1.本発明のポリヌクレオチド
 本発明は、第1に、オキシダーゼ活性を有す るタンパク質をコードするポリヌクレオチド を提供する。

 本発明においてオキシダーゼとは、アミ� ��酸等の基質の酸化的脱アミノ基反応を触媒� ��る酵素を意味し、オキシダーゼ活性を備え� ��とは、係るオキシダーゼの酵素活性を備え� ��ことを意味する。このような反応の代表的� ��ものとしては、トリプトファンを3-インド� �ルピルビン酸に変換する反応(例えば、下記� ��応式5に示される反応が挙げられる。)を示� �ことができる。尚、本発明においてトリプ� �ファン等のアミノ酸は、L-体、D-体、DL-体の� ��れも含むものであるが、通常はL-体である� �

 本発明においては、オキシダーゼは、上� ��の反応を触媒するとともに、カタラーゼ活� ��をも備えていることが好ましい。カタラー� ��活性とは、過酸化水素水の分解反応を触媒� ��る活性であり、例えば下記反応式6に示され る反応を触媒する。

 本発明のポリヌクレオチドとしては、こ� ��ようなオキシダーゼ活性を有するタンパク� ��をコードするタンパク質であり、その代表� ��なものとして、(a)配列番号2に記載のアミノ 酸配列を有するタンパク質をコードするポリ ヌクレオチドを挙げることができる。

 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する タンパク質は、プロビデンシア レットゲリ( Providencia rettgeri)AJ2770株から、本発明者らが� �規に単離し、オキシダーゼ活性を有するタ� �パク質のアミノ酸配列として特定したもの� �ある。AJ2770株は1985年11月28日に通商産業省工 業技術院微生物工業技術研究所(現独立行政� �人 産業技術総合研究所)に国際寄託され、� �託番号FERM BP-941が付与されている。AJ2770株� �当初プロテウス レットゲリ(Proteus rettgeri)� �同定されたが、再同定の結果、プロビデン� �ア レットゲリエスピー(Providencia rettgeri)に� ��類された。

 また、上記反応式5に示されるオキシダー ゼ活性を有するタンパク質は、プロテウス � ��ットゲリ(Proteus rettgeri)IFO13501株からも単離� ��得る。IFO13501株は、財団法人発酵研究所(日� ��国大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17-85)に 寄託されたものであるが、平成14年6月30日以� ��、その業務は独立行政法人製品評価技術基� ��機構(NITE)・バイオテクノロジー本部(DOB)・� �物遺伝資源部門(NBRC)に移管され、NBRCより上� ��IFO番号を参照して分譲を受けることができ� ��。

 本発明のポリヌクレオチドは、上述の配列� ��号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク 質と実質的に同一のタンパク質をコードする ポリヌクレオチドをも含む。具体的には、下 記ポリヌクレオチド(b)およびポリヌクレオチ ド(c)を挙げることができる。
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において� �1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、お� ��び/または挿入を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、オキシダーゼ活性を有するタンパク質 をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上� �相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ� �オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコ� �ドするポリヌクレオチド

 ポリヌクレオチド(b)において、「数個」� ��は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造� ��おける位置や種類によっても異なるが、ア� ��ノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を� ��きく損なわない範囲のものであり、具体的� ��は、好ましくは2~140個、より好ましくは2~95� ��、より好ましくは2~50個、より好ましくは2~3 0個、さらに好ましくは2~10個である。また、1 若しくは数個のアミノ酸の変異を有する配列 は、変異を有さない配列に対して、70%以上、 好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上 、さらにより好ましくは95%以上、さらにより 好ましくは98%以上の相同性(ホモロジー)を有� ��るものとすることができる。ここでいう相� ��性とは、2つまたはそれ以上の配列間におけ る配列の一致の度合いを表す概念である。相 同性の一つの簡便な評価方法として、二つの 配列のうちより長い方のアミノ酸配列におけ る全長アミノ酸残基数を分母として、比較す る二つの配列のうち対応するアミノ酸残基が 同一のものの数を分子として算出し、これに 100を乗じて数値化した度合いを得ることがで きる。相同性は、バイオインフォマティクス の論理に従ってより細密に算出することが可 能であり、複数の配列の類似性を対比するた めの種々のソフトウエアが開発されている。 相同性を算出するためのソフトウエアとして は、例えば、BLASTなどが挙げられる。

 また、ポリヌクレオチド(c)において、配� ��番号2に記載のアミノ酸配列との相同性は好 ましくは、70%、より好ましくは80%、より好ま しくは90%以上、より好ましくは95%以上、さら に好ましくは98%以上である。

 ポリヌクレオチド(b)またはポリヌクレオ� ��ド(c)は、オキシダーゼ活性を有することが� ��要である。特に、30℃、pH8の条件下で、変� �を含まない状態で、配列番号2に記載のアミ� ��酸配列を有するタンパク質の半分程度以上� ��より好ましくは80%以上、さらに好ましくは9 0%以上の酵素活性を保持していることが望ま� ��い。例えば、30℃、pH8の条件下で配列番号2� ��記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の� ��分程度以上、より好ましくは80%以上、さら� ��好ましくは90%以上の酵素活性を保持してい� ��ことが望ましい。

 上記ポリヌクレオチド(b)に示されるよう� ��アミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異� ��によって、配列番号2に記載のアミノ酸配列 中の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、お よび/または挿入されるように改変されたア� �ノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ� �配列に対応するヌクレオチド配列を発現さ� �ることによって得られる。

 また、ポリヌクレオチド(c)に示されるよ� ��なアミノ酸の変異も、例えば部位特異的変� ��法によって、配列番号2に記載のアミノ酸配 列中の特定の部位のアミノ酸が前記配列と90% 以上の相同性を有する範囲で改変されたアミ ノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ酸 配列に対応するヌクレオチド配列を発現させ ることによって得られる。

 また、上記のような塩基の置換、欠失、� ��よび/または挿入等には、微生物の種あるい は菌株による差等、天然に生じる変異も含ま れる。上記のような変異を有するアミノ酸を コードするポリヌクレオチドを適当な細胞で 発現させ、発現産物の本酵素活性を調べるこ とにより、配列番号2に記載のアミノ酸配列� �有するタンパク質と実質的に同一のタンパ� �質が得られる。

 上述のポリヌクレオチド(a)~(c)において、そ れぞれのアミノ酸配列を規定するヌクレオチ ド配列は、コドンの縮重により複数あり得る 。ポリヌクレオチド(a)~(c)の具体例の代表的� �ものとしては、下記のポリヌクレオチド(d)� �挙げられる。
(d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列のう� �ヌクレオチド番号61~1476のヌクレオチド配列� ��有するポリヌクレオチド

 配列番号1に記載のヌクレオチド配列から なるポリヌクレオチドは、プロビデンシア � ��ットゲリ AJ2770株より単離されたものであ� �。配列番号1のヌクレオチド番号61~1476のヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドは、 コードシーケンス(CDS)部分であり、このCDS部� ��によりコードされるアミノ酸配列は、配列� ��号2に示される。

 なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え� ��法については、Molecular Cloning,2nd edition,Cold� �Spring Harbor press(1989)などの記載に準じて行� �ことができる。

 本発明のポリヌクレオチド(d)は、オキシ� ��ーゼ活性を有する微生物、好ましくは、ト� ��プトファンに作用するアミノ酸オキシダー� ��活性とカタラーゼ活性を有する微生物から� ��ることができる。例えばプロビデンシア � �ットゲリなどの染色体DNA、もしくはDNAライ� �ラリーから、PCR(polymerase chain reacion、White,T. J.et al;Trends Genet.,5,185(1989)参照)又はハイブリ ダイゼーションによって取得することができ る。PCRに用いるプライマーは、プロビデンシ ア レットゲリから精製されたオキシダーゼ� ��基づいて決定された内部アミノ酸配列に基� ��いて設計することができる。また、配列番� ��1に記載のヌクレオチド配列に基づいてプラ イマーやハイブリダイゼーション用のプロー ブを設計することもでき、プローブを使って 単離することもできる。PCR用のプライマーと して、5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域に対応� �る配列を有するプライマーを用いると、本� �素のコード領域全長を増幅することができ� �。具体的には、5'側プライマーとしては配列 番号1において塩基番号61よりも上流の領域の ヌクレオチド配列を有するプライマーが、3'� ��プライマーとしては塩基番号1476よりも下流 の領域のヌクレオチド配列に相補的な配列を 有するプライマーが挙げられる。

 プライマーの合成は、例えば、Applied Bios ystems社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホス� �アミダイト法を用いて(Tetrahedron Letters(1981),2 2,1859参照)常法に従って合成できる。PCR反応� �、例えばGene Amp PCR System 9600(PERKIN ELMER社� �)及びTaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit(宝酒造� �製)を用い、各メーカーなど供給者により指� ��された方法に従って行うことができる。

 本発明のポリヌクレオチドには、上記ポリ� ��クレオチド(d)と実質的に同一のポリヌクレ� ��チドも含まれる。このような実質的に同一� ��ポリヌクレオチドとしては、下記ポリヌク� ��オチド(e)を挙げることができる。
(e)配列番号1に記載のヌクレオチド配列のう� �ヌクレオチド番号61~1476のヌクレオチド配列� ��相補的なヌクレオチド配列、または該配列� ��ら調製されうるプローブとストリンジェン� ��な条件下でハイブリダイズし、かつオキシ� ��ーゼ活性を有するタンパク質をコードする� ��リヌクレオチド

 本発明において「ストリンジェントな条� ��」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが� ��成され、非特異的なハイブリッドが形成さ� ��ない条件をいう。この条件を明確に数値化� ��ることは困難であるが、一例を示せば、相� ��性が高いポリヌクレオチド同士、例えば50%� ��上、より好ましくは80%以上、さらに好まし� ��は90%以上、中でも好ましくは95%以上、更に� ��り好ましくは97%以上の相同性を有するポリ� ��クレオチド同士がハイブリダイズし、それ� ��り相同性が低いポリヌクレオチド同士がハ� ��ブリダイズしない条件、あるいは通常のサ� ��ンハイブリダイゼーションの洗いの条件で� ��る60℃、1×SSC、0.1%SDS、好ましくは、60℃、0. 1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダ� �ズする条件が挙げられる。このような条件� �ハイブリダイズする遺伝子の中には途中に� �トップコドンが発生したものや、活性中心� �変異により活性を失ったものも含まれるが� �それらについては、市販の発現ベクターに� �なぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物� �酵素活性を後述の方法で測定することによ� �て容易に取り除くことができる。

 ポリヌクレオチド(e)におけるプローブは� ��配列番号1のヌクレオチド配列と相補的な配 列から調整されうる配列からなる。そのよう なプローブは、配列番号1のヌクレオチド配� �に基づいて作製したオリゴヌクレオチドを� �ライマーとし、配列番号1のヌクレオチド配� ��を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製� ��ることができる。プローブとして、300bp程� �の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブ� �ダイゼーションの洗いの条件としては、例� �ば50℃、2×SSC、0.1%SDSなどが挙げられる。

 上述のポリヌクレオチド(e)の場合には、� ��キシダーゼ活性を有することが必要である� ��例えば、30℃、pH8の条件下で、前述のポリ� �クレオチド(d)によってコードされるアミノ� �配列で規定されるタンパク質の半分程度以� �、より好ましくは80%以上、さらに好ましく� �90%以上の酵素活性を保持していることが望� �しい。具体的には、30℃、pH8の条件下で、配 列番号1に記載のヌクレオチド配列のうちヌ� �レオチド番号61~1476のヌクレオチド配列によ� ��コードされるタンパク質の半分程度以上、� ��り好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%� ��上の酵素活性を保持していることが望まし� ��。

 これらのポリヌクレオチド(e)の入手手段� ��特に限定されない。例えば、変異を有する� ��酵素をコードするポリヌクレオチドまたは� ��れを保持する細胞などから、配列番号1に記 載のCDSと相補的なヌクレオチド配列からなる ポリヌクレオチドもしくは同ヌクレオチド配 列から調製されるプローブとストリンジェン トな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキ シダーゼ活性を有するタンパク質をコードす るポリヌクレオチドを単離することによって 得ることができる。

 プローブは、例えば配列番号1に記載のヌ クレオチド配列に基づいて常法により作製す ることができる。また、プローブを用いてこ れとハイブリダイズするポリヌクレオチドを つり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単 離する方法も、常法に従って行えばよい。例 えば、DNAプローブはプラスミドやファージベ クターにクローニングされたヌクレオチド配 列を増幅し、プローブとして用いたいヌクレ オチド配列を制限酵素により切り出し、抽出 して調製することができる。切り出す箇所は 、目的とするポリヌクレオチドに応じて調節 することができる。

 このような改変されたポリヌクレオチド� ��、従来知られている突然変異処理によって� ��得され得る。突然変異処理としては、本酵� ��をコードするポリヌクレオチド、例えば上� ��のポリヌクレオチド(d)を、ヒドロキシルア� ��ン等でインビトロ処理する方法、および本� ��素をコードするポリヌクレオチドを保持す� ��エシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN -メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)� �しくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用い� �れている変異剤によって処理する方法が挙� �られる。

2.本発明の組換えポリヌクレオチド、形質転� ��体およびオキシダーゼの製造方法
 本発明は第2に、上述の本発明のポリヌクレ オチドを有する組換えポリヌクレオチド、該 組換えポリヌクレオチドが導入された形質転 換体、および培地中で培養し、培地中および /または形質転換体中に、オキシダーゼを蓄� �させることを特徴とするオキシダーゼの製� �方法を提供する。

 ポリヌクレオチドにより特定されるタン� ��ク質を発現させるための宿主としては、エ� ��ェリヒア コリ(Escherichia coli)等のエシェリ� ��ア属細菌、及びバチルス ズブチリス(Bacillu s subtilis)をはじめとする種々の原核細胞、サ ッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevi siae)、ピヒア スティピティス(Pichia stipitis)� �アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)を� �じめとする種々の真核細胞を用いることが� �きる。

 ポリヌクレオチドを宿主に導入するのに� ��いる組換えポリヌクレオチドは、発現させ� ��うとする宿主の種類に応じたベクターに、� ��入しようとするポリヌクレオチドを、該ポ� ��ヌクレオチドがコードするタンパク質が発� ��可能な形態で挿入することで調製可能であ� ��。本発明のポリヌクレオチドを発現させる� ��めのプロモータとしては、プロビデンシア� �レットゲリなどのオキシダーゼ遺伝子固有� �プロモータが宿主細胞で機能する場合には� �該プロモータを使用することができる。ま� �、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモ� �タを本発明のポリヌクレオチドに連結し、� �プロモータ制御下で発現させるようにして� �よい。

 組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導� ��するための形質転換法としては、D.M.Morrison� ��方法(Methods in Enzymology 68,326(1979))あるいは� ��容菌細胞を塩化カルシウムで処理してポリ� ��クレオチドの透過性を増す方法(Mandel,M.and H iga,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))等が挙げられる。

 タンパク質を組換えポリヌクレオチド技� ��を用いて大量生産する場合、該タンパク質� ��生産する形質転換細胞内で該タンパク質が� ��合し、タンパク質の封入体(inclusion body)を� �成させる形態も好ましい一実施形態として� �げられる。この発現生産方法の利点は、目� �のタンパク質を菌体内に存在するプロテア� �ゼによる消化から保護する点および目的の� �ンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作に� �って簡単に精製できる点等である。

 このようにして得られるタンパク質封入� ��は、タンパク質変性剤により可溶化され、� ��にその変性剤を除去することによる活性再� ��操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的� ��活性なタンパク質に変換される。例えば、� ��トインターロイキン-2の活性再生(特開昭61-2 57931号公報)等多くの例がある。

 タンパク質封入体から活性型タンパク質� ��得るためには、可溶化・活性再生等の一連� ��操作が必要であり、直接活性型タンパク質� ��生産する場合よりも操作が複雑になる。し� ��し、菌体の生育に影響を及ぼすようなタン� ��ク質を菌体内で大量に生産させる場合は、� ��活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄� ��させることにより、その影響を抑えること� ��できる。

 目的タンパク質を封入体として大量生産� ��せる方法として、強力なプロモータの制御� ��、目的のタンパク質を単独で発現させる方� ��の他、大量発現することが知られているタ� ��パク質との融合タンパク質として発現させ� ��方法がある。

 以下、形質転換された大腸菌を作製し、� ��れを用いてオキシダーゼを製造する方法を� ��として、より具体的に説明する。なお、大� ��菌などの微生物にオキシダーゼを作製させ� ��場合、タンパク質のコード配列として、リ� ��ダー配列を含む前駆タンパク質をコードす� ��ポリヌクレオチドを組み込こんでも、リー� ��ー配列を含まない成熟タンパク質領域のポ� ��ヌクレオチドのみを組み込んでもよく、作� ��しようとする酵素の製造条件、形態、使用� ��件などにより適宜選択することができる。

 オキシダーゼをコードするポリヌクレオ� ��ドを発現させるプロモータとしては、通常� ��腸菌における異種タンパク質生産に用いら� ��るプロモータを使用することができ、例え� ��、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモ� �タ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダ� �ァージのPRプロモータ、PLプロモータ等の強� ��なプロモータが挙げられる。また、ベクタ� ��としては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298� ��pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、p MW218等を用いることができる。他にもファー� ��ポリヌクレオチドのベクターも利用できる� ��さらに、プロモータを含み、挿入ポリヌク� ��オチド配列を発現させることができる発現� ��クターを使用することもできる。

 オキシダーゼを融合タンパク質封入体と� ��て生産させるためには、オキシダーゼ遺伝� ��の上流あるいは下流に、他のタンパク質、� ��ましくは親水性であるペプチドをコードす� ��遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子� ��する。このような他のタンパク質をコード� ��る遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積� ��を増加させ、変性・再生工程後に融合タン� ��ク質の溶解性を高めるものであればよく、� ��えば、T7gene 10、β-ガラクトシダーゼ遺伝子 、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインター� ��ェロン遺伝子、インターロイキン-2遺伝子� �プロキモシン遺伝子等が候補として挙げら� �る。

 これらの遺伝子とオキシダーゼをコード� ��る遺伝子とを連結する際には、コドンの読� ��取りフレームが一致するようにする。適当� ��制限酵素部位で連結するか、あるいは適当� ��配列の合成ポリヌクレオチドを利用すれば� ��い。

 また、生産量を増大させるためには、融� ��タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列で� ��るターミネータを連結することが好ましい� ��合がある。このターミネータとしては、rrnB ターミネータ、T7ターミネータ、fdファージ� �ーミネータ、T4ターミネータ、テトラサイク リン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA� �伝子のターミネータ等が挙げられる。

 オキシダーゼまたはオキシダーゼと他の� ��ンパク質との融合タンパク質をコードする� ��伝子を大腸菌に導入するためのベクターと� ��ては、いわゆるマルチコピー型のものが好� ��しく、ColE1由来の複製開始点を有するプラ� �ミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系の� �ラスミドあるいはその誘導体が挙げられる� �ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠� �、および/または挿入などによってプラスミ� ��に改変を施したものを意味する。なお、こ� ��でいう改変とは、変異剤やUV照射などによ� �変異処理、あるいは自然変異などによる改� �をも含む。

 また、形質転換体を選別するために、該� ��クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマー� ��ーを有することが好ましい。このようなプ� ��スミドとして、強力なプロモータを持つ発� ��ベクターが市販されている(pUC系(宝酒造(株) 製)、pPROK系(クローンテック製)、pKK233-2(クロ� ��ンテック製)ほか)。

 プロモータ、オキシダーゼまたはオキシ� ��ーゼと他のタンパク質との融合タンパク質� ��コードする遺伝子、場合によってはターミ� ��ータの順に連結したポリヌクレオチド断片� ��、ベクターポリヌクレオチドとを連結して� ��換えポリヌクレオチドを得る。

 該組換えポリヌクレオチドを用いて大腸� ��を形質転換し、この大腸菌を培養すると、� ��キシダーゼまたはオキシダーゼと他のタン� ��ク質との融合タンパク質が発現生産される� ��形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現� ��通常用いられる株を使用することができる� ��、エシェリヒア コリ JM109株が好ましい。� ��質転換を行う方法、および形質転換体を選� ��する方法はMolecular Cloning,2nd edition,Cold Sprin g Harbor press(1989)等に記載されている。

 融合タンパク質として発現させた場合、� ��液凝固因子Xa、カリクレインなどの、オキ� �ダーゼ内に存在しない配列を認識配列とす� �制限プロテアーゼを用いてオキシダーゼを� �り出せるようにしてもよい。

 生産培地としては、M9-カザミノ酸培地、L B培地など、大腸菌を培養するために通常用� �る培地を用いてもよい。また、培養条件、� �産誘導条件は、用いたベクターのマーカー� �プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜� �択する。

 オキシダーゼまたはオキシダーゼと他の� ��ンパク質との融合タンパク質を回収するに� ��、以下の方法などがある。オキシダーゼあ� ��いはその融合タンパク質が菌体内に可溶化� ��れていれば、菌体を回収した後、菌体を破� ��あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用で� ��る。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、� ��過、カラムクロマトグラフィー等の手法に� ��りオキシダーゼあるいはその融合タンパク� ��を精製して用いることも可能である。この� ��合、オキシダーゼあるいは融合タンパク質� ��抗体を利用した精製法も利用できる。

 タンパク質封入体が形成される場合には� ��変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク� ��とともに可溶化してもよいが、以降の精製� ��作を考慮すると、封入体を取り出して、こ� ��を可溶化するのが好ましい。封入体を菌体� ��ら回収するには、従来公知の方法で行えば� ��い。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作� ��によって封入体を回収する。タンパク質封� ��体を可溶化させる変性剤としては、グアニ� ��ン塩酸(例えば、6M、pH5~8)や尿素(例えば8M)な どが挙げられる。

 これらの変性剤を透析等により除くと、� ��性を有するタンパク質として再生される。� ��析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸� ��衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、� ��度としては20mM~0.5M、pHとしては5~8が挙げら� �る。

 再生工程時のタンパク質濃度は、500μg/ml� ��度以下に抑えるのが好ましい。再生したオ� ��シダーゼが自己架橋を行うのを抑えるため� ��、透析温度は5℃以下であることが好ましい 。また、変性剤除去の方法として、この透析 法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、 いずれを用いても活性の再生が期待できる。

3.本発明の3-インドールピルビン酸の製造方� �
 本発明の3-インドールピルビン酸の製造方� �は、本発明の形質転換体および/またはその� ��養物の存在下で、トリプトファンを3-イン� �ールピルビン酸に変換する工程を有するこ� �を特徴とする。係る本発明の製造方法によ� �ば、オキシダーゼを簡便に大量生成できる� �め、3-インドールピルビン酸の生成も大量に 速く行うことができる。

 本発明に使用するトリプトファンは、L-� �、D-体、DL-体何れであってもよいが、入手の 容易さと価格の点からL-体を採用することが� ��ましい。

 本発明の形質転換体については既に述べ� ��とおりである。形質転換体の培養物とは、� ��質転換体を培養して得られるものを意味す� ��。培養は、液体培養、固体培養のいずれに� ��ってもよく、また培地の種類も特に限定さ� ��ない。形質転換体の培養物の例としては、� ��養に用いた培地、培養された形質転換体に� ��り生成された物質、これらの混合物が挙げ� ��れる。これらの培養物は、さらに、酵素を� ��り出すことを目的として行われる処理、例� ��ば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス� ��凍結乾燥処理、溶菌酵素、有機溶剤、界面� ��性剤等による処理が施されたものであって� ��よい。また、これらの処理物は、常法、例� ��ば液体クロマトグラフィーや硫安分画等に� ��り精製されていてもよいほか、カラギーナ� ��ゲルやポリアクリルアミドに包括或いはポ� ��エーテルスルホンや再生セルロース等の膜� ��固定化されていてもよい。

 形質転換体またはその培養物の使用量は� ��目的とする効果を発揮する量(有効量)であ� �ばよく、この有効量は当業者であれば簡単� �予備実験により容易に求められる。例えば� �洗浄湿潤菌体の場合、反応液100mlあたり1~40mg とすることができる。

 本発明の製造方法において、上述の本発� ��の形質転換体の培養物をトリプトファンに� ��用せしめるにあたっては、形質転換体の培� ��物とトリプトファンとを接触させればよい� ��例えば、上述の本発明の形質転換体を培地� ��で培養し、その形質転換体中および/または 形質転換体の培養液中にオキシダーゼを蓄積 させ、この培養液中にトリプトファンを添加 する方法;予めオキシダーゼを得るために培� �された形質転換体の培養物にトリプトファ� �を添加させる方法を挙げることができる。� �リプトファンの添加は、目的の反応が抑制� �れない濃度の範囲(例えば、0.1~10%)で、一括� �て、間欠的に、または連続的に行われる。� �加の際、基質は水溶液或いはスラリー状の� �態で添加され得るが、溶解度の増加や分散� �促進を目的として、反応に影響を与えない� �機溶媒や界面活性剤と混合して添加しても� �い。

 本発明の製造方法において、反応条件は� ��宜定めることができる。反応pHは、通常は3~ 10、好ましくは5~9である。反応温度は通常10~6 0℃、好ましくは20~40℃である。反応時間は通 常0.5~120時間、好ましくは0.5~24時間である。� �た、必要に応じて攪拌を行ってもよいし、� �置培養であってもよい。

 生成された3-インドールピルビン酸は、� �法により回収し、必要に応じて精製するこ� �ができる。尚、培養後に生成した3-インドー ルピルビン酸の分解を防止する必要がある場 合には、脱気処理や脱酸素処理を行うことも できる。

 下記反応式7に示すように、本発明の製造 方法〔反応式7のステップ(1)〕によりトリプ� �ファンから生成された3-インドールピルビン 酸は、甘味料として有用な4-(インドール-3-イ ルメチル)-4-ヒドロキシ-グルタミン酸(3-(1-ア� ��ノ-1,3-ジカルボキシ-3-ヒドロキシ-ブタン-4-� ��ル)インドール)〔モナティン〕の出発原料� �して有用である。すなわち、3-インドールピ ルビン酸をピルビン酸とアルドール縮合させ ることにより前駆体ケト酸(IHOG)を合成し〔反 応式7のステップ(2)〕、酵素の存在下IHOGの2位 をアミノ化してモナティンを合成することが できる〔反応式7のステップ(3)〕。

 本発明の3-インドールピルビン酸の製造� �法の好ましい一実施形態として、反応系に� �ーパーオキシドジスムターゼ(以下、SODとい� ��場合がある)を添加する形態が挙げられる。 生成した3-インドールピルビン酸は、条件に� ��よるが、自発的に酸化し、スーパーオキシ� ��が生じ得る。生成したスーパーオキシドは3 -インドールピルビン酸を分解させ、ラジカ� �反応により、急速に3-インドールピルビン酸 の分解が進行してしまう場合がある。そこで 、反応系内にSODを添加することにより、スー パーオキシドを反応系内から消去し、スーパ ーオキシドによる3-インドールピルビン酸の� ��解を抑制することができる。また、SOD以外� ��も、メルカプトエタノールなどのラジカル� ��カベンジャーを添加し、3-インドールピル� �ン酸の分解を防ぐことも可能である。

 SODを用いると過酸化水素が生成し、過酸� ��水素によって3-インドールピルビン酸が分� �される可能性も生じるようにも推測される� �、意外にも下記実施例にて実証された通り� �SODを添加することによって、反応系内に存� �する3-インドールピルビン酸の量を維持する ことができた。その機構は必ずしも定かでは ないが、過酸化水素よりもスーパーオキシド の方が、3-インドールピルビン酸の分解作用� ��強く、その結果、わずかに過酸化水素の量� ��増えたとしても、SODを反応系に添加しスー� ��ーオキシドを軽減した方が、3-インドール� �ルビン酸は安定して反応系に残存し得るも� �と推測される。

 SODは市販の酵素として入手可能である。S ODは、精製酵素として反応系に添加してもよ� ��。また、SODを発現する形質転換体を作製し� ��形質転換体またはその培養物を反応系に添� ��してもよい。SODをコードする遺伝子(sod遺伝 子)、例えば、sodA遺伝子、sodB遺伝子、および sodC遺伝子などは、公開データベース上にそ� �塩基配列等が公開されている。これらのデ� �タベースを参照し、SODをコードする核酸断� �を増幅し、これを用いて形質転換体を作製� �得る。

 形質転換体を作製する場合、上記アミノ� ��オキシダーゼを発現するように形質導入さ� ��た形質転換体に、さらにSODを発現するよう� ��形質転換させてもよいし、あるいは、それ� ��れ個別に形質転換体を作製し、それぞれの� ��質転換体を反応系内に共存させるようにし� ��もよい。また、一つの形質転換体に、アミ� ��酸オキシダーゼとSODを共発現させる場合、� ��れぞれ個別に、それぞれのタンパク質をコ� ��ドする核酸断片をプラスミドに組み込んで� ��よいし、或いは、一つのプラスミドにタン� ��ムに両核酸断片を組み込んでもよい。

 SODは、菌体内に蓄積される菌体内酵素と� ��て存在する場合がある。そのため、好まし� ��一形態として、形質転換体内からSODを放出� ��せる形態が挙げられる。SODの放出は、形質� ��換体を破膜処理することによって行っても� ��い。例えば、SODを発現する形質転換体を培� ��し、十分な量のSODを形質転換体内に蓄積せ� ��め、その後形質転換体を破膜処理して、形� ��転換体内に蓄積されたSODを形質転換体内か� ��放出させてもよい。SODを供給する形質転換� ��を破膜処理することにより、SODとスーパー� ��キシドとの接触確率をより向上させること� ��でき、その結果、3-インドールピルビン酸� �分解を抑制し、3-インドールピルビン酸の収 率を向上させることができる。破膜処理は、 形質転換体の細胞膜を破膜できればよい。破 膜処理としては、例えば、超音波破砕、トル エンなど溶剤を用いた溶菌処理などが挙げら れる。なお、トルエンを用いて破膜する場合 、トルエンによりアミノ酸オキシダーゼが失 活してしまう場合があるため、SODの生成は、 アミノ酸オキシダーゼの生成およびこれを用 いた反応系とは別個に行い、SODを単離してそ の反応系に添加してもよい。