【발명의 명칭】 조혈줄기세포 혈중 방출효과 및 골다공증 치료효과를 나타내

펩타이드 및 이의 용도

【기술분야】 본 출원은 2017년 7월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017- 0085663호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

본 발명은 골수조혈줄기세포 혈중 방출효과 및 골다공증 치료효과를 나타내는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 발명으로， 보다 상세하게는, 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도하여 골수 내에서 파골세포의 수적인 감소를 유도함과 동시에 조골세포의 수를 증가시키는 효과가 있는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증, 빈혈 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】 조혈줄기세포 (hematopoiet i c stem cel l )는 혈액을 구성하는 적혈구， 백혈구 및 혈소판 등의 혈액세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 말한다. 조혈줄기세포는 특히 골수에서 대량으로 생산되며， '정상인의 골수 세포 중 약 1% 가량 존재한다.

그러나 재생 불량성 빈혈처럼 조혈줄기세포의 수가 부족한 경우， 백혈병, 골수이형성 증후군 등과 같이 조혈즐기세포가 병든 경우， 항암제 투여 또는 방사선 조사 등으로 조혈줄기세포가 손상된 경우에는 조혈줄기세포가 제대로 기능을 발휘할 수 없어 혈액세포를 만들어 낼 수 없게 된다.

이러한 경우 환자의 조혈줄기세포를 완전히 제거한 후 정상적인 조혈줄기세포를 환자에게 투여하면 조혈줄기세포는 환자의 골수로 이동하여 생착한 후 정상 혈액세포를 다시 생산함으로써 정상적인 조혈기능올 회복하게 되는데, 이를 조혈줄기세포 이식 (hematopoiet ic stem cel l transplantat ion)이라 한다. 조혈줄기세포를 제공할 수 있는 원천재료로는 골수， 제대혈, 말초혈 등이 있고， 각각을 이용하여 조혈줄기세포이식을 시행할 경우, 각각을 골수이식, 제대혈이식， 말초혈이식이라고 부르기도 하며， 환자의 상태와 공여자의 가능 여부 등에 따라 종류를 결정하게 된다.

골수는 조혈줄기세포의 전통적인 소스이나， 그것은 줄기 세포 기증자를 위해 일반적인 마취를 요구하는 침투성 하비스트 절차 ( invasive harvest ing procedure)에 근거하는 소스로서 가끔 이용된다. 골수 이식 수술을 위한 임상 절차 동안에， 뼈는 일반적으로 구멍이 난 골반뼈가 되며， 골수 세포들은 주사기로 도출된다.

인간의 조혈줄기세포의 임상 이식수술을 위해， 의사들은 말초의 순환 혈액으로부터 기증자 세포들을 수집하는 것을 더욱 선호하고 있다. 수십년 동안， 적은 양의 조혈줄기세포들과 전구 세포들 (progeni tor eel I s)은 혈액 내에서 순환하고 있으나, 지난 10년 동안에， 연구자들은 과립상 백혈구 콜로니 촉진 인자 (G-CSF)와 같은 사이토카인을 기증자에게 투입함으로써 그러한 세포들이 더욱 많이 골수에서 혈액으로 이동하도록 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. 기증자에게는 조혈줄기세포 수집 며칠 전에 G-CSF가 주입된다. 기증자로부터 수집된 세포들 중에서 골수내의 100,000개의 세포 당 약 1개가 장시간의 조혈줄기세포이다. 그러므로， 혈액내의 조혈줄기세포의 수를 증가시킬 필요성이 있다.

한편， 골다공증은 폐경에 따른 급격한 호르몬의 변화에 의한 파골세포 (osteoclast )의 활성화에 따른 골흡수 증가로 나타나는 폐경 후 골다공증과, 노화가 되면서 조골세포 (osteoblast )의 기능이 감소하여 골형성이 감소하는 노인성 골다공증으로 분류할 수 있다. 이러한 골다공증으로 인한 골절은 심각한 활동 제한에 이르게 되고， 고관절 골절의 경우 약 15-35%의 높은 사망률과 관련되어 있기 때문에， 골다공증성 골절이 발생하기 이전에 골다공증의 진단과 치료가 중요하다 (골다공증 진단 및 치료 지침 2007， 2008) . 국내의 골다공증 유병률은 2008년 기준 최근 5년간 약 3배 증가되었고， 골다공증 골절에 의한 연간 사회경제적 손실이 약 1조 500억원에 달할 정도로 심각한 수준에 이르고 있다고 보고된다 (골다공증 진단 및 치료 지침 2007， 2008) . 또한, 최신의 2009년도 국민건강통계에 따르면， 50세 이상 및 65세 이상 한국인 전체의 골다공증 유병률은 23.1%와 42.0%로 만성질환 증에서도 유병를이 매우 높게 나타나 국민건강에 커다란 문제로 떠오르고 있다 (2009년 국민건강통계- 국민건강영양조사) .

기존에 알려진 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트 (bi sphosphonate)계열의 약물이 있는데， 비스포스포네이트는 골의 무기질 성분에 침착되며， 비스포스포네이트가 침착된 골을 파골세포가 탐식할 경우 가수분해되지 않는 ATP 유사체 (analogue)를 형성하여 세포에 독성을 나타내거나 파골세포 내에서 다양한 방식으로 파골세포의 활성감소 및 세포사멸 (apoptosi s)을 초래해 골 흡수를 즐이고 이를 통해 골밀도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 약물들은 비교적 안전한 것으로 알려져 있으나， 최근 장기간 사용시 정상적인 골 흡수 및 골 형성에 의한 골의 재형성 (remodel ing)이나 골절 이후 골 재생 (heal ing)과정에 영향을 주어 골의 탄성이 떨어져 오히려 골 강도에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다는 우려들이 제기되고 있으며， 실제로 이로 인해 많은 환자에서 피로 골절을 일으킨다는 보고가 있다.

따라서 골다공증 발병과 관련된 새로운 골대사 기전의 발견 및 골다공증 예방 또는 치료제 개발의 필요성이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

한편, 본 발명자는 선행발명을 통해 교감신경계 전달물질인 뉴로펩타이드 YCneuropept ide Y, 이하 'NPY' 라 함)와 이의 단편들이 골다공증의 예방 또는 치료효과가 있다는 것을 보고한 바 있다 (한국등톡특허 10-1503020호， 10-1486061호 및 10-1486074호) . 그러나， 상기 펩타이드들은 상대적으로 그 길이가 길고 분자량이 커 체내 안정성이 낮을 뿐만 아니라 펩타이드의 제조에 있어서 시간적, 비용적으로 경제적이지 못하다는 단점이 있었다. 【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 이에， 본 발명자들은 종래 보고된 펩타이드가 지닌 상기한 문제점을 해결하고， 더 우수한 골다공증 예방 또는 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 조혈줄기세포의 혈중 방출을 촉진할 수 있는 펩타이드를 개발하기 위해 예의 노력을 기을인 결과, NPY의 아미노산 서열 중 21번째 내지 28번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편이 우수한 골다공증 예방 또는 치료효과와 조혈줄기세포의 혈중 방출을 촉진하는 효과를 나타내는 것을 확인ᅳ하고 본 발명올 완성하게 되었다.

따라서， 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료용 제제를 제조하게 위한， 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 호중구 감소증, 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방또는 개선용 식품조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드로 구성되는 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방또는 개선용 식품조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 호중구 감소증, 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료용 제제를 제조하게 위한， 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 템타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 호중구 감소증, 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 1의 펩타이드는 뉴로펩타이드 Y(NPY)의 아미노산 서열 중 21번째 내지 28내지 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편으로 (NPY(21-28) ) , Tyr— Ser— Ala— Leu-Arg— Hi s— Tyr-I le의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이다.

본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 총 8개의 아미노산으로 이루어져， 매우 짧은 서열을 갖기 때문에 부작용이 없고 약효가 우수하면서도 생산단가가 상대적으로 낮다는 점에서 매우 우수하다. 즉, 본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열이 매우 짧기 때문에 인체에 이용하는데 있어서 면역원성， 독성 부작용 등을 최소화시킬 수 있으며, 분자량이 작기 때문에 쉽게 합성이 가능하여 대량생산이 용이하고 비용절감의 효과를 가져을 수 있다 . 뿐만 아니라 작은 분자량으로 인해 좀 더 빠르게 조직 장벽을 넘나들 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면， NPY의 아미노산 서열 중에서 본 발명의 서열번호 1의 펩타이드와 인접해 있으며， 8개의 아미노산으로 이루어진 다른 두 종류의 템타이드 단편에서는 골다공증 예방 또는 치료효과가 전혀 나타나지 않았으나， 본 발명의 펩타이드는 양성대조군으로 사용된 NPY 및 이의 21번째 내지 ₃₆ 번째 아미노산 단편 (0steopep2)보다 더 우수한 효과를 나타내었다. 즉， 본 발명의 상기 서열번호 1의 펩타이드는 NPY 및 /또는 0steopep2의 아미노산 서열 중에서 약리학적 활성을 나타내는 핵심 단편만으로 이루어져 있다고 할 수 있으며， 펩타이드의 길이 짧기 때문에 상기 언급한 장점이 나타나 더 우수한 골다공증 예방 또는 치료 효과가 나타난 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 수용체에 대한 친화성을 개선하고자 일부 아미노산의 구조에 변형을 가하였다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 5번째 아미노산인 아르기닌 및 /또는 6번째 아미노산인 히스티딘을 D-형으로 변형시킨 펩타이드를 제조하여 골다공증 예방 또는 치료효과를 평가하여 본 결과， 0steopep2 및 NPY 뿐만 아니라 NPY(21-28)보다도 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

따라서， 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 5번째

아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 D-형

특징으로 하는 템타이드를 제공한다.

본 발명의 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함하는 개념으로 이해된다. "기능적 동등물" 이란 상기 서열번호 1의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다. "동질의 생리활성" 이란 이성화 능력이 있으며， 적어도 60% 이상의， 바람직하게는 Wh, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 말한다ᅳ 또한 "기능적 동등물 "에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나， 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산 (Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산 (lie, Leu, Val), 방향족 아미노산 (Phejyr , Trp), 산성 아미노산 (Asp,Glu) , 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gin, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met).

본 발명의 상기 펩타이드는 당해 분야의 숙련가가 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드는, 흔히 보다 큰 폴리펩타이드의 일부로서 본 발명의 펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시켜 원핵 또는 진핵 세포에서 생성시킬 수 있다. 다른 방법으로는， 이러한 펩타이드는 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 재조합 숙주내의 이종성 단백질의 발현， 폴리펩타이드의 화학적 합성 및 시험관내 전사를 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌 (참조 문헌: Maniatis et al .， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed. , Cold Sprin Harbor , N.Y.； Berger and Kimmel , Methods in Enzyraology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) , Academic Press, Inc. , San Diego, Calif.； Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11： 255； Kaiser et al.(1989) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing)에 추가로 기재되어 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이의 5번째 및 /또는 6번째 아미노산이 D-형으로 변형된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이의 5번째 및 /또는 6번째 아미노산이 D-형으로 변형된 펩타이드로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이의 5번째 및 /또는 6번째 아미노산이 D-형으로 변형된 펩타이드를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명의 상기 펩타이드는 조혈줄기세포의 접착인자 발현을 저해하여 조혈줄기세포의 혈중 방출을 촉진하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 혈중으로 방출된 조혈줄기세포 (hematopoiet ic stem cel l )는 혈액을 구성하는 적혈구， 백혈구 및 혈소판 등의 혈액세포로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있기 때문에, 본 발명의 상기 펩타이드는 다양한 원인에 의해 발생하는 호중구 감소증 및 빈혈을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 발휘한다.

본 발명에서 상기 호중구 감소증은 발생하는 원인은 특별히 제한되지 않으며， 바림직하게는 방사선， 알콜 중독， 약물， 알러지성 질환， 재생불량성 빈혈, 자가면역 질병, Τ— γ 림프구 증식성 질병 (T— γ LPD) , 골수이형성， 골수 섬유증， 이상감마글로불린혈증, 발작성 야간혈색소 뇨증， 암， 비타민 B12 결핍， 엽산 결핍, 바이러스 감염 세균 감염， 비장 질환， 혈액 투석， 또는 이식， 백혈병， 골수종, 림프종， 골수에 침윤하여 이를 대체하는 전이성 고형 종양， 독소, 골수 부전， 슈와츠만 -다이아몬드 증후군， 연골 -모발 발육부전， 선천성 이상각화증 및 IB형 글리코겐 저장 질병 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 원인에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 상기 펩타이드는 골수로부터 조혈줄기세포의 혈중 방출을 촉진하는 효과가 있기 때문에， 조혈즐기세포의 이식을 위한 준비과정에서 기증자의 골수조혈줄기세포를 말초혈액으로 방출하기 위한 약학적 조성물로 사용이 될 수도 있다.

조혈줄기세포이식 (Hematopoiet i c Stem Cel l Transplant at ion)은 백혈병과 같이 세포분화 과정에서 이상이 생긴 경우나 재생불량성빈혈과 같이 조혈줄기세포의 숫자가 줄어들어 이상이 오는 경우에 이들 질환을 근본적으로 치료하기 위하여 사용하는 방법을 의미한다. 조혈줄기세포이식은 조혈줄기세포 공급원에 따라 골수에서 유래하는 골수 조혈줄기세포이식, 항암제 투여 후나 백혈구조혈성장인자를 투여한 후 말초혈액에서 채취하는 말초혈액 조혈줄기세포이식， 태반에서 유래하는 제대혈 조혈줄기세포이식으로 나눌 수 있으며， 본 발명에서 상기 조혈줄기세포이식은 바람직하게는 말초혈액 조혈줄기세포이식을 의미한다.

즉， 본 발명의 상기 펩타이드는 항암화학요법， 방사선 치료 등을 받고 있는 암환자의 호중구 감소증， 재생불량성빈혈에 따른 호중구 감소증， 선천성 및 특발성 호중구 감소증， 감염성 질환에 의한 호중구 감소증， 자가면역질환에 의한 호중구 감소증의 치료제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라， 조혈줄기세포 이식을 위해 기증자의 골수조혈줄기세포를 말초혈액으로 방출 촉진하기 위해서 사용될 수도 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 본 발명의 상기 펩타이드는 우수한 골다공증 예방 또는 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다. 한편， 본 발명의 상기 펩타이드의 골다공증 예방 또는 치료효과는 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도하여 골수 내에서 조혈줄기세포로부터 분화하는 파골세포의 수적인 감소를 유도함과 동시에 조골세포의 수를 증가시킴으로써 골다공증 마우스의 골밀도 및 골조직 두께 감소를 억제시키는 것임을 알수 있었다.

즉， 본 발명의 펩타이드가 나타내는 골수조혈줄기세포의 혈중 방출 촉진효과는 호중구 감소증 및 빈혈 치료 기전으로도 작용할 뿐만 아니라， 골다공증 치료의 기전으로도 작용한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를로오스， 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슴, 락토스， 만니를， 엿， 아라비아고무 , 전호화전분 , 옥수수전분， 분말샐를로오스 , 히드톡시프로필셀를로오스， 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납， 합성규산알루미늄， 스테아린산， 스테아린산마그네슴， 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슘， 백당, 덱스트로스 , 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제, 증량제， 결합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제， 산제， 과립제, 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슴 카보네이트， 수크로오스， 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순회석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜, 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골， 트원 (tween) 61 , 카카오지， 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편， 주사제에는 용해제, 등장화제， 현탁화제， 유화제， 안정화제， 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

또한， 본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edi t ion, Al fonso , R. , ed, Mack Publ i shing Co . (Easton, PA: 1995) )를 추가로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고， 완층용액， 예를 들어 인산， 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질， 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체， 예를 들어 폴리비닐피를리돈; 아미노산， 예를 들어 글리신， 글루타민， 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류， 이당류， 및 글루코스， 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제， 예를 들어 EDTA; 당 알콜， 예를 들어 만니를 또는 소르비틀; 염 -형성 반대이온， 예를 들어 나트륨; 및 (또는) 비이온성 계면활성계, 예를 들어 트원， 폴루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게， 성별, 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 일반적으로 0.01 - 100mg/kg/day이며， 바람직하게는 0.1 - 20mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 1 - 5mg/kg/day일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 식품 조성물은 기능성 식품 ( funct ional food) , 영양보조제 (nutrit ional supplement ) , 건강식품 (health food) 및 식품첨가제 ( food addit ives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면， 건강식품으로는 본 발명의 식품 조성물 자체를 차， 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나， 과립화， 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 골다공증 예방 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 흔합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함) , 과실 및 그의 가공식품 (예를 들어 과일 통조림， 병조림， 잼， 마아말레이드 등)， 어류， 육류 및 그 가공식품 (예를 들어 햄， 소시지콘비이프 등)， 빵류 및 면류 (예를 들어 우동， 메밀국수， 라면, 스파게티， 마카로니 등)， 과즙， 각종 드링크， 쿠키， 엿， 유제품 (예를 들어 버터， 치이즈 등)， 식용식물유지, 마아가린， 식물성 단백질， 레토르트 식품, 넁동식품， 각종 조미료 (예를 들어 된장， 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 총 중량 중 0.01 내지 50 중량 % 이다. 본 발명의 식품 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 템타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 "폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide)" 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열， DNA( _g DNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며， 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라， 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라， 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건 (stringent condit ions) 하에서， 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 흔성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 80%의 상동성， 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다.

용어 "백터 (vector) "는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어， 플라스미드백터， 코즈미드 백터 및 박테리오파아지 백터， 아데노바이러스 백터， 레트로바이러스 백터 및 아데노 -연관 바이러스 백터와 같은 바이러스 백터를 포함한다. 상기 재조합 백터로 사용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면， pSClOl , pGV1106 , pACYC177 , Col El , pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79 , pIJ61 , pLAFRl , pHV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 pUC19 등)， 파아지 (예를 들면， gt4 B, λ -Charon, λ Δ ζΙ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면， CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 백터에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된 (operat ively l inked) ' '은 뉴클레오티드 발현 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및 /또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 백터는， 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물， 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 사용되는 백터가 발현 백터이고， 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, ρί λ프로모터， trp 프로모터， lac 프로모터， tac 프로모터， T7 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열올 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 백터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 fl 복제원점， SV40 복제원점， pMBl 복제원점ᅳ 아데노 복제원점， MV 복제원점， CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터 , SV40 프로모터， 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며， 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명은 상기 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 원핵 세포로는， 예를 들어， E. col i JM109 , E. col i BL21 , E. col i RR1 , E. col i LE392 , E. col i B, E. col i X 1776, E. col i 3110, 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevi siae) , 곤층 세포， 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어， SP2/0 , CHOCChinesehamster ovary) Kl , CHO DG44, PER.C6, W138 , BHK, COS— 7， 293， HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이이용될 수 있다.

본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는， 골다공증 예방 또는 치료용 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포 내로의 삽입은， 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl ₂ 방법 또는 전기천공 방법 등을 사용할 수 있고， 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법， 칼슴 포스페이트 침전법， 전기 천공법， 리포좀 -매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. col i 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화 (glycosylat ion) 문제로 인해 온전한 ( intact ) Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만， Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여， 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들에 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명은 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료용 제제를 제조하게 위한， 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 호중구 감소증， 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 호중구 감소증， 빈혈 또는 골다공증의 개선， 치료， 예방, 검출， 진단 또는 호중구 감소증， 빈혈 또는 골다공증 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다. 본 발명의 상기 '치료' 는 호중구 감소증， 빈혈， 골다공증 또는 호중구 감소증， 빈혈, 골다공증의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 호중구 감소증， 빈혈 또는 골다공증으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 '〜을 포함하는 (compr i sing) ' 이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '-로 구성되는 (consi st ing of )' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent i al ly consi st ing of )' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.

【발명의 효과】 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 골수 내 조혈즐기세포 접착 인자들의 발현량을 감소시켜 조혈줄기세포의 혈중 방출을 효과적으로 유도며， 이는 골수 내 파골세포의 수적 감소 및 조골세포의 수적 증가를 유도하여 골밀도의 감소를 완화하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 골다공증 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】 도 la 내지 Id는 재조합한 세 종류의 펩타이드인 NPY(21-28) , NPY(24-31) , NPY(29-36)을 골수조혈줄기세포 접착인자를 발현하는 조골세포에 처리한 후， 접착인자들의 발현량 변화를 나타낸 결과이다 (a : 실험의 개요， b 내지 d : 접착인자들의 발현량을 대조군 대비 상대적인 fold change로 나타낸 그래프) .

도 2a는 NPY(21-28)이 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 통해 골다공증 완화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행한 실험의 개요이며, 도 2b는 각각의 펩타이드를 골다공증 동물 모델에 투여한 후 체중 변화를 나타낸 결과이다 (Sham : 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델, 0VX : 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 3a 내지 3c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 조혈줄기세포 접착인자의 발현량 변화를 대조군 대비 fold change로 나타낸 결과이다 (0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한골다공증 동물모델) .

도 4a는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 혈중 골수조혈전구세포의 수를 확인한 것이며， 도 4b는 골수 내 조혈줄기세포의 수를 골수조혈줄기세포의 표지인자를 이용하여 나타낸 결과 및 이를 정량화한 그래프이다 (0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 5a 내지 5c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 전체적인 골밀도를 마이크로 씨티 (mi cro CT)로 촬영한 후 (a) 골밀도의 변화 (b) 및 골조직 두께 변화 (c)를 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델， 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 6a 내지 6c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 파골세포 수의 변화를 TRAP 염색을 실시한 후 (a) 파골세포의 수 (b)와 파골세포가 차지하는 표면적 (c)을 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델， 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 7a 내지 7c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 조골세포 수의 변화를 H&E 염색을 실시한 후 (a) 조골세포의 수 (b)와 조골세포가 차지하는 표면적 (c)을 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Shara : 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델， 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) . 도 8a 내지 8d은 NPY(21-8)의 수용체 친화성올 높이기 위해 특정 아미노산의 구조를 변형시켜 재조합한 세 종류의 펩타이드인 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)를 골수조혈즐기세포 접착인자를 발현하는 조골세포에 처리한 후， 접착인자들의 발현량 변화를 나타낸 결과이다 (a: 실험의 개요， b, c , d: 접착인자들의 발현량을 대조군 대비 상대적인 fold change로 나타낸 그래프) .

도 9a는 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 통해 골다공증 완화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행한 실험의 개요이며， 도 9b는 각 펩타이드들을 골다공증 동물 모델에 투여한 후 체중 변화를 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델, 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 10a 내지 10c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 조혈줄기세포 접착인자의 발현량 변화를 대조군 대비 fold change로 나타낸 결과이다 (0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한골다공증 동물모델) .

도 11a는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 혈중 골수조혈전구세포의 수를 확인한 것이며， 도 lib는 골수 내 조혈줄기세포의 수를 골수조혈줄기세포의 표지인자를 이용하여 나타낸 후 이를 정량화한 결과이다 (0VX: 피하절개 후 난소절제술을수행한골다공증 동물모델) .

도 12a 내지 12c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 전체적인 골밀도를 마이크로 씨티 (micro CT)로 촬영한 후 (a) 골밀도의 변화 (b) 및 골조직 두께 변화 (c)를 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델, 0VX: 피하절개 후 난소절제술을수행한 골다공증 동물모델) .

도 13a 내지 13c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 파골세포 수의 변화를 TRAP 염색을 실시한 후 (a) 파골세포의 수 (b)와 파골세포가 차지하는 표면적 (c)을 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델, 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

도 14a 내지 14c는 골다공증 동물 모델에 각 펩타이드를 투여한 후 골수 내 조골세포 수의 변화를 H&E 염색을 실시한 후 (a) 조골세포의 수 (b)와 조골세포가 차지하는 표면적 (c)을 그래프로 정량화하여 나타낸 결과이다 (Sham: 피하절개술만 실시한 대조군 동물모델, 0VX: 피하절개 후 난소절제술을 수행한 골다공증 동물모델) .

【발명의 실시를 위한 형태】 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료 및 실험 방법

1-1. 마우스의 준비 및 약물처리 프로토콜 실험에 사용된 모든 마우스는 6주령 내지 8주령의 마우스로， C57BL/6 마우스이며 Jackson Laboratory (Bar Harbor , Maine , USA)로부터 구입하여 사용하였다. NPY(21-28) (서열번호 1)， NPY(24-31) (서열번호 2) , NPY(29- 36) (서열번호 3) , NPY D ²⁵ (21-28) (서열번호 4) , NPY D ²⁶ (21-28) (서열번호 5) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28) (서열번호 6) , NPY(21-36) (0steopep2) (서열번호 7)는 Anygen으로부터 제작하여 사용하였으며， Ful l length NPY (서열번호 8)는 Bachem으로부터 구입하여 사용하였다. 인 비트로 ( In vi tro) 실험을 위하여 각각의 펩타이드 10 nM을 각 배지에 희석하여 주입하였다. 상기 NPY D ²⁵ (21-28)는 NPY(21-28)의 아미노산 서열 중 5번째 아미노산인 아르기닌이 D-형으로 변형된 펩타이드， NPY D ²⁶ (21-28)는 6번째 아미노산인 히스티딘이 D-형으로 변형된 펩타이드, D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)는 5번째 및 6번째 아미노산이 모두 D-형으로 변형된 펩타이드를 각각 의미한다. 골다공증 모델을 만들기 위해 한 그룹 당 10~18마리의 12 주령 암컷 마우스를 난소적출 수술을 실시하였고， 일주일 후에 50 //g/kg의 NPY(21-28), NPY D ²⁵ (21-28), NPY D ²⁶ (21-28), NPY D ^25,26 (21-28) , 0steopep2, NPY 그리고 PBS(Gibco) 100 12시간 간격으로 하루에 2회씩 4주간 복강 투여하였다. 경쟁약물로서 사용한 Alendronate(Sigma)는 50 fig/kg 용량으로 일주일에 1회씩 4주간 복강 투여하였다. 대조군으로는 골다공증의 Sham 모델로 암컷마우스의 피하절개술만 실시를 하였다. 구획 무선화 (Block randomization) 방법을 사용하여 마우스를 실험군에 배치시켰으며, 모든 마우스 실험은 경북대학교 동물실험 관련 위원회 (Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)를 통하여 승인받았다.

1-2. 골수 중간엽 줄기세포의 배양 및 조골세포로의 분화유도

4주 내지 6주된 C57BL/6마우스를 마취 후 회생시킨 다음， 경골 (tiMas)과 대퇴골 (femurs)을 절개하였다. 경골 및 대퇴골로부터 골수를 수거하고 단일세포 현탁액을 40 μια cell strainer (Bectonᅳ Dickinson LAP ware, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 얻었다. 대략 107개의 세포를， 항생제가 첨가된 중간엽 줄기세포 Stimulatory Sup lements (Stem Cell Technologies, Inc) 및 MesenCult ^TM MSCBasal배지를 함유하는 75-cnf플라스크에 분주하였다. 상기 세포들을 1주 동안 배양하고， 조골세포 (osteoblast)로의 분화를 위해 StemXVivo Osteogenic supplement (20X)와 페니실린-스트렙토마이신 (Penici 11 in-streptomycin, 100X)이 첨가된 StemXVivo 0s t eogen i c / Ad i pogen i c Base Media (R&D systems)로 3주간 배양하였고， 배양액은 매 2일 내지 3일 간격으로 교체하였다.

1-3. 실시간정량 PCR(Real-time quantitative PCR) 조골세포 (osteoblast)에 존재하는 조혈줄기세포 접착인자 (Sdf-la, Kitl , Angptl)의 발현량을측정하기 위하여 실시간 정량 PCR법을사용하였다. 총 RNA를 RNeasy Plus 미니 키트 (Qiagen, Korea, Ltd)를 사용하여 세포 용출액 및 골수 세포로부터 추출하고， Clontech (Mountain View, CA)사의 키트를 사용하여 5 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 또한， Corbett research RG-6000 real-time PCR 기기를 사용하여， 95°C， 10분; 95°C， 10초; 58°C， 15초; 72°C , 20초를 1사이클로 하여 40사이클을 반복하는실시간 정량 PCR을수행하였다. 상기 실시간 정량 PCR에 사용한 프라이머는 표 1과 같다.

【표 1]

1-4. Colony- forming unit (CFU) assays 마우스의 혈중 골수 조혈전구세포의 수를 측정하기 위하여 CFU 분석을 수행하였다. 먼저 마우스를 마취한 후， 심장 채혈로 500≠ 내지 700 ^의 혈액을 헤파린 튜브에 모은 다음， 염화암모늄 용액 (Stem Cel l Technologies , Inc. 1 : 10)에 넣고 15분간 얼음에 넣어두어 적혈구를 제거하였다. 2분 내지 3분 간격으로 적혈구가 잘 제거되도록 흔들어 준 뒤 7분간 1000 rpm에서 원심 분리시켰다. 상층액을 제거하고 2% 소태아혈청 (FBS, Gibco)이 공급된 IMDM(Gibco)으로 세척하였다. 세척한 세포 (3 X 10 ⁵ per mouse)를 메틸셀를로오스 -기반 배양액 (methylcel lulose-based media, Methocult , Stem cel l )이 포함된 35 mm 접시 3개에 각각 분주 (1 X 10 ⁵ per dish)하여 상기 세포를 2주 동안 배양한 뒤 플라스크에 생긴 콜로니의 개수를 세었다.

1-5. Flow Cytometry Analysis (FACs) 마우스의 골수 내에 존재하는 골수조혈줄기세포의 수에는 어떠한 변화가 있는지 알아보기 위해， 마우스의 골수를 채취하여 골수조혈줄기세포의 표지인자인 Lineage, Sca-1 , c— kit , CD150, CD48 다섯 가지의 항체를 사용하여 FACs로 분석하였다. 골수조혈줄기세포 분석을 위해， 각각의 펩타이드를 주입한 골다공증 동물 모델의 경골 (Tibias)과 대퇴골 (femurs)로부터 수거한 골수를 염화암모늄 용액 (Stem Cell Technologies, Inc. 1:4)으로 적혈구를 제거한 후 10% 소태아혈청 (FBS, Gibco)과 1% 아지드 나트륨 (sodium azide, Sigma-Aldrich)이 포함된 PBS(Gibco)용액으로 세척한 뒤 10분간 300 xg에서 원심 분리시켰다. 골수에 포함된 조혈세포들은 biotinylated lineage 항체 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 MACs 비드 (Miltenyi Biotec)로 제거하였고， 남은 세포들은 Sca-1-PECY7, c-kit-APC, CD150-PE, CD48-FITC(BD science) 항체를 이용하여 4 ^° C에서 30분간 반응시킨 후 LSRII (BD science) 유세포 분석기 (flow cytometry)로 분석하였다.

1-6. 마이크로 씨티 (micro CT) 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 80% 에탄올에 냉장 보관한 뒤， 골밀도 변화 측정을 위해 Quantum FX microCT Imaging System으로 성장판 기준선에서부터 0.7mm와 2.3瞧 사이 구역을 분석하여 골밀도 (bone volume/total volume) 및 골조직 두께 (trabecular thickness)를 측정하였다.

1-7. 면역조직화학법 (Immunohistochemistry) 마우스로부터 대퇴골올 분리하여 24시간동안 4% 파라포름알데이드 내에 고정하고, 5주 동안 조직을 1 EDTA 내에서 석회질을 제거 (decalcify)하였다. 그 후 단계 회석된 알코올 시리즈로 탈수하고, 파라핀화한 후 5 mm의 파라핀 절편으로 제작하였다.

TRAP 염색을 위하여， 절편을 탈파란핀화 시킨 후 225 μΜ Naphthol AS-MX 인산염 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0, USA), 0.84% N, N—디메틸포름아미드 (dimethyl formaraide) (Sigma-Aldrich), 및 50 mM 타르타르산 나트륨을 포함하는 50 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.0) 증 1.33 mM Fast Red Violet LB Salt (Sigma- Aldrich)으로 염색하고, 30분간 배양하였다. 배양 후， 절편을 증류수로 세척하고 1% 메틸 그린 (methyl green)으로 대비 염색하였다.

H&E 염색을 위하여， 탈파라핀화 시킨 절편을 Harris hematoxyl ine으로 8분간 염색한후 증류수로 세척하고 Eosin으로 1분간 염색하였다. 조직계측학적 분석 (Histomorphometric analysis)을 OsteoMeasure 프로그램 (Extensive interactive Bone Historaorphometry Analysis System)을 이용하여 수행하였다.

-8. 통계적 분석 각 군과의 비교는 일원화분산분석 (one way AN0VA) 및 Tukey' s HSD test를 수행하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 이용하였다. p < 0.05의 경우 유의적인 것으로 간주하였다.

실시예 2. NPYC21-28) , NPYC24-31) , NPY(29-36)이 조골세포에 발현하는 골수 조혈줄기세포 접착인자의 발현에 미치는 영향

8개의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 펩타이드인 NPY(21-28) , NPY( 24-31) NPY(29-36)이 조골세포에 존재하는 조혈줄기세포 접착인자 (Sdf-la, Kit l , Angpt l)의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 1-1 및 1-2， 1-3의 방법에 따라 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저 4주 내지 6주된 C57BL/6마우스로부터 골수를 채취하여 골수 중간엽줄기세포 (BM-MSC)를 수거한 뒤， 골세포 분화 유도 배지로 3주간 배양하여 조골세포 (osteoblast )로 분화시켰다. 28 일째에 각각의 펩타이드를 10 nM로 3일간 처리 한 뒤， 골세포를 수거하여 실시간 정량 PCR로 3가지 접착인자의 발현량을 조사하였다. Posi t ive contr 로서 0steopep2와 이의 모체인 NPY를 사용하였다.

실험과정에 관한 모식도와 상기 접착인자의 발현량 측정 결과는 도 la 내지 Id에 나타내었다. 도 la 내지 Id에 나타낸 바와 같이， 펩타이드를 처리하지 않은 조골세포 (control )와 비교 시 NPY(21-28) , NPY(24-31) , NPY (29-36) 펩타이드 중 NPY(21-28)를 처리한 조골세포에서만 Sdf-la, Kit l , Angptl의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다 (p<0.05, n=3 per group) . 상기 결과로부터 , 8개의 아미노산으로 재조합한 세 종류의 펩타이드 중 NPY(21-28)만이 조골세포에 존재하는 골수조혈줄기세포 접착인자의 발현량을 감소시킴으로써 골수에서 혈액으로의 골수조혈줄기세포의 방출을 유도할 가능성이 있음을 알 수 있었다. 즉， NPY(21- 28)는 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도할 수 있는 활성 부위를 포함하는 펩타이드임을 알 수 있었다. 실시예 3. 본 발명의 ΝΡΥ(21-28)이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 미치는 영향 본 발명의 ΝΡΥ(21_28)이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 영향을주는지 알아보기 위하여 실시예 1-1 , 1-3 , 1-4 및 1-5의 방법에 따라 하기와 같은실험을수행하였다.

먼저 골다공증 동물 모델을 만들기 위해 12주된 C57BL/6암컷 마우스를 각 군당 10~18마리씩 난소적출 수술을 실시하였고 일주일 후에 50 /kg의 NPY(21-28) , PBS(Gi bco) 100 峰 12시간 간격으로 하루에 2회씩 4주간 복강 투여하였다. 대조군으로는 정상 마우스에 피하절개술만 실시한 마우스를 사용하였다. 매주 체중 변화를 측정하고, 4주째 마지막 투여 후 1시간 후에 골수와 혈액을 채취하여 골수조혈전구 ·줄기세포의 혈중 방출 여부를 분석하였다. 양성대조군으로서 NPY(21- 36)인 0steopep2와 Ful l length NPY (50 jug/kg , 하루 2회 4주간 복강 투여)를 사용하였다. 골다공증 치료 경쟁 약물로서 사용한 Al endronate는 50 g/kg용량으로 일주일에 1회씩 4주간 복강 투여하였다. 실험과정에 관한 모식도는 도 2a에 나타내었다.

3-1. 골다공증 동물 모델에서 NPY(21-28)이 골다공증에 의한 체중 증가에 미치는 영향 본 발명의 NPY(21— 28)이 골다공증에 의해 유도되는 체중 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NPY(21-28)을 주입하는 총 4주간 매주 1회씩 체중을 측정하였다. 결과는 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타낸 바와 같이， 골다공증 동물 모델에 PBS를 주입한 그룹이 시간에 따라 체중이 증가하는 반면， NPY(21-28)을 주입한 그룹에서는 체중이 변화하지 않았다 (p < 0.05 , n-10~18 per group) . 상기의 결과로부터， NPY(21-28)이 골다공증에 의한 체중증가를 억제시켜줄 수 있음을 알 수 있었다.

3-2. 골다공증 동물 모델에서 NPY(21-28)이 골수조혈줄기세포 접착인자의 미치는 영향 본 발명의 NPY(21-28)이 골다공증 동물 모델에서 골수 내 골수조혈줄기세포 유지에 관여하는 접착인자의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NPY(21-28)를 ₄ 주째 마지막 투여 후 1시간 후에 마우스의 경골 (t ibia)과 대퇴골 (femur)로부터 골수를 채취하였다. 실시예 1-3 기재된 방법인 실시간 정량 PCR법으로 접착인자의 발현량을 조사하였다.

이에 대한 결과를 도 3a 내지 3c에 나타내었다. 도 3a 내지 3c에 나타낸 바와 같이 Sdf— la, Ki t l , Angptl의 주요 접착인자들의 발현량이 감소되었다 (p < 0.05, n=3~4 per group) .

3-3. 골다공증 동물 모델에서 NPY(21-28)이 골수조혈전구세포 및 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 미치는 영향 본 발명의 NPY(21-28)의 투여가 골다공증 동물 모델에서 혈중으로 방출되는 골수조혈전구 ·줄기세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 1-4와 1-5에 기재된 방법인 CFU assay와 FACs를 통하여 확인하였다.

이에 대한 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이， (a) CFU assay를 통해 NPY(21-28)이 골다공증 동물 모델의 혈중 골수조혈전구세포의 방출을 증가시키는 것을 알 수 있었다 (p < 0.05, n=4~5 per group) . 그 결과， (b) 골수에 남아 있는 골수조혈줄기세포의 수가 감소되어 있는 것을 FACs를 통해 확인하였다 (p < 0.05， n=4~5 per group) .

상기 결과로부터， 본 발명의 NPY(21-28)의 투여가 조골세포에 존재하는 골수조혈줄기세포접착인자의 발현량을 감소시킴으로써 혈액으로의 골수조혈전구 ·줄기세포의 방출을 유도할 수 있음을 알 수 있었으며， 이러한 NPY(21-28)의 효과는 양성대조군으로 사용된 0steopep2 및 NPY보다 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 본 발명의 NPY(21-28)이 골다공증 예방 및 치료에 미치는 영향 본 발명의 NPY(21-28)의 투여에 의한 골수조혈줄기세포의 혈중으로 방출이 골다공증의 골밀도 감소 완화에 효과가 있는지 알아보기 위하여 실시예 1-6 및 1- 7의 방법에 따라하기와 같은 실험을 수행하였다.

4-1. 골다공증동물모델에서 NPY(21-28) 투여에 의한골밀도 변화

NPY(21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 골밀도 변화 측정을 위해 Quantum FX microCT Imaging System으로 골밀도 (bone volume/total volume) 및 골조직 두께 (trabecular thickness)를 측정하였다.

이에 대한 결과를 도 5a 내지 5c에 나타내었다. 도 5a 내지 5c에 나타낸 바와 같이 microCT로 촬영한 사진에서 골다공증 동물 모델에 NPY(21-28)을 투여한 마우스의 골밀도 퍼센트 (BV/TV, %) 및 골조직 두께 (Trabecular Thickness , 麵)가 PBS를 주입한 마우스보다 증가한 것을 확인하였다. 또한 이러한 NPY(21-28)의 효과는 양성대조군인 0steopep2 및 NPY의 효과보다 더 우수하였으며， 경쟁약물안 Alendronate를 주입한마우스와 비슷한 효과를 보임을 확인하였다 (p < 0.05, n=4~5 per group) .

4-2. 골다공증 동물 모델에서 NPY(21-28) 투여에 의한 골수 내 파골세포의 변화

NPY(21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 TRAP 염색을 통하여 골수 내 파골세포 수를 측정하였다.

이에 대한 결과를 도 6a 내지 6c에 나타내었다. 도 6a 내지 6c에 나타낸 바와 같이 NPY(21-28)를 투여한 마우스의 골수 내 TRAP posit ive한 파골세포의 수 (Number of osteoclast /Bone surface , mm)와 파골세포의 표면적 (Osteoclast surface/Bone surface, ¾)이 PBS를 투여한 마우스보다 감소한 것을 확인하였다 (p < 0.05, n=3~4 per group) . 또한, 이러한 NPY(21-28)의 효과는 양성대조군인 0steopep2 및 NPY보다 우수한 것일 뿐만 아니라， 경쟁약물인 Alendronate보다도 더 우수하다는 것을 알수 있었다. 4-3. 골다공증 동물 모델에서 NPY(21-28) 투여에 의한 골수 내 조골세포의 변화

NPY(21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 H&E 염색을 통하여 골수 내 조골세포 수를 측정하였다.

이에 대한 결과를 도 7a 내지 7c에 나타내었다. 도 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이 NPY(21-28)를 투여한 마우스의 골수 내 골에 인접한 조골세포의 수 (Number of osteoblast /Bone surface, 匪)와 조골세포의 표면적 (Osteoblast surface/Bone surface, %)이 PBS를 투여한 마우스보다 증가한 것을 확인하였으며， 이러한 효과는 양성대조군인 0steopep2보다 더 우수한 것임을 알 수 있었다 (p < 0.05， n=4 per group) .

상기 결과들로부터， NPY(21— 28)이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도하여 골수 내에서 조혈줄기세포로부터 분화하는 파골세포의 수적인 감소를 유도함과 동시에 조골세포의 수를 증가시킴으로써 골다공증 마우스의 골밀도 및 골조직 두께 감소를 억제시키는 것임을 알 수 있었다. 또한， NPY(21-28)는 양성대조군으로 사용한 0steopep2 및 /또는 NPY의 활성부위를 포함하는 짧은 서열의 펩타이드로서 이들보다 더 우수한 효과를 나타내어 골다공증 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 5. NPY(21-28)의 수용체 친화성을 높이기 위해 특정 아미노산의 구조를 변형시킨 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 조골세포에 발현하는 골수 조혈줄기세포 접착인자의 발현에 미치는 영향

NPY(21-28)의 수용체 친화성을 높이기 위해 특정 아미노산의 구조를 변형시킨 펩타이드인 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 조골세포에 존재하는 조혈줄기세포 접착인자 (Sdf-la, i t l , Angptl)의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 1-1 및 1-2， 1-3의 방법에 따라 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험과정에 관한 모식도와 상기 접착인자의 발현량 측정 결과는 도 8a 내지 8d에 나타내었다. 도 8a 내지 8d에 나타낸 바와 같이， 펩타이드를 처리하지 않은 조골세포 (control )와 비교 시 NPY D ²⁵ (21— 28)， NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)를 처리한 조골세포에서 Sdf-la, Ki t l , Angptl의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다 (p < 0.05， n=3 per group) . 특히 NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)가 NPY(21-28)보다 Angpt l의 발현량을 더 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 결과로부터， 특정 아미노산의 구조를 D-form으로 변형시킨 NPY D ²⁵ (21- 28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21— 28) 펩타이드들은 조골세포에 존재하는 골수조혈줄기세포 접착인자의 발현량을 감소시킴으로써 골수에서 혈액으로의 골수조혈줄기세포의 방출을 유도할 가능성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ ^^^이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 미치는 영향

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21— 28)， NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 영향을 주는지 알아보기 위하여 실시예 1-1 및 1-3， 1-4， 1-5의 방법에 따라 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6-1. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ^25>26 (21- 28) 이 골다공증에 의한 체중 증가에 미치는 영향

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21— 28)이 골다공증에 의해 유도되는 체중 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 펩타이드들을 주입하는 총 4주간 매주 1회씩 체중을 측정하였다.

결과는 도 9a 및 9b에 나타내었다. 도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이 골다공증 동물 모델에 PBS를 주입한 그룹이 시간에 따라 체중이 증가하는 반면， NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)을 주입한 그룹에서는 체중이 변화하지 않았다 (P < 0.05, n=10~18 per group) . 상기의 결과로부터, NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골다공증에 의한 체중증가를 억제시켜줄 수 있음을 알 수 있었다. 6-2. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ^25,26 ( 21- 28)이 골수조혈줄기세포 접착인자의 발현에 미치는 영향

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골다공증 동물 모델에서 골수 내 골수조혈줄기세포 유지에 관여하는 접착인자의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 펩타이드들올 4주째 마지막 투여 후 1시간 후에 마우스의 경골 (t ibia)과 대퇴골 (femur)로부터 골수를 채취하였다. 실시예 1-3 기재된 방법인 실시간 정량 PCR법으로 접착인자의 발현량을 조사하였다.

결과는 도 10a 내지 10c에 나타내었다. 도 10a 내지 10c에 나타낸 바와 같이 Sdf-la, Kit l , Angpt l의 주요 접착인자들의 발현량이 감소되었으며， 그 효과는 대체적으로 NPY(21-28)과 비교해 더 우수한 것으로 확인되었다 (p < 0.05, n=3 per group) .

6-3. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ^25,26 (21- 28)이 골수조혈전구세포 및 골수조혈줄기세포의 혈중 방출에 미치는 영향

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)의 투여가 골다공증 동물 모델에서 혈중으로 방출되는 골수조혈전구 ·줄기세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 1-4와 1-5에 기재된 방법인 CFU assay와 FACs를 통하여 확인하였다.

결과는 도 11a 및 lib에 나타내었다. 도 11a 및 lib에 나타낸 바와 같이， (a) CFU assay를 통해 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ ( 21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골다공증 동물 모델의 혈중 골수조혈전구세포의 방출을 증가시키는 것을 알 수 있다 (p < 0.05, n=3 per group) . 그 결과， (b) 골수에 남아 있는 골수조혈줄기세포의 수가 감소되어 있는 것을 FACs를 통해 확인하였다 (p < 0.05， n=4~5 per group) . 한편， 이러한 D-형 변이 펩타이드들의 효과는 NPY(21-28)과 비교해 더 우수한 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터， 본 발명의 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21- 28)의 투여가 조골세포에 존재하는 골수조혈줄기세포접착인자의 발현량을 감소시킴으로써 혈액으로의 골수조혈전구 ·줄기세포의 방출을 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 특히 이들 펩타이드 중에서도 NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 가장 높은 효율로 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도함을 알수 있었으며， 그 효과는 NPY(21-28)과 비교하더라도 더 우수한 것임을 확인할수 있었다.

실시예 7. NPY ϋ ^Μ ( 21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ ^^^이 골다공증 예방 및 치료에 미치는 영향

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ ( 21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)의 투여에 의한 골수조혈줄기세포의 혈중으로 방출이 골다공증의 골밀도 감소 완화에 효과가 있는지 알아보기 위하여 실시예 1-6 및 1-7의 방법에 따라하기와 같은 실험을수행하였다.

7-1. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ^25,26 ( 21- 28) 투여에 의한골밀도 변화

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 골밀도 변화 측정을 위해 Quantum FX mi croCT Imaging System으로 골밀도 (bone volume/total volume) 및 골조직 두께 (trabecular thi ckness)를 측정하였다.

결과는 도 12a 내지 12c에 나타내었다. 도 12a 내지 12c에 나타낸 바와 같이 microCT로 촬영한 사진에서 골다공증 동물 모델에 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)을 투여한 마우스의 골밀도 퍼센트 (BV/TV, %) 및 골조직 두께 (Trabecular Thickness , mm)가 PBS를 주입한 마우스보다 증가한 것을 확인하였다. 또한 이러한 효과는 NPY(21-28)과 비교해 동등 또는 그 이상이었으며， 경쟁약물인 Alendronate를 주입한 마우스와도 비슷한 효과를 보임을 확인하였다. 특히, NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)를 투여한 동물이 가장 우수한 효과를 보였다 (p < 0.05 , n=4~5 per group) .

7-2. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ² ^ 21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21- 28) 투여에 의한골수 내 파골세포의 변화 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골올 분리하여 TRAP 염색올 통하여 골수 내 파골세포 수를 측정하였다.

결과는 도 13a 내지 13(：에 나타내었다. 도 13a 내지 13c에 나타낸 바와 같이 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ᅳ ²⁶ (21-28)를 투여한 마우스의 골수 내 TRAP posi t ive한 파골세포의 수 (Number of osteocl ast /Bone surface , 譲)와 파골세포의 표면적 (Osteoclast surface/Bone surface , %)이 PBS를 투여한 마우스보다 감소한 것을 확인하였다 (p < 0.05， n=4 per group) . 골밀도 결과와 마찬가지로 NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 가장높은 효율로 골수 내 파골세포를 감소시켰음을 알수 있었다.

7-3. 골다공증 동물 모델에서 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ^25>26 (21- 28) 투여에 의한골수 내 조골세포의 변화

NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)의 4주째 마지막 투여 후 마우스로부터 대퇴골을 분리하여 H&E 염색올 통하여 골수 내 조골세포 수를 측정하였다.

결과는 도 14a 내지 14c에 나타내었다. 도 14a 내지 14c에 나타낸 바와 같이 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)를 투여한 마우스의 골수 내 골에 인접한 조골세포의 수 (Number of osteoblast /Bone surface , mm)와 조골세포의 표면적 (Osteoblast surface/Bone surface , ¾ 이 PBS를 투여한 마우스보다 증가한 것을 확인하였다 (p < 0.05 , n=4 per group) .

상기 결과들로부터， NPY(21-28)의 특정 아미노산의 구조를 변형시킨 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 골다공증 동물 모델에서 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도하여 골수 내에서 조혈줄기세포로부터 분화하는 파골세포의 수적인 감소를 유도함과 동시에 조골세포의 수를 증가시킴으로써 골다공증 마우스의 골밀도 및 골조직 두께 감소를 억제시키는 것임을 알 수 있었다. 특히 NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)이 NPY(21-28)보다 더 효율적으로 골수조혈줄기세포의 혈중 방출을 유도하고 골수 내 파골세포의 수를 크게 감소시켜 골밀도를 증가시키는 것을 확인하였다.

따라서， NPY(21-28)과 이로부터 구조 변형을 통해 재조합한 NPY D ²⁵ (21-28) , NPY D ²⁶ (21-28) , NPY D ²⁵ ' ²⁶ (21-28)은 골다공증 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있으며， 이러한 짧은 단편의 펩타이드는 종래 보고된 긴 펩타이드들과 비교해 더 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 향상된 안정성， 높은 조직 흡수율， 제조 용이성 등의 추가적인 장점을 나타낼 수 있다.

【산업상 이용가능성】

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 골수 내 조혈줄기세포 접착 인자들의 발현량을 감소시켜 조혈줄기세포의 혈중 방출을 효과적으로 유도며， 이는 골수 내 파골세포의 수적 감소 및 조골세포의 수적 증가를 유도하여 골밀도의 감소를 완화하는 효과가 있다. 따라서， 본 발명의 서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 펩타이드는 골다공증 예방또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.