KI MI RAN (KR)
NGUYEN THI KHOA MY (KR)
2020/165883 1^(:1^2020/051518 18 청구범위 [청구항 1] 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드및서열번호 2의아미노산 서열을갖는펩타이드로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의 펩타이드와실리카전구체를포함하는,실리카합성용조성물. [청구항 2] 제 1항에 있어서, 상기실리카전구체는테트라에틸오르토실리케이트,테트라메틸 오르토실리케이트,메틸트리에톡시실란,에틸트리에톡시실란,페닐 트리에톡시실란,디메릴디메톡시실란,디메릴디에톡시실란,트리 메틸에톡시실란,트리아미노프로필트리에톡시실란,티타니아 테트라이소프로폭사이드,티타니움옥시셀페이트, 티타니움비스암모니움락테이토디하이드록사이드,티타니음 디이소프로폭사이드비스아세릴아세토네이트및테트라에틸 게르마늄으로이루어진군으로부터선택된하나이상인것을특징으로 하는,실리카합성용조성물, [청구항 3] 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드및서열번호 2의아미노산 서열을갖는펩타이드로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의 펩타이드와실리카전구체를반·웅시키는단계를포함하는실리카합성 방법. [청구항 4] 저 13항에 있어서, 상기반응은상온및상압의조건에서 5-8의수용액하에서수행되는 것을특징으로하는,실리카합성방법 . [청구항기 서열번호 1또는서열번호 2의아미노산서열을포함하는펩타이드;및 페리틴(1¾出 11)및바이러스캡시드단백질로이루어진군으로부터 선택된하나이상을포함하는융합단백질, [청구항 6] 저ᅵ5항의융합단백질및실리카전구체를포함하는실리카파티클합성용 조성물. [청구항 7] (1)제 5항의융합단백질을산성조건에서단량체로분해하는단계; (2)상기 단량체를약염기조건에서코어-쉘구조체로결합시키는단계; 및 (3)상기구조체에실리카전구체를혼합하여반응시키는단계;를 포함하는실리카파티클제조방법 . [청구항 8] 제 7항에 있어서, 상기 (1)단계는융합단백질과페리틴단백질을혼합하여수행되 특징으로하는,실리카파티클제조방법. [청구항 9] 제 8항에 있어서, 상기융합단백질과페리틴단백질은 1:1~5의비율로혼합되는 특징으로하는,실리카파티클제조방법 . [청구항 10] 제 7항에 있어서, 상기 (1)단계는 pH 2〜 3조건하에서수행되는것을특징으로하는, 실리키-파티클제조방법 . [청구항 11] 제 7항에 있어서, 상기 (2)단계는 : pH 1-9조건히-에서수행되는것을특징으로하는, 실리카파티클제조방법. [청구항 12] 제 7항에 있어서, 상기 (2)단계는하기의知)내지 (c)단계를포함하는것을특징으로하는, 실리카파티클저 i조방법: (a)상기단량체와약물을혼합하는단계 ; (b)약염기조건에서상기단량체를코어-쉘구조체로결합시켜약물이 담지된구조체를제조하는단계;및 (c)구조체내부에담지되지않은약물과구조체를형성하지않은 단량체를제거하여약물이담지된구조체를분리하는단계. [청구항 13] 제 7항에 있어서, 상가 (3)단계는글리세롤이포함된용액내에서수행되는것을특징으로 하는,실리카파티클제조방법 . [청구항 14] 제 7항에 있어서, 상기방법은 (3)단계이후에제조된실리카파티클을약물에담지하여 파티클표면에약물을결합시키는단계를추가로포함하는것을 특징으로하는,실리카파티클제조방법 . [청구항 15] 제 7항내지제 15항중어느한항의방법으로제조된실리카피-티클. [청구항 16] (가)서열번호 12의염기서열로이루어진 Kps유전자또는서열번호 13의 염기서열로이루어진 Kpt유전자와페리틴 (ferritin)을암호화하는 유전자를포함하는재조합발현벡터를제조하는단계; (나)상기발현벡터를숙주세포에도입하여형질전환체를제조하는 단계;및 (다)상기혈질전환체를배양하는단계;를포함하는실리카형성 펩타이드와페리틴의융합단백질제조방법. [청구항 17] 제 16항에 있어서, 상기방법은 (다)단계이후에상기형질전환체를파쇄하고,원심분리를 통해형질전환체의파편을제가하여획득된가용성분획물을니켈 수지와혼합하여니켈수지에결합된융합단백질을수득하는단계를 주가로포함하는것을특징으로하는,융합단백질제조방법. |
1
명세서
발명의 명칭:신규의실리카합성펩타이드및이를이용 실리카 입자합성방법
기술분야
[1 ] 본발명은신규의실리카합성펩타이드및이를이 용한실리카합성방법등에 관한것이다.
四
배경기술
[3] 산업화이후한정된육상가용자원의소비급증에 따른육상자원소재의
고갈로인한새로운유용자원개발이국가적미래 를위한중요이슈가되고 있다·.따라서미국,유럽 일본등의선진국들은신규원천소재개발및확보 에 국가역량을집중시키고있다.여기에더하여환 오염으로인한지구온난화및 기후변화등은인류의생존을위협하는요인으로 작용하고있어경제성장과 환경보호를동시에추구하는새로운패러다임이 대두되고있다.
[4] 환경친화적인생물학적생산방법을통해신소재 를생산화는방법은원천
기술의확보뿐아니라친환경산업으로인한국가 적인저탄소녹색성장의 견인차역할을할기술로기대된디-.특히,실리카 는특정화학종들과공유 결합이가능하기때문에새로운하이브리드소재 (유기··무기복합체)합성에 중요하고 또한,생체적합한소재로서각개별소재의단점 을보완할수있는 우수한특성을가지고있다.현제실리카의공업 생산공정은고온,강산또는 강염기조건이요구되고환경적으로유해한부산 물생성의문제점이있디-.
[5] 그러나상온상압에서실리카를형성할수있는효 소및펩타이드가
발견됨으로써생물학적생산방법을통한바이오 실리카복합소제개발에대한 관심이증대되고있다.
[6] 한편,페리틴은생체내주요철저장단백질로서 포유류에서세균류에
이르기까지다양한생명체에존재한디 페리틴분자는 18 22노 의단량체 24게가결합된약 450 kDa분자량을지닌구형의거대분자이면서단백질 내부 공간이비어 있는코어셀 (core shell)형태를띠고있디-.이러한구조적특징은 다양한분야에응용될수있는데,예를들어페리 틴의내부공간을이용해 다양한금속이온,동위원소,약물전달소재를 반할수있으며페리틴각 단량체의 N _말단부분에특정기능의 리간드를연결하여표적지향적인영상 지단및약물전달체를제조할수있디-,또한페리 자체의구조적특성을이용, 주형으로사용하여규칙적인나노구조체를만들 수있다.
[7] 전술한기슬적배경하에서본발명자들은입자의 크기를조절할수있는
바이오실리카입자제조기술에대해연구하던중 ,신규실리카형성
펩타이드를개발하고,상기실리카형성펩타이 드와페리틴이융합된단백질을 9
이용할경우실리카나노입자의크기를효과적 으로제어할수있음을확인하고 본발명을완성하였디-。
[8]
발명의상세한설명
기술적과제
[9] 본발명이이루고자하는기술적과저 i는실리카를합성할수있는신규
펩타이드및이를이용하여단분산입자로생성되 며,크기조절이가능한바이오 실리키·입자를제조하는방법을제공하는것이 -.
[10] 또한,본발명에서는상기펩타이드에 의해제조된실리카기반복합체의전지-, 화학,약학등의다양한산업분야에서의용도를 제공하는것이다.
[11] 그러나본발명이이루고자하는기술적과제는이 상에서언급한과제에
제한되지않으며,언급되지않은또다른과제들 은아래의기재로부터당해 기술분야의통상의기술자에게명확하게이해될 수있을것이다.
[12]
과제해결수단
[13] 본발명은싱끼 과제를해결하기위하여,서열번호 1또는서열번호 2의
아미노산서열을포함하는신규의실리카합성펩 타이드 (silica forming peptide: SFP)를제공한디-.
[14] 또한,본발명은상기신규의실리카합성 펩타이드와실리카전구체를
포함하는실리카합성용조성물을제공한다-.
[15] 또한,본발명은상기신규의실리카합성펩타이 드와실리카전구체를
반응시키는단계를포함하는실리카합성방법을 제공하며,상기반응은상온 및/또는상압조건하에서수행될수있고, pH 5-8조건하에서수행될수있다.
[16] 또한,본발명은상기신규의실리카합성펩타이 드와페리틴 (ferritin)또는
바이러스캡시드단백질이결합된융합단백질을 제공한다.
[17] 또한,본발 · 명은상기융합단백질과실리카전구체를포 함하는실리카파티클 합성용조성물을제공하며 ,상기실리카파티클은상기페리틴또는바이러 캡시드단백질에의해형성된코어쉘구조체표면 에실리카가코팅된구조를 가질수있다.
[18] 또한,본발명은 (1)상기융합단백질을산성조건하에서단량체로 분해하는 단계; (2)약염기조건하에서상기단량체의페리틴또는 바이러스캡시드 서브유닛 (subunk)의결합을유도하여코어-쉘구조체를제조 하는단겨] ;및 (3) 상기구조체와실리카전구체를반응시키는단계 ;를포함하는실리카파티클 제조방법을제공한다.
[19] 본발명의일구현예로서 ,상기 (1)단계는 질과페리틴단백질을
혼합하여수행될수있으며,그혼합비율은 있다,상기혼합비율은 최종산물인실리카파티클의입자크기에영향을 미치며,제조하고자하는 실리카파티클의크기가큰경우융합단백질의비 율을높이고,그크기가작은 경우페리틴단백질의비율을높인다.
[20] 본빌「명의다른구현예로서 ,상기 (1)단계는 pH 2-3조건하에서수행될수
있으며, 직하게는 pH 2수·용액하에서수행될수있다.
[21 ] 본발쟁의또다른구현예로서 ,상기 (2)단계는 pH 7~9조건하에서수행될수 있으며,바 ¾ '직하게는 pH 8수용액하에서수 ¾될수있다,
[22] 본발명의또다른구현예로서,상기 (3)단계는글리세롤이포함된용액내에서 수행될수있으며,바람직하게는 50%글리세롤이포함된용액내에서수행될수 있,디-.
[23] 또한、본발명은상기방법으로제조된실리카파 티클을제공한다.
[24] 한편,본발명의실리카파티클은내부에약물을 지하여약물전달체로
이용될수있으며,상기약물의담지는상기 (2)단계에서코어-쉘구조체의 제조시약물과융합단백질의단량체가혼합된용 액의 pH를염기로조절하여 코어·.쉘구조체를제조함으로써수행될수있다 .
[25] 또한,본발명의실리카파티클은그표면에약물 로딩하여약물전달체로 이용될수있다.상기약물의로딩은상기 (3)단계이후에제조된실리카 파티클과약물을반응시켜실리카파티클의표면 과약물의 결합을
유도함으로써수행될수있다.
[26] 한편,본발명의실리카파티클은내부와표면에 각독립적으로약물을
로딩하여이중약물전달시스템으로이용될수있 고,상기파티클표면에 결합된약물과내부에담지된약물의방출패턴과 로딩되는약물을고려하여 표면과내부에각각로딩되는약물은서로동일하 거나상이할수있디-.
[27] 본발명의일구현예로서 ,상기약물은화합물,펩타이드,단백질,이 징
제제 (imaging agent),유전자구、성물 (gene construct),및이들의조합으로이루어진 군으로부터선택되는 1종이상일수있다.
[28] 본발명의다른구현예로서 ,상기실리카전구체는테트라에틸
오르토실리케이트,테트라메틸오르토실리케 이트,메틸트리에톡시실란,에틸 트리에톡시실란,페닐트리에톡시실란,디메 디메톡시실란,디메틸
디에톡시실란,에틸트리에톡시실란,트리메 에톡시실란,
트리아미노프로필트리에특시실란,티타니아 테트라이소프로폭사이드., 티타니움옥시셀페이트,티타니움비스암모니 락테이토디하이드록사이드-, 티타니움디이소프로폭사이드비스아세틸아세 토네이트및테트라에틸 게르마늄으로이루어진군으로부터선택된하나 이상일수있다.
[29] 또한,본발명은 (가)서열번호 3의염기서열로이루어진 Kps유전자또는
서열번호 4의염기서열로이루어진 Kpt유전자와페리틴 (ferritin)또는바이러스 캡시드단백질을암호화하는유전자를포함하는 재조합발현벡터를제조하는 단계; (나)상기발현벡터를숙주세포에도입하여형질 환체를제조하는딘「계; 및 (다)상기혈질전환체를배양하는단계;를포함하 는실리카형성펩타이드와 2020/165883 ?€1/162020/051518
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페리틴의융합단백질제조방법을제공한다.
[30] 본발명의일구현예로서,상기방법은(다)단 이후에상기형질전환체를 파쇄하고 원심분리를통해형질전환체의 파편을제가하여획득된가용성 분획물을니켈수지와혼합하여니켈수지에결합 된융합단백질을수늑하는 정제단계를추가로포함하여고순도의융합단백 질을제공할수있디-,
[31]
발명의효과
[32] 본발명에서는페리틴의각서브유닛 24개가모여구형의페리틴단백질을
형성하고이구조가산에서는해체되었다가 를다시중성으로맞추면페리틴 단백질의 24개서브유닛이다시모이는성질을이용하여페 틴아미노말단에 실리카형성펩타이드가융합된페리틴과(1¾) !5-1¾/ 1 - 1¾)과그렇지않은페리틴 0¾)을일정비율로섞어바이오실리카형성펩타 이드밀도를조절함으로써 실리카나노입자의크기를제어할수있는신규한 실리카합성펩타이드를 제공한다.
[33] 본발명에따르면 크기조절이가능한바이오실리카나노입자 · 를,글리세롤의 농도조절을통해단분산형태로제조할수있는바 ,다양한바이오하이브리드 나노물질의디자인에적용할수있는새로운바이 오실리카입자의생성방법을 제공할수있다.
[34]
도면의간단한설명
[35 ] 도 1욘· 에따른실리카형성펩타이 실리카침전활성을 비교확인한도면이다.
[36] 도 2는니켈수지에대한펩타이드의흡착등온선이 [(서 6x018.(6) ( )
도면이다.
[39] 도 5는페리틴기반의실리카파티클(예¾)제어방 법의모식도이디-,
[40] 도 6은주형으로키메라 ¾을사용하여 50%글리세롤의존재하에졸-·겔
공정으로부터유도된실리카입자에대해 200개이상의 입자의통계분석을 통해얻어진입자크기히스토그램결과를나타낸 것이다.
[41] 도 7은실리카형성반응시 50%글리세롤첨가유무에따른,형성된실리카
50%글리세롤첨가, ± ¾0 2 /1(排-¾ 50%글리세롤첨기-),스케일바: 5001·,
[42] 도 8은실리카입자에결합한 양을비교한것으로, £1는아가로즈겔(0.7 %) 전기영동을통해각실리카입자에흡착되었던 0 쇼를용출시켜그양을비교한 대표도이며 (레인 1 : Si0 2 /Kps-Fn,레인 2: Si0 2 /Kpt-Fn,레인 3: Si0 2 /Kpsl:5,례인 4: Si0 2 /Kptl:5,레인 5:상업용 SiO 2 (170nmX레인 6:상업용 Si0 2 (310nm),레인 7: 유리 DNA (500ng)), b는실리카입자로부터용출된 DNA의양을 Image! 소프트웨어로측정하여정량화한결과를나타낸 다 (T <0.01 , Si0 2 /Kpsl:5대 Si0 2 /Kps-Fn. ** P <0.01, Si0 2 /Kptl:5대 Si0 2 /Kpt-Fn. # P <0.001, Si0 2 /Kpsl:5대상업용 실리키-. U P <0.001, Si0 2 /Kpti:5대상업용실리카·).
[43] 도 9는 Kps6:6 Fii및 Si0 2 /Kps6:6Fn에담지된 Dox의방출패턴을 pH에
따라확인한도면이디- ,
[44] 도 10은 Kpi6:6(Dox)의표면에고정된 raRFP의· Dox의시간의흐름에따른방출 패턴을확인한도면이다.
[45]
발명의실시를위한최선의형태
[46] 본발명자들은새로운실리카합성팹타이드의개 발과이를이용한바이오
실리카의다양한이용방법에대해예의연구하여 본발명을완성하였다.
[47] 본발명자들은새로운실리카합성탭타이드를발 글하기위하여 Kps서열
(KPSHHHHHTGAN; US20060172282AI; DOI:
htps://doi.org/10.1166/jnn.2002,074)#기초로단백질데 터베이스 Blast검색에 의해 Kpt펩타이드를선별하였고, Kps와 Kpi펩타이드를 R5펩타이드를 reference로하여실리카합성능력을확인한결과, Kps및 Kpt모두상온,상압, pH 5내지 8조건하에서활발하게실리카를합성할수있음 확인하였다.해양 미생물 Ruegeria pomeroyi DSS-3 (이전 Silicibacter pomeroyi)의 -f 단백질 (NCBI RefSeq : WP_011046633.1)에존재하는서열 (KPTHHHHHHDG)로이루어진 Kpt 펩타이드는 pH 5, 6,및 8조건하에서 R5및 Kps보다우수한실리카형성능을 나타내었디- (실시예 M ).
[48] Kps및 Kpt펩타이드는단독으로도사용될수있지만효소 나기능성단백질과 융합을통해단백질에실리카형성능력을부여할 수있다、그러나재조합 단백질의발현을위해 muUi-tag의융합은단백질구조및발현에영향을즐 있어단일결합 tag이다기성을갖는다면더가치및유용성이증가 하게된디-.
Kps및 Kpt는서열중히스티딘잔기 6개가반복서열로존재하기때문에정제를 위한니켈수지에결합가능할것으로예상되었고 이를확인한결과, Kps및 Kpt 모누니켈수지에대해높은친화력을가짐을알수 있었디- (실시예 1-2).
[49] 한편,페리틴의각단량체는 24개가모여구형의페리틴단백질을형성하고이 구조가산에서는해체되었다가 pH를다시중성으로맞추면페리틴단백질의 24개단량체가다시모여코어-쉘구조체를형성하 는성질을갖는다.
[50] 이에,본발명자들은상기 Kps또는 Kpt에코어-셀구조체를형성하는페리틴 단백질을결합한융합단백질 (SFP-Fn)을제조하고이를니켈수지를이용하여 정제한후상기융합단백질은산성조건하에서단 량체로분해하고다시중성 2020/165883 ?€1/162020/051518
6 또는염기성조건하에서결합을유도하여획득된 구조체의형태를관찰한결과, 결합된페리틴단백질의기능에영향을미치지않 고니켈수지를 이용한정제에친화성태그로효과적으로기능함 을확인할수있었다(실시예 2),
[51] 본발명에서상기 : 를이용하여제조된구조체는키메라페리틴이라 고 할수있으며 ,상기코어-셀구조체와키메라페리틴은혼용될 있다.
[52] 또한,본발명자들은상기융합단백질의코어· 쉘구조체와실리카전구체를 혼합하여실리키·파티클을제조하였으며,상기 실리카파티클은상기융합 단백질로이루어진구조체의표면에실리카가코 팅된구조로서 ,실리카 파티클의크기는융합단백질에결합된 꾸의실리카형성능에영향을받음을 확인하였다.이에상기페리틴에의한코어··쉘 조체표면에위치한 성능에따라실리카과티클의크기를조절할수있 을것으로예상하고
8-1½¾ -1¾및 1¾서브유닛의비율을달리하여키메라페리틴을 제작하고 실리카파티클을제조하여실리카파티클의크기 를효과적으로조절할수 있음을확인하였다(실시예 3-1).한편,본명세서에서 및 1¾을 혼합하여제작한키메라페리틴은그혼합비율에 따라구분하여명명한디-. 예를들어 나¾와!¾을 1대 5의몰비로섞은후재구성하여얻은키메라 페리틴은 로명명하고 내11와! ¾을 1대 5의몰비로섞은후재구성하여 얻은키메라페리틴은 1^1:5로명명하였디-.
[53] 또한,본발명자들은제조된실리카파티클은서 뭉치는현상이
확인되었으나,이는실리카전구체와반응시 50%글리세롤을첨가하여방지할 수있음을확인하였다(실시예 3-2).
[54] 8-1¾은 내11보다크기가큰실리카나노파티클을형성하 ,보다작은 실리카파티클을형성하는 은표면적이넓은바이오실리카를제조할수 있음을알수있다.이에,본발명자들은 ½, [마 - !¾및키메라 1¾을주형으로 제조된실리카나노입자에 £)■흡착능을확인한결과동량의바이오
실리카에서크기가작을수록 DNA흡착능이우수함을확인하였고.본발명의 신규한 로제조된실리카파티클은시판되는실리카파티 클보다우수한
[) 흡착능을나타내었다(실시예 5).
[55] 또한,본발명자들은상기코어··쉘구조체내부 약물을담지하여실리카
파티클을제조함으로써약물전달체로제공할수 있음을확인하기위하여,상기 융합단백질의코어-쉘구조체형성시약물을혼 하여쉘구조내부에약물을 담지하고실리카파티클을제조하였다.약물을 지한실리카파티클은산성 조건하에서빠르게약물을방출하였고,중성부 근의{)11에서서서히 약물을 방출함을확인할수있었디 _(실시예 6).
[56] 또한,본발명자들은상기코.어··쉘구조체내부 와실리카코팅막에약물을각 각담지하여 2중약물전달체로제공할수있음을확인하기위 여,상기 융합단백질의코어-쉘구조체형성시약물을혼 하여웰구조내부에약물을 담지하고실리카파티클을형성하는과정에다른 약물을첨가하여페리틴코어 주위에실리카가침전되면서주위에존재하는약 물을함께실리카에 고정화시켜약물이담지된실리카파티클을제조 하였다.페리틴내부코어와 외부실리카셀에약물을담지한이중약물전달시 스템은외부약물이내부 약물에비해빠르게방출됨을확인할수있었다 (실시예 7).
[57]
[58] 본발명의약물전달체는약제학적으로허용가능 한담체를추가로포함할수 있으며,상기약물전달체의실리카복합체는코 어-셀구조로내부에약제학적 활성성분을내포할수도있다.
[59] 상기약제학적으로허용가능한담체는의약분야 에서통상사용되는담체및 비히클을포함하며,구체적으로이온교환수지 ,알루미나,알루미늄
스테아레이트,레시틴,혈청단백질 (예,사람혈청알부민),완충물질 (예,각종 인산염,글리신,소르브산,칼륨소르베이트 ,포화식물성지방산의부분적인 글리세라이드혼합물),물,염또는전해질 (예,프로타민설페이트,
인산수소이나트륨,인산수소캄룸,염화나트 및아연염),교질성실리카, 마그네슘트리실리케이트,폴리비닐피를리돈 ,셀룰로즈계기질,폴리에틸렌 글리콜,나트륨카르복시메틸셀룰로즈,폴리아 레이트,왁스,폴리에틸렌 글리콜또는양모지등을포함하나이에제한되지 않는다.
[60] 또한,본발명의약물전달체는상기성분들이외 윤활제,습윤제·유화제, 현탁제,또는보손제능을주가로포함할수있다,
[61 ] 본발명의구체적인실시예에서 백터 (vector)”는적합한숙주내에서 DNA를 발현시킬수있는적합한조절서열에작동가능하 게연결된 DNA서열을 함유하는 DNA제조물이라면이에제한되는것은아니다.따 서,벡터는 쓸라스미드,파지입자,또는간단하게잠제적 놈삽입물일수있다.적당한 숙주로형질전환되면,벡터는숙주게놈과무관 게복제하고기능할수있거나, 또는일부경우에게놈그자체에통합될수있다. 라스미드가현재벡터의 가장통상적으로사용되는형태이고,본발명의 체적인실시예에서이용하고 있는형태이므로,본발명의명세서에서 플라스미드 (plasmid)"및 "백터
(vector)”는때로상호교환적으로사용된다.그러 나,본발명은당업계에알려진 또는알려지계되는바와동등한기능을갖는벡터 의다른형태를포함한다.
[62] 또한,본명세서에 "재조합발현벡터’’는통상이종의 DNA의단편이삽입된 재조합캐리어 (recombinant carrier)로서일반적으로이중가닥의 DNA의단편을 의미한다.여기서 ,이종 DNA는숙주세포에서천연적으로발견되지않는
DNA인이형 DNA를의미한다.발현벡터는일단숙주세포내에 있으면숙주 염색체 DNA와무관하게복제할수있으며벡터의 수개의카피및그의삽입된 (이종) DNA가생성될수있디-.
[63] 상기벡터는클로닝되는유전자와직-동가능하 연결된 (operatively linked) 프로모터를포함할수있으며,본명세서에서“ 로모터”는형질주입하고자 하는유전자의발현을촉진시키는것으로서상기 프로모터에는전사에필요한 기본인자 (Basal element)뿐만아니라,발현의촉진및조절에사용될 수있는 인핸서 (enhancer)가더포함될수있다.
[64] 또한,본명세서에서 "형질전환”또는“형질주입”은 DNA를숙주로도입하여 DNA가염색체외인자로서또는염색체통합완성에 의해복제가능하게되는 것을의미한디-,상기형질전환은핵산을유기체, 세포,조직또는기관에 도입하는어떤방법도포함되며,당분야에서공 지된바와같이숙주세포에따라 적합한표준기술을선택하여수행할수있다.이 방법에는
전기충격유전자전달법 (eleciroporaiion),원형질융합,인산칼슘 (CaP0 4 )침전, 염화칼슘 (CaCl 2 )침전,실리콘카바이드섬유이용한교반, 그로박테리아 매개된형질전환, PEG,덱스트란설페이트,리포펙타민등이포함되 이로 제한되지않는다.
[65] 또한,숙주에따라서단백질의발현량과수식등 이다르게나타나므로,목적에 가장적합한숙주세포를선택하여시·용할수있 .숙주세포로는
대장균 (Escherichia coli),바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis),
스트렙토마이세스 (Strepiomyces),슈도모나스 (PseudomonasX프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)또는스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와같은원핵 숙주세포가있으나이로제한되는것은아니다, 한,진균 (예를들어, 아스페르길러스 (Aspergillus)),효모 (예를들어,피치아파스토리스 (Pichia pastoris),사카로마이세스세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae),
쉬조사카로마세스 (Sdiizosaccharomyces),뉴로스포라크라시- (Neurospora crassa))등과같은하등진핵세포,곤충세포,식물 세포,포유동물등을포함하는 고등진핵생물유래의세포를숙주세포로사용할 수있다.
[66]
[67] 본발명은다양한변환을가할수있고여러가지실 시예를가질수있는바, 이하특정실시예들을도면에예시하고상세한설 명에상세하게설명하고자 한다.그러나,이는본발명을특정한실시형태에 해한정하려는것이아니며, 본발명의사상및기술범위에포함되는모든변환 ,균등물내지대체물을 포함하는것으로이해되어야한다.본발명을설 함에있어서관련된공지 기술에대한구체적인설명이본발명의요지를흐 릴수있다고판단되는경우 그.상세한설명을생략한다.
[68]
발명의실시를위한형태
[69] [실험방법]
[70] 1.실리키·형성펩타이드 (Si!ica forming peptide: SFP)
[71] 1-1. SFP의준비
[72] 실험에이용된 SFP는하기표 1과같다. Kpt는 Kps서열을기초로 Blast단백질 데이터베이스검색을통해선별하였다. [73] [표 1]
[74] l:2JiE£완 .실권.칸..1성.효..: S.il.
[75] 탈-이은수에 SFP (R5, Kps, Kpt)를각각 10 mg I mL의농도로제조하고, 1M의 TMOS(Tetrameliiyi oithosilicate)를·반응· W분전에 HC1을최종농도 ImM이 되도록첨가하여실리카전구체 silicic acid을제조하였디 실리카침전을위해 80 M.L의실리카침전반응용완충제 (아세테이트완충제 pH 5.0및칼륨포스페이트 완충제 pH 6, 7또는 8.0)에가수분해된 1 M의 TMOS 10 및 SFP 10 L를 첨가한후혼합물을실온에서 5분동안교반하여반응시켰디 침전된실리카 입자를원심분리로분리한다음탈이은수로 3회세척히-였다, pH에따른 펩타이드의실리카형성능은몰리브덴블루법을 이용한실리카정량법으로 정량하였다.
[76]
[77] 1-3.니렘수지어]대하 SFP의히화성획-이
[78] PBS에녹인 10 mg/mL의펩타이드와 100 L를니켈수지를 30분간상온에서 교반하여혼합하고원심분리하여 (i4000xg, 5분)니켈수지와결합되지않은 펩타이드를회수하였다.상청액샘플중펩티드 양을 pierce Quantitative Fluorometric Peptide assay (Thermo Fisher Scientific, IL, USA)를이용하여 즉정하고,하기 Langmuir흡착등온선식 1에따라흡착용량 (q)과 K d 값을 계산하였디-.
[79] [식 1]
[80] q = (q· x C eq ) / (K d + C eq )
[81]
[82] 2.Fn단백질및 SFP-Fn융합단백질의제조
[83] 2-1.밤현백터및형짐저환체저!조
[84] 인간의중쇄페리틴 (human Ferritin heavy chain: Fn)유전자는 plJC57-Fn OPT (GenScript USA Inc.)를주형으로 PCR을수행하여준비하였다. PCR수행을위한 정방향/역방향프라이머의구체적인정보는하 표 2와같다.이어서 ,상기 PCR 산물로확보된 Fn유전자를 pET-42b백터에삽입하여 pET-Fn플라스미드를 제조하고대장균시스템(1 21(1:恨3))에도입하여형질전환체를제작 였다.
[85] [표 2]
[86] Kps-Fn및 Kpt-Fn을제조하기위하여 , pUC57-Fn OPT플라스미드를주형으로 하여 3게의 Kps또는 Kpi서열을 Fn의아미노말단에도입하:기위한각유전자에 대한전방향프라이머 3개(FI, F2및 F3-K:ps또는 -KpO를제작하였다(표 3) :미과 R Fn으로첫 PCR을수행후그산물을다시주형으로 F2와 R-Fn으로 PCR을 수행하고그산물을다시주형으로하여마지막 F3와 R-Fn으로 PCR을수행하여 Kps-Fn및 Kp(-Fn유전자를얻은푸 T-벡터인 pGEM-T Easy vector(Promega Co , Madison, W】)에서브클로닝하였디-.제한효소 Ndel / Xhol:으로상기서브 클로닝된 T··벡터로부터 Kps-Fn또는 Kpt-Fn유전자단편을절단하고,같은제한 효소로처리된 pET42b벡터를이용하여 pET-Kps-Fn, pET-Kpt-Fn을발현벡터를 제조하고이를대장균 RL21(DE3)에도입하여 Kps-Fn또는 Kpt-Fn생산균주를 제작하였디·.삽입된모든 DNA염기서열은자동화된 DNA시퀀싱(Cosmo Genetech Co , Seoul)에의해확인하였다,
[87] [표 3]
[88] 2-2.다백겉의밤혀
[89] 1¾, ¾또는 Kpt Fn발현벡터가도입된대장균 BL2ί £3)을카나마이신 (25能/ ¾£)이포함된 1 액체배양액에배양하여 37ᄋ 에서균체흡광도가 ’ 0 6~0.8 (600001흡광도)정도에이를때까지성장시킨후 ,최종농도가 0.1111 이되도록 ]1 (}를첨가하였디-.이어서, 발현백터가도입된균주는 20。(::에서밤새 배양하여단백질발현을유도하고, Kps-Fi!또는: !¾)내11발현벡터가도입된 균주는 37。(:에서 4시간배양하여 8-¾또는 1예¾의발현을유도하였디-. 다음으로상기각균주를원심분리로회수후초음 파처리로파쇄하고., 4ᄋ(:에서 13000피이으로 30분간원심분리하여불용성균체파편을제거한 가용성 I I 분획만을회수하였다.상기가용성분획은 60°C에서 10분간처리하여침전된 단백질들을같은조건으로원심분리하여최종가 용성분획을희수하였다.
[9이
[91] 2-3.다배짐의 정저 I
[92] - Fn단백질의정제 :왕산 ¾모늄짐전, phenyl- sheparose column chrom atograph y 및 Q-sepharose column chromatography의해정제하였다.
[93] - Kps-Fn및 Kpt-Fn단백질의정제:니켈수지를이용하여고순 로정제하였다.
[94] -최종적으로,용출된분획을투석을통해 50mM Tris-HCL 300mM Nad및 i % 수크로스 (pH 8.0)로완충액을교환하였다.각단백질농도는 Bradford분석시약 (Thermo Fisher Scientific)을사용하여즉정하였다.
[95]
[96] 3.키메라페리틴단백질의제조
[97j Fn과 Kps/Kpt-Fn단백질을다양한몰비율로혼합한혼합 액 (Kps-Fn 2rad대
Fn 10 mol의비율로융합된경우 Kps 2: 10로표현,같은방법으로 Kpt-Fn 2mol대 Fn 10 mol의비율로융합된경우 Kpt 2: 10)에 1M HC1을첨가하여 pH를 2.0으로 조정하여 20분동안페리틴을단량체로분해하고다시 1 M NaOH를첨가하여 pH를 8.0로조절하여 24개단량체페리틴이합체된키메라 Fn단백질을재구성 하였다. HC1및 NaOH의첨가로발생된염은 4 O C에서완충용액 (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH B.O(TBS)및 1 %수크로즈로)으로 24시간동안투석하여 제거하었다、이어서,투석후 Aniicon Ultra TOOK원심여과액장치로여과·하여 단량체및막대형올리고머를제거하고,크기구 배크로마토그라피를이용하여 구형의 Fn단백걸만을수득하였다.상기획득된 Fn단백질은이하규화반응의 주형으로사용하였다,모든단백질은사용전에 4 O C에서단백질안정성을 유지하기위해 1 %수크로오스를함유하는 TBS완충액에저장하였다.
[101] 1M의 TMOSiTetraniethy] oriliosiUcate)를반웅 10분전에 HC1을최종농도
ImM이되도록첨가하여규산을제조하였다.다양 농도의글리세롤 (0 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %)을함유하는인산칼륨완충액 (pH 8.0)에 40«g/ ml 페리틴단백질및 lOmM규산을첨가한혼합물을실온에서 2시간동안진탕 반응시키고,원심분리에의해실리카로캡슐화 Fn입자를수득하고,증류수로 수회세척하였다.
[102]
[loss 生요. jjm트 im j:
[104] 실리카캡슐화된 Fn입자를 1M NaOH에용해시키고 95 °C에서 5분동안
인큐베이션하였디-,희석된시료총 20 jxL를 1 M HC1 20 L와증류수 10 L가 들어있는 96 -웰플레이트의각웰에첨가하여 pH값을중화시켰다.후속 2020/165883 ?€1/162020/051518
12 단계에서, 2 %암모늄몰리브데이트테트라하이드레이트, 5 %옥살산및 10() 111^1아스코르빈산을각각 50 씩순차적으로첨가하였다.마지막으로 200 ¹ 용액의흡광도를파징 · 700아»에서측정하였디-.메타규산나트륨비수 물의 용액을 ¾표준곡선을생성하기위해사용하였디-.
[105]
[106] 파티큼의표며특성
[107] 전물을증류수로세척하고,에탄올로희석하고 실리카웨이퍼상에 하였다,스캐닝전자현미경 (804)이미지는 2 의가속전압으로 0에서촬영되었다.샘플은이온스퍼터시스템 (1¾요베시030)을 사용하여아르곤대기에서 관찰직전에백금으로코팅되었다.
[108] 또한,실리카파티클의다공성및표면적측정을 하여, 내 1^ 2: 1이
Kpt - ¥\\, ]&마 2: 10에의해형성된 100
수행하였다.질소흡착등온선은 2020 0 / \, \)을 사용하여 77 에서측정되었다.제조된샘플의비표면적은
사용하여질소흡착데이터에의해 결정되었다.
[109]
[110] 4-4.심리카파·티큼의 DNA휴착및용.
[111] (최종농도 60 ¾/ )와실리카입자 (최종농도 100 를섞은후
혼합물을실온에서 2시간동안진탕반응시키고실리카입자를원심 리에 의해결합완충액으로부터제거하였다. 용출을위해실리카입자에 20 의 정제수를첨가한다음,진탕조건 (200] 1¾11 )하에 30분동 · 안배양하였다.원심 분리후,실리카입자를연속적으로세척하여 켰다. 물에서의 농도는겔전기영동에서염색된 DNA밴드의세기를 1110^1 프로그램으로정량화하여결정되었다,
[112]
첨가하여 5분간반응시킨후· 1 N 8£1011를첨가하여반응용액의 를 8로 조절하여하룻동안냉장챔버에서교반반응시켰 다.원심분리를통해침전물을 제거후,상청액을투석막에넣고페리틴내부에 지되지않은 [)0>[를 제거하였다. 33(«를담지한페리틴샘플 (: 1切86:6(0(«))에최종농도가 40% 되도록빈 이을첨가하고최종 11 03농도는 100 :조건에서 2시간동안 실리카형성반응을시킨후형성된실리카를침전 시켜최종산물 (810 2 / 86:6(!)0>0)을회수하였다.실리카반응을수행하 지않은독소담지키메라 페리틴 8 6:6(1)0幻과실리카로캡슐화된 ¾0/^36:6(1)0幻로부터방출된 !)(¾양을비교하였디-, [ 1 15] 각 ImL샘플은투석막 ( 10K MWCO, Pierce)에넣은후투석막은· 10 niL의 완충액 (인산-시트레이트완충액, pH5.5와 pH 7 .4)이들어있는 50 mL튜브에 넣은후 37 O C의항온에서 150 rpm으로진탕반응시켰다、상기 Dox방출량확인 시마다투석막밖의완충액을회수하고새완충액 으로교환하였다,샘플로부터 방출된 Dox농도는상응하는완충용액에서의 Dox표준곡선과비교하여형광 마이크로플레이트판독기 (M85 / XInfinite F200 NanoQuant; TECAN)를사용하여 결정되었다、각시점에검출된 Dox양은시간에따른누적양으로계산하였디-.
[116】
[1 17] 4-6.이중약물저담시스텐
[118] 이중약물전달시스템의적용가능성을확인하기 위해, mRFP단백질을모델 분자로사용하였디-,미리제조된 Kpt6:6 (Dox)용액을 mRFP및 20 mM의가수 분해된 TMOS를함유하는 50 mM인산나트륨완충액에첨가하였다 [mRFP대 Kpt6:6 (Dox)의몰비는 10대 H서 1대 1까지 :!. 24시간동안교반하여 mRFP를 Kpt6:6 (Dox)의규화된쉘에포획하였다 (Si0 2 (mRFP)/Kpt6:6(Dox)).미반응 mRFP및 TMOS는 Amicon Ultra-0.5장치 (YM100)를사용하여제조사의지시에 따라 PBS (pH 7,4)로 5변에걸쳐한의여과에의해제거되었디-,
[119] Si0 2 (mRFP)/K;pt6:6(Dox)로부터의 mRFP및 Dox의방출프로파일은 8일동안 매일 14,000 x g에서원심분리하여수득하였디-。침전물을 I mL의 PBS에재 분산시켰디 상청액중의 mRFP또는 Dox의양은형광마이크로플레이트리더 (Infinite F200 NanoQuant; TECAN)를사용하여각각 A590 / Xem 635 nm및 Aex 485 / X535 nm에서모니터링되었다.완충액중의 mRFP및 Dox의농도는각분자에 대한표준곡선에따라결정되었다、가시광선으 로상등액으로방출된 Dox양을 즉정할때는 UV / visible microplate reader (Infinite M200 NanoQuant; TECAN)-· 사용하여 550 nm에서모니터링하였다.샘플로부터방출된 Dox농도는상응하는 완충용액에서의 Dox표준곡선과비교하여형광마이크로플레이트 판독기 分 485 / X를사용하여결정되었다.각시점에검출된 Dox양은시간에따른 누적양으로계산하였디-,
[120]
[121] [실험결과]
[122] 실시예 1.실리카형성핍타이드의특성확인
[123] 丄丄.
[124] 상기표 1에 3종 SFP (R5, Kps, Kpt)각각을실리카전구체 (TMOS)와혼합한 용액의 p H를달리하여각펩타이드의실리카형성능 확인한결과, 3종 펩타이드모두 pH 7및 8에서높은실리카침전을나타냈다 . R5펩타이드는 Kps 및 Kpt와비교하여 pH 7.0에서가장높은활성을나타냈디-,그러나, pH 6.0에서 거의실리카를침전시키지못하였고, pH 5.0에서완전히활성이없었다. Kpt 펩타이드는 pH 5, 6및 8에서 R5및 Kps보:다더큰실리카형성능력을
나타냈디 _ (도 1), [125]
[126] 1 -2.니켈수지의 SFP흠착용량및히화력확? 1
[127] 히스티딘은히스티딘이미다졸고리상의 전자공여체그룹과수지에고정화된 전이금속(니켈또는코발트)사이의 배위결합을형성함으로써 매트릭스상에 고정된금속이온과강한상호작용을나타낸다. Kps, Kpt,및 6xHis펩타이드의 니켈수지에 대한결합능의 능력을조사하였다.
[128] Langmuir등온선을사용한 Ni-수지에대한펩타이드흡착파라미터 비교
결과를하기 표 4에 나타내었고,그등온선은도 2와같다,
[129] [표 4]
친화력이 보다더높은것으로나타났다. 6x018펩타이드- ¾값은 52.3하·로 펩타이드가 6x1:118와니켈수지에 대한유사한친화력을보여주었디·.
[131 ]
[132] 실시예 2.페리틴기반의실리카파티클형성 확인
[133] 페리틴의 아미노말단에도입된邪1?는페리틴구조표면에 노출된형태로
대장균에서발현되었디-,故5-1¾은황산암모늄 로침전시킨후소수성수지인 지를
[134] 닛이 모인 480 1<1)£1의 이상의 단백질을형성하는것을확인하였으나요5-1¾은 러한 페리틴구조를형성하지못한것으로나타났다( 도 3.4).즉 묘5서열이휴먼 페리틴의자가조립을방해하는것으로보인다, 1¾«와 ]¾)1:는 ]15에비해 이-미노산서열이짧으며,실리카를형성할수 고,또한정제도용이하게 때문에 ]¾5에 비해융합단백질제작에유용함을보였다. Kps-Fi!, 竹!의 이미지(도 36)또한융합단백질과페리틴구조가동일함을 타내어 펩타이드가페리틴구조형성에 영향을주지 않음을확인하였디-, [135]
[136] 실시예 3,페리틴기반의실리카파티클입자크기및분산 도조절
[137] 3-1.:[¾과、¾平-!¾의비읍에따른크기조점
[138] : 이 에비해실리카형성능력이높은것과형성된실리 카파티클 크기도큰것을확인하였다(도 4).이를 해실리카형성능력과실리카파티클 크기에비례관계가존재할것으로가정 고 抑가융합되지않은페리틴은 실리카형성능이없고,페리틴표면에 밀도를달리하여실리카형성능을 조절함으로써실리카피·티클의사이즈조절이 능할것으로가정하여,도 5의 모식도와같이 8[꾸밀도에따른실리카파티클사이즈조절전략 수립하였다.
[139] 구체적으로,
1:5(2:10)로각각변경함으로써크기가다른바 오실리카입자(100 - 500 미고)를얻을수있었다(표 5,도 6).
[14이 [표기
[141] * 이론적으로 ¾키메라케이지의표면에존재하는펩타이드의
[142】
[143] 3-2.바유계의금리세름농도에따른분산정도조
[144] 실리카입자들은서로뭉쳐있는형태이니- 첨가하여반응시뭉침현상을방지하고 분산된실리카입자를얻을수있었다 · (도 7).
[145]
[146] 실시예 4,페리틴기반의실리카파티클의표면분석
[147] 실리카파티클의다공성과표면적을측정한결과 는표 6에나타내었다.질소 흡착등온선분석은 ¾0 2 / 8-1¾및 ¾0 :2 / 8 2 : 10의표면적이각각 403.18및 492.09 임을보여주었다, ¾0 2 /하82:10의평균기공크기는 3.02 이며 , 이는 ¾0 2 /1<^-1½의평균기공크기(약 2.65미 11)보다컸다.더작은크기의 바이오실리카나노파티클은더큰표면적을가짐 을확인하였고이러한 특징으로인해생체분자들이결합시더큰부착표 면을제공할수있을것이다. &0 2 保:마-]¾및 ¾0 2 / 比10의표면적은각각 468 38및 537.68 으로 810 2
/ ]¾3 ¾ 에비해표면적이더큰것으로나타났디-, ¾() 2 /¾;마2 : 10 의평균기공크기는 2.90 고이며 , ¾0/1¾)내]!1의평균기공크기는약 2.74 11111보.다약가증가하였다.
결합력을나타낸것으로판단된디、비교를위해 시판하는비다공성 310 며«크기의실리카파티클에대한비교분석결과 면적은 2,30미 2 ,평균 기공크기는 69아표로나타났으며 ,비다공성입자이므로입자사이의 공극으로 판단된다.
[148] [표 6]
[149] 실시예 5.폐리틴기반의실리카파티클의 DNA흡착및용출확인
[: 150] Kps-Fn, Kpt-Fn및키메라 Fn을주형으로사용하여합성된실리카니-노
입자뿐만이·니라 Bangs Laboratories Inc (Indiana, USA)의직경 170nra (수성 현틱_액)및 310nm (건식실리카)의판매되고있는실리카입자를이 하여 고농도칼륨하에서 700 bp크기의 DNA에대한흡착력을비교하였다.그결과, 키메라템플릿상의 Kps또는 K:pi의표면밀도가낮으면더작은크기의바이오 실리카입자를만들수있으며크기가작을수록표 면적이증가함으로 DNA 흡착성능비교를통해표면적증가의 이점을확인하였다 (도 8) .본발명에서 개발된바이오실리카입자는시판되는실리카입 자보다우수한 DNA흡착 성능을보였다.
[151 i
[152] 실시예 6.약물이딤·지된페리틴기반의실리카파티클 약물방출
[153] pH 5.5에서는 Dox방출량이증가하였고실리카코팅에의한차이 는없었다-. 이는페리틴내부에담지된약물의방출이산에의 해촉진되며실리카코팅은 pH에의한약물방출을방해하지않음을의미한다.
[154] pH 7.4에서는 Dox방출량이감소하였고,또한실리카코팅에의 빙-출속도가 보다감소됨을확인하였디、이는확산에의해서 만약물방출이조절되기때문에 실리카코팅에의해확산속도가느려지는것으로 판단된다.그러나시간이 지나면서약물방출속도가서서히증가하는데, 이는실리카가분해되어실리카 코팅에의한약물방출저해가감소되기때문인것 임을알수있다 (도 9),
[155]
[156i 실시예 7,이중약물전달시스템기반의실리카파티클의 물방출
[157] Si0 2 /Kps6:6(Dox)제조와동일한방법으로제조된 Kpt6:6(Dox)의표면에 mRFP 분자의 in situ고정에의해이중약물전달시스템을시연하 다.카고분자 모델로서모노머 RFP (mRFP)를사용하고 Kpt6:6(Dox)에의해형성된실리카와 함께침전시켰디-. 2020/165883 ?€1/162020/051518
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실리카파티클은,위의두가지결과에기초하여 ,두종류의분지 _가다른구획에 적제되고다른속도로방출될수있는이중약물전 달체로사용될수있다.
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[16이 이상으로본발명내용의특정한부분을상세히기 술하였는바,당업계의 통상의지식을가진자에게있어서,이러한구체 적기술은단지바람직한실시 양태일뿐이며,이에의해본발명의범위가제한 되는것이아닌점은명백할 것이디、따라서본발명의실질적인범위는첨부 된청구항들과그것들의 등가물에의하여정의된다고할것이다.