Besehreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Diagnostik von hochaffinen Bindern, insbesondere Antikörpern und/oder Autoantikörpern, und die Identifizierung,

Charakterisierung und Selektion von Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung, insbesondere in Form eines Panels. Die Erfindung betrifft auch einen Singleplex Assay bei dem eine gefundene Selektion von Markersequenzen in Form eines Panels eingesetzt wird und der Nachweis von hochaffinen

Bindern mit einem Single-Signal erfolgt. Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle

Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der

Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als

Screeninginstrumente etabliert.

Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von

Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere

Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine

Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J., Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A.,

Kreut zberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)

Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,

C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,

Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,

D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1:

experimental verification of the genome annotation and

resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol , 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungspro ekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund

differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-

Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G.

(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gut ähr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr . Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte

Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten

Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische

Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht. Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA-

Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus

Expressionsbibliotheken konnten darüber hinaus im

Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human

proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654- 2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening.

Analytical Biochemistry, 270, 103-111). Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind

insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.

Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264).

Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis die Diagnostik von hochaffinen Bindern, insbesondere Antikörpern, Autoantikörpern und MarkerSequenzen zu verbessern.

Proteinbiochips der Anmelderin sind bereits beschrieben und erlauben die Diagnose von Krankheiten, insbesondere

Autoimmunerkrankungen, anhand der Identifizierung von

MarkerSequenzen . WO2010/000874 der Anmelderin beschreibt z.B. die Diagnose von Prostatakarzinom und Prostataentzündungen mittels eines

Proteinbiochip und stellt bestimmte diagnostische

MarkerSequenzen zur Verfügung.

Hierbei konnten erstmals mittels Proteinbiochips diese

MarkerSequenzen für die jeweiligen Indikationen sensitiv identifiziert werden.

Proteinbiochips erlauben die vorteilhafte Zuweisung einzelner hochdichter Loci (Spots) zu den jeweiligen Markersequenzen und Signalen . Beispielsweise kann ein Proteinbiochip mit einem hochaffinen Binder aus einer Probe versetzt werden und die Wechselwirkung zwischen einem hochaffinen Binder und einer Markersequenz in einer Gesamtheit verschiedener Markersequenzen nachgewiesen werden. Dies ist ebenfalls mit einem Array möglich, wobei auf einzelnen Spots (Loci) Markersequenzen angeordnet sind.

Auf diese Weise können ebenfalls diagnostische Fragestellungen bearbeitet werden, je nach Auswahl der Markersequenzen und der eingesetzten hochaffinen Binder. Insbesondere sind

Diagnoseverfahren von Interesse, wobei ein Proband oder

Patient eine Probe enthaltend hochaffine Binder bereitstellt und die Probe auf einen Array mit ausgewählten Markersequenzen zur Diagnose einer Fragestellung oder eines Ereignisses (z.B. Zustand, Krankheit, etc.) gegeben wird. Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis solche Verfahren zu vereinfachen und zu minimalisieren, insbesondere zu

miniaturisieren .

Zumeist können eine Mehrzahl von Markersequenzen für eine bestimmte diagnostische Fragestellung herangezogen werden, und so genannte „Markerpanel" dienen zur besseren Bewältigung diagnostischer Fragestellungen oder Ereignisse. Beispielsweise werden im Stand der Technik literaturbekannte Markersequenzen miteinander kombiniert, so dass eine erhöhte Aussagekraft erzielt werden kann. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die

Bereitstellung von verbesserten Diagnoseverfahren und deren diagnostische Verwendung, so dass geeignete Panel von

Markersequenzen bereitgestellt werden können. Eine weitere Aufgabe betrifft die Identifizierung und/oder Charakterisierung und/oder Selektion von Markersequenzen, so dass geeignete Panel von Markersequenzen bereitgestellt werden können . Die Aufgabe wird gelöst durch Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung und/oder Selektion von

Markersequenzen mit den folgenden Schritten: a. ) n platzierte Markersequenzen werden auf einem festen

Träger mit einer Probe enthaltend hochaffine Binder versetzt und eine Wechselwirkung wird mittels Signalen nachgewiesen, b. ) mindestens n-1 platzierte Markersequenzen mit

hinreichender Signalintensität aus a.) werden auf einem Träger mit einer gleichen Probe enthaltend hochaffine Binder versetzt und eine Wechselwirkung wird mittels Signalen nachgewiesen, c. ) optional wird Schritt b.) mit mindestens n-k

Markersequenzen wiederholt, wobei k > 1 gilt, d. ) n-k ausgewählte Markersequenzen werden auf einem Träger gemeinsam auf einem Locus aufgebracht und mit einer gleichen Probe versetzt und eine Wechselwirkung wird mittels einem Single-Signal nachgewiesen. Das vorstehende Verfahren wird nachstehend „erfindungsgemäßes Verfahren" genannt.

Die Anzahl von Markersequenzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, wird mit „n" bezeichnet.

Theoretisch können beliebig viele Markersequenzen eingesetzt werden. Die Anzahl ist nur durch die praktische Realisierbarkeit (z.B. Dimension des festen Trägers, verwendete cDNA Bank) begrenzt. Beispielsweise können 50.000 oder 100.000 oder mehr Markersequenzen in Schritt a.) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Verwendung von 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000 oder weniger Markersequenzen in Schritt a.) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bei gegebenem n von 5.000 ist k bevorzugt ein Wert von 1 bis 1.000, insbesondere 10 bis 500. Beispielsweise kann eine

Signifikanz von 90, 95 oder 99 oder 99,9 % der

Signalintensitäten eingestellt werden, so dass hinreichend solche Markersequenzen in Schritt b.) berücksichtigt und selektiert werden. Schritt c.) kann ebenfalls mehrfach

wiederholt werden. n ist eine repräsentative Gesamtheit von Markersequenzen auf einem festen Träger. Nachfolgend wird Schritt b.) des

erfindungsgemäßen Verfahrens und gegebenenfalls dessen

Wiederholung gemäß Schritt c.) durchgeführt, wodurch

Markersequenzen mit hinreichender Signalintensität und

hinreichender Wechselwirkung mit den hochaffinen Bindern selektiert werden. Dabei bleiben in den weiteren

Verfahrensschritten, die Marker unberücksichtigt, die keine hinreichende Signalintensität und keine hinreichende

Wechselwirkung mit den hochaffinen Bindern aufweisen. Für die Verfahrensschritte b.) und c.) werden deshalb nur n-1 bzw. n-k Markersequenzen eingesetzt, wobei k > 1 ist und wobei

vorzugsweise k < n ist. Auf diese Weise können in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung könnnen

beispielsweise „z" spezifische Markersequenzen aus einem einzigen Verfahren erhalten werden, wobei n-k = z. IN einer anderen besonderen Ausführungsform des Verfahrens können die spezifischen Markersequenzen ,,z" durch mehrere unabhängig voneinander durchgeführte Verfahren erhalten werden.

Im Ergebnis wird mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Panel von spezifischen Markersequenzen mit hinreichender

Sensitivität erhalten.

Besonders vorteilhaft können Panel von Markersequenzen

erhalten werden, die erfindungsgemäß besonders bevorzugt auf einem Locus oder Spot auf einem Array aufgetragen werden, so dass dieses Panel von Markersequenzen ein Single-Signal emittieren kann.

Überraschender Weise können auf diese Weise besonders

effektive Panel von Markersequenzen erhalten werden, die ein Single-Signal mit signifikanter Signalintensität

gewährleisten. Dies ist besonders vorteilhaft, falls

verschiedene Signale mit unterschiedlichen Signalintensitäten auf einen Array vorliegen. Anderseits erlaubt „ein Locus-ein Signal" (Single-Signal) für ein Panel von Markersequenzen eine hinreichende Miniaturisierung und Vereinfachung der

Diagnostik, so dass nicht z Signalintensitäten von z

Markersequenzen ermittelt werden müssen, sondern lediglich eine Signalintensität des einzellokalisierten Panel von z Markersequenzen. Dies ist ebenfalls vorteilhaft für das

Signal-Rausch-Verhältnis im Rahmen der Auswertung,

insbesondere mittels algorithmischen Methoden. Ein Single-Signal kann beispielsweise der Mittelwert oder der Median der gemessenen oder berechneten Signalintensitäten der einzelnen Markersequenzen in dem Panel sein.

Die Bereitstellung von solchen Paneln mit Markersequenzen erlaubt zudem eine sichere Diagnose eines Ereignisses eines Probanden (z.B. Zustand, Krankheit) und / oder Stratifizierung von Patienten mit einer Erkrankung.

„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung einer Wechselwirkung zwischen Markersequenzen und hochaffinen Bindern, insbesondere Antikörpern,

Autoantikörpern . Ferner kann aufgrund dieser Wechselwirkung auf ein Ereignis geschlossen werden. Bevorzugt ist das

Ereignis die Aussage über eine Krankheit oder einen Zustand eines Probanden oder Patienten. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und diesbezügliche

Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und

Labordiagnostik .

„Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des

Patienten erlaubt, sei es die Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die

Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten. Insbesondere umfasst ist ebenfalls die personalisierte Medizin.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die

Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses.

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden. Der Begriff „Markersequenzen" im Sinne dieser Erfindung umfasst solche Moleküle, die mittels hochaffiner Binder erkannt werden können. Insbesondere sind daher nicht

abschließend solche Sequenzen wie mRNA, si-RNA, microRNA, cDNA, Peptid oder Protein, insbesondere Antigene oder

Autoantigene, umfasst. Die Markersequenzen können aus einer Expressionsbibliothek stammen, insbesondere eine mRNA, si-RNA, microRNA, cDNA, Peptid oder Protein-Expressionsbibliothek umfassen. Weiterhin können die Markersequenzen aus jedem biologischem Material gewonnen werden, solche wie nicht abschließend Gewebe, native Quellen, Zellen, Bakterien, Viren, Phagen, Prionen, Pflanzen, Tiere, Menschen, etc. Vorzugsweise werden die Markersequenzen nach gängigen Verfahren gereinigt und ggfs. isoliert. Diese Markersequenzen binden signifikant mit einem hochaffinen Binder und weisen zu dem hochaffinen Binder eine signifikante Wechselwirkung auf. Beispielsweise können die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine

Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit einer Erkrankung aufweisen

(z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung).

Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung an mindestens einer Markersequenz oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich

definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green

Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50%

Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren

Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente

Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei

Raumtemperatur .

Im Rahmen dieser Erfindung ist ein hochaffiner Binder ein solcher, der spezifisch an eine „Markersequenz" bindet oder an eine solche „Markersequenz" adressiert ist, bevorzugt solche wie Antikörper oder Autoantikörper . Antikörper binden mit einer oder mehreren Antigen-Bindungsregionen an ein oder mehreren Epitopen der Markersequenz spezifisch nach dem

Schlüssel-Schloss Prinzip und bilden auf diese Weise eine signifikante Wechselwirkung im Sinne der Erfindung.

Im Sinne der Erfindung liegt beispielsweise eine spezifische Wechselwirkung vor, wenn die Dissoziationskonstante von hochaffinem Binder und Markersequenz im picomolaren oder nanomolaren Bereich liegt.

Solche hochaffinen Binder, insbesondere (Auto ) Antikörper sind erfindungsgemäß vorzugsweise Bestandteil einer Probe eines Patienten/Probanden, beispielsweise einer Probe der

Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten.

Die „MarkerSequenzen" verfügen in einer weiteren

Ausführungsform der Erfindung über ein Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz adressiert ist (z.B.

Antikörper, Nukleinsäure) . Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder Bindungsregion und/oder ein Aptamer.

Erfindungsgemäß umfassen die Markersequenzen auch

Modifikationen einer cDNA-Sequenz oder einer

Aminosäuresequenz, wie chemische Modifikationen, insbesondere Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,

Glykosilierung oder polyA-Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind ebenfalls Teilsequenzen oder Fragmente von bekannten Markersequenzen (z.B. SWISSProt, Datenbanken, etc . ) umfasst. Insbesondere solche Teilsequenzen, die eine Identität von 95%, 90 %, insbesondere 80% oder 70 % mit den bekannten Markersequenzen aufweisen . In einer weiteren Ausführungsform können die jeweiligen

Markersequenzen in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.

Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere

Biomarker. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche

MarkerSequenzen und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker. Weiterhin ist erfindungswesentlich, dass mindestens ein Spot oder Locus ein Panel von Markersequenzen aufweist,

beispielsweise 10 oder mehr, vorzugsweise 5, 6 oder 7, besonders bevorzugt, 2, 3 oder 4 Markersequenzen.

Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten

Markersequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Markersequenzen erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichte gespottete Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen.

Im Rahmen dieser Erfindung umfasst jedoch der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche

Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot, immunchromatographische

Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays ) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex- Nachweisverfahren . Ein Proteinbiochip im Sinne dieser

Erfindung ist die systematische Anordnung von Proteinen auf einem festen Träger.

Die Markersequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Ein oder mehrere Markersequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller

Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die

Markersequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.

Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur

Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) .

In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 ( supra ) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken

enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer

exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA

Markersequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der

Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan ; 60(5) : 523-33) .

Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die

gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden. Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.

Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.

Die Clone werden auf einem festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.

Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die

Markersequenzen als Clone vorliegen.

Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches

beispielsweise mindestens ein Affinitätsepitop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein, wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder

Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten.

In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein

Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.

Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der

erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und

Charakterisieren eines hochaffinen Binders für die jeweiligen Markersequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einem hochaffinen Binder in Kontakt gebracht wird und b.) eine Wechselwirkung mittels einem Signal nachgewiesen wird, wobei mindestens ein Locus (Spot) einen Panel von Markersequenzen aufweist, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

In einer bevorzugten Variante der Erfindung ist der hochaffine Binder mindestens ein Autoantikörper , welcher mindestens ein Panel von Markersequenzen erhältlich nach dem

erfindungsgemäßen Verfahren erkennt, wobei aufgrund des eingesetzten Autoantikörpers in der Probe des

erfindungsgemäßen Verfahrens n-k Markersequenzen in einem Panel bereitgestellt werden. Insbesondere werden vorzugsweise die Markersequenzen aus Patienten oder Probanden erhalten, die eine Krankheit aufweisen, die maßgeblich mit der Prominenz solcher Autoantikörper korrelieren. Z.B. sind Autoantikörper besonders prominent bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen und entsprechende Autoantigene können mittels dem

erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert, charakterisiert und selektiert werden und insbesondere in einem Panel von

Markersequenzen bereit gestellt werden.

Von daher können Probanden und Patienten vorteilhaft auf die entsprechende Erkrankung diagnostiziert oder stratifiziert werden. Weiterhin kann eine personalisierte Medizin erfolgen, indem ein patientenindividuelles Panel von Markersequenzen hergestellt wird, indem beispielsweise patienteneigenes Gewebe (biologisches Material) als Ausgangsmaterial verwendet wird.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Panel von n-k

Markersequenzen erhältlich nach dem erfindungsgemäßen

Verfahren auf einem festen Träger, wobei die n-k

Markersequenzen mit einem Single-Signal korrelieren und auf einem Locus präsentiert sind, und die Markersequenzen

spezifische Autoantigene sind, die spezifisch an die

komplementären Autoantikörper einer Probe enthaltend

Autoantikörper binden. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Diagnose oder Stratifizierung von Erkrankungen mittels einem Panel von Markersequenzen, wobei die Markersequenzen

beispielsweise Autoantigene sind, auf einem Locus (Spot) eines festen Trägers, wobei eine Probe enthaltend Autoantikörper in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung mittels einem Single- Signal nachgewiesen wird.

Ein Locus (Spot) ist vorzugsweise auf einem festen Träger angeordnet. Der Locus kann einem Well einer Mikrotiterplatte oder einem Gitterpunkt im Luminex Assay entsprechen. Der Locus ist das Testfeld, in dem sich das Panel aus Markersequenzen befindet und von seinen Dimensionen, seiner Topographie und dem verwendeten Material so ausgestaltet das die

Markersequenzen aufgebracht, mit dem hochaffinen Binder in Kontakt gebracht und ein Single-Signal erzeugt und gemessen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Singleplex Assay

umfassend ein Panel von 2 oder mehr verschiedenen

Markersequenzen mit hinreichender Sensitivität auf einem Locus oder Spot, wobei die verschiedenen Markersequenzen an einen oder mehrere hochaffine Binder binden können und dadurch ein Single-Signal zum Nachweis des oder der hochaffinen Binder (s) erhalten wird.

Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Singleplex Assay wobei 10 oder 50 oder 100 oder mehr, vorzugsweise 6, 7 oder 8, besonders bevorzugt 3, 4 oder 5 verschiedene

Markersequenzen kombiniert werden und dadurch das Panel verschiedener Markersequenzen bilden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Singleplex Assay wobei die verschiedenen Markersequenzen durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden. Vorzugsweise betrifft die Erfindung eine Ausführungsform bei der für den Singleplex Assay Markersequenzen ausgewählt werden aus

Antigenen, Teilen von Antigenen, Haptenen oder Proteinen.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines

Singleplex Assays zur Früherkennung und/oder Diagnose und/oder Stratifizierung einer Erkrankung.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Früherkennung und/oder Diagnose und/oder Stratifizierung von Erkrankungen enthaltend ein Panel von Markersequenzen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden auf einem Träger oder einen erfindungsgemäßen Singleplex Assay und weitere übliche Hilfsmittel (Nachweisreagenzien, etc.)- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Antigene, insbesondere Autoantigene als Markesequenzen eingesetzt. Eine besondere Ausführungsform betrifft die

Anwendung des Kits bei Autoimmunerkrankungen oder Verdacht auf Autoimmunerkrankungen (Früherkennung) .

Erkrankungen umfassen beliebige Erkrankungen des Menschen, vorzugsweise solche wie Krebs, Autoimmunerkrankungen,

insbesondere rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose u.a., vorzugsweise solche Erkrankungen, die charakteristische

Autoantikörper bzw. Muster von Autoantikörpern, vorzugsweise im Plasma oder Serum aufweisen. Nachdem der hochaffine Binder das Panel von Markersequenzen auf einem Locus (Spot) kontaktiert, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt.

Die Visualisierung erfindungsgemäßer Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie Antigen/Antikörper ) oder

entsprechende „Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges" bzw. „Mittel zum Nachweis einer Wechselwirkung mittels

Signalen" kann beispielsweise mittels Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen-Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel-Markierung in üblicher Weise

erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, kolloidale Gold ^¬ oder Latex-Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie

alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den entsprechenden kolorimetrischen, fluoreszenten oder

chemolumineszenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .

Weiterhin kann die Bestimmung von Signalen zum Nachweis einer Wechselwirkung mit Hilfe von radioaktiven oder

fluoreszenzmarkierten Antikörpern erfolgen, insbesondere mittels bioanalytischer Verfahren, wie Western blot (1D und 2D) , Immunhistochemie, Antikörperarrays , Luminex®, ELISA, Immunfluoreszenz, Radioimmunoassays . massenspektrometrische Verfahren, wie MRM (Multi reaction monitoring) oder AQUA

(absolute Quantification) .

Figuren 1 bis 4 zeigen die Mittelwert MFIs von Multiplex Assay (mehrere Markersequenzen liefern mehrere einzelne Signale) und Singleplex Assays im Vergleich, wobei 10 verschiedene Antigene (Proteine 1 bis 10) und die Seren RA00029 (Figur 1), RA0037 (Figur 2), RA00046 (Figur 3) und PR0244 (Figur 4) verwendet wurden. Es wurden die Einzelwerte für Proteine 1 bis 10 im Multiplex Assay gemessen und daraus die Mittelwerte für den Multiplex Assay berechnet und mit dem gemessenen Wert (Single- Signal) für den Singleplex Assay verglichen. Figur 5 zeigt den Vergleich der Median MFIs von Multiplex und Singleplex Assay, wobei 10 verschiedene Antigene (Proteine 1 bis 10) verwendet wurden. Als Kopplungskontrolle wurden 10 μΐ/ml (Median der gezählten Beads) . Set 1 (Multiplex Assay) mit 10 Proteinen an unterschiedlichen Beadregionen im Vergleich zu Set 2 (Singleplex Assay) mit 10 Proteinen an der gleichen Beadregion.

Figur 6 zeigt den Vergleich der Mittelwert MFIs von Multiplex und Singleplex Assay, wobei 10 verschiedene Antigene

(Proteine) verwendet wurden. Als Kopplungskontrolle wurden 10 μΐ/ml (Mittelwert der gezählten Beads) . Set 1 (Multiplex

Assay) mit 10 Proteinen an unterschiedlichen Beadregionen im Vergleich zu Set 2 (Singleplex Assay) mit 10 Proteinen an der gleichen Beadregion. Figur 7 zeigt die Spots auf einem Mikroarray, auf dem Proteine und Proteingemische (Markersequenzen) immobilisiert sind, die als Antigene fungieren und die mit Serum RA00037 inkubiert wurden .

Figur 8 zeigt die Spots auf einem Mikroarray, auf dem Proteine und Proteingemische (Markersequenzen) immobilisiert sind, die als Antigene fungieren und die mit Serum RA00033 inkubiert wurden .

Figur 9 zeigt den errechneten Mittelwert im Vergleich zum Messwert der Signalintensitäten bei Verwendung von Serum

RA00037 mit verschiedenen Proteinen und Proteingemischen als Markersequenz bzw. Panel von Markersequenzen.

Figur 10 zeigt den errechneten Mittelwert im Vergleich zum Messwert der Signalintensitäten bei Verwendung von Serum

RA00033 mit verschiedenen Proteinen und Proteingemischen als Markersequenz bzw. Panel von Markersequenzen.

Figur 11 zeigt Tabelle 1. Angegeben sind die

Signalintensitäten der verwendeten Seren (RA0026 bis RA0046) bei den einzelnen verwendeten Markersequenzen PI bis P9 und PO .

Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele erläutert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt sondern grundsätzlich universell für verschiedenste

Markersequenzen, hochaffine Binder, Typen von Assays und

Nachweisverfahren anwendbar.

In den Beispielen werden ELISA und SUPA Luminex Assays verwendet, außerdem Antigene (Proteine) als Markersequenzen, sowie Seren, die Antigene und Autoantigene als hochaffine Binder enthalten.

Assays auf Basis der Luminex Technologie erlauben die

simultane quantitative Bestimmung von bis zu 100 Parametern in einer einzelnen Probe, wobei im Stand der Technik Multiplex

Assays bekannt sind. Vorteile des Multiplex Formats sind hohe Sensitivität und Spezifität, exakte Quantifizierung und

Automatisierbarkeit .

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft

Singleplex Assays (Single-Signal Assays). In dem

erfindungsgemäßen Singleplex Assay (Single-Signal Assay) wird im Gegensatz zum Multiplex Assay nur ein Parameter bestimmt. Bei dem erfindungsgemäßen Singleplex Assay wird nicht eine ausgewählte Markersequenz sondern ein Panel von

Markersequenzen verwendet das durch Kombination von mehreren Markersequenzen zu einem einzigen Marker (Panel von Markern, Markerkombination) erhalten wird. Ein Vorteil bei der

Verwendung eines Panels von Markersequenzen in einem

Singleplex Assay ist die Additive Signalverstärkung durch die Kombination der Markersequenzen in einem Panel. Gemessen wird bei dem Singleplex Assay dann vorzugsweise der Mittelwert der Intensität der kombinierten Markersequenzen. Markersequenzen werden nachfolgend auch einfach als Marker bezeichnet. Beispiel 1 : Additive Signalverstärkung durch Markerkombination in einem Panel von Markerproteinen.

Theoretische Signalintensität, Vorüberlegung

Bei einem Singleplex Assay mit einem Panel aus Markersequenzen aus Protein 1 und Protein 2 (Zweifachkombination), bei dem das Protein 1 eine Signalintensität von 10.000 und Protein 2 eine Signalintensität von 30.000 hat, beträgt der berechnete

Mittelwert der Intensität MFI der Signale aus Protein 1 und Protein 2 20.000.

Bei einem Singleplex Assay mit einer Fünffachkombination aus Protein 1, Protein 2, Protein 3, Protein 4, Protein 5 in einem Panel entspricht die berechnete Signalintensität des Panels aus Markersequenzen dem Mittelwert der Einzelsignale der 5 Proteine .

Versuchsdurchführung Die verwendeten Beads sind mit den Proteinen die als Antigen fungieren beschichtet. Diese beschichteten Beads werden mit unterschiedlichen Seren inkubiert, so dass die im Serum vorhandenen Antikörper an die Antigene binden können. Es geht dabei darum, die Signalintensitäten einer Multiplex Messung mit der Signalintensität der erfindungsgemäßen Singleplex Messung zu vergleichen.

Bei dem Mulitplex Assay werden 10 unterschiedliche

Beadregionen mit 10 unterschiedlichen Proteinen beschichtet, wobei 100 Beads/Beadregion - d.h. insgesamt 1000 Beads - eingesetzt werden. Es werden dann 45 Seren (je 2 Replikate) in drei verschiedenen Settings getestet: Als 10 Plex mit den Proteinen 1-10 und als 5 Plex, einmal mit den Proteinen 1-5 und einmal mit den Proteinen 6-10. Bei der Datenauswertung wird der Median MFI (Median Fluorescent Intensity) oder

Mittelwert MFI (Mean Fluorescent Intensity) aller Proteine bestimmt .

Bei dem Singleplex Assay werden 10 Proteine in der gleichen Beadregion getestet, wobei 1.000 Beads sich in einer

Beadregion befinden. Getestet werden 45 Seren (je zwei

Replikate) in 3 Settings: als Singleplex mit den Proteinen 1- 10, als Singleplex mit den Proteinen 1-5 und als Singleplex mit den Proteinen 6-10. Bei der Datenauswertung wird der

Median MFI oder Mittelwert MFI der 1000 Beads (Mix)

berücksichtigt .

Das Prinzip der Messung und Auswertung beruht auf der Luminex Technologie. Die Beads sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (rot und infrarot) eingefärbt, die in unterschiedlichen

Bereichen des optischen Spektrums emittieren. Die Kombination dieser beiden Farbstoffe in jeweils zehn verschiedenen

Konzentrationsstufen führt zu einhundert spektral

unterscheidbaren Schattierungen von rot und infrarot. Jede der daraus resultierenden Fluoreszenzintensitäten definiert eine Population von Beadregionen . Die Fluoreszenzkodierung der Beadregionen sind die Basis für die Erkennung durch das

Analysegerät und die exakte Zuordnung. Die eindeutige

Zuordnung der einzelnen Beadregionen ist die Grundlage für die Multiplexe Analyse, wobei jede Beadregion einen Einzeltest repräsentiert (Fluoreszenzkodierung der Beadregionen) . Im

Singleplex wird nur eine Beadregion verwendet, so dass ein Einzeltest durchgeführt wird und eine Zuordnung als auch

Markierung mit dem roten und infraroten Fluoreszenzfarbstoff im Gegensatz zum Multiplex Assay nicht erforderlich ist.

Die Beads werden mit den zu untersuchenden Proteinen 1 bis 10 beschichtet, die als Antigen wirken. Die Beads werden dann mit den zu untersuchenden Seren inkubiert. Je besser die in einem Serum vorhandenen Antikörper an das oder die auf dem Bead immobilisierten Antigene (Markerproteine) binden, desto höher ist das gemessene Fluoreszenzsignal. Der spezifische Nachweis der Bindung des Antikörpers an die Beads erfolgt über ein

Detektionsmolekül (Konjugat). Dieses Konjugat hat eine hohe spezifische Affinität zum gebundenen Antikörper aus dem Serum und ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Phycoerythrin) gekoppelt, der im Wellenlängenbereich des grünen Lichts emittiert. Dieser spektrale Bereich unterschiedet sich von denen der internen Farbstoffe, so dass die Klassifizierung der Beads und die Quantifizierung der Antikörper im Multiplex Assay neben einander durchgeführt werden können.

Auswertung der Ergebnisse: Die allgemeine Standardauswertung für die Messung von

Luminexbeads ist der Median MFI (Median Fluorescent

Intensity) . Dabei werden systematisch einzelne hohe bzw.

niedrige Signale vernachlässigt.

Der Median teilt die Gesamtmenge (Anzahl) der gemessenen

Intensitäten in zwei Hälften. Der Median ist somit der

Intensitätswert, der in der Mitte aller gemessenen

Intensitäten liegt. Er gibt die mittlere Intensität der gemessenen Intensitäten an, die „typische" Intensität für ein bestimmtes Protein, hier einen bestimmten Antikörper. Bei der Angabe des Medians, wird nur der mittlere Wert berücksichtigt, während einzelne hohe und niedrige Intensitätssignale, die rechts und links vom Median liegen unberücksichtigt bleiben.

Der Mittelwert ,,M" (arithmetisches Mittel) berechnet sich wie folgt : M = 1/n Σ Xi = xl+x2+ .... +xn / n

Damit ergibt sich für die Multiplex Messung eines Proteins 1 an Bead 1 (Signalstärke 300), Protein 2 an Bead 2

(Signalstärke 600) und Protein 3 an Bead 3 (Signalstärke

30.000) ein errechneter Median von 600 MFI (Median Fluorescent Intensity) und ein errechneter Mittelwert von 10.3000 MFI (Mean Fluorescent Intensity) .

Für eine Singleplex Messung von Protein 1 (Signalstärke 300), Protein 2 (Signalstärke 600) und Protein 3 (Signalstärke

30.000) an einem Bead gemessener Median von 600 MFI und ein gemessener Mittelwert von 10.300 MFI.

Die Werte von Median MFI und Mittelwert MFI in Multiplex und Singleplex Assay sind folglich identisch.

In der erfindungsgemäßen Singleplex Messung sollen einige hohe Signale im Gegensatz zur herkömmlichen Multiplex Messung nicht vernachlässigt werden. Daher wird bei der erfindungsgemäßen Singleplex Messung vorzugsweise der Mittelwert bestimmt, und nicht der Median.

In Figur 1 werden die MFI Mittelwerte der einzelnen Proteine 1 bis 10 des Multiplex Assays dargestellt. Aus diesen Werten wurden der Mittelwert des Multiplex Assays für Proteine 1-10, 1-5 und 6-10 berechnet. Diese berechneten Mittelwerte des Multiplex Assays wurden mit den aus den gemessenen Werten des Singleplex Assays für die Proteine 1-10, 1-5 und 6-10 verglichen .

Es wurden die Seren RA-00037 (positiv), RA-00029 (positiv), RA-00046 (positiv) und PRO-244 (negativ) untersucht. Bei dem Serum RA-00029 zeigt sich, dass die berechneten

Mittelwerte des Multiplex Assays mit den gemessenen

Mittelwerten des Singleplex Assays weitgehend übereinstimmen (d.h. vergleichbar sind) und zwar sowohl für die Proteine 1- 10, als auch für die Proteine 1-5 und 6-10. Für die Seren RA-00037 (Figur 2), RA-00046 (Figur 3) und PRO- 244 (Figur 4) werden ähnliche Effekte gefunden - die aus den gemessenen Intensitäten berechneten Mittelwerte der Multiplex Assays sind mit den gemessenen Intensitäten des Singleplex Assays (Auswertung nach Mittelwerten) vergleichbar. Diese Experimente haben gezeigt, dass der Mittelwert MFI des

Multiplex Assays (Proteine auf unterschiedlichen Beadregionen) als 5 Plex als auch als 10 Plex vergleichbar ist mit dem

Mittelwert des jeweiligen Singleplex Assays (Proteinpanel auf einer Beadregion) . Beispiel 2

Vergleich von Multiplex Assay und Singleplex Assay im Bezug auf die Median Intensitäten und die Mittelwert Intensitäten

Versuchsaufbau und Durchführung wie in Beispiel 1 mit Protein 1 an Bead 1, Protein2 an Bead 2 und Protein 3 an Bead 3 beim Muliplex Assay. Aus den gemessenen Intensitäten der Proteine 1 bis 3 wurde einmal der Median MFI und einmal der Mittelwert MFI für den Multiplex Assay bestimmt. Diese wurden mit den gemessenen Intensitäten des Median MFI und des Mittelwertes MFI des Singleplex Assays verglichen. Beim Singleplex Assay waren die Proteine 1, 2 und 3 an einem Bead (Bead 4) immobilisiert. Figur 5 zeigt den Vergleich des Medians von Multiplex und Singleplex Assay der einzelnen Proteine 1 bis 10. Im Set 1 sind die Proteine 1-10, 1-5 und 6-10 an unterschiedliche

Beadregionen gekoppelt und in Set 2 sind die Proteine 1 bis 10, 1-5 und 6-10 separat an die gleiche Beadregion gekoppelt. Die Werte für den Median MFI von Multiplex und Singleplex

Assay sind für die Proteine 1 bis, 1-5 und 6-10 nahezu gleich. Als Kopplungskontrolle wurden 10 g/ml (Median der gezählten Beads) eingesetzt.

Figur 6 zeigt den Vergleich des Mittelwerts von Multiplex und Singleplex Assay der einzelnen Proteine 1 bis 10. Im Set 1 sind die Proteine 1-10, 1-5 und 6-10 an unterschiedliche

Beadregionen gekoppelt und in Set 2 sind die Proteine 1 bis 10, 1-5 und 6-10 separat an die gleiche Beadregion gekoppelt. Die Werte sowohl für den Mittelwert MFI von Multiplex und Singleplex Assay sind nahezu gleich. Als Kopplungskontrolle wurden 10 g/ml (Mittelwert der gezählten Beads) eingesetzt.

Beispiel 3 : Auswertung SUPA Mikroarray

Verglichen wurden die Signalintensitäten von Mulitplex und Singleplex Assay. Untersucht wurde, wie sich die

Signalintensität bei einer Reduktion von Markersequenzen durch die Kombination von mehreren Markersequenzen zu einem

Markerpanel verändert.

Ausgangspunkt ist folgende Überlegung: Die Summe der

Signalintensitäten 15.000 und 5.000 ergibt eine Signalintensität von 20.000. Der Mittelwert der

Signalintensität aus 15.000 und 5.000 ist eine

Signalintensität von nur 10.000.

In Mikroarray Experimenten wurden die Antigen/Antikörper Interaktionen von 10 Proteinen und 20 Seren auf Protein Mikroarrays untersucht (siehe Tabelle 1, Abb.11). Die untersuchten Antigene (Proteine) sind mit PI bis PO

bezeichnet. Es wurden die Seren RA00026 - RA00033, RA00035 - RA00046 auf die Aktivität von in diesem Seren enthaltenen Autoantikörpern untersucht.

Insgesamt wurden nur geringe Signalintensitäten für

Protein/Autoantikörper Interaktionen in den einzelnen Seren gefunden, wobei sich die einzelnen Seren hinsichtlich ihrer Aktivität in Bezug auf einzelne Proteine und auch die

Signalintensität zum Teil deutlich unterschieden. Es wurden zwei sehr hohe Signalintensitäten von 15.643 (bei Protein 9) und 16.034 (bei Protein 0) mit dem Serum RA00037 gefunden. Serum RA000333 zeigte insgesamt eine mittlere Aktivität - eine Signalintensität von 1.367 bei Protein 1, 1.573 bei Protein 3, 5.010 bei Protein 8 und 2.631 bei Protein 9. Als hohe Signalintensitäten werden solche mit einem MFI (Median Fluorescent Intensity) von größer 10.000 bezeichnet. Als mittlere Signalintensität solche mit einem MFI (Median

Fluorescent Intensity) von 1.000 bis 10.000 und als gering solche mit einem MFI von kleiner 1.000.

Die Seren RA00037 und RA00033 wurden im Bezug auf ihre

Reaktivität auf verschiedene Proteinkombinationen weiter charakterisiert . Tabelle 2 gibt einen Überblick über die verwendeten Proteinkombinationen und die verwendete

Bezeichnungssystematik .

Tabelle 2

; Getestete Bezeichnungs- ; Erläuterung

Anzahl Systematik

1 Protein 10 P6 Protein 6

Kombination

von 2 45 P67 Protein 6 und 7

Proteinen

Kombination

von 3 20 P678 Protein 6,7 und 8

Proteinen

Kombination

_Q nno _Q Protein 6,7,8 und vvoonn 44 8 P6789 _: _

Proteinen

Kombination

vvoonn 55 2o DPi6i7 _Q 8o9n0 -.· Pro,te.in 6, 7,8,9 und 0

Proteinen

Kombination ; Protein

von 10 1 P1234567890 ^; 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9

Proteinen ^: : und 0

Serum RA00037 und Serum RA00033 wurden mit den verschiedenen Proteinen in den in Tabelle 2 genannten Kombinationen

getestet. Es wurden 16 Replikate pro Protein bzw.

Proteingemisch getestet. Dann wurde statistisch der

Schwellenwert bestimmt, bei dem sich der Background von dem Signal unterscheidet und alle Signale unterhalb des Schwellenwertes (detection call) wurden auf Null gesetzt. Der Detection Call Algorithmus hilft zu entscheiden, ob ein Spot auf einem Microarray leuchtet oder nicht. Dazu wird die

Verteilung des lokalen Hintergrundes auf dem Microarray berechnet .

Von dieser Verteilung werden jeweils 5% am unteren Ende

(niedrigste Werte) und 5 % am oberen Ende (höchste Werte) entfernt. Dann werden die restlichen Daten zur Basis 10 logarithmiert . Der Schwellwert ergibt sich aus dem Mittelwert der

logarithmierten Daten plus zweimal der Standardabweichung der logarithmierten Daten.

Alle Spots deren Intensitäten unter diesem Wert liegen werden auf Null gesetzt. Mit dem Serum RA00037 wird das stärkste Signal mit einer

Signalstärke von 16034 bei PO gemessen (Figur 7) . Der

Background liegt bei einer Signalstärke von 1134 und der dynamische Bereich somit bei 1,15 - d.h. zwischen log 10(1134) und log 10(16034). Insgesamt wurden 35 unterschiedliche

Interaktionen bei RA00037 und der verwendeten

Proteinkombination detektiert.

Mit dem Serum RA00033 wird das stärkste Signal mit einer

Signalstärke von 5010 bei P8 gemessen (Figur 8) . Der

Background liegt bei einer Signalstärke von 1522 und der dynamische Bereich somit bei 0,52 - d.h. zwischen logl0(1522) und logl0(5010). Insgesamt wurden 38 unterschiedliche

Interaktionen bei RA00033 und der verwendeten

Proteinkombination detektiert. Eine detaillierte Analyse der erzeugten Signalintensitäten der Proteine und Proteinkombinationen durch Interaktion mit

Autoantikörpern in Serum RA00037 und Serum RA00033 ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Bezeichnungs ^¬ Serum RA00037 Bezeichnungs ^¬ Serum RA00033 systematik Signalintensität systematik Signalintensität

MFI MFI

P6 0 P6 0

P7 0 P7 0

P8 0 P8 5010

P9 15643 P9 2631

PO 16034 PO 0

P60 5236 P68 2218

P70 4059 P78 2121

P80 5373 P89 3196

P90 9856 P80 1653

P670 2210 P678 0

P680 2490 P689 1809

P690 4344 P680 900

P780 2014 P789 2331

P790 5292 P780 0

P890 4783 P890 926

P6790 3118 P6789 976

P6890 2455 P6890 0

P7890 2893 P7890 978

P67890 2240 P67890 0

P1234567890 0 P1234567890 0 Figur 9 zeigt für Serum RA00037 die berechneten und gemessenen MFIs für die einzelnen Proteine und Proteinkombinationen im Vergleich. Figur 10 zeigt dies analog für RA00033. Es zeigt sich, dass bei der Kombination von vielen Proteinen, die Signalstärke abnimmt und die gemessenen Signalintensitäten unter den berechneten Signalintensitäten liegen. Für die hier untersuchten Seren RA00037 und RA00033 sind bei der

Kombination von 10 Proteinen in einer Beadregion keine Signale mehr detektierbar . Bei einer Kombination von 5 Proteinen sind Signale detektierbar , aber die detektierte Signalintensität liegt unter der berechneten. Bei den verwendeten Seren und Markerpaneln sind Panel von 2 bis 3 Proteinen optimal.

Insbesondere sind Proteine zur Verwendung in einem Markerpanel geeignet die eine starke Interaktion mit Autoantikörpern zeigen .

Beispiel 4 Singleplex Assay als SUPA-ELISA (Multimarker ELISA)

Die Vorteile des ELISA sind die niedrigen Kosten, die einfache Anwendung (ELISA Anwendungen sind bekannt und standardisiert) und die vergleichsweise schnelle Durchführung.

ELISAS (Enzym-linked-immunoabsorbent-assays ) sind seit langem bekannt (z.B. „Immunoassays of endogenous plasma insulin in man", Rosalyn S. Yalow and Solomon A. Berson, From the

Radioisotope Service, Veterans Administration Hospital, New York, N. Y., Submitted for publication March 7, 1960; accepted March 22, 1960; J. Clin. Invest. 39: 1157-75,

doi : 10.1172/JCI104130. PMC 441860. PMID 13846364; „Enzym- linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative assay of Immunoglobulin G" in Immunochemistry, Pergamon Press 1971, Vol . 8 pp. 871-874) .

Hier wird der indirekte ELISA verwendet, z.B. beschrieben in (http://en.wikibooks.org/wiki/ Structural_Biochemistry/Protein/ Enzyme-Linked_Immuniabsorbent_Assay_%28ELISA%29 ) . Dabei wird eine Vertiefung einer ELISA Platte (well) mit einem Protein beschichtet, das als Antigen fungiert. Daran kann ein

spezifischer Antikörper binden. Die Bindung wird durch einen zweiten - enzymgebundenen Antikörper - der ein nachweisbares Substrat umsetzt, nachgewiesen.

Bei einem erfindungsgemäßen Singleplex ELISA werden in einem well einer ELISA Platte 10 Proteine als Antigen eingesetzt und das Signal des Panels aus Antigenen bestimmt.

Die Proteine, die als Antigene verwendet werden, werden über Nacht immobilisiert (dreimal pro Probe) . Dann wird gewaschen, mit Candor Puffer für 2 Stunden geblockt, anschließend

gewaschen und eine Stunde mit dem zu untersuchenden Serum inkubiert. Daran schließt sich ein Waschschritt und die anschließende einstündige Inkubation mit humanem AK HRP

Konjugat. Danach wird abermals gewaschen und mit Substrat 15 min inkubiert. Die Reaktion wird nach 15 min gestoppt und das Ergebnis bei 450 nm (Readout Tecan Safire) ausgelesen.

Es werden drei verschiedene Seren RA00029, RA00037 und RA00045 getestet . Die Seren liefern die gleichen Ergebnisse wie im Luminex Assay (Beispiel 2 und 3) . Es ist notwendig, die Versuchbedingungen für den ELISA für die zu testenden Markerproteine und die zu analysierenden Seren zu optimieren, z.B. im Hinblick auf die verwendeten Puffer und die Beschichtung der ELISA Platten. Der Singleplex Assay ist universell einsetzbar, wobei für den jeweiligen Assaytyp und das verwendete Nachweissystem die Bedingungen optimiert werden müssen, um ein signifikantes Single-Signal des Panels aus Markersequenzen zu erhalten.