, d, e = 3 b, f = 1 und c = 0 ist und die allgemeine Foπnel IV, V oder VI aufweist:

oder

oder

Von ganz besonderem Interesse sind dabei solche Verbindungen, in denen das Grundge- rüst der Lipidkomponente, welche die Formel IV, V oder VI aufweist, aus natüihch vorkommenden Aminosäuren besteht, wie zum Beispiel Omitlün, Glutaminsäure oder Asparagiusäure, an die zwei von natüihch vorkommenden Fettsäuren, zum Beispiel Öl- säure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Myristoylsäure etc., abgeleitete Alkylketten über Peptidbiudungen verknüpft sind. Die Lipidkomponente kann wiederum direkt oder über einen Spacer an den Polyamin-Rest, welcher der Formel 1 entspricht, wobei a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 ist, gebunden sein.

Dies bedeutet in Formel IV, daß n = 0, m = 0 oder 1, für in = 1 und k = 1 der Spacer ebenfalls aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure aufgebaut ist, so daß R ₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, l-( l-Methyl-) propyl oder Beuzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5, oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalauin, Amino- capronsäure usw. darstellen kann, q - 3, und p - 0, R ₅ = - CH ₂ ) _\ ιC ^ und R„ - - (CH_) ₇ CH=CH(CH ₂ ) ₇ CH ₃ sein kann.

Dies bedeutet in Formel V, daß u = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6, der Spacer somit aus einer Diaminokomponente, wie Ethylendiamin, Propylendiainin. Butylendi- amin, Diaminopentan, Diaminohexan, besteht, R ₅ und R_ = (CH_) ₇ CH=CH(CH_) ₇ CH ₃ sein kann.

Dies bedeutet für Formel VI, daß n =0, = 0 oder 1, q = 0, p = 0, 1 oder 2, k = I (falls m =1) R ₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, l-( l-Methyl-) propyl oder Beuzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5 oder 6 der Spacer die Verbindungen Horaoalamn, Arainocapronsäure usw. darstellen kann, R ₅ und R_ = -(CH ₂ )ι ₇ CH ist.

Nachstehend werden allgemeine Synthesewege der folgenden ganz besonders interessan¬ ten Verbindungen erläutert.

Zunächst zwei Verbindungen, die durch die Formeln I und II gekennzeichnet sind. Als Ausgangsverbindung dient in beiden Fällen 5-Cholesten-3-arnin, wobei durch allge¬ mein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden einerseits über die Spacer-Gruppe Glycin, andererseits direkt der Sperminrest an die Amiuofunktion der Ausgangsverbmdung ge¬ bunden wird. Als Endprodukte erhält man N-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amiuo- 1- oxopeutyl] cholesteryl-3-amid und N-(2,5-Bis (3-amiuopropyl) amino]- l-oxopentylgly- cylcholesteryl-3-amid.

- Tstrα-Boc-ACP / DCCI 2) TFA

0 Tatrα-Boc-ACP / DCCI 2) TFA

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem bi- teresse, die aus Kombinationen folgender Steroid-Grundgerüste und Spacer bestehen: a) Steroidgrundgerüste: Cholesterin-3-amin, Lanosterin-3-amin, Campesterin-3- amin, Stigmast-5-en-3-amin, Stigmasta-5,22-dien-3-at__tn. b) Spacer: Glycin, Alanin, ß-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure,

6-Aminocaprousäure, 7-Amiuoheptansäure.

Das nächste Beispiel beschreibt die Synthese e es Lipopolyamins, welche durch die Formeln 1 und VI gekennzeichnet ist:

Als Edukt wild Asparaginsäure eingesetzt, welche über allgemein bekannte Paptidver- knüpfüngsmethoden an den Carboxyfünktionen, in diesem Falle jeweüs mit Stearylamin und nach der Entschützung der Aminofünktion direkt an 2,5-Bis (3-ammopropyl) amino-1-carboxypenty.-Rest gebunden wird. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis (3- aminopropyl) amino-1-oxopentylasparagyldistearylamid

CHafCHjJpNHa DCCI

TFA

1) Teirα-Boc-ACP / DCCI

2) TFA

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem In¬ teresse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgeruste, Spacei und Ami- nen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsauren ableitet, bestehen a) Aminosäuregrundgerüste. Asparaginsäure, Glutaminsäure, α-Aminomalonsauie b) Spacer: Glycin, Alanin, ß- Alanin, 4-A__ιinobuttersaure, 5-Amιnopeutansauιe,

6-Aminocapronsauιe, 7-Aminoheptansaure c) Fettsäuren Olsaure, Palmitinsaure, Myristiusäuie, Stearinsäure, Lauπnsauie,

Palmitoleinsäure, Liuoleusäuie, Liuolsauie, Aiachidousauie, Aia- chinsäure, Liguoceriusauie.

Im nächsten Beispiel wird die Synthese einer weiteren Verbindung vorgestellt, welche durch die Formel I und V gekeimzeichnet ist. Hierbei wnd als Grundgerust die an dei Carboxyfunktion als tert-Butylester geschützte α- Aminosäure Ornithin eingesetzt Eben- falls durch allgemem bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird jene Veibinduug in diesem Falle mit Olsäure und nach dei Entschützung dei Caiboxyfunktiou ubei den Spacer Ethyleudiamiu an 2,5-Bis (3-auünopropyl) amiuo- 1-carboxypentyl-Rest gebun¬ den Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis (3-amiuopropyl) amiuo- l-oxopentyl]-N'- [(N-α-,N-δ-dioleoyl)oraithyl]ethylen-diamin

ÖLsöurβ / DCCI

1) TFA

2) N-Boc-EthyLβndl min / DCCI

1) TFA

2) Tθtrα-Boc-ACP / DCCI

3) TFA

Desweitereu sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem In¬ teresse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Gruudgerüste, Spacei und den aufgehsteten Fettsäuren bestehen: a) Aininosäuregrundgerüste: Lysin, Ornithiu. b) Spacer: Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiatnin, Pentamethylendiarain,

Hexamethylendiamiu c) Fettsäuren- Olsäure, Palmitiusaure, Myristiusäuie, Steaiinsaure, Laurinsauie,

Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäuie, Arachidonsaure, Ara- chinsäure, Lignocerinsäure.

Im nächsten Beispiel, welches die Synthese einer Verbindung, charakterisiert durch die Formel I und IV, beschreibt, wird als Grundkörper wiederum die α-Arninosäui e Or- nithin verwendet, wobei die α-Aminofünktion durch die basenlabile Fluorenylmethoxy- carbonyl-Gruppe und die δ-Aminofünktion durch die bekannt erweise säurelabile tert- Butoxycarbonyl-Gruppe geschützt sind Durch allgemein bekannte Peptidveiknüp- füngsmethoden wird zωiächst die α-Carboxyfünktion mit Steaiylamin, dann nach Ent¬ schützung der δ-Ajninofünktiou jene mit Olsäure und im darauffolgenden Schritt die α- Aminogruppe nach deren Entschützung direkt mit der Polyaminkomponente gekenn¬ zeichnet durch den 2,5-Bis (3-aminopropyl) aπώιo-1-carboxypentyl-Rest gekuppelt Als Endprodukt erhält man N-α-[2,5-Bis (3-amiuopropyl) amino- l-oxopentyl]-N-δ-oleoyl- omithylstearylamid

1) StβσryLαmln / DCCI

2) TFA

31 ÜLaöurβ / DCCI

1) Tθtrα-Boc-ACP / DCCI

2) TFA

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem In¬ teresse, die aus Kombinationen folgender A-tninosäure-Grundgerüste, Spacer, Ammen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgehsteten Fettsäuren ableitet, und den Fett- säuren als solche bestehen: a) Aminosäuregi'undgerüste: Ornithin, Lysin b) Spacer: Glycin, Alanin, ß-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure, ό-Aminocaprousäure, 7-Aminoheptansäure. c) Fettsäuren: Olsäure, Palmitinsäure, Myristinsäuie, Stearinsäure, Laurinsäure. Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäαre, Ara- chinsäure, Lignocerinsäure.

Als letztes Beispiel wird die Synthese einer Lipopolyamin- Verbindung ausgeführt, wel- ehe in der Formel I und III enthalten ist. Als Grundgerüst dient hier die an beiden Arcάnofunktionen durch die allgemein angewendete Beuzyloxycarbonylgruppe ge¬ schützte α-Aminosäure Ornithin. Zunächst wird über Curtius-Abbau die Carboxyfunk- tion in die piimäre Aminfünktion übergeführt, welche mit an den Amüiofünktionen des pergeschützteu 2,5-Bis (3-amiuopropyl) arnino-1-carboxypentyl-Restes über allgemem bekannte Peptid-verknüpfüngsmethoden gekuppelt wird. Nach Entschützung der Ajiiinofunktionen werden jene nach gleicher Methodik jeweils mit Olsäure verknüpft. Als Endprodukt erhält man l,4-Dioleoylamido-l-[2,5-Bis (3-amiuopropyl) amino-1- oxopentyl] amidobutan

1) S0CL ₂ / Base

2) Nα ₃ / PTC

3) H ₂ 0

4) Tθtrα-Boc-ACP / DCCI

11 5%P /C + rt _j 21 ÜLaäure / DCCI 3) TFA

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem In¬ teresse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und den aufgelisteten Fettsäuren bestehen: a) Aminosäuregrundgerüste: Lysiu, Oniithin. b) Spacer: Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin, Pentamethylendiamin,

Hexamethylendiamin. c) Fettsäuren: Olsäure, Palmitinsäure, Myiistinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure

Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Ara- chinsäure, Lignocerinsäure.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wässriger oder wässriger Puffer- oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposo- men mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleoylphospatidylcholin (DOPC) formuliert werden.

Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemaßen Lipide zu steigern, beisteht die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymati- sehe Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosornatropisch wirkende Proteine.

Die erfindungsgem ßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und ver- wandten Stoffklassen stabile Aggregate bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle fülut. Dabei sind in vitro als auch in vivo Anwendungen möglich. Analoges gilt für Liposomenfor- mulierungen der erfindungsgemäßen Lipide. Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432 (1987)), in denen Polykationeu, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum Beispiel Polylysin etc.) au sogenannte Intenialisierungsfaktoreu (zum Bei¬ spiel bestimmte Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächeurezepto-

ren bestimmter Zellen binden, besitzen die erfindungsgemäßen Lipide, bzw. deren Lipo- somenformuüerungen keine Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfin¬ dungsgemäßen Lipide bzw. derer Liposomenformuherungen kann dadurch erreicht wer¬ den, daß die Ladungen von Lipiden und den zu transportierenden Biomolekülen ausge- güchen werden und zusätzlich an das Aggregat zwischen Biomolekül und Lipiden lnte - nalisierungsfaktoreu augebracht werden. Dies kann zum Beispiel durch Liposoinenfor- mulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als Kopfgruppe solche luter- nalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf Ladiuigsneutralität ab¬ gestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und luternahsierung-faktoren. Soge- nannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Maimose, Mannose-6- phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Trauscobalamin, α-2-MakiOglobulin, Biotin, Folat, mannosyüerte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden. Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt werden.

Die erfindungsgemaßen Verbindungen können zu The apiezwecken eingesetzt weiden. Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cysti- scher Fibröse, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propiouazi- dämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinämie, Hämophilie, ß-Thalassämie genutzt werden. Geutherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wemi Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxiue oder immu- nomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen ge¬ bracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die ge- wünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die In¬ hibition von DNA-Bereichen ( zum Beispiel Antisense-DNA / RNA), die die Erkran¬ kung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können tumorunter- drückende Gene in der Krebs- Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene eine Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutge- fäßkrankheiteu geleistet werden. Weiters können DNA, welche Ribozyrae kodiert, oder Ribozyme selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme, die an spezifischen Stelleu m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kami zum Beispiel virale m-

ERSATZBLÄΓT (REGEL 26)

RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre rn-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehruugszyklus von Viren (HTV, Herpes, Hepatitis) ka i auf diesem Wege unterbrochen werden.

Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvak2inen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die erfindimgsgernäßen Verbindungen.

Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogeue Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid / DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expres¬ sion des immmiogenen Peptids und löst somit die Immunantwort aus. Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche als Komponente die erfindungsgemäßen Lipopolyamine enthalten, ein geschlos¬ sen oder an deren Oberfläche adsorbiert werden. Bringt man derartige Aggiegate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine, Tumore Ne- krose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren, Gewebeplasminogen- aktivator, Faktor-VIII:c, Granulocyten-Makrophageu-Kolouie-stimulierendei Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitoniu, Thymidinkinase und andere. Auch toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch gewiimbringend eingesetzt werden. Die Lipide werden aufgrund üirer positiven Ladung vorwiegend dazu eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in Zellen einzu¬ schleusen. Durch sogenannte „seif ¹ assembling Systems" können jedoch auch positiv ge¬ ladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfin¬ dungsgemaßen Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert wer¬ den, in dem die gegensätzlich geladeneu Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die

resultierenden positiv geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenom¬ men.

Weitere Anwendungsmögüchkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992) zu eutueh- men, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.

Beispiele der für derzeit als für therapeutisch aussichtsreich augesehene Sequenzen für genetisches Material sind in der Übersicht von F.W.Anderson, Science 256, 808 ( 1992) entnehmbar, die ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.

Beispiele:

Bezugsquellen:

1. Plasmide pCHHO (enthält ß-Gal als Repoitergen) und pMSGCAT: Pharmacia Fine

Chemicals,Uppsala, Schweden

L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- l-oxopeutan (tetra- BOC-ACP) wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 86, PP- 6982- 6986, (1998) synthetisiert.

5-Cholesten-3-amin wurde nach H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 ( 1992) synthetisiert.

Beispiel 1:

Synthese von N-[2.5-Bis (3-aminopropyl) amiuo- 1-oxopentyl] cholesteryl-3-amid Zu einer Lösung von 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aιninopropyl) amiuo]-tetra-tert- butyloxy-carboxy-1-oxopentan und 385 mg ( 1 mmol) 5-Cholesten-3-amin in 10 ml THF (Tetrahydrofüran) oder DMF (N,N-Dimethylfoπnamid) werden 206 mg ( lramol) Di- cyclohexylcarbocbimid (DCCI) gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren des Reaktionsgemisches durchgefühlt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem Dicyclohexylharastoff (DCH) abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eüies Trifluoressigsäure (TFA)/CH ₂ CH ₂ -Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges

TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kami durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergefühlt werden.

Beispiel 2: Synthese von N-.2.5-Bis (3-aminopropyl) amino]-l-oxopentylglycylcholesteιyl-3-amid. Zu einer Lösung von 175 mg ( 1 mmol) N-Boc-Glyciu und 385 mg ( 1 mmol) 5-Choles- ten-3-amin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg ( 1 mmol) DCCI gegeben und bei RT 12 h gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH ₂ CH ₂ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren des Gemisches wnd überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin überge¬ führt. Danach wird zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyri amino]- tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt und bei RT für 12 h gerührt. Danach wird das ausgefallene DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH_CH> - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriuinhydiogeucai- bonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 3: Synthese von N-[2.5-Bis (3-amiuopropyl) amiuo- 1-oxopentylasparagyldisteaιylamid

Zu einer Lösung von 233 mg (1 mmol) N-Boc-Asparaginsäure und 540 mg ( 2 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT und Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH_CH_ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wnd überschüssiges TFA/CH ₂ CH_ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wässrige Na-

triumhydrogeucarbonatlösung in das freie Arnin übergefülut. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amhιo]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- 1 - oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( I mmol) DCCI versetzt. Die Reaktion wird wiederum bei RT und unter Rühren ausge- führt und nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml emes TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencar- bouatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 4:

Synthese von N-[2.5-Bis O-aminopropyl) aι uo- l-oxopentv-]-N ^, -[.N-c.- .N-δ-dioleoyl,- oπüthyl] ethylendiamin

Zu emer Lösung von 455 mg (1 mmol) Ornithin-OtBu und 566 mg (2 mmol) Olsäure in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT 12 h lang gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lö¬ sungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchiomatographie ge- reinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine 95 %ige wässrige Lösung von TFA gegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/H ₂ O abgezogen. Danach wird zusammen mit 160 mg (1 mmol) N-Boc-Ethylendiamin in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Das Reakti- onsgemisch wird bei RT gerühit und nach emer Reaktionszeit von 12 h von ausgefalle¬ nem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wύd durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindimg werden bei RT 10 ml eines TFA/CH ₂ CH ₂ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/CH ₂ CH ₂ abge- zogen. Das erhaltene TFA-Salz wird durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbo- natlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amiuo]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- l -oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt

ERSATZBLÄΠ ^" (REGEL 26)

Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmit¬ tel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH ₂ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wüd überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencar- bouatlösung in das freie Amin übergeführt werden.

Beispiel 5:

Synthese von N-α-[2.5-Bis (3-aminopropyl. amino-l-oxopentyl]-N-δ-oleoylomithylste- arylamid

Zu einer Lösung von 455 mg ( 1 mmol) N-α-Fmoc-N-δ-Boc- Ornithin und 270 mg ( 1 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg ( 1 mmol) DCCI gegeben. Der bei RT und unter Rühren durchgeführte Reaktionsansatz wird nach einer Reakti¬ onszeit von 12 h vom ausgefallenem DCH filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH_C1 ₂ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH ₂ C1 ₂ abgezogen. Danach wird zusammen mit 283 mg ( 1 mmol) Olsäure in 10 ml THF oder DMF aufge¬ nommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das er¬ haltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine Lösung von 10 % Diethyl- amin in DMF zugegeben. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchro- matographie wird das erhaltene Produkt zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3- aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- l -oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhalteneu gereiuigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH CH ₂ - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencar¬ bonatlösung in das freie Amin übergeführt weiden.

Beispiel 6

Synthese voιιl.4-Dioleoylamido-l- 2.5-Bis .3-aminopropyl) arnino- I-oxopentyll amido- butan Zu einer Losung von 400 mg (1 mmol) N- -N-δ-di-CBz-Ornithin in 20 ml CH ₂ C1 ₂ werden 140 μl NEt _. und 119 mg SOCl ₂ tropfenweise zugegeben, wobei das Reaktions¬ gemisch 0°C nicht übersteigen sollte. Nach Erwärmen des Gemisches auf RT weiden 0.33-0 65 g NaN ₃ (5-10 facher Überschuß) zusammen mit Tetra-n-Butylammoniumliy- drogensulfat ( 10 mol% bezüglich Edukt) zugegeben Nach ca 6 h uutei Ruckfluß wud mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencaibouatlosuug und Wasser mehrmals gewa- sehen Das erhaltene Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie gereinigt

Das erhaltene Produkt wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aιninopro- pyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-l -oxopentan in 10 ml THF odei DMF aufge¬ nommen und die Lösung mit 206 mg (X mmol) DCCI versetzt Nach 12 h Ruinen bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen Das ei- haltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt

Nach Abspaltung der Cbz-Gruppeu durch Hydiogenolyse bei RT und Ruinen mit 5 % Pd auf Aktivkohle in Methanol wird das Lösungsmittel abgezogen, danach wnd dei Rückstand zusammen mit 565 mg (2 mmol) Olsäure in 10 ml THF oder DMF aufge¬ nommen und die Lösung mit 412 mg (2 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Ruhren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen Das ei - haltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt

Zu der erhaltenen gereinigten Veibindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH ₂ CH ₂ - Gemisches zugegeben Nach 2 h Rühren wüd überschüssiges TFA/CH ₂ CH ₂ abgezogen Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydiogencai- bonatlösung in das freie Amin übergeführt werden

Beispiel 7

Lip osomenformulierung Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Choiesterol und Cho- lesteryl-amin werden üi einem organischen Lösungsmittel gelost Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche oder in Form ihrei Salze, zum Beispiel Trifluoiacetat- Salze in emem organischen Lösungsmittel gelöst. Durch Kombination vei schiedenei Mengen der unterschiedlichen Losungen werden veischiedene Kompositionen aus e -

zelnen Lipiden aus den Beispielen 1-6 oder Lipidgemische aus Colipideu und Lipiden aus den Beispielen 1-6 hergestellt. In einem Glaskolben wüd mit Hilfe eines Rotations¬ verdampfers ein dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird ün Hochvakuum von Lösungs¬ mittelresten befreit. Der Film wird mit soviel Wasser oder wässriger Pufferlösung hy- dratisiert, daß die Konzentration 1mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wüd unter Kühlung mit Ultraschall behandelt. Die Liposomenformuherung wüd durch einem FUter (Porenweite 0.2 μm) sterilfitriert.

Beispiel 8:

Lipidlösungen Die Lipide aus den Beispieleil 1-6 werden als solche und in Form ihrer TFA- Salze zu einer Konzentration von 1-2.5 mg/ml üi Wasser, Ethanol und einem Gemisch aus Was¬ ser und Ethanol verschiedener Zusammensetzung gelöst.

Beispiel 9:

Zellkulturen Die Zelllinien COS-7, Heia und BHK-21 werden in „Dulbecco's-modified Eagle's me- dium" (DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2mM L-Glutamin (Gin), 0. 1 mM nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), lOOU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, in einem Inkubator (5% CO ₂ - Atmosphäre) kultiviert.

Beispiel 10:

Transfektion Die Zellen werden auf einer 96-well-Mikrotiterplatte ausplattiert und über Nacht zu an¬ nähernd 60 % Konfluenz iukubiert. Um die Zellen in einem „well" zu transfizi ren, wer¬ den 1-2 μg von pCHHO oder pMSGCAT in 100 μl Opti-MEM I gelöst. Das kationi¬ sche Lipid als ethanoüsche Lösung oder Liposomenformuherung wüd ebenfalls in 100 μl Opti-MEM I gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbeliälter ge- mischt, für 10-15 nun stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen. Danach wird auf 1 ml aufgefüllt indem 0.8 ml Opti-MEM 1 od r DMEM mit 5% FBS, 2 mM Gin, 0.5 mM NEAA ohne Antibiotika zugegeben werden.

Die Zellen werden einmal mit Opti-MEM I oder serumfreien DMEM gewaschen und der DNA/Lipid-Komplex wüd düekt zu den Zellen gegeben. Nach 6 h Inkubationszeit bei 37°C wüd der Transfektionskomplex entfernt und 2 ml DMEM mit 10% FBS, 2 mM Gin, 0.2 mM NEAA, 100 U/ml Penicilhn und 100 μg/nü Streptomycm zu jedem „well" hmzugegeben. Die Zellen werden weitere 48 h kultiviert und durch ein bis zweimahges Frieren und Tauen m 300 μl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), welches 0. 1 % Triton X-100 enthält, lysiert. Die Zelllysate werden auf ß-Galactosidase oder Chlorainphenicolacetyl- transferase getestet. Diese Tests werden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Testkits nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.