In eucaryotischen Organismen findet die DNA-Replikation und RNA-Biogenese in dem Zelikern statt, wohingegen die Proteinsynthese im wesentlichen im Cy- toplasma abläuft. Die Integration dieser in verschiedenen Zell kompartimenten ablaufenden Aktivitäten ist abhängig von einem selektiven Transport der Protei- ne und der Ribonucleoproteinpartikel zwischen dem Zellkern und dem Cy- toplasma. Der Transport der Proteine, DNA und/oder RNA erfolgt über Kernpo- ren, die sich in der Membran, die den Zellkern umschließt, befinden.

Der Transport durch die Kernporen, der erforderlich wird, da wichtige Zellaktivi- täten räumlich in der Zelle getrennt sind, wird unter anderem über Signale für den zellulärer Import und Export zwischen Zellkern und Cytoplasma vermittelt.

Während Informationen und Studien zu dem Transport der Proteine in den Zell- kern vorliegen, liegen nur wenige Informationen über den Export von Proteinen und/oder Peptiden bzw. anderen biologischen Strukturen aus dem Zellkern vor.

Der Transport der Proteine und/oder Peptide oder anderer Strukturen aus dem Zelikern in das Cytoplasma wird unter anderem über Nucleus-Export- Signalpeptide (NES) realisiert. Bei vielen molekularen Prozessen zwischen Zeilkern und Cytoplasma ist es erforderlich, daß ein gekoppelter In-und Export von Kompartimenten zwischen Zellkern und Cytoplasma erfolgt. So wird z. B. die Signaltransduktion durch Stat-Proteine (Signal-Transducers and Activators of Transcription) so reguliert, daß sowohl Import als auch Export von Komporti- menten zwischen Zeilkern und Cytoplasma in Regelkreisen reguliert werden. menten zwischen Zelikern und Cytoplasma in Regelkreisen reguliert werden.

Stat-Proteine bilden eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die beispielsweise die Regulation der Genexpression von Interferonen und Cytokinen sowie ande- ren Wachstumsfaktoren modifizieren und regulieren. Die Aktivierung der Stat- Proteine erfolgt im Cytoplasma der Zelle an aktivierten Rezeptoren, worauf mehrere von den Stat-Molekülen in den Kern transportiert werden, um dort die Transkription bestimmter Gene zu aktivieren (Damell, J. E., Jr. (1997) Science 277,1630-1635). Die Stat-Proteine befinden sich demgemäß vor Aktivierung im Cytoplasma. Die Cytokin-Signale gehen von Zelloberflächen-Rezeptoren aus.

Die Bindung von Cytokinen oder Wachstumsfaktoren an ihre entsprechenden Rezeptoren initiiert eine Reihe von Tyrosin-Phosphorylierungen, welche durch Kinase-Mitglieder der Janus-Familie (Jaks) ausgelöst werden. Das führt zur Phosphorylierung einer Tyrosin-Seitenkette der Stat-Proteine. Dieser Prozess, gewöhnlich als Stat-Aktivierung bezeichnet, bewirkt die Dimerisierung der Stat- Proteine durch reziproke Phosphotyrosin/SH2-Interaktionen und später die schnelle und effiziente Translokation von cytoplasmischen Molekülen in den Nuklearteil, wo sie spezifische Gene aktivieren. Die Cytokin induzierte Transc- ription ist ein vorübergehender Prozess, der wenige Minuten bis Stunden dau- ern kann. Zellen mit abweichend hoher und verlängerter Jak-oder Stat- Aktivierung sind anfällig für Transformationen und assoziiert mit anormaler Entwicklung (Frank, D. A. (1999), Mol. Med. 5,432-456). Details der dynami- schen Umverteilung von Stat-Proteinen, die durch Cytokin-Aktivierung ausge- löst wird, sind zum größten Teil unbekannt. Gegenwärtig liegen nur wenig oder keine Informationen über Signale vor, die mit dem Prozess eines Nucleus- Exports von Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise Stat-Proteinen einher- gehen.

Die Nucleus-Export-Signalpeptide spielen bei zahireichen krankheitsrelevanten, pathogenen Prozessen eine entscheidende Rolle, wie z. B. Störungen des Zellwachstums, des Wundverschlusses, der Carcinogenese, des septischen Schocks, der Arthritis, der Leukämie, sowie zahlreichen Herz-Kreislauf- Erkrankungen. Obwohl die Nucleus-Export-Signalpeptide eine große Bedeu- tung für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Mittel haben, sind die Details der Interaktionen der Nucleus-Export-Signalproteine mit ihren Re- zeptoren bzw. Zielorten weitgehend unbekannt. Das Fehlen genauerer Informa- tionen über diesen Mechanismus ist deshalb besonders nachteilig, da DNA- Replikationen, RNA-Biogenese und die Proteinsynthese, sowie der Transport dieser biologischen Strukturen zwischen Zelikern und Cytoplasma mit zahlrei- chen Krankheiten assoziiert sind. Die Integration der im Kern und im Cytoplas- ma ablaufender Prozesse ist entscheidend bei Krebserkrankungen, bei Defek- ten des Immunsystems, bei den Stoffwechselleistungen von Leber und Nieren und anderen.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht daher in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die den Transport von Proteinen, Peptiden Nucleinsäuresequenzen und anderen biologischen Struktu- ren, insbesondere von Transkriptionsfaktoren zwischen Cytoplasma und Zell- kern modifizieren, sowie der Bereitstellung von Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen, die sich zur Diagnose und Behandlung von mit Signalpeptiden, die den Transport zwischen Zelikern und Cytoplasma induzieren und regulieren, im Zusammenhang stehenden Krankheiten eignen.

Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung einer Aminosäuresequenz gemäß der allgemeinen Formel (I) mit einer Aktivität, die den Transport von Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuresequenzen, insbesonde- re Transkriptionsfaktoren zwischen Kern und Cytoplasma modifiziert. Die Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel (I) lautet A1-A2-A3-A4-A5-A6- A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13 (I) worin A1 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A2 D oder E ist, A3 K, R oder H ist, A4 G, N, Q, C, S, T oder Y ist, A5 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A6 G, N, Q, C, S, T oder Y ist, A7 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A8 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A9 G, N, Q, C, S, T oder Y ist, A10 G, N, Q, C, S, T oder Y ist, A11 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A12 A, V, L, I, D, F, M oder W ist, A13 A, V, L, I, D, F, M oder W ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verwendet werden : Gemäß der Erfindung handelt es sich bei einer"mit Nucleus-Export- Signalpeptiden (NES) im Zusammenhang stehenden Krankheit"um eine tes/Fettleibigkeit, akute und chronische Abstoßung allogener Organtransplanta- te, Nervenzell-Degeneration, Parkinson-Krankheit, septischer Schock, Endoto- xinämie, Hypersensibilität, Uveitis, Wundverschluß/Zellwachstum und andere.

Die NES spielen auch bei der Regulation des Immunsystems, Entzündungs- und Effektor-Mechanismen der zelluläre und humoralen Immunität, septi- schem Schock, Entzündungen der Sinnesorgane, z. B. der Augen, bei der Re- gulation von Transkriptions-und Zellzyklen und akuter respiratorischer Insuffi- zienz, physiologischem Streß und anderen Störungen eine wichtige Rolle Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff"phar- mazeutische oder diagnostische Zusammensetzung"eine Substanz, die zur Diagnose und/oder Behandlung von Krankheiten, insbesondere von mit den NES im Zusammenhang stehenden Krankheiten, geeignet ist, vorzugsweise in einer Menge, die ausreicht, um eine solche Wirkung zu erzielen. Der in der vor- liegenden Beschreibung verwendete Begriff"pharmazeutische oder diagnosti- sche Zusammensetzung"bedeutet sowohl den Wirkstoff selbst als auch den Wirkstoff in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Adjuvantien, anderen Wirkstoffen, usw.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff"Be- handlung"die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung eines Arznei- stoffes.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff"NES" sowohl natürlich vorkommenden NES als auch alle Modifikationen, Mutanten oder Derivate der NES, mittels Rekombinationstechniken hergestellte NES, der Aminosäure-Modifikationen, wie Inversionen, Deletionen, Insertionen, Anlage- rungen usw. enthält, sofern zumindest ein Teil der essentiellen Funktionen der Wildtyp-NES vorhanden sind. Solche NES können auch ungewöhnliche Amino- säuren und/oder Modifikationen, wie eine Alkylierung, Oxidation, Thiol- Modifikation, Denaturierung und Oligomerisation und dergleichen umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können NES insbesondere Peptide sein, speziell ein Fusionsprotein und/oder Fusionspeptid, das neben anderen Proteinen, Peptiden oder Teilen davon NES insgesamt oder teilweise enthält. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die NES verkürzte Formen der natürlich vorkommenden NES wie ein kleines Pep- tid.

Der Begriff"Promotor"bedeutet eine DNA-Sequenz, die sich meistens aufwärts (5') von der codierenden Sequenz eines Strukturgens befindet und die die Ex- pression des codierenden Bereichs kontrolliert, indem eine Erkennungssequenz für eine RNA-Polymerase und/oder für andere Faktoren, die erforderlich sind, damit die Transkription an der richtigen Stelle beginnt, bereitgestellt wird. Pro- motersequenzen sind notwendig, jedoch nicht immer ausreichend, um die Expression des Gens zu steuern.

"Nucleinsäure"bedeutet ein großes Molekül, das einzel-oder doppelsträngig sein kann und aus Monomeren (Nucleotiden) besteht, die eine Zuckereinheit, eine Phosphateinheit und entweder einen Purin-oder einen Pyrimidin-Rest enthalten. Bei der Nucleinsäure kann es sich um cDNA, genomische DNA oder RNA, beispielsweise mRNA, handeln.

Der Begriff"Nucleinsäuresequenz"bedeutet ein natürliches oder synthetisches Polymer einzel-oder doppelsträngiger DNA oder RNA, die alternativ synthetische, nicht-natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält, die in DNA-oder RNA-Polymere eingebaut werden können.

Der Begriff"Gen"bedeutet eine ein spezifisches Protein codierende DNA- Sequenz und Regulationselemente, die die Expression dieser DNA-Sequenz kontrollieren.

Der Begriff"codierende Sequenz"bezieht sich auf den Teil eines Gens, der ein Protein, ein Polypeptid oder einen Teil davon codiert, wobei die Regulationssequenzen und/oder-elemente, die die Initiation oder Termination der Transkription steuern, ausgeschlossen werden. Die codierende Sequenz und/oder das Regulationselement kann eine/eines sein, die/das normalerweise in der Zelle zu finden ist, wobei sie/es in diesem Fall als"autolog"oder als "endogen"bezeichnet wird, oder eine/eines, die normalerweise nicht in der Zelle lokalisiert ist, wobei es/sie in diesem Fall als"heterolog"bezeichnet wird.

Auch ein heterologes Gen kann aus autologen Elementen bestehen, die in ei- ner Reihenfolge und/oder Orientierung angeordnet sind, die in der Zelle, in die das Gen übertragen wird, normalerweise nicht zu finden ist. Ein heterologes Gen kann insgesamt oder teilweise aus einer beliebigen dem Fachgebiet be- kannten Quelle stammen, wozu ein bakterielles oder virales Genom oder Epi- som, eukaryontische Kern-oder Plasmid-DNA, cDNA oder chemisch syntheti- sierte DNA gehören. Das Strukturgen kann einen ununterbrochenen codieren- den Bereich bilden oder kann ein oder mehrere Introns umfassen, die durch geeignete Spleißverbindungen begrenzt sind. Das Strukturgen kann aus Ab- schnitten zusammengesetzt sein, die aus unterschiedlichen, natürlich vorkom- menden oder synthetischen Quellen stammen.

Ein"Transaktivator-Protein"ist ein Protein, das an den Operator-Bereich eines Gens binden und dadurch die Transkription des Gens fördern kann.

Eine"DNA-Bindungsdomäne"ist eine Aminosäuresequenz, die an eine spezifische DNA-Sequenz binden kann.

Ein"Fusionsprotein"ist ein Protein, das aus Aminosäuresequenzen besteht, die aus mindestens zwei verschiedenen Quellen stammen. Im Zusammenhang mit einem Fusionsprotein ist eine"heterologe"Aminosäuresequenz eine Sequenz, die aus einer anderen Quelle als die anderen Teile des Fusionsproteins stammt.

Ein"nachweisbares Genprodukt"ist eine Nucleotid-oder Aminosäuresequenz, die sich mit Hilfe eines Tests nachweisen lässt. Vorzugsweise verleiht die Expression eines nachweisbaren Genprodukts der Zelle ein Merkmal, das eine einfache Selektion der Zelle aus anderen Zellen erlaubt, die das nachweisbare Genprodukt nicht exprimieren.

Mit"funktionell verbunden"ist gemeint, dass ein Gen und eine Regulationssequenz bei einer Sense-Expression oder Antisense-Expression so miteinander verbunden sind, dass eine Genexpression ermöglicht wird, wenn geeignete Moleküle (z. B. Transkriptions-Aktivator-Proteine) an die Regulationssequenz gebunden werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff"assozi- iert"einen beliebigen Typ einer Wechselwirkung zwischen den NES und den Targets, insbesondere eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung oder Asso- ziation, wie eine kovalente Bindung, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkung, Van-der-Waalsche Kräfte, lonenpaare, Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung, Wechselwirkung zwischen Epitop und der Antikörper-Bindungsstelle, Enzym- Substrat-Wechselwirkung, Wechselwirkung zwischen Liposomen und hydro- phoben Molekülen, Nucleotidbasenpaarung, Wechselwirkung zwischen Memb- ranen und hydrophoben Molekülen und dergleichen, ohne jedoch darauf be- schränkt zu sein. Eine solche Assoziation kann auch das Vorliegen weiterer Moleküle, wie Peptide, Proteine oder weiterer Nucleotidsequenzen umfassen.

Der Begriff"Vektor"bedeutet ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das ein Plasmid, Virus oder eine autonom replizierende Sequenz, ein Phage oder eine Nucleotidsequenz sein kann, das linear oder zirkulär ist, das aus einzel-oder doppelsträngiger DNA oder RNA besteht, bei dem eine Reihe von Nucleotidsequenzen zu einer einzigartigen Konstruktion verknüpft oder rekombiniert worden sind und das ein Promoterfragment und eine DNA- Sequenz eines ausgewählten Genprodukts in Sense-oder Antisense- Orientierung zusammen mit geeigneten untranslatierten 3'-Sequenzen in eine Zelle einschleusen kann.

"Plasmide"sind genetische Elemente, die stabil vererbt werden, ohne ein Teil des Chromosoms ihrer Wirtszelle zu sein. Sie können DNA oder RNA umfassen und linear und zirkulär sein. Plasmide codieren Moleküle, die ihre Replikation und stabile Vererbung während der Zellreplikation sicherstellen, und können Produkte mit beträchtlicher Bedeutung für Medizin, Landwirtschaft und Umwelt codieren. Beispielsweise codieren sie Toxine, die die Virulenz pathogener Bakterien stark erhöhen. Sie können auch Gene codieren, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. Plasmide werden in der Molekularbiologie allgemein als Vektoren zur Klonierung und Expression rekombinanter Gene verwendet. Entsprechend den dem Fachmann vertrauten Regeln der Standardbezeichnung werden Plasmide allgemein mit dem Kleinbuchstaben p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Ziffern vorangestellt sind oder folgen. In der vorliegenden Beschreibung offenbarte Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, der Öffentlichkeit zugänglich oder können aus verfügbaren Plasmide mittels routinemäßiger Anwendung wohlbekannter veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Viele Plasmide und andere Klonierungs-und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind wohlbekannt und für den Fachmann ohne weiteres erhältlich. Außerdem kann der Fachmann ohne weiteres eine beliebige Anzahl anderer Plasmide konstruieren, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind. Aus der vorliegenden Offenbarung erschließen sich dem Fachmann ohne weiteres die Eigenschaften, Konstruktion und Verwendung sowohl solcher Plasmide als auch anderer Vektoren.

Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff"Expression"soll die Transkription und/oder Codierung der Sequenz des Genprodukts beschreiben.

Bei der Expression wird zuerst eine DNA-Kette, die die Sequenz eines Genpro- dukts codiert, in eine komplementäre RNA transkribiert, bei der es sich häufig um eine mRNA handelt, und dann wird die so transkribierte mRNA in das vor- stehend erwähnte Genprodukt translatiert, wenn es sich bei dem Genprodukt um ein Protein handelt. Die Expression umfasst jedoch auch die Transkription einer DNA, die in Bezug auf ihre Regulationselemente in Antisense-Richtung insertiert worden ist. Eine Expression, die konstitutiv verläuft und möglicherwei- se durch ein von außen kontrolliertes Promotorfragment weiter gesteigert wer- den kann, wobei mehrere mRNA-Kopien und große Mengen des ausgewähiten Genprodukts erzeugt werden, kann auch die Überproduktion eines Genpro- dukts umfassen.

Der Begriff"Wirtszelle"bedeutet eine Zelle, die durch die Übertragung von einer chimären, heterologen oder autologen Nucleinsäuresequenz oder deren Abkömmlinge, die diese Sequenz noch enthalten, genetisch modifiziert worden ist. Diese Zellen werden auch als"transgene Zellen"bezeichnet. Im Falle der Übertragung einer autologen Nucleinsäuresequenz liegt die Sequenz in der Wirtszelle in höherer Kopiezahl vor als die natürlich vorkommenden Sequenzen.

Die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine, insbesondere der NES, die nicht in ihrer natürlichen (zellulären) Umgebung vorkommen, sind isoliert. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff"isoliert"bedeutet im Zusammenhang mit Proteinen ein Polypeptid, das ohne das Material, mit dem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, vorliegt oder höchstens mit einem Teil davon. Bezogen auf das Gewicht des Gesamtproteins in einer bestimmten Probe macht das isolierte Protein mindestens 0,5%, vorzugsweise mindestens 5%, bevorzugter mindestens 25% und noch bevorzugter mindestens 50% aus. Am bevorzugtesten ist das"isolierte"Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Substanzen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, und bildet auf einem Polyacrylamid-Gel eine einzige Hauptbande."Im wesentlichen frei"bedeutet, dass das Protein zu mindestens 75%, vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugter zu mindestens 95% und am bevorzugtesten zu mindestens 99% frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Substanzen ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.

"Antikörper"bedeutet ein Polypeptid, das im wesentlichen von einem Im- munglobulin-Gen oder Immunglobin-Genen codiert wird, oder Fragmente da- von, das/die einen Analyten (Antigen) spezifisch bindet/binden und er- kennt/erkennen. Bekannte Immunglobin-Gene umfassen-sowohl die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon-und mu-Gene für den konstanten Be- reich als auch die unzähligen Gene für den variablen Immunglobulin-Bereich.

Antikörper kommen beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe gut charakterisierter Fragmente vor, die mittels Spaltung mit verschiede- nen Peptidasen erzeugt werden."Antikörper"bedeutet auch modifizierte Anti- körper (z. B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff"Antikörper"umfasst auch Antikörper-Fragmente, die entweder mittels Modifikation ganzer Antikörper oder mittels de novo-Synthese unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken erzeugt worden sind. Der Begriff"Antikörper"umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie Fab, F (ab') 2 und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fä- higkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind : (1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden ; (2) das Fab'-Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden ; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab'-Fragmente erhalten ; (3) F (ab') 2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt ; f (ab') 2 ist ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden ; (4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird ; und (5) Einzelketten-Antikörper ("SCA"), definiert als gentechnisch verändertes Mo- lekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Be- reich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid- Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.

Die Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff"Epitop"bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf einem Antigen, an den das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale.

Der Fachmann kann leicht"monoklonale Antikörper"im Sinne der Erfindung gegen die erfindungsgemäßen Proteine und die Fragmente davon bzw. andere biologische Strukturen herstellen. Die allgemeinen Methoden zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung von Hybridom-Techniken sind wohlbekannt. Immortalisierte, Antikörper produzierende Zellinien können mittels Zellfusion und auch mittels anderer Verfahren, wie direkter Transformation von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr- Virus, erzeugt werden. Vgl. beispielsweise M. Schreier et al.,"Hybridoma Tech- niques", (1980) ; Hammering et al.,"Monoclonal Antibodies and T-cell Hybrid- omas", (1981) ; Kennet et al.,"Monoclonal Antibodies", (1980) ; vgl. auch die US- Patente 4,341,761,4,399,121,4,427,783,4,444,887,4,452,570,4,466,917, 4,472,500,4,491,632 und 4,493,890. Gruppen von gegen das interessierende Protein erzeugten monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon können im Hinblick auf verschiedene Eigenschaften, nämlich Isotop, Epitop, Affinität, usw., gescreent werden. In einer anderen Ausführungsform können Gene, die monoklonale Antikörper von Interesse codieren, mit Hilfe von auf dem Fachge- biet bekannten PCR-Verfahren aus Hybridomen isoliert und in geeigneten Vek- toren cloniert und exprimiert werden. Bei Verwendung von Immunaffinitätsver- fahren eignen sich monoklonale Antikörper zur Aufreinigung der einzelnen Pro- teine, gegen die sie gerichtet sind. Ungeachtet, ob es sich um monoklonale o- der polyclonale Antikörper handelt, weisen die erfindungsgemäßen Antikörper insofern einen zusätzlichen Nutzen auf, als sie als Reagenzien bei Immuntests, wie RIA, ELISA und ähnlichen, eingesetzt werden können. Außerdem können sie zur Isolierung der NES oder NES-Domänen aus Zellen oder anderen biolo- gische Proben verwendet werden. Die Antikörper könnten z. B. zur Etablierung eines auf einer Gewebekultur basierenden Tests verwendet werden, um neuar- tige NES oder neuartige Verbindungen, die die Wechselwirkung von NES und Rezeptoren und/oder Zielorten modifizieren, zu finden, zu isolieren oder zu mo- difizieren.

Die humanisierten oder chimären Antikörper können Teile umfassen, die von zwei unterschiedlichen Arten stammen (z. B. menschlicher konstanter Bereich und Maus-Bindungsbereich). Die von zwei unterschiedlichen Arten stammenden Teile können mittels herkömmlicher Verfahren chemisch verbunden oder unter Verwendung gentechnischer Verfahren als einzelnes Fusionsprotein hergestellt werden. Eine DNA, die die Proteine der beiden Teile des chimären Antikörpers codiert, kann als einzelnes Fusionsprotein exprimiert werden.

Ein Antikörper"bindet spezifisch an"ein Protein beispielsweise eine andere biologische Struktur oder zeigt damit eine spezifische Immunreaktivität", wenn der Antikörper in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen in einer Bindungsreaktion seine Funktion ausübt, anhand der sich entscheiden lässt, ob das Protein oder eine andere biologische Struktur vorliegt. Unter den festgelegten Bedingungen eines Immuntests binden die angegebenen Antikörper vorzugsweise an ein spezielles Protein, während keine signifikante Bindung an andere in der Probe vorhandene Proteine erfolgt. Eine spezifische Bindung an ein Protein unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der aufgrund seiner Spezifität für ein spezielles Protein selektiert worden ist. Zur Selektion von Antikörpern, die mit einem speziellen Protein eine spezifische Immunreaktivität zeigen, können verschiedene Immuntest-Ausführungsformen verwendet werden.

Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immuntests routinemäßig zur Selektion monoklonaler Antikörper verwendet, die eine spezifische Immunreaktivität mit einem Protein zeigen. Bei Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Publications, New York, findet man eine Beschreibung von Immuntest-Ausführungsformen und Bedingungen, die sich zur Bestimmung einer spezifischen Immunreaktivität verwenden lassen.

"Immuntest"betrifft einen Test, bei dem ein Antikörper zur spezifischen Bindung eines Analyten verwendet wird. Der Immuntest ist dadurch charakterisiert, dass spezifische Bindungseigenschaften eines speziellen Antikörpers genutzt wer- den, um den Analyten zu isolieren, zielgerichtet zu testen und/oder quantitativ zu bestimmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel (I) an den Positionen A7 und/oder A11 die Aminosäuren Leucin, Isoleucin und/oder Valin, vorzugsweise Leucin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Positionen A9, A10 und/oder A13 die Aminosäuren Glutamin, Asparagin und/oder Tyrosin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Positionen A1, A5 und/oder A12 die Aminosäuren Trytophan, Phenylalanin und/oder Isoleucin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Positionen A2, A3, A4 und/oder A8 die Aminosäuren Asparaginsäure, Arginin, Threonin und/oder Phenylalanin.

In bevorzugter Weise betrifft die Erfindung eine Aminosäuresequenz gemäß der aligemeinen Formel (I), wobei A1 W, A2 D, A3 R, A4 T, A5 F, A6 S, A7 L, A8 F, A9 Q, A10 Q, A11 L, A12 i und A13 Q bedeutet.

Die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz kann beispielsweise auch ein helikales Segment des Stat1-Proteins, nämlich die Aminosäuren 302 bis 314, die sich in Helix-4 der"gewickelten Spiraldomäne"des Stat1-Proteins befinden, sein. Diese Aminosäure und mindestens zwei Leucin-Reste enthaltende Peptid, das man auch als ein Leucin-reiches Peptid bezeichnen kann, ist vorteilhafterweise für den effizienten Nuklear-Export des Stat-Proteins verantwortlich.

Die Leucinreste in der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz können durch andere, insbesondere hydrophobe, Aminosäuren ersetzt sein, wie zum Beispiel Isoleucin, Valin, Cystein und andere. Mit Vorteil befinden sich zwischen den Leucin-Bausteinen jeweils drei andere Aminosäuren.

Die erfindungsgemäße Lehre umfasst vorteilhafterweise auch Homologe des helicalen Elements des Stat-Proteins, beispielsweise Drosophila melanogaster Stat (Drn), Anopheles gambia Stat (Ag), humanen CAMP-abhängigen Protein- kinaseinhibitoralpha (PKI), humanen IKB alpha und andere.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Fusionsprotein umfassend die Aminosäuresequenz der Formel (I) oder einem Teil davon und mindestens eine Marker-Struktur. Die Marker-Struktur kann beispielsweise ein Reportergen sein.

Im Sinne der Erfindung ist ein Reportergen ein Protein oder Peptid, das man mit verschiedenen biologischen, chemischen und/oder physikalischen Methoden nachweisen kann. Das erfindungsgemäße Reportergen kann sowohl das gesamte Konstrukt als auch das nachzuweisende Protein sein, es ist jedoch auch möglicb, daß es sich hierbei nur um den Teil des Proteins handelt, der eine nachzuweisende Aktivität besitzt. Somit kann jede DNA-Struktur, die für einen Bereich codiert, den man mit verschiedenen Nachweismethoden detektieren kann, als Reportergen dienen. Bevorzugt sind hierbei Expressionskonstrukte, die für einfach und mit hoher Sensitivität nachzuweisende Proteine codieren. Bei der erfindungsgemäßen Markerstruktur in dem Fusionsprotein kann es sich beispielsweise um die Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT) handeln. Die CAT katalysiert insbesondere die Übertragung eines Acetylrestes von Acetyl-CoA auf Chloramphenicol. Die CAT besitzt unter anderem den Vorteil, daß sie mit einer Halbwertzeit von ungefähr 50 Stunden in der Zelle stabil ist. Das ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn beispielsweise möglichst hohe Ausbeuten des Reportergens erzielt werden sollen. Mit Vorteil weist die CAT ein gutes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis auf.

Eine weitere vorteilhafte Markerstruktur im Sinne der Erfindung ist die Luciferase. Die Luciferase besitzt vorteilhafterweise eine hohe Sensitivität und eignet sich wegen relativ kurzer Halbwertzeiten von ca. 3 Stunden gut für Induktionsstudien. Besonders vorteilhaft ist eine Markerstruktur, die zwei Luciferasen mit unterschiedlichen Eigenschaften umfaßt, wobei die eine Luciferase beispielsweise aus Phottinus pyralis die Aktivität des eigenen Promotors nachweist, während die cotransfizierte Luciferase beispielsweise aus Renilla reniformis unter Kontrolle des konstitutiven Promotors steht und so mit Vorteil zur Standardisierung verwendet werden kann.

Weitere Beispiele für Markerstrukturen im Sinne der Erfindung sind die Beta- Galactosidase, das humane Wachstumshormon und die sekrierte alkalische Phosphortase. Mit Vorteil können die erfindungsgemäßen Markerstrukturen auch als Reportergene für den qualitativen Nachweis eingesetzt werden. Bei dem qualitativen Nachweis kann beispielsweise bestimmt werden, ob eine aus- gewählte Zelle transfiziert ist oder nicht transfiziert ist, bzw. kann im gesamten Organismus bestimmt werden, in welchen Geweben ein Promotor aktiv ist. Re- portergene für den qualitativen Nachweis sind beispielsweise die Luciferase oder auch die Beta-Galactosidase.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Markerstruktur ein Green Fluorescent Protein-GFP, die Glutathion-S- Transferase und/oder ein Fragment hiervon. Das Green Fluorescent Protein weist vorteilhafterweise eine geringe oder überhaupt keine cytotoxische Aktivität auf. Mit Vorteil sind die Absorptions-und Emissionsmaxima des Green Fluorescent Protein ähnlich denen von Fluorescin, so daß beispielsweise eine GFP-positive Zelle mit gleichen Methoden nachgewiesen werden kann, wie solche Zellen, die mit Fluorescin-gekoppelten Antikörpern gefärbt wurden, das heißt beispielsweise im UV-Licht, unter dem Fluoreszenz-Mikroskop oder im Zellsorter (FACS).

Als Markerproteine werden im Sinne der Erfindung nachdem solche Proteine verstanden, die an NES gekoppelt sind und den Nachweis des NES ermöglichen. Bevorzugte Markerproteine, die mit den NES fusioniert werden können, sind weiterhin : Glutathion-S-Transferase (GST), aber auch andere Fluoreszenzproteine, wie das rote oder gelbe, sowie das Maltose-bindende Protein (MBP) und andere.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform beinhaltet das Fusionsprotein die Markerstruktur an dem NH-Ende und/oder dem COOH-Ende.

Vorteilhafterweise kann hierdurch die Lokalisation von zu untersuchenden Peptiden oder Proteinen in der lebenden Zelle, insbesondere der Wirtszelle bestimmt werden. Weiterhin ist es beispielsweise möglich, in Echtzeit- Untersuchungen die Wanderung der Proteine und/oder Peptide zu verfolgen.

Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäurese- quenz der Formel (I) oder das Fusionsprotein codiert, oder einen komplementä- ren Strang davon. Der Begriff Nucleinsäure betrifft ein natürliches oder syntheti- sches Polymer von DNA oder RNA, die einzel-oder doppelsträngig sein kann und in einer anderen Ausführungsform eine synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nucleotidbase enthalten kann, die in DNA-oder RNA-Polymere ein- gebaut werden kann. Das Nucleinsäuremolekül kann cDNA, genomische DNA oder RNA, z. B. mRNA, sein. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vek- tor, der die vorstehend beschriebene Nucleinsäuresequenz umfaßt, insbeson- dere einen bakteriellen Vektor, wie ein Plasmid oder ein Virus.

Überdies betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind, insbesondere prokariotische oder eukariotische Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zelikulturen, Gewebe, Organe und dergleichen, die eine Zelle umfassen, die ein vorstehend beschriebenes Plasmid oder einen vorstehend beschriebenen Vektor enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das eine spezifische Reaktivität mit der Aminosäuresequenz gemäß der Formel (I) oder mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein und/oder der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz oder einzelne Domäne hiervon aufweisen. Diese Antikörper können zum Screenen von Expressions- Genbanken, zur Identifizierung von Klonen, die die erfindungsgemäßen Komplexe erzeugen und auch für therapeutische Zwecke verwendet werden.

Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff, betrifft einen Antikörper"betrifft den Nachweis, die Aktivierung oder Hemmung molekularer oder zellulärer Stoffwechselwege, die durch die Wechselwirkung der Aminosäuresequenzen gemäß der Formel (I) oder des erfindungsgemäßen Fusionsproteins induziert werden.

Der Begriff"Antikörper"betrifft bivalente und monovalente Moleküle, die die Eigenschaft aufweisen, mit einem Komplex oder mit der isolierten Struktur des erfindungsgemäßen Fusionsproteins der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz und/oder der Aminosäuresequenz gemäß der Formel (I) in Wechselwirkung zu treten.

Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff"Antikörper"bedeutet ein Protein, das aus einem oder mehreren Polypeptiden besteht, die im wesentlichen von Immunoglobulinen-Genen oder Fragmenten von Immunoglobulinen-Genen codiert werden. Leichte Ketten der erfindungsgemäßen Antikörper werden entweder in Kappa-oder Lambda- Ketten eingeteilt. Schwere Ketten der erfindungsgemäßen Antikörper werden in Gamma-, Mu-, Alpha-, Delta-oder Epsilon-Ketten eingeteilt. Die ihrerseits die Immunoglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren (bezüglich Einzelheiten vgl. die Definition der Begriffe im vorderen Teil der Beschreibung).

Der Ausdruck"bindet spezifisch an"sofern er im Zusammenhang mit einem erfindungsgemäßen Antikörper steht, betrifft eine Bindungsreaktion in Gegen- wart einer heterogenen Population von Proteinen oder anderer biologischer Substanzen, anhand der sich entscheiden läßt, ob eine Domäne vorhanden ist.

Unter den festgelegten Bedingungen eines Immuntests binden die erfindungsgemäßen Antikörper daher an spezielle Domänen, während die Bindung an andere in der Probe vorhandenen Proteine und/oder Peptide bzw. anderer erfindungsgemäßer Strukturen nicht signifikant ist. Eine spezifische Bindung an die Domäne unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der aufgrund seiner Spezifität für die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz gemäß Formel (I), die erfindungsgemäßen Fusionsproteine und/oder die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen ausgewähit worden ist. Zur Selektion von Antikörpern die eine spezifische Immunreaktivität mit den erfindungsgemäßen Strukturen, wie beispielsweise der Aminosäuresequenz gemäß Formel (I), den Fusionsproteinen und/oder den Nucleinsäuresequenzen zeigen, können verschiedene Immuntest- Ausführungsformen verwendet werden. Beispielsweise werden Festphasen- ELISA-Immuntests routinemäßig zur Selektion monoklonaler Antikörper verwendet, die eine spezifische Immunreaktivität mit den genannten Domänen zeigen. Die Immuntests die sich verwenden lassen, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, kompetitive und nichtkompetitive Testsysteme unter Verwendung von Techniken, wie Western-Blot-Analyse, Radioimmun-Tests, <BR> <BR> Immunpräzipitations-Tests, Präzipitin-Reaktionen, Geldiffusions-Präzipitin- Reaktionen, Immundiffusions-Tests, Agglutinations-Tests, Komplemenffixierungs-Tests, immunradiometrische Tests, Fluoreszenz- lmmuntests und Protein-A-Immuntests und dergleichen mehr.

Die erfindungsgemäßen Antikörper binden spezifisch an ein oder mehrere Epitope auf einer Domäne, die mit den erfindungsgemäßen biologischen Strukturen wie beispielsweise den Aminosäuresequenzen gemäß Formel (I), dem Fusionsprotein und/oder den Nucleinsäuresequenzen bzw. mit diesen Domänen in Wechselwirkung stehenden Strukturen beteiligt ist., Epitop" bedeutet den Bereich der erfindungsgemäßen biologischen Strukturen oder der in Wechselwirkung mit diesen Strukturen tretende Domänen, Proteine oder Nucleotidsäuresequenzen, die von einem Antikörper gebunden werden, wobei die Bindung die Assoziation eines zweiten Antikörpers mit den erfindungsgemäßen Strukturen verhindert und wobei der Antikörper die Bindung anderer Proteine verhindert.

In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Antikörpern um polyklonale, monoklonale Antikörper oder Fragmente davon. Antikörper- Fragmente umfassen diejenigen Fragmente, die mit den erfindungsgemäßen Strukturen in Wechselwirkung treten. Es kann sich auch um humanisierte Antikörper handeln, die typischerweise mittels Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wobei die menschlichen Sequenzen einen Antikörper, der mit den erfindungsgemäßen Strukturen in Wechselwirkung tritt, teilweise oder insgesamt umfassen.

Beispiele für humanisierte Antikörper umfassen schwere Antikörper oder Antikörper mit einem eingebauten CDR. Es kann sich auch um vollkommen menschliche Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Strukturen wie beispielsweise den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen und/oder den erfindungsgemäßen Aminosäuren handeln, die in genetisch veränderten Mäusen produziert werden.

Erfindungsgemäße Antikörper können auch eine daran angelagerte nachweisbare Markierung besitzen. Eine solche Markierung kann eine Fluorenszenz-Markierung beispielsweise mit Fluorescinisocyanat, eine enzymatische Markierung beispielsweise mit Meerrettichoxydase, eine Affinitätsmarkierung beispielsweise mit Biotin und/oder eine Isotopenmarkierung mit 1251sein. Die Erfindung umfaßt auch Hybridom-Zeffinien, die einen monoklonalen Antikörper produzieren, der mit den erfindungsgemäßen Strukturen wie beispielsweise den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, Fusionsprotein und/oder Nucleinsäuresequenzen in Wechselwirkung tritt.

Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich zur Diagnose und Therapie von Krankheiten, die mit dem Nucleus-Export-Signalpeptiden sowie den erfindungs- gemäßen Aminosäuresequenzen, den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen und/oder den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen im Zusammenhang stehen. Die Antikörper können als Teil eines diagnostischen Kits zum Nachweis verwendet werden, ob in einer biologischen Probe eine pathologische Verände- rung oder eine krankheitsinduzierende Modifizierung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, der erfindungsgemäßen Fusionsproteine, der erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Nucleus-Export-Signalpeptide stattgefunden hat bzw. vorliegt. Die biologischen Proben umfassen Gewebe, Untersuchungsproben und intakte Zellen oder Ex- trakte davon. Bei solchen Kits werden Antikörper eingesetzt, die eine angela- gerte Markierung besitzen, die einen Nachweis erlaubt. Die Antikörper eignen sich zur identifizierung normaler Domänen der erfindungsgemäßen biologi- schen Strukturen, oder mit Domänen und Bereichen die mit diesen Strukturen in Wechselwirkung treten. Die Antikörper an sich sind auch zur Diagnose und Therapie geeignet.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit, umfassend die Aminosäuresequenz der Formel (I), das erfindungsgemäße Fusionsprotein, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, den erfindungsgemäßen Vektor, die erfindungsgemäße Wirtszelle und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper.

Im Zusammenhang mit der Erfindung können die erfindungsgemäßen Aminosäuren, die erfindungsgemäßen Fusionsproteine, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, die erfindungsgemäßen Vektoren, die erfindungsgemäßen Wirtszellen und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper in Liposomen mit reinen Lipidmembranen oder mit biologischen Membranen enthalten sein. Die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz kann als Adjuvans oder als Substanz zur Immunisierung verwendet werden. Die Liposomen oder das Adjuvans eignen sich zur Diagnose und zur Therapie von Krankheiten, die mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren, den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, den erfindungsgemäßen Vektoren, den erfin- dungsgemäßen Wirtszellen, den erfindungsgemäßen Antikörpern und/oder den erfindungsgemäßen Nucleus-Export-Signalpeptiden in Zusammenhang stehen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz codierende Nucleotidsequenz und/oder die das Fusionsprotein codierende Nucleotidsequenz zur Herstellung eines Medikaments, Arzneistoffs oder Therapeutikums zur Behandlung von Krankheiten, die mit den Nucleus-Export-Signalpeptiden in Zusammenhang stehen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Fusionsproteins zur Herstellung eines Arzneistoffs zur Diagnose und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit den Nucleus-Export-Signalpeptiden in Zusammenhang stehen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch nichtmenschliche Säugerzellen, die die Expression der Aminosäuresequenz der Formel (I) zeigt. Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die ein Gen zur Expression der Aminosäuresequenz der Formel (I) enthalten, die mindestens eine Mutation aufweisen.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist die erfindungsgemäße Zelle, insbesondere eine nichtmenschliche Säugerzelle, mindestens ein Antisense-Konstrukt auf, die der Expression der Aminosäuresequenz gemäß der Formel (I) entgegen wirkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch nichtmenschliche Säuger, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Zellen enthalten.

Vorteilhafterweise kann es sich bei den nichtmenschlichen Säugern um Säuger handeln, die in Forschung und Entwicklung bzw. für verschiedene Labortestreihen üblich sind, wie beispielsweise Ratten, Mäuse, Primaten, Hamster, Kaninchen, Ziegen u. a.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Aminosäuresequenz gemäß der Formel (I), des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, der erfindungsgemäßen Vektoren, der erfindungsgemäßen Wirtszellen und/oder der erfindungsgemäßen Antikörper zur Herstellung eines Arzneistoffes zur Diagnose und/oder Behandlung von mit Nucleus-Export-Signalpeptiden in Zusammenhang stehenden Krankheiten.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, der erfindungsgemäßen Vektoren, der erfindungsgemäßen Wirtszellen und/oder der erfindungsgemäßen Antikörper zum Screening von Wirkstoffen, welche die Nucleus-Export-Aktivität modifizieren. Unter Modifizieren im Sinne der Erfindung wird jede Beeinflussung der Nucleus-Export-Aktivität verstanden, die zu einer Steigerung oder Verminderung der Aktivität führt, die ohne Wechselwirkung mit den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, der erfindungsgemäßen Vektoren, der erfindungsgemäßen Wirtszellen und/oder der erfindungsgemäßen Antikörper mit biologischen, chemischen oder physikalischen Meßmethoden zu bestimmen ist.

Desweiteren sind die erfindungsgemäßen Nucleus-Export-Signalpeptide und Fusionsproteine in Funktionstests in der Immunologie einsetzbar, wie z. B. zur Identifizierung von spezifischen Antikörpern, insbesondere gegen die Amino- säuresequenz gemäß der Formel (I).

Außerdem können sie zum Screening von Wirkstoffen dienen, welche die Nucleus-Export-Aktivität hemmen oder aktivieren. Insbesondere zum Screening für Substanzen, die die Funktionen regulierender Cytokine und Wachstumsfaktoren aufweisen.

Die Erfindung wird am Beispiel des Peptides W D R T F S L F Q Q L I Q näher erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiel : Identifizierung von Peptiden mit NES-Funktion Das Amino-terminale Dritte) des Stat1-Proteins enthält eine Anzahl von Helices, welche Aminosäuren beherbergen. Zur Identifizierung von Peptiden mit einer NES-Funktion wurde das Arzneimittel Leptomycin B (LMB) eingesetzt, welches als spezifischer Inhibitor des Exportrezeptors CRM1 (auch Exportin 1 genannt) bekannt ist. Die Export-Aktivität eines Stat-Nuklear-Exportsignals kann demzufolge durch LMB blockiert werden.

Zelikultur und Transfektion Humane HeLa S3-Zellen und 293T-Zellen wurden bei 37°C und 7% CO2- Atmosphäre in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert. Das Wachstumsmedium umfasste außerdem Streptomycin, Penicillin und Amphotericin (Biochrom, Berlin). Die 293T Zellen wurden auf Poly-L-Lysin- beschichteten Kulturgefäßen kultiviert und mit Lipofektamin-plus (Gibco) in 12- well-Platten den Herstellerangaben folgend transfektiert. 20 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 30 Minuten mit Wachstumsmedium umfassend Human Interferon-y (IFNy ; 5 ng/ml ; Gibco) und Cycloheximidin (CHX ; 10 lug/ml). Nach dem Waschen mit Wachstumsmedium wurden die Zellen mit CHX weiter inkubiert. Leptomycin (Dr. Yoshida, Tokyo) wurde in einer Konzentration von 10 ng/ml verwendet und eine Stunde vor der Stimulation mit IFNy. The Proteoasome Inhibitor MG132 (Calbiochem) wurde in einer Konzentration von 50 pMol 30 Minuten vor der Stimulation mit IFNy zugegeben.

Die Transformation humaner eukaryonter Zellen erfolgte nach Standardprotokollen (Ca-Phosphat oder Lipofektion). Der Kerntransport wurd durch Gabe von humanen Interferon gamma (5ng/ml, 30 Min.) ausgelöst. Die Behandlung mit dem Exportblocker Leptomycin B (10 ng/ml ; Fukuda, M., Asano, S., Nakamura, T., Adachi, M., Yoshida, M., Yanagida, M. & Nishida, E.

(1997) Nature 390,308-311) startete eine Stunde vor der Interferonbehandlung.

Plasmid-Herstellung Verschiedene Proben von humanem Stat1 cDNA (Dr. J. E. Darnel, New York) wurden durch PCR unter Verwendung einer Vent-Polymerase (NEB) mit einem spezifischen Set von Primern (MWG-Biotech AG, Ebersberg ; IDT, Coralville) amplifiziert, um artifizielle BamHl (5)-und EcoRl (3')-Seiten an den Enden herzustellen. Die folgenden Segmente der coiled-coil domain von Stat1 wurden hergestellt : N-Domäne (Aminosäuren 1-129), Helix-1 (Aminosäuren 127-188), Helix-2 (Aminosäuren 183-254) Helix-3 (Aminosäuren 254-292) und Helix-4 (Aminosäuren 289-314) unter Verwendung der folgenden Primer-Sets : N-Domäne : 5'-atataaggatccccatgtctcagtggtacgaacttcagc-3'und 5'-atataagaattctattccccgactgactgagcctgatt-3' ; Helix-1 : 5'-atataaggatcccctcggggaatattcagagcacagtg-3'und 5'-atataagaattcttgccacaccattggtctcgtg-3' Helix-2 : 5'-atataaggatccccgagaccaatggtgtggcaaag-3'und 5'-atataagaattctagcattgggcggccccccaatac-3' Helix-3 : 5'-atataaggatccccgcttgcttggatcagctgcaga-3'und 5'-atataagaattctgtcatgttcgtaggtgtatttc-3' Helix-4 : 5'-atataaggatccccacctacgaacatgaccctatcac-3'und 5'-atataagaattctctgaatgagctgctggaaaagac-3' (Restriktionsbereiche sind unterstrichen).

Plasmidkonstruktion Die Plasmide zur Erzeugung der GST-GFP Fusionsproteine für die Mikroinjektion wurden wie folgt hergestellt : Ein Abschnitt des Vektors pEGFPNI (Fa. Clontech), der für das GFP (Green fluorescent protein) Protein codiert, wurde mittels PCR amplifiziert (Primer 5'- atatatagaattcagatggtgagcaaggggcgaggagctg ; 5'-gattatgatctagagtcgcggccgc), mit den Enzymen EcoRl und Nocl gespalten, und unter Erhalt des Leserasters in den Vektor pGEX5X-2 (Fa. Pharmacia) legiert. In diesen Vektor können nun Gene und Genfragmente kloniert werden. Dazu stehen im Vektor EcoRl und BamHl Restriktionsschnittstellen zur Verfügung. Die Molekularbiologischen Manipulationen erfolgten nach Standardmethoden (Gassen und Schrimpf ; Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg).

Nach der Behandlung der PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen wurden die PCR-Produkte in Bglll/EcoRl-Bereiche von pEGFPC2 (Clontech) für die Transfektion der 293T-Zellen ligiert, wahlweise war es auch möglich, die PCR- Produkte in die BamHI/EcoRI-Klonierungsbereiche des bakteriellen Expressionsvektors (pGST-FFP) zu. legieren, welche sich zwischen den cDNAs für die Glutathione S-Transferase (GST) und dem grünen fluoreszierenden Protein (GFP) für die Mikroinjektion des Fluoreszenzfusionsproteins mit Stat1- Fragmenten (GST-Stat-GFP) in HeLa S3 Zellen befinden.

Isolierung der GST-GFP-Fusionsproteine Es wurden Bakterien des Stammes E. coli BL21 pLysS mit Plasmide zur Ex- pression der GST-GFP Fusionsproteine mittels Elektroporation transformiert.

Positive Klone wurden mittels Antibiotikaresistenz selektioniert. Eine Über- nachtkultur der entsprechenden Klone wurde 1 : 100 mit LB-Medium verdünnt (Gesamtvol. 1 Liter) und bis zum Erreichen einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Kultur in Eis- wasser auf 15-18°C abgekühlt, mit 1 mlPIG versetzt und für weitere 20 Stunden bei 18°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und durch dreimaliges Einfrieren (auf Trockeneis)/Auftauen (bei 37°C im Wasser- bad) und Ultraschallbehandlung (5 mal je 20 Sekunden) im Extraktionspuffer (PBS mit 2mM EDTA, 2mM EGTA, 1% Triton X-100,1mM DTT, Complete Pro- teasehemmer, Fa. Roche) aufgeschlossen. Der Extrakt wurde zentrifugiert (40 Min. bei 20.000 g) und der Überstand mit 1,5 ml Glutathion-Sepharose 4B (Fa. Pharmacia) versetzt. Nach 2 stündigem Über-Kopf-Rotieren bei 4 C wurde die Sepharose sedimentiert (10 Min. 10.000 g) und der Überstand verworfen.

Die Sepharose wurde dreimal mit Extraktionspuffer gewaschen, einmal mit Ex- traktionspuffer ohne Triton X-100, und dann eluiert (5 Min. bei RT vorsichtig schütteln, abzentrifugieren). Der Elutionspuffer bestand aus PBS mit 5 mM re- duziertem Glutathion. Das eluierte Protein wurde dann mittels Ultrafiltration (Centriprep 50 Gerät, Fa. Amicon) auf eine Konzentration von etwa 1 mg/ml gebracht (gemessen mit Biorad Protein Assay, Fa. Biorad) und anschließend für 15 Stunden gegen Injektionspuffer (20 mM HEPES, 110 mM k-Azetat, 2 mM Mg-Azetat, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, ph 7,5) dialysiert. Das Protein konnte nun direkt injiziert werden, oder bei-80°C gelagert werden. Das Einfrieren ge- schah auf Trockeneis.

Die Stat1-Umverteilung : Die Stat1-Umverteilung, die auf eine IFN-gamma-Stimulierung folgt, verläuft nach einem typischen Zeitplan. 10 Minuten nach einer halben Stunde Stimulierung mit IFN-gamma ist das gesamte Stat1 nuklear. Nach weiteren 3 Stunden findet man etwa gleiche Fluoreszenz in cytoplasmatischem und nuklearem Kompartiment und nach weiteren fünf Stunden scheint der Nucleus weniger Stat1 zu enthalten als das umliegende Cytoplasma.

Eine Zugabe von LMB eine Stunde von IFN-gamma-Behandlung bewirkte keine Umverteilung in dem Zeilkern im Ruhezustand, aber beeinträchtigte nicht die durch IFN-gamma ausgelöste Kernakkumulation weder Stat1-Cytoplasma- Lokalisation (im Ruhezustand) noch seine nukleare Akkumulation nach Aktivierung. Der spätere Nuklear-Export jedoch wurde wesentlich unterdrückt.

Auch drei Stunden nach IFN-Stimulierung war das meiste Stat1 noch in dem Nucleus und es dauerte fünf Stunden bis signifikante Mengen an Stat1 im Cytosol erschien.

Es wurden verschiedene Stücke der Stat1-cDNA durch PCR synthetisiert und in den Vektor pGST-GFP (durch bakterielle Expression erzeugte Fluoreszenz- Fusionsproteine von Stat1-Peptiden) eingebracht. Die affinitätsgereinigten Fu- sionsproteine wurden in das Cytoplasma und die Nuclei von HeLa-Zellen mikro- initiieren und ihre subzelluläre Lokalisation wurde über mehrere Stunden ver- folgt (Abb. 2). Nach Addition von IFN-gamma war das Transport-Verhalten aller geprüften Fusionsproteine unbeeinflußt. Keines der chimären Konstrukte (N- Domäne, Helices-1 bis-4 der"gewickelten Spiraldomäne"zeigten die Tendenz vom Cytoplasma in den Nucleus zu translokalisieren.

Im Gegensatz dazu, zeigte die Helix-4 der"gewickelten Spiraldomäne" (Aminosäuren 289-314 von Stat1) Translokationsaktivität, wenn die rekombinanten Proteine in den Nucleus injiziert wurden. Nach 3 Stunden Inkubation war das Fusionsprotein im Cytoplasma lokalisiert und der Zelikern weitgehend frei davon.

Wurden HeLa-Zellen in Gegenwart von LMB inkubiert, verblieb das Fusionsprotein mit Helix-4 für Stunden im Nucleus. Die Nuklear-Export-Aktivität wurde demzufolge durch LMB vollständig blockiert.

Um die gewünschte Region mit NES-Aktivität vom Helix-4 einzuschränken, wurden noch GST-GFP-Fusionsproteine mit der Amino-oder Carboxy- terminalen Hälfte der Helix-4 gebildet (GST-h4N (AS 289-301)/h4C (AS 302- 314)-GFP). Nur die Carboxy-terminale Hälfte, die die Aminoäuren 302 bis 314 (GST-h4C-GFP) enthielt, wies Nuklear-Export-Fähigkeit auf. Eine weitere Verkürzung auf 5 Reste am Amino-Terminus der Helix-4C beendete jedoch die Aktivität des Peptides.

Eine Analyse mit Mutationen der Aminosäuresequenz der Helix-4C zeigte die Wichtigkeit hydrophober Reste für die Export-Aktivität. So besitzt eine mutierte Helix-4C von Stat1, die an den Positionen Leu308, Phe309, Leu312 und Ile 313 durch Alanin substituiert ist, keine Export-Aktivität.

Auch bereits ein einfacher Aminosäurewechsel von Leu308 durch Alanin zeigte den gleichen Effekt und das mutierte GST-h4C-GFP-Protein translokalisierte nicht länger in das Cytoplasma, sondern blieb auf der Injektionsseite im Nucleus.

Um die zelluläre Lokalisation eines Fusionsproteins des Stat1-NES mit einem heterologen Protein unter stabilen Bedingungen zu bestimmen, wurde ein Fusi- onsgen, welches Helix-4 (Aminosäuren 292-314 des Stat1-Proteins) und das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) kodiert, gebildet. Da die molekulare Masse des exprimierten Fusionsproteins (<30 kDa) klein genug ist, den Eintritt in den Nuc- leus durch Diffusion zu gestatten, kann das GFP-Fusionsprotein als Marker für den Nuklear-Export verwendet werden.

Das Fusionsprotein von Helix-4 mit GFP war nicht mehr im Nucleus sondern eindeutig im Cytoplasma lokalisiert. Das beweist, daß die lineare Sequenz der Reste 302 bis 314 der Helix-4 als ein übertragbares Nuklear-Export-Signal anzusehen ist.

Im Unterschied dazu, wurde für GFP allein eine Gleichverteilung zwischen Cy- toplasma und Nucleus beobachtet was auch für ein Fusionsprotein mit Stat1- Aminosäuren 137-183 (Helix-1) gilt.