1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una enzima con actividad poligalacturonasa altamente eficiente a temperaturas en un rango entre 5 ^Q C-15 ^Q C.

La presente invención también se refiere a una formulación líquida o como polvo liofilizado que comprende dicha enzima y excipientes apropiados, y que tiene utilidad en procesos de fermentación relacionados con la agroindustria, específicamente en procesos de fermentación de la industria del vino, industrias productoras de jugos de frutas, industria cervecera y otras industrias que en sus procesos necesitan degradar pectina. La presente invención es especialmente útil en procesos de clarificación de mosto de uva o jugo de frutas.

La presente invención además se refiere a la secuencia nucleotídica sintética que codifica dicha enzima y al método de obtención de la misma mediante cepas transformantes de la levadura Pichia pastoris. Así como también, la presente invención se refiere al vector de expresión recombinante ppinka-HC (Invitrogen) que permite la transformación apropiada de la levadura Pichia pastoris.

2. Antecedentes

La pectina es un componente importante de la pared celular de las plantas, en general, otorgándoles principalmente, la propiedad de textura a frutas y verduras.

Las pectinasas son las enzimas que degradan la pectina, eliminando de ésta, al menos un residuo de azúcar o un grupo éster. Así, las pectinasas catalizan la eliminación de algún grupo funcional de la pectina, hidrolizan tipos específicos de enlace, entre otras funciones.

La pectinasa poligalacturonasa es importante para la industria de alimentos, siendo especialmente útil, en la producción de jugos de frutas o en la elaboración del vino, donde su utiliza por su capacidad para degradar pectina. En general, las pectinasas se utilizan en la industria de la fruta para ayudar a extraer, aclarar y modificar jugos de frutas.

En este sentido, es importante notar que en los procesos de extracción del jugo de las frutas, las pectinas se aglomeran formando coloides que es necesario clarificar. La clarificación es dependiente del tipo de fruta, y la floculación del material suspendido y su separación por filtración, sólo se logra, después de usar una enzima pectinasa adecuada. Sin embargo, dicha enzima se debe en general, inactivar por tratamiento térmico para evitar una degradación excesiva, y con ello, evitar cambios no deseados en el sabor, color y consistencia del producto final.

Las enzimas que degradan pectina (pectinasas) son secretadas por ejemplo, por hongos y levaduras, deduciéndose sus correspondientes secuencias de aminoácidos así como también las secuencias nucleotidos que las codifican. Es posible nombrar entre los hongos que secretan dicha enzima, a Aspergillus niger, entre varios otros. También, se han transformado una serie de microorganismos, incluyendo bacterias y levaduras, para que secreten pectinasas con diferentes propiedades, entre ellos se pueden mencionar a Saccharomyces cerevisiae.

Aunque, todavía hay una necesidad de pectinasas diferentes a la ya conocidas con propiedades apropiadas para ser usadas en la producción de jugos de frutas o en la elaboración del vino, donde la enzimas comerciales disponibles son efectivas a temperaturas entre 40-60 ^Q C, pero muestran un rendimiento muy disminuido, en un rango de temperatura tan bajo como 5 ^Q C-15 ^Q C.

El uso de pectinasas que muestren actividad a un rango de temperatura bajo tal como entre 5 ^Q C-15 ^Q C, mejoraría el rendimiento disminuyendo los tiempos de producción y con ello, se reducen costos pues se agrega menos enzima, y se podrían obtener de esta forma, jugos de frutas de buena calidad para consumo humano, en un tiempo menor.

Es entonces, un objeto de la presente invención proporcionar tal enzima pectinasa poligalacturonasa (recombinante) aislada que es capaz de degradar la pectina a una temperatura en el rango de 5-15 ^Q C, siendo muy útil en la producción de jugos de frutas o elaboración del vino, y que permite clarificar, por ejemplo, el mosto de la uva a temperaturas tan bajas como por ejemplo, 8 ^Q C (vinos blancos) o 12 ^Q C (vinos tintos).

De esta forma, la enzima poligalacturonasa de acuerdo con la invención muestra actividad a temperaturas más bajas que aquellas comercialmente disponibles en la actualidad o si se compara con aquellas del arte previo. En el arte previo, hubo esfuerzos por obtener poligalacturonasas. De acuerdo con ello, varios métodos han sido desarrollados para modificar microorganismos que incluyen levaduras tales como Pichia pastoris (solicitud de patente ES200202566) o Saccharomyces cerevisiae (solicitud de patente ES200201596). Pero a partir de tales esfuerzos se han logrado endopoligalacturonasas que producen en grandes cantidades, y nada se indica o se refiere a abordar el problema de obtener poligalacturonasas que muestran actividad a temperaturas tan bajas como 5 ^Q C y 12 ^Q C.

Por otra parte, la publicación Biosc. Biotechnol. Biochem., 69 (2), 419-421 , 2005 de Nakagawa T. et al, enseña que a partir de una levadura basidiomicete psicrófila (esto es, que crece a una temperatura óptima bajo 20 ^Q C, y como máximo, a una temperatura máxima de crecimiento de 22 ^Q C) identificada como la cepa PPY-1 de Cystofilobasidium capitatum, es posible obtener una poligalacturonasa activa incluso a temperaturas tan bajas como 0 ^Q C.

En tanto, la publicación Letters in applied Microbiology 2004, 38, 383-387 de Nakagawa T. et al enseña que las cepas PPY-3, PPY-4, PPY-5 y PPY-6 Cystofilobasidium capitatum producen enzimas pectinasas que muestran actividad, por ejemplo, a 5 ^Q C.

De igual forma, la publicación Letters in applied Microbiology ISSN 0266-8254 de Sahay S et al, enseña cepa SPY1 1 de Cystofilobsidium capitatum y la cepa PT1 de Rhodotorula mucilaginosa, las que secretan enzimas poligalacturonasas que son activas a temperaturas entre 5 ^Q C y 12 ^Q C y que tienen 50-80% de actividad a pH 3,5 (condiciones enológicas), lo que las hace una alternativa adecuada para ser usadas en la producción de vino y clarificación de jugo de frutas.

La presente invención divulga una enzima con actividad poligalacturonasa diferente de aquella revelada en Letters in applied Microbiology ISSN 0266- 8254 de Sahay S et al., la que es altamente eficiente en un rango de temperatura entre 5 ^Q C-15 ^Q C.

3. Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a una enzima con actividad poligalacturonasa, altamente eficiente a temperaturas en un rango entre 5 ^Q C-15 ^Q C, y en consecuencia, útil en procesos de fermentación de la industria del vino, específicamente, en la clarificación del mosto de uva, un proceso que por ejemplo, se puede realizar a bajas temperaturas, 8°C - elaboración de vinos blancos, o a 12°C - elaboración de vinos tintos, y que además requiere el control de la actividad enzimática mediante tratamientos térmicos moderados que inactivan la enzima.

Así, la presente invención se refiere a una formulación líquida o como polvo liofilizado que comprende dicha enzima y excipientes apropiados, y que tiene utilidad en degradar pectina a una temperatura entre 5 ^Q C y 15 ^Q C. De igual forma, la presente invención se refiere a una secuencia nucleotidica sintética que codifica dicha enzima poligalacturonasa o una secuencia de amino ácido que tiene al menos alrededor de 55% de identidad de secuencia y, más preferiblemente, al menos 90% de homología o identidad y que, aún más preferentemente, tiene al menos 955 de homología y que mantienen la capacidad de ser altamente eficiente a bajas temperaturas, en particular en un rango de temperatura entre 5 ^Q C y 15 ^Q C. Dicha secuencia nucleotidica también comprende una variante de ácido nucleico que codifica dicha enzima que difiere de la presente enzima en no más de alrededor de 55 sustituciones de amino ácidos y que, más preferentemente, tiene no más de 18 sustituciones de amino ácidos, y que mantiene la misma actividad poligalacturonasa a temperaturas entre 5 ^Q C y 15 ^Q C.

La presente invención también se refiere al método de obtención de la presente enzima mediante una cepa transformante de la levadura Pichia pastoris. Conforme a ello, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante ppinka-HC (Invitrogen) que permite la transformación apropiada de la levadura Pichia pastoris.

En particular, la presente invención se refiere en un aspecto principal a una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleotido que tiene una secuencia de ADN que codifica para un polipeptido que tiene actividad poligalacturonasa caracterizada en que la secuencia de ADN es seleccionada de: a) secuencias de ADN que comprenden una secuencia nucleotida de SEQ ID NO.:3; b) secuencias de ADN que comprenden una secuencia nucleotida de SEQ ID NO:5; c) secuencias de ADN que comprenden una secuencia nucleotida de SEQ ID NO:6; d) secuencias de ADN que codifican la secuencia de amino ácidos SEQ ID NO:1 ; e) secuencias de ADN que codifican la secuencia de amino ácidos SEQ ID NO:2; f) secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones estrictas con una de las secuencias de acuerdo a a), b), c), d) o e); g) secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con una de las secuencias de ADN de acuerdo con a), b), c), d9) o e); h) variante alélica o especie homologa de una de las secuencias de ADN de acuerdo con a), b), c), d), e) f) o g) que difiere de una de estas secuencia en no más de alrededor de 1 a alrededor de 165 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones de ácido nucleico, preferentemente en no más de alrededor de 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 1 0, 1 a 1 1 , 1 a 1 2, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19 o 1 a 20 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones de acido nucleico; j9 un fragmento de cualquiera de las secuencia de acuerdo a a9 a i) que codifica un polipeptido que tiene actividad poligalacturonasa; o k) una hebra complementaria de cualquiera de las secuencias de acuerdo a a) a j).

También están en vista un polipeptido que tiene actividad poligalacturonasa, caracterizado en que el polipeptido es seleccionado de: a) un polipeptido que es codificado por la parte codificante de cualquier secuencia de ADN como se describió antes; b) un polipeptido que comprende una secuencia de acuerdo de acuerdo a SEQ ID No:1 o SEQ ID NO:2, o c) un polipeptido que es derivado de la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO:1 ó 2, obtenible por sustitución, adición o deleción de uno o más amino ácidos de dicha SEQ ID NO:1 o 2. En una realización preferida, el polipeptido es derivado de la secuencia de acuerdo a SEQ ID NO:1 o 2 por sustitución de no más que alrededor de 55 amino ácidos en dichas SEQ ID NO:1 o 2. En una realización aún más preferida, el polipeptido es derivado de la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO:1 o 2 por una sustitución de no más de 18 amino ácidos en dicha SEQ ID NO:1 o 2.

En un realización particularmente, preferida de la presente invención dicho polipeptido es una enzima con actividad poligalacturonasa, donde dicha actividad poligalacturonasa es una alta actividad poligalacturonasa en un rango de temperatura de alrededor de 5 ^Q C a alrededor de 15 ^Q C, es decir, la actividad poligalacturonasa de la enzima está presente y es altamente pronunicada en un rango de temperatura baja de 5 a 1 5 ^Q C. En una realización preferida adicional, dicho polipeptido o dicho ácido nucleico puede ser aislado de la especie Articulospora proliferata.

También en vista está un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico según fue definida aquí antes.

En una realización preferida de la presente invención, dicho vector de expresión recombinante comprende la secuencia nucleotida de SEQ ID NO:4 ,

5 o 6.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula hospedera recombinante caracterizada en que ha sido transformada con el vector de expresión recombinante según de definió aquí antes.

En una realización preferida, dicha célula hospedadora recombinante es derivada de una célula de E. coli, de un hongo de la familia Aspergillus, Tricoderma o Neurospora, o de una levadura de la familia Kluveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula o Pichia. En una realización particularmente preferida, dicha célula hospedadora es una célula Pichia pastorís.

La presente invención se refiere en una aspecto adicional a un método para la producción de un polipeptido de acuerdo con la invención según se define aquí antes, o que es codificada por la secuencia de ADN de acuerdo con la invención como se definió aquí antes, caracterizada en que comprende: (i) cultivar la célula hospedadora recombinante según se mencionó antes bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipeptido, y (ii) recuperar dicho polipeptido.

La presente invención además tiene en vista en un aspecto diferente una composición caracterizada en que comprende el polipeptido de la invención según se definió aquí antes u obtenida por el método de la presente invención según se mencionó aquí antes. En una realización específica de la presente invención, dicha composición comprende de, esencialmente consiste de o consiste de una formulación líquida o un polvo liofilizado.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona al uso de un polipeptido de la invención según se definió aquí antes o de un polipeptido de la invención obtenido por un método según se mencionó aquí antes o de una composición según se definió aquí para la degradación de pectina en un proceso de producción de bebidas en que la degradación de la pectina es deseable. En una realización particularmente preferida, dicho proceso es en la producción de vino, cerveza o jugo de fruta.

En otra realización preferida dicho proceso de producción de bebida en que la degradación es pectina es deseable que ocurra a na baja temperatura, por ejemplo, a una temperatura bajo 25 ^Q C, más preferentemente a una temperatura entre 5 ^Q C y 20 ^Q C, más preferentemente a una temperatura entre 5 ^Q C y 15 ^Q C. En aún otra realización preferida, dicho proceso de producción de bebidas en la cual la degradación de pectina es deseable es la clarificación de mosto de uva o jugo de fruta.

4. Breve descripción de Figuras

Figura 1 : Muestra el fraccionamiento de sobrenadantes de cultivos inducidos (YM-1 % pectina (producto Sigma-Aldrich P9135, pectina comercial, Pectin from citrus peel, Número CAS 9000-69-5, Número EC 232-553-0, numero MDL MFCD00081838) con sulfato de amonio, visualizados mediante SDS-PAGE y tinción con plata. Carril 1 : fracción 60%, Carril 2: fracción 80%, M: Marcador de peso molecular (Thermo Scientific). La figura 1 muestra claramente un enriquecimiento de ciertas proteínas en las fracciones de 60% de sulfato de amonio en relación a la fracción 80%. El fraccionamiento se realiza en un cultivo de Articulospora proliferava. Figura 2: Muestra una cromatografía de intercambio iónico. Las proteínas extracelulares totales enriquecidas con 60% de sulfato de amonio fueron cargadas en una columna DEAE sephadex equilibrada en amortiguador Tris- HCI 20mM, pH 8.0. Las proteínas fueron eluidas utilizando un gradiente de NaCI desde 0-1 M, y posteriormente, se cargaron en un gel SDS-PAGE y se tiñeron con plata. Los números 1 -41 indican las fracciones obtenidas y M, corresponde al marcador de peso molecular utilizado. Los ensayos de actividad enzimática indicaron que las muestras enriquecidas con la enzima pectinasa, fueron las fracciones 10-20. La flecha indica un tamaño de aproximadamente 40kDa.

Figura 3: Muestran un gel de electroforesis y cuantificación de RNA purificado, y sometido posteriormente, a RNA-seq. Los carriles A-D muestran diferentes extracciones de RNA que presentaron diferentes rendimientos. En el carril A se observa mayor cantidad de RNA pero más degradado, en cambio el carril D muestra buen rendimiento de extracción pero con mucha menor degradación. Las extracciones de RNA fueron realizadas mediante el kit Ribopure Yeast RNA purification kit (Ambion).

Figura 4: Muestra una representación gráfica de la enzima poligalacturonasa, donde se observan los dominios proteicos de la enzima pectinasa. También, se muestran los motivos estructurales que fueron identificados mediante el programa InterproScan (Disponible en el programa Geneious), siendo el más importante el que abarca los residuos aminoacídicos 223-236, los cuales definen el sitio catalítico de enzimas poligalacturonasas.

Figura 5: Muestra una representación gráfica del gen que codifica para la enzima pectinasa. Muestra la estructura de intrones y exones del gen que codifica para la enzima pectinasa, y una esquematización de la estructura del gen que codifica para la enzima poligalacturonasa. Los exones (celeste) son regiones que codifican para la enzima, mientras que los intrones (negro) son regiones eliminadas durante el proceso de "splicing" del mRNA. La secuencia completa del mRNA de la enzima tiene un largo de 1325 pares de bases (pb) y estaría compuesta por 5 exones.

Figura 6: Muestra pectinasas recombinantes obtenidas desde clones transformantes de la levadura Pichica pastoris. En esta figura, se muestra un gel de proteínas en donde se separaron las pectinasas recombinantes obtenidas desde los 4 clones transformantes obtenidos (carriles 1 -4). En el carril 5 se cargó una muestra de proteína que se obtuvo sin inducción con metanol (control negativo). En el carril 6 se cargó otra proteína, como control positivo. El carril M corresponde a un marcador de proteínas de peso conocido, con el objetivo de estimar el tamaño de la enzima pectinasa. El clon N ^Q 1 fue el que expresó mayores cantidades de la proteína recombinante (40kDa).

Figura 7: Muestra una enzima pectinasa purificada. Desde el gel de proteínas, se separó la enzima pectinasa (poligalacturonasa) recombinante del presente invento obtenida tras los dos pasos de purificación. Se observan dos bandas de proteínas (carril N ^Q 2), las cuales se diferencian solo en que la banda superior, se encuentra glicosilada.

Figuras 8A y 8B: Muestra la evaluación de la actividad poligalacturonasa de la enzima purificada en condiciones de laboratorio y semi-industriales. La Figura 8A muestra un ensayo de DNS utilizando una pectina comercial (Pectin from citrus peel, Sigma Aldrich). Se incubó tanto la poligalacturonasa antártica como la enzima comercial (Lafazym®, Laffort) con una solución de dicha pectina comercial (1 Omg/ml) a pH 3.0 por una hora a 37 ^Q C. Posteriormente, 100μ! de la reacción enzimática fue ensayada para actividad enzimática, mediante e! método del DNS. La Figura 8B muestra un ensayo de DNS, utilizando mosto de vino blanco como sustrato. Las muestras se trataron idénticamente que en el caso de los datos de la Figura 8A pero se evaluó la actividad de la enzima a 15 ^Q C y sobre mosto de vino blanco. La concentración de ácido galacturónico liberado se cuantificó mediante una curva de calibración realizada previamente. Figura 9: Muestra la curva de calibración realizada con diferentes concentraciones conocidas de ácido galacturónico (2, 1 .5, 1 , 0,5, 0,25 y 0,125mg/ml) ensayadas mediante el método del DNS. Se incubó 1 00μ! de cada solución de diferentes concentraciones de ácido galacturónico con 10ΟμΙ de! reactivo DNS y se realizó e! ensayo como se ha descrito anteriormente.

Figura 10A y 10B, Muestra el control de calidad realizado a las muestras de RNA que se enviaron a secuenciar (la muestra inducida y la muestra control). La figura 1 0A muestra la concentración del RNA, la razón del rRNA en relación a los mensajeros y el RIN que es una medida de cuan integro está este ácido nucleico (RIN>7 está bien para los análisis), para la muestra inducida y control (10A y 10B, respectivamente).

Figura 11 : Muestra los clones sembrados en placas PDA (medio selectivo). Las colonias blancas corresponden a colonias transformantes de la levadura Pichia pasíorís, en donde las blancas corresponden a las colonias que adquirieron el inserto recombinante.

Figura 12: Alineamiento de los péptidos obtenidos mediante espectrometría de masas (VIFSGTTTFGYK y SGAVVQNQDDC) con respecto a la secuencia aminoacídica completa de la enzima poligalacturonasa de la invención. Se observa un 1 00% de identidad y cobertura con respecto a esta secuencia.

Figura 13: Muestra un electroforesis en geles de agarosa en donde se separaron los fragmentos de DNA obtenidos tras la digestión del vector de expresión ppinka-HC, con las enzimas de restricción Mlyl y Kpnl (thermoscientific). En esta figura se visualiza el vector linearizado (fragmento más grande) y el fragmento pect, en el carril 1 . El carril M corresponde a un estándar de DNA de peso conocido, con el objetivo de estimar el tamaño de los fragmentos. Figuras 14A y 14B: Muestra un ensayo de actividad pectinasa realizado en placas Y suplementadas con pectina 1 % y revelado con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (1 %). La figura 14a evidencia un halo de hidrólisis positivo mientras que la figura 14b muestra una levadura que no presentó actividad pectinasa positiva (ausencia de halo).

Figura 15: Muestra la evaluación de la actividad poligalacturonasa de la enzima purificada a 5 ^Q C. La Figura 15 es una representación gráfica de los datos mostrados en la tabla 4,

Figura 16: Muestra los ensayos de actividad poligalacturonasa en jugo de pulpa de ciruela a 5 ^Q C de la enzima purificada.

5. Descripción detallada del invento

Conforme a lo mencionado anteriormente, la presente invención se refiere en un aspecto principal a una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleotido que tiene una secuencia de ADN que codifica para un polipeptido que tiene actividad poligalacturonasa y dicha enzima poligalacturonasa en sí misma, como también los usos adecuados del mismo, composiciones que comprenderlo etc. Los inventores han, en particular, encontrado que la enzima reivindicada en la presente es altamente activa a temperaturas bajas, por ejemplo, en un rango de alrededor de 5 ^Q C a 15 ^Q C.

Aunque la presente invención será descrita con respecto a realizaciones particulares, esta descripción no es construida en un sentido limitante.

Antes de describir las realizaciones ejemplares en detalle de la presente invención, se dan las definiciones importantes para la comprensión de la invención.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones que se acompañan, las formas singulares de "un" también incluyen los plurales respectivos a menos que el contexto dicte otra cosa. En el contexto de la presente invención, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" indican un intervalo cuidadoso que una persona versada en el arte entenderá que asegura el efecto técnico de la característica en cuestión. El término típicamente indica una desviación del valor numérico indicado de ± 20%, preferentemente ± 15%,, más preferentemente ± 10%,y aún más preferentemente ± 5%. En ciertos aspectos el término "alrededor de" puede también referirse a un valor, que es mayor o menor en varios enteros, preferentemente en , 4, 3, 2 ó 1 en comparación al valor de partida.

Se debe entender que el término "comprendiendo" no es limitante. Para los propósitos de la presente invención, el término "consiste de" es considerado una realización referida del término "comprendiendo de". Si de aquí en adelante un grupo es definido para comprender al menos un cierto número de realizaciones, este significa que también abarca un grupo que preferentemente consiste de estas realizaciones solamente.

Si el término "comprendiendo" se usa en el contexto de secuencias, en particular secuencias nucleotidas, el termino puede no solo referir a la secuencia mencionada en la secuencia listada sino también la secuencia complementaria de la misma, a menos que el contexto indique otra cosa.

Además, los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" o "(i)", "(ü)", "(iii)", "(iv)", "(v)", "(vi)", (vii)", etc. y lo similar en la descripción y en las reivindicaciones son usadas para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir una secuencia u orden cronológico. Se debe entender que los términos son usados en forma intercambiable bajo circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descrita aquí son capaces de la operación en secuencias distintas a las descritas o ilustradas aquí.

En caso de los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" o "(i)", "(ü)", "(iii)", "(iv)", "(v)", "(vi)", (vii)", etc. se refiere a etapas de un método o uso no hay coherencia de tiempo o intervalos de tiempo entre etapas, es decir, las etapas pueden ser conducidas simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incuso años entre tales etapas, a menos que se indique otro significado al descrito o ilustrado antes o después.

Se debe entender que esta invención no está limitada a una metodología, protocolo, proteína, bacteria, vector, reactivo, etc. particular descrita aquí y esta puede variar. Se debe entender que la terminología usada aquí es para el propósito describir las realizaciones particulares solamente, y no se intenta limitar el alcance del presente invento que será limitado solo por las reivindicaciones anexas. A menos que se indique otra cosa, los términos usados aquí son aquellos descritos en "A multilingual glossary de biotechnological terms (IUAPC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kólbi, H. eds (199), Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza. El término "polinucleotido" como se usa aquí se refiere a una molécula teniendo, comprendiendo o consistiendo de una secuencia de ácido nucleico. Un polinucleotido de acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir de una secuencia entera que codifica o una porción de una secuencia que codifica y/o puede comprender una región sin traducir, por ejemplo un 5' UTR y/o un 3' UTR. Un polinucleotido de acuerdo con la presente invención puede también comprender o consistir de porciones de un gen de flanqueo, es decir, 5' o 3' para la secuencia genómica, preferentemente de secuencias correspondientes a SEQ ID NO:3, 5 o 6. La presente invención mira el polinucleotido a ser una secuencia de ADN o una secuencia de ARN, o cualquier derivado de los mismos.

SEQ ID NO:3 indica un cDNA que codifica la enzima recombinante con actividad poligalacturonasa de acuerdo con SEQ ID NO:1 . SEQ ID NO:5 indica un cDNA que codifica la enzima recombinante con actividad poligalacturonasa de acuerdo con SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:6 indica una secuencia nucleotida optimizada en base al uso del codon Pichia pastoris, es decir, una secuencia nucleotida recombinante optimizada para el uso de Pichia pastoris.

El término "polipeptido" como se usa aquí se refiere a una molécula que tiene, comprende o consiste de la secuencia de amino acido generada de un polinucleotido o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como de definió a lo largo de la memoria descriptiva. Preferentemente, el término se refiere a una molécula que tiene, comprende o consiste de la secuencia SEQ ID NO:1 o 2, un fragmento del mismo, un dominio del mismo, un epitope contenido en él, una variante del mismo, una variante alélica del mismo, una especie homologa del mismo así como también una secuencia homologa del mismo cualquier combinación, fusión, etc. del mismo como se define aquí.

SEQ ID NO:1 indica la secuencia de aminoácido completa déla presente poligalacturonasa según también se muestra en la Figura 4 que comprende 369 amino ácidos, Esta secuencia comprende también una secuencia señal en el terminal N. E polipeptido ha sido obtenido de Articulospora proliferata.

SEQ IDNO:2 indica la enzima recombinante con actividad poligalacturonasa de acuerdo con la presente invención sin el péptido señal. Este corresponde a SEQ ID NO:1 sin el péptido señal como deriva de la Figura 4 y el listado de secuencias.

Un "fragmento de polinucleotido" como se usa aquí se refiere a una polinucleotido corto que tiene, comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs:3, 5 o 6 o la hebra complementaria de la misma. Un fragmento nucleotidico de acuerdo a la presente invención puede ser al menos alrededor de 500 nt, preferentemente alrededor de 700 nt, más preferentemente 800 nt, aún más preferentemente 900 nt en longitud. Un fragmento puede, en ciertas realizaciones, también tener longitudes menores tales como alrededor de 10 nt, 20 nt, 30 nt, 40 nt, etc. Ejemplos representativos de fragmentos de polinucleotidos de la invención incluyen, por ejemplo fragmentos que comprenden o alternativamente consistente de una secuencia de alrededor de 1 -500, 50-550, 100-600, 150-650, etc número de nucleotidos al término de SEQ ID NOs: 3, 5 o 6 o para la hebra complementaria de las mismas. Alternativamente, los fragmentos de polinucleotido de la presente invención pueden incluir por ejemplo fragmentos que comprenden o alternativamente consistente de una secuencia de alrededor de 1 -500, 501 - 1000 etc numero de nucleotidos al término de SEQ ID NO:3, 5 o 6 o la hebra complementaria para las mismas.

Un "fragmento de polipeptido" como se usa aquí se refiere a una secuencia de amino ácidos que es una porción de la secuencia contenida en la secuencia de amino ácido SEQ ID NOs:1 o 2. Fragmentos de polipeptido (o proteína alternativa) puede ser ya sea "freestanding" o estar comprendido dentro de un polipeptido mayor por ejemplo en la forma de una proteína de fusión. Ejemplos representativos de fragmentos de polipeptidos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden a alternativamente consisten de, desde alrededor de 1 -5, 6-10, 1 1 etc. números de amino ácidos al término de SEQ ID NOs: 1 o 2. Alternativamente, los fragmentos de polipeptido de la invención pueden incluir, por ejemplo, fragmentos que comprenden o alternativamente consisten de una secuencia de alrededor de 1 -150, 151 -300, 301 números de amino ácidos al término de SEQ ID NO: 1 o 2. Además, los fragmentos de polipeptido pueden ser alrededor de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16 o 17 o alrededor de 100, 200, o 300, etc. amino ácidos en longitud.

Un fragmento de polipeptido de acuerdo con la presente invención puede comprender un dominio de polipeptido, es decir, un dominio funcional o estructural de un polipeptido, preferentemente cualquier estructura de proteína secundaria típica o tridimensional como una porción helicoidal una lámina beta, un puente beta, un retorno o curva de enlace. Los dominios del polipeptido de la invención, pueden ser derivados de Fig. 3. Ejemplos de tales dominios son un dominio glicol-hidro-2, pectin-liasa poligalacturonasa y no citoplasmático. Un ejemplo adicional es una región alrededor de los residuos de amino ácidos 223 a 236 de SEQ ID NO: 1 que define el sitio catalítico de las enzimas poligalacturonasas por ejemplo, una región que comprende aproximadamente los residuos de amino ácido 200 a 250, por ejemplo. 210 a 240, o 215 a 240, o cualquier porción de SEQ ID NO: 1 que comprende dicha región. Un fragmento como se definió antes puede estar en conformidad comprendido de uno o más de tales dominios. Se prefiere que uno o más de dichos dominios realice las actividad poligalacturonasa de la enzima de la invención.

Un polipeptido o fragmento de polipeptido de acuerdo con la presente invención puede además comprender un polipeptido epitope, es decir, una porción de un polipeptido que tiene actividad antigénica y/o inmunogenica en un organismo hospedero apropiado, por ejemplo, un animal. El término "epitope inmunogenico" como se usa aqu{l indica una porción de proteína que eluye una respuesta de anticuerpo en un organismo hospedero apropiado, por ejemplo, un animal, como se determina por cualquiera de los métodos conocidos en el arte, por ejemplo, por los métodos para generar anticuerpos conocidos para una persona versada en la materia. En consecuencia los anticuerpos obtenidos por ejemplo un anticuerpo que se une a un epitope del polipeptido de la invención y puede ser usado para identificar la enzima o su uso en procesos industriales o semi-industriales.

El término "variante" de la presente invencióncomo se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un o polinucleotido o polipeptido que difiere del polinucleotido o polipeptido de la presente invención, por ejemplo, el polinucleotido SEQID NOs: 2, 5 o 6, o el polipeptido de SEQ ID NOs: 1 o 2, pero retiene las propiedades esenciales o donde el polipeptido codificado retiene propiedades esenciales, en una realización particularmente preferida las propiedades de la poligalacturonasa.

El término "propiedad de de poligalacturonasa" o "actividad de galacturonasa" como se usa aquí se refiere a la actividad enzimática de hidrolizar los enlaces alfa-1 ,4. Esta actividad se refiere en particular a la degradación de pectina o la red de pectina, es decir una actividad pectinasa. Dicha actividad poligalacturonasa puede ser probada con cualquier prueba o ensayo conocido para la persona versada en la materia o derivable de fuentes de literatura adecuada. Preferentemente, la actividad es probada con un ensayo es DNS como se describe aquí, en particular en los Ejemplos. De acuerdo a realizaciones preferidas de la presente invención, dicha actividad de galacturonasa se da en un amplio rango de es temperaturas incluyendo temperaturas bajas que parten alrededor de 5°C. Conforme a ello, una poligalacturonasa de acuerdo con la presente invención es capaz de hidrolizar los enlaces 1 ,4-glicosidicos entre residuos de ácido galacturonico a baja temperatura de alrededor de 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 1 1 °C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C o más, preferentemente en un rango de 5°C a 15°C, o 5°C a 10°C. En una realización específica una actividad enzimática alta es mostrada por la presente enzima poligalacturonasa a una temperatura entre 5°C y 15°C si se compara a otras enzimas poligalacturonasas.

Además, una poligalacturonasa de acuerdo con la presente invención es capaz de hidrolizar los enlaces alfa-1 ,4-glicosidicos entre residuos de ácido galacturonico a un pH bajo de alrededor de 2 a alrededor de 5, por ejemplo, a un pH de 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 o 5. En una realización específica el pH óptimo de la poligalacturonasa de la presente invención en que la actividad mayor puede ser detectada entre pH 2.5 y 4.

En ciertas realizaciones una variante de acuerdo con la invención se refiere a un polinucleotido o polipeptido que difiere del polinucleotido o polipeptido de la presente invención y retiene propiedades esenciales del mismo o donde el polipeptido codificado retiene propiedades esenciales tales como poligalacturonasa es activa a baja temperaturas de alrededor de 5 a 25°C, tal como 5°C a 20°C, 5°C a 15° o 5°C a 10°C, preferentemente a baja temperaturas de alrededor de 5 a 15°C. En realizaciones adicionales, las propiedades esenciales incluyen adicionalmente una actividad a un pH de 2.5 y 4, más preferentemente a un pH de 3.5. El término "activo" en este contexto se refiere a una actividad moderada a alta, por ejemplo. Una actividad enzimática a/o cerca a una temperatura y/o pH óptimo.

En general, las variantes son sobretodo cercanamente similares, y, en muchas regiones, idénticas al polinucleotido o polipeptido de la presente invención. Variantes de acuerdo con la presente invención pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Especialmente preferidas son las variants polinucleotidas que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silentes pero no alteran las propiedades o actividades del polipeptido codificado variantes de polinucleotido. Preferidos además son las variantes de secuencia nucleotida, que son producidas por sustituciones silentes debido a la degeneración de código genético. Variantes de polinucleotido pueden ser producidos por una variedad de razones, típicamente para optimizar la expresión de codon para un hospedero particular, es decir, para cambiar codones en el mRNA a aquellos preferidos por una célula hospedera de bacteria, planta u hongo, preferentemente por un hospedero hongo tal como Pichia pastorís, u otro hongo adecuado o sistema de expresión que no incluye un hongo.

Además, variantes de polipeptido en que 5-10, 1 -5 o 1 - amino ácidos son sustituidos, eliminados o agregados en cualquier combinación son preferidos. En particular, al usar métodos de ingeniería de proteína y tecnología de ADN recombinante conocida para la persona versada en la materia, variantes pueden ser generadas para mejorar o alterar las características de los polipeptidos de la presente invención. Por ejemplo, uno más amino ácidos pueden ser eliminados del terminal N o C sin perdida sustancial de la función biológica, en particular la actividad poligalacturonasa como se definió aquí antes.

Además, aún si se eliminar los amino ácidos de los terminales N o C del polipeptido resulta en una modificación o perdida de una o más funciones biológicas, otras actividades biológicas pueden aún ser retenidas. Por ejemplo, la capacidad de una variante de deleción para inducir y/o unir anticuerpos que reconocen el polipeptido o peptido serán probablemente retenidas cuando menos la mayoría de los residuos de la forma secretada, son removidos de terminal N o C. Si un polipeptido particular le faltan residuos terminales N o C de una proteína retiene tales actividades inmunogénicas y pueden ser determinadas por métodos estándares conocidos para la persona versada en la materia.

En una realización adicional de la presente invención, variantes de polinucleotido o polipeptido pueden incluir deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y sustituciones selecciondas de acuerdo a reglas generales conocidas en el arte de modo de tener un efecto pequeño en la actividad de la proteína o polipeptido codificado. Por ejemplo, la guía relacionada a como hacer sustituciones de amino ácidos silentes fenotípicamente es proporcionada en Bowie et al., 1990, Science 247: 1306- 1310. Variantes pueden ser producidas vía mutagenesis sitio dirigida o mutagenesis de escaneo de alanina, es decir, la introducción de un mutaciones de alaninas únicas en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes que resultan pueden susecuentemente ser probadas para actividad biológica, por ejemplo, en base a un ensayo DNS como se describe aquí. Típicamente, los residuos de amino acido enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras pocas características de las cadenas laterales de superficie son en general conservadas. Además, las sustituciones de amino ácidos conservadora tolerada involucre el reemplazo de los amino ácidos alifáticos o hidrofobicos Ala, Val, Leu y lie; en reemplazo de los residuos Ser y Thr; el reemplazo de los residuos acidicos Asp y Glu; el reemplazo de los residuos de amida Asn y Gln, el reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg, y His; el reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, y el reemplazo de los amino ácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly.

Además de la sustitución de amino ácidos conservadora, las variantes de la presente invención pueden incluir sustituciones con uno o más residuos de amino ácidos no conservados, donde los residuos de amino ácido sustituidos pueden o no ser codificados por el código genético, o sustituciones con uno o más residuos de amino ácidos que tienen un grupo sustituyente, o una fusión del polipeptido maduro con otro compuesto tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipeptido (por ejemplo, polietilenglicol), o una fusión del polipeptido con amino ácidos adicionales, tales como, por ejemplo, un péptido de región de fusión IgG Fe, o secuencia líder o secretora, o una secuencia que facilita la purificación.

Particularmente preferidas son las secuencias polinucleotidas variantes que difieren de la secuencia SEQ NO: 3, 5 y 6, o cualquier derivado de la misma como se define aquí, por no más de alrededor de 1 a 165 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones deácido nucleico, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, alrededor de 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160 o alrededor de 165 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones de ácido nucleico. Además preferidas son las variantes de secuencias polinucleotidas que difieren de la secuencia SEQ NO: 3, 5 y 6 por no más de alrededor de 1 a 54 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones de ácido nucleico, más preferentemente por no más de 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 10, 1 a 1 1 , 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a18, 1 a 19 o 1 a 20 sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o mutaciones de ácido nucleico. El término "mutación de ácido nucleico" como se usa aquí se refiere a cualquier modificación al ácido nucleico distinta de una sustitución, deleción, inserción o adición.

En una realización adicional preferida la presente invención mira hacia variantes de secuencias de péptido o polipeptido que difieren de la secuencia SEQ ID NO: 1 o 2, o cualquier derivado como se define aquí ,por sustitución, adición o deleción de uno o más amino ácidos de dicha amino ácidos SEQ ID NO: 1 o 2. El término "más" significa que cualquier número de sustituciones, adiciones o deleciones para la secuencia de referencia sin comprometer, por ejemplo. Reducir o esencialmente cambiar, la actividad de poligalacturonasa en un entorno hospedero dado como se define aquí, preferentemente la propiedad de poligalacturonasa como siendo activa a bajas temperaturas de alrededor de 5 a 25°C, tal como 5°C a 20°C, 5°C a 15° o 5°C a 10°C que pueden ser probadas con cualquier prueba o ensayo adecuado conocido para la persona versada en la materia en particular un ensayo DNS como se describe aquí. Preferido además son las variantes que muestran una sustitución, deleción o adición de no más de alrededor de 55 amino ácidos een SEQ ID NO: 1 o 2, por ejemplo, una susitución, deleción o adición de alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 amino ácidos en SEQ ID NO: 1 o 2. Tales variantes, mientras comprende una secuencia de amino ácido son aún funcionales como poligalacturonasas como se definen aquí, preferentemente siendo activa, por ejemplo, altamente activa, a bajas temperaturas de alrededor de 5 a 25°C, tal como 5°C a 20°C, 5°C a 15° o 5°C a 10°C. En una realización preferida adicional, las variantes muestran una sustitución, deleción o adición de no más de alrededor de 18 amino ácidos en SEQ ID NO: 1 o 2.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a variantes de polipeptido que contienen sustituciones de amino ácidos, amino ácidos cargados con otro amino ácido cargado o neutro, lo que puede producir proteínas con características mejoradas, tal como menos agregación.

El término "variante alélica" como se usa aquí se refiere a variantes que ocurren naturalmente, es decir, a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Estas variantes alélicas pueden variar en ya sea el nivel de polinucleotido y/o polipeptido y están incluidas en la presente invención. En una realización específica de la presente invención, el término también incluye variantes que no ocurren naturalmente, puede por ejemplo ser producido por técnicas de mutagenesis o síntesis dirigida. En una realización específica adicional el término se refiere un alelo que ocurre naturalmente del polinucleotido SEQID NOs: 3, 5, o 6, o el polipeptido de SEQ ID NOs: 1 o 2 en la forma de un polimorfismo nucleótido pequeño, preferentemente en la forma de SNPs.

En un realización adicional de la presente invención también se mira hacia especies homologas de las secuencias de polinucleotido o polipeptido. El término "especies homologas " de la presente invención como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a secuencias de polipeptido o polinucleotido que muestran un alto grado de identidad al polinucleotido o polipeptido de la presente invención, por ejemplo, al polinucleotido SEQ ID NOs: 3,5 o 6, o al polipeptido de SEQ ID NOs: 1 o 2 y que son derivados de una especie diferente, por ejemplo, de una especie de hongo, levadura, bacteria, planta o animal, preferentemente una especie de hongo basidiomiceto.

Por un ácido nucleico que tiene un secuencia nucleotida o secuencia de DNA es al menos, por ejemplo, alrededor de 85% "idéntica" a una secuencia nucleotida o secuencia ADN de la presente invención, o mostrando una "identidad de al menos alrededor de 85%", esto es intentado que la secuencia nucleotida del ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia nucleotida puede incluir hasta 15 puntos de mutación por cada 100 nucleotidos de la secuencia nucleotida de referencia que codifica al polipeptido. En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotida de al menos 85% identidad a una secuencia nucleotida de referencia hasta 15% de los nucleotidos en la secuencia de referencia pueden ser eliminados o sustituidos con otro nucleótido o un numero de nucleotidos hasta 15% del total de nucleotidos en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser una secuencia entera o cualquier fragmento como se describió aquí.

En ciertas realizaciones la invención, secuencias ADN de la invención pueden tener una secuencia de identidad de al menos alrededor de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con una de las secuencias de ADN como se mencionó antes, por ejemplo. SEQ ID NO: 3, 5 o 6, o cualquier derivado de la misma cualquier derivado de la misma de acuerdo con la presente invención. Si cualquier molécula de ácido nucleico o secuencia de ADN particular es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más idéntica a la secuencia nucleotida o secuencia ADN de la presente invención, por ejemplo. SEQ ID NO: 3, 5 o 6, o cualquier derivado de la misma puede ser determinada convencionalmente usando programas computacionales conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia entre una secuencia consulta (la secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también referida a un alineamiento de secuencia global puede ser determinada usando el programa computacional FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., 1990, Comp. App. Biosci. 6: 237-245. En un alineamiento de secuencia nucleotida las secuencias consulta ay sujeto son ambas secuencias ADN. Una secuencia de ARN puede ser comparada al convertir U's to T's. El resultado de dicho lineamiento de secuencia global es un porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias ADN para calcular el procentaje de identidad son: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=1 , Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 o la longitud de la secuencia nucleotida cualquiera sea es menor. Si la secuencia sujeto es menor que la secuencia consulta por las deleciones 5' o 3' deleciones, no por las deleciones internas, una corrección manual se debe hacer a los resultados. Esto es porque el programa FASTDB no cuenta con truncaciones 5' y 3' de la secuencia sujeto cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos 5' o 3', en relación a la secuencia consulta, el porcentaje de identidad es corregido al calcular el número de bases de la secuencia consulta que son 5' y 3' de la secuencia sujeto, que no coinciden/alinean, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia consulta. Si un nucleótido coincide/alinea es determinado por los resultados de la secuencia de alineamiento FASTDB. Este porcentaje puede entonces ser sustraído del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros específicos, para llegar a puntaje de identidad porcentual final. Este puntaje corregido es lo que se ya para los propósitos de la presente invención. Solo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia sujeto como se despliega por el alineamiento FASTDB que no coinciden/alinean con la secuencia consulta son calculados para los propósitos del ajuste manual del puntaje de identidad porcentual.

En ciertas realizaciones de la invención, secuencia de polipeptido de la invención pueden tener identidad de al menos alrededor de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con uno de las secuencias de polipeptido como se describió antes, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 2, o cualquier derivado de la misma de acuerdo con la presente invención.

Por un polipeptido que tiene secuencia de amino ácidos al menos, por ejemplo, 85% "idéntica" a una secuencia de amino ácidos de consulta de la presente invención, se intenta que la secuencia de amino ácido del polipeptido sujeto sea idéntica a la secuencia consulta excepto que la secuencia de polipeptido sujeto puede incluir hasta 15 alteraciones de amino ácidos por cada 100 amino ácidos de la secuencia de amino ácido de consulta. En otras palabras, para obtener un polipeptido que tiene una secuencia de amino ácidos de al menos 85% identidad a un secuencia de amino ácido consulta, hasta 15% de los residuos de amino ácidos en la secuencia sujeto pueden ser insertadas, eliminadas, (indels) o sustituidas con otro amino ácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amonio o carboxi de la secuencia de amino ácidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, interesparcidos ya sea entre residuos individuales en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Si cualquier polipeptido particular es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, una secuencia de amino ácidos de la presente invención se puede determinar convencionalmente al usar programas computaciones conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia entre una secuencia consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también referida como un alineamiento de secuencia global, puede ser determinada usando el programa computacional FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., 1990, Comp. App. Biosci. 6: 237-245. En la secuencia de amino ácidos un alineamiento de secuencia de amino ácidos secuencia consulta y sujeto son ambas secuencias de amino ácidos. El resultado de dicha alineamiento de secuencia global está dada por el porcentaje de identidad. Parámetros preferidos usados en el alineamiento FASTDB de amino ácidos son: Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1 , Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 o la longitud de la secuencia de amino ácido sujeto la que sea más corta. Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia consulta es debido a las deleciones de los terminales N- o C-, no por las deleciones internas, una corrección manual debe ser hecha para los resultados. Esto porque el programa FASTDB no cuenta para truncaciones del terminal N- y C- de la secuencia sujeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para secuencias sujeto truncadas en los terminales N- y C-, en relación a la secuencia consulta, el porcentaje de identidad es corregido al calcular el número de residuos de la secuencia consulta, el porcentaje de identidad es corregido al calcular el número de residuos de la secuencia consulta que son terminal N- y C- de la secuencia consulta que no coinciden/alinean con una residuo sujeto correspondiente como un porcentaje de las bases totales de la secuencia consulta. Si un residuo alinea/coincide puede ser determinado por los resultados del alineamiento de secuencia FASTDB. Este porcentaje es entonces sustraído del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros específicos para llegar a un puntaje de porcentaje de identidad final. Este puntaje de porcentaje de identidad final es el que se usa para los propósitos de la presente invención. Solo residuos para los terminales N- y C- de la secuencia sujeto que no coinciden/alinean con la secuencia consulta son consideradas para los propósitos de ajustar manualmente el puntaje de identidad de porcentaje. Esto es, solo posiciones de residuos de consulta fuera de los residuos terminales N- y C- más lejanos de la secuencia sujeto. Por ejemplo, un residuo de 90 amino ácidos se alinean con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar la identidad de secuencia. La deleción ocurre en el terminal N- de la secuencia sujeto y entonces, el alineamiento FASTDB no muestra una coincidencia/alineamiento de los primeros 10 residuos del terminal N-. Los 10 sin unir representan 10% de la secuencia (número de residuos en el terminal N- y C- no coinciden/número total de residuos en la secuencia consulta) así 10% se resta del puntaje de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. Si lo 90 residuos remanentes coinciden perfectamente con la identidad porcentual final sería 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos se compara con una secuencia de consulta que tiene 100 residuos. Este momento las deleciones son deleciones internas así hay residuos en el terminal N- o C- de la secuencia sujeto que no coinciden/alienan con la consulta. En este caso el porcentaje de identidad se calcula por FASTDB y no es corregido manualmente. Solo posiciones de residuos fuera los extremos terminales N- y C- de la secuencia sujeto según despliega el alineamiento FASTDB que no coinciden/alinean con la secuencia consulta son manualmente corregidos. No se hacen otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención.

La presente invención también se refiere en un aspecto a secuencias de ADN o ácidos nucleicos capaces de hibridar bajo condiciones de hibridación estrictas a las secuencias de ADN de la invención o acido nucleicos como se definieron antes, preferentemente a las secuencias nucleotidas SEQ ID NOs: 3, 5, o 6, o la secuencia nucleotida que codifica la secuencia de ácido de SEQ ID NO: 1 o 2. El término "condiciones de hibridación estrictas " se refiere a una incubación de toda la noche a 42°C en una solución que comprende 50% formamida 5x SSC (750 mM NaCI, 75 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato sódico (pH 7.6), 5x solución de Denhardt's, 10% sulfato dextran, y 20 g/m) desnaturada, ADN de esperma de salmón cortado, seguido de lavado en filtros en 0.1 x SSC a alrededor de 65°C. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que hibridan a los polinucleotidos de la presente invención en condiciones de hibridación menos estrictas. Los cambios en la exigencia de la hibridación y detección de señal son primariamente acompañados a través de manipulación de la concentración de formamida (porcentajes menores de formamida resultan en exigencia disminuida); condiciones de sal, o temperatura. Por ejemplo, condiciones de exigencia menor incluyen una incubación toda la noche a 37°C i.e. una solución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = 3M NaCI; 0.2M NaH ₂ PO ₄ ; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% formamida, 100 μg/ml DNA que bloquea esperma de salmón; seguido por lavados a 50°C con 1 X SSPE, 0.1 % SDS. Además, para alcanzar aún menor exigencia, lavados se realizan siguiendo la hibridación estricta se pueden conducir a concentraciones mayores de sal (por ejemplo, con 5X SSC). Variaciones adicionales en las condiciones anteriores pueden ser acompañadas a través de la inclusión y/o sustitución de reactivos de bloqueo alternativos usados para suprimir el respaldo en experimentos de hibridizacion. Reactivos de bloque típicos a ser usados en el contexto de la presente invención incluyen reactivos de Denhardt's, BLOTTO, heparina o DNA de esperma de salmón desnaturado. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos pueden requerir de modificaciones de las condiciones de hibridación anteriores, debido a los problemas de compatibilidad.

En ciertas realizaciones una molécula de ácido nucleico o un polipeptido de acuerdo con la presente invención es una molécula recombinante, no natural. Puede ser derivada de una molécula de ácido nucleico aislada o polipeptido por una modificación, por ejemplo, una variación como se definió antes, por ejemplo, la sustitución, deleción, adición, etc. de uno o más residuos de nucleotido o amino ácido. También en vista están las fusiones con otras proteínas o secuencias que encierran tales proteínas. Tales compañeros de fusión pueden comprender además funcionalidades o pueden constituir tags para purificación o señales de secreción etc. También en vista están las moléculas sintéticas de ácido nucleico en que la secuencia de molécula de ácido nucleico deriva de Articulospora proliferata ha sido reconstruida de nuevo, por ejemplo, en base a oligonucleotidos. Asimismo, dicha secuencia puede comprender una modificación o variación en comparación a las secuencias aisladas originales.

En una realización preferida adicional, el uso de codon en una secuencia que codifica una poligalacturonasa como se describió antes puede ser adaptada a cualquier organismo hospedero adecuado. Conforme a ello, el uso de codon (es decir, la frecuencia de uso de 3 nucleotidos en un ORF) o uso de dicodon (es decir la frecuencia de uso 6 nucleotidos en un ORF) puede ser adaptada en vista de la frecuencia del uso de codon o dicodon en un organismo objetivo al codón o dicodon adecuado o preferido en dicho organismo objetivo. El uso de codon/dicodon puede ser adaptado tal que ya sea los codones o dicodones más preferidos de dicho organismo objetivo sean empleados, o 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% de los codones o dicodones más preferidos de dicho organismo objetivo sean usados, con la permanencia de codones o dicodones siendo los codones/dicodones segundos más preferidos o, en otra realización, los codones/dicodones terceros más preferidos de dicho organismo. La frecuencia de uso correspondiente de un organismo objetivo sería conocido para la persona versada en la materia o puede ser calculado en base a una base de datos genómica y datos de expresión derivables de fuentes de literatura adecuada. Un ejemplo preferido de un uso de codón adaptado es la secuencia SEQ ID NO: 6 que comprende una secuencia que tiene adaptado el uso de codón en Pichia pastoris.

En realizaciones adicionales, la presente invención mira la provisión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención que incluye variantes de los mismos como se definió antes o el polipeptido de acuerdo con la invención incluyendo variantes del mismo como se definió antes aislado de la especie Articulospora proliferata. También mira que dichas moléculas de ácido nucleico o polipeptidos pueden ser aislados de organismos de la misma familia, es decir, otra especie Articulospora. Además se provee una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención que incluye variantes de la misma como se definió antes, o un polipeptido de acuerdo con la invención que incluye variantes de la misma como se mencionó antes que son aislados de especies fúngicas o bacterianas adicionales, por ejemplo, basidiomicetos o levaduras.

En otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico como se definió aquí antes, preferentemente la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de secuencia nucleótido de SEQ ID NO: 4, 5 o 6 o fragmentos o variantes de los mismos como se definió aquí antes o una molécula de ácido nucleico que representa una fusión de dichas secuencia nucleotidas con otras secuencias o fragmentos de los mismos o constructos de fusión que incluyen otras actividades, etc. un vector adecuado de acuerdo con la presente invención puede ser, por ejemplo, un fago, plasmido, viral, o vector retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes de replicación o deficientes de replicación. En el último caso, la propagación viral en general ocurriría solo en complementar las células hospederas. Preferidos son los vectores de expresión recombinante para la expresión en microorganismos tales como bacteria o levaduras.

Los polinucleotidos de acuerdo con la presente invención pueden ser unidos a una vector que contiene un marcador seleccionare para la propagación en un hospedero. Además, el inserto de polinucleotido puede estar operativamente ligado a un promotor apropiado, tal como el promotor de fago lambda PL, los promotores E. coli lac, trp, phoA y tac, los promotores tempranos y tardíos SV40 y promotores retroviral LTRs o el promotor inducido por metanol AOX1 . Otros promotores adecuados son conocidos por la persona versada en el arte. Los constructos de expresión pueden además contener sitios para la iniciación de la transcripción, terminación, y, enla región transcrita, un sitio de unión de ribosoma. En particular, la iniciación específica de señales puede ser requerida para la traducción eficiente de secuencia codificante insertadas. Estas señales incluyen el codon de iniciación ATG y secuencia adyacentes. Además, el codon de iniciación muy típicamente está en fase con el marco de lectura de la secuencia que codifica deseada para asegurar la traducción del inserto entero. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden tener una variedad de origines, ambos natural y sintético. La eficacia de expresión puede ser además mejorada por la inclusión de elementos de transcripción apropiados etc. En una realización particularmente preferida la porción que codifica de los transcriptos expresada por los constructos preferentemente incluirá una traducción del codón de iniciación al comienzo y termino del codon (UAA, UGA o UAG) apropiadamente posicionados al termino del polipeptido traducido.

Los vectores de expresión incluirán preferentemente al menos un marcador seleccionarle adecuado para la célula hospedera en que este intenta ser usado. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, resistencia a dihidrofolato reductasa, G418, higromicina o neomicina con para cultivos celulares eucarioticos y genes resistentes a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivos en E. coli y otras bacterias. Además marcadores de selección incluyendo kinasa timidina de virus de herpes simplex, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa y adenina fosforibosiltransferasa. Métodos comúnmente conocidos en el arte de tecnología de ADN recombinante puede ser rutinariamente aplicado a seleccionar el clone recombinante deseado, y tales métodos son descritos, por ejemplo, en Ausubel et al., eds, 2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York. Vectores preferida para el uso en bacteria incluye pQE70, pQE60 y pQE9, disponible de QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript , vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems, Inc.; pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponible de Pharmacia Biotech, Inc., y vectores pET disponibles de Novagen, o pUC57 disponible de Gensecript. Entre los vectores eucarioticas preferidas son pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG disponible de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponible de Pharmacia. Vectores de expression preferidos para uso en sistemas de levadura incluyen pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K, y PAO815. Particularmente preferidos son vectores de expresión para Pichia tal como pPINK-LC y en particular pPINK-HC disponible de ThermoFischer Scientific o ppinka-HC disponible de Invitrogen. Otros vectores adecuados son conocidos para la persona versada en el arte.

En una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para hacer una célula hospedadora recombinante, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico o el vector de acuerdo con la presente invención en la célula hospedadora. El término "célula hospedadora" como se usa aquí se refiere un célula hospedadora adecuada cualquiera conocida para la persona versada en la materia. Ejemplos representativos de de células hospedadoras apropiadas incluyen células bacterianas, tales como E. coli, o Streptomyces; células fúngicas, tal como células de levadura (por ejemplo., Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris); células de insecto tales como Drosophila melanogaster S2 y células Spodoptera frugiperda Sf9; y células vegetales. Particularmente preferidas con las células hospederas E. coli, así como también las células hospederas fúngicas, en particular del género Aspergillus, Trichoderma, o Neurospora. También preferidos son células hospederas de levadura de una levdura de la familia Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula o Pichia. Las más preferidas son las células hospederas Pichia pastoris.

Además, la célula hospedadora puede ser escogida porque modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica los procesos del producto génico en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) y procesos (por ejemplo, clivaje) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Células hospedadoras diferentes tienen características y mecanismos específicos para el proceso post-translacional y modificación de proteínas y productos génicos. Las líneas celulares apropiadas o sistemas hospederos pueden ser escogidos para asegurar la modificación correcta y proceso de la proteína introducida expresada.

En una realización particularmente preferida, la levadura Pichia pastoris puede ser usada para expresar un polipeptido de acuerdo con la presente invención. Pichia pastoris es una levadura metilotrofica, que puede metabolizar metanol como su fuente de carbón único. Una etapa principal en la ruta de la metabolización de metanol es la oxidación de metanol a formaldehido usando O ₂ . Esta reacción es catalizada por la enzima alcohol oxidasa. Para metabolizar metanol como su única fuente de carbono, Pichia pastoris debe generar altos niveles de alcohol oxidasa debido, en parte, a la afinidad relativamente baja del alcohol oxidasa para O ₂ . En consecuencia, en un medio de crecimiento depende de metanol como fuente de carbono principal, la región promotora de uno de los genes de alcohol oxidasa (AOX1 ) es altamente activa. En presencia de metanol, alcohol oxidasa producida del gen AOX1 comprende hasta aproximadamente 30% de la proteína soluble total en Pichia pastoris. Así, una secuencia que codifica heterologa, tal como, por ejemplo, un ppolinucleotido de acuerdo con la presente invención como se define aquí antes, bajo la regulación transcripcional de todo o parte de la secuencia reguladora AOX1 es expresada en niveles excepcionalmente altos en levadura Pichia crecida en presencia de metanol. En un ejemplo, el vector plasmido pPIC9K puede ser usado para expresar la secuencia de AND que codifica el polipeptido de la invención, como se indica aquí, en un sistema de levadura Pichia esencialmente como se describe en "Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology," (D. R. Higgins y J. Cregg, eds; The Humana Press, Totowa, NJ, 1998). Este vector de expresión permite expresión y secreción de la proteína de la invención en virus del promotor AOX1 fuerte unido al péptido señal secretor de fosfatasa alcalina Pichia pastoris (PHO) (es decir, líder) ubicado corriente arriba de un sitio de clonación múltiple. Varios otros vectores de levadura podrían ser usados en lugar de pPIC9K, por ejemplo, los vectores de levadura mencionado aquí antes, tanto como los constructos de expresión propuestos proporcionados apropiadamente señales únicas para transcripción, traducción, secreción (si se desea), y lo similar, incluyendo un AUG en un marco, como se requirió. En un ejemplo adicional, el vector plasmidio pPINK-HC disponible de ThermoFisher Scientific o ppinka-HC disponible de Invitrogen pueden ser usados para expresar DNA que codifica el a polipeptido de la invención.

El término "transformando un vector de expresión en una célula hospedera " como se usa aquí se refiere a cualquier célula adecuada para la introducción de ácido nucleico o técnicas de transformación conocidas por la persona versada en el arte. Por ejemplo, tal introducción puede ser conducida por transfixión, por ejemplo, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación, microinjección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión de célula, transferencia de gen mediada por cromosoma, transferencia de gen mediada por microcelula, transfección cationia mediada por lípido, fusión esferoplastia, etc. Además la técnica de introducción contemplada por la presente invención incluye el contacto con retroviral defectivos o atenuados, bombardeo de macropartículas, el uso de cubiertas con lípidos o receptores de superficie o agentes de transfección, el uso de encapsulación en liposomas, microparticulas o microcapsulas, por ejemplo al administrarlas ligadas a un péptido que es conocido que entra al núcleo o al administrarlo a un péptido que es conocido que entra al núcleo o al administrarlo ligado a un péptido que es sabido entra al núcleo, o al administrarlo ligado a un ligante y sujeto a endocitosis mediada por receptor, o electroporación. Detalles adicionales serían conocidos para la persona versada en la material o pueden ser derivadas de fuentes adecuadas de literatura. En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una célula hospedera recombinante u obtenible de acuerdo a las técnicas de introducción descrita antes, es decir transformada con el vector de expresión recombinante como se mencionó aquí antes. Preferentemente, tales células hospederas recombinantes contienen una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención. En una realización particularmente preferida las células hospederas recombinantes expresan un polipeptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Típicamente, las células hospederas difieren de células que ocurren naturalmente o células hospederas conocidas por la presencia de moléculas de ácido nucleico adicional o fragmentos de los mismos, los que están presentes en contextos naturales o en células padres o líneas celulares. Por ejemplo, células hospederas recombinantes pueden comprender marcadores de selección, copias duplicados o multimericas de genes presentes naturalmente o acido nucleicos, elementos meteorólogos como secuencias promotor, secuencias de terminación etc. o tags de identificación genética. Estos elementos pueden preferentemente ser usados para la caracterización de las células hospederas recombinantes y para distinguirla de contextos naturales y células padres o líneas celulares.

La expresión de elementos introducidos puede ser controlada por numerosas pruebas genéticas estándares conocidas para la persona versada en la materia. Por ejemplo, la transcripción de un ácido nucleico introducido puede ser probada en pruebas de análisis Northern y/o la presencia de polipeptidos traducidos correspondientemente puede ser probada pruebas de análisis Western o pruebas enzimáticas para el funcionamiento de poligalacturonasas como se describe aquí.

En otro aspecto la invención se refiere a un método para hacer o producir un polipeptido codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como se define aquí antes que comprende: (a) cultivar la célula hospedera recombinante como se define aquí antes tal como el polipeptido codificado es expresado; y (b) recuperar dicho polipeptido. Método para cultivar células hospederas recombinantes para expresar polipeptidos codificado ampliamente conocido en el arte. Por ejemplo, si un promotor regulable es usado, un agente de inducción puede ser agregado al cultivo o las condiciones apropiadas, óptimas para trabajo pueden ser fijadas, por ejemplo, una temperatura específica, pH, concentración iónica, etc. El término "recuperar" como se usa aquí antes se refiere a cualquier método adecuado para la extracción y/o purificación de polipeptidos desde células, suspensiones celulares o cultivos celulares conocidos para la persona versada en el arte. Los métodos de recuperación típica incluyen sulfato de amonio o precipitación por etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio anionica o cationica, cromatografía fosfolcelulosa, cromatografía de interacción hidrofobica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxipapatita y cromatografía de lectina. Detalles adicionales de como el polipeptido puede ser recuperado y/o purificado puede ser derivado de los Ejemplos, cuyas correspondientes etapas y técnicas de purificación son referenciadas como realizaciones específicas de la presente invención.

La invención también se refiere a una composición que comprende un polipeptido de acuerdo con la invención, u obtenida por un método de producción de acuerdo con la invención. Dicho polipeptido puede ser proporcionado como proteína aislada o básicamente purificada en una composición. Un polipeptido aislado y purificado se refiere a un polipeptido que es aislado de su entorno nativo y está presente en una forma purificada para uso adicional. Un polipeptido aislado puede estar presente en una forma purificada o puede estar presente en un entorno no nativa tal como en una célula hospedera transgénica o recombinante como se describió antes. Por ejemplo, una proteína aislada o purificada o biológicamente activa parte del mismo es básicamente libre de material celular adicional o medio cultivo si es producido de acuerdo con técnicas recombinantes o está básicamente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos. Una proteína que está básicamente libre de material celular puede estar comprendido con menos que aproximadamente 70%, 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (en relación al peso seco) de proteína contaminante. Si el polipeptido de acuerdo con la invención o un fragmento biológicamente activo del mismo es recombinantemente producido, el medio de cultivo preferentemente comprende menos de aproximadamente 70%, 50%, 30%, 20%, 10% o 5% (en relación al peso seco) de los precursores químicos o sustancias químicas que no parecen proteína. En realizaciones adicionales, composiciones de poligalacturonasa de la presente invención pueden ser liquida o seca. Composiciones liquidas preferentemente comprenden la enzima poligalacturonasa en una forma purificada o enriquecida. Sin embargo, los agentes auxiliares tal como un estabilizador y/o glicerol, sorbitol o monopropilenglicol, aditivos tal como sales, azúcar, preservativos, agentes para ajuste del valor de pH y proteínas pueden ser agregados. Composiciones liquidas típicas son suspensiones acuosas u oleosas.

Composiciones secas pueden ser composiciones liofilizadas, pulverizadas en seco, granuladas o extruidas, que pueden solo comprender la enzima. Las composiciones en seco pueden ser granulados que pueden fácilmente ser mezclados con, por ejemplo, ingredientes adicionales o componentes, o que pueden formar un componente de una premezcla. Preferentemente, el tamaño de partícula del granulado de enzima es compatible con el otro componente de la mezcla. Esto permite agentes seguros y útiles para incorporar enzimas en premezclas procesadas etc. Composiciones secas pueden también comprender otros aditivos tales como sales, particularmente sales de fosfato y sus formas anhidra, y estabilizadores tales como poli(vinil pirrolidona) etc. para regular ciertas condiciones tales como el valor de pH en la aplicación.

En una realización adicional las composiciones de poligalacturonasa de acuerdo con la invención comprenden adicionalmente una cantidad efectiva de una o más enzimas para a producción de bebidas o degradación de pectina. Tales enzimas adicionales pueden incluir una o más pectinasas, una o más pectin liasas que clivan los enlaces glicosidicos entre los residuos galacturonicos o eliminación beta, o uno o más estereasas, por ejemplo, una pectin metil estereasa que diva el grupo metilo de los residuos de ácido galacturónico.

El polipeptido de la invención, es decir la poligalacturonasa como se definió aquí antes o una composición de la presente invención como se definió aquí antes puede ser usada para una variedad de aplicaciones. Ejemplos son aplicaciones en procesos en que la degradación de la pectina es relevante o deseable. Tales procesos incluyen la producción de bebidas, tales como la producción de vino, cerveza o jugo de fruta. La producción de vino incluye, por ejemplo, la producción de vino tinto, vino blanco, vino rosé o champagne. La producción de los jugos de fruta incluyen, por ejemplo, la producción de jugo de cereza, jugo de naranja, jugo de manzana, jugo de piña, jugo de ciruela, jugo de mandarina, jugo de plátano, jugo de melón y cualquier otro jugo, por ejemplo, frutos exóticos o mezclas de frutos.

Además mira el uso del polipeptido de la invención para la clarificación de mosto o jugo de fruta, por ejemplo, como se mencionó aquí antes. El mosto puede ser mosto de uva, por ejemplo, una roja o banca.

La poligalacturonasa como se definió aquí antes o una composición de la presente invención como se define aquí puede conforme a ello ser puesta en contacto con pectina que comprende elementos a ser tratados e incubados a una temperatura adecuada hasta el proceso de degradación haya comenzado. Es particularmente preferido que dicho contacto sea realizado bajas temperaturas de alrededor de 5°C a 20°C, preferentemente a una temperatura entre 5°C y 15°C. El uso de los polipeptidos o composiciones puede estar adaptadas a los elementos que son tratados. Por ejemplo, para la producción de vinos blancos una temperatura de 8°C puede ser elegida, y para la producción de vinos rojos una temperatura de 12°C puede ser escogida. La poligalacturonasa como se definió aquí antes o una composición de la presente invención como se definió aquí puede ser también usada a diferentes temperaturas, por ejemplo, aún a temperaturas más allá de 20°C o 25°C. En realizaciones adicionales, la poligalacturonasa como se definió aquí antes o una composición de la presente invención como se definió aquí puede también ser usada a valores de pH diferentes, por ejemplo, a un pH de 2.5, 3.0, 3.5 o 4.

En aspectos específicos la presente invención se refiere a una enzima con actividad poligalacturonasa con alta actividad en un rango de temperatura entre 5 ^Q C-15 ^Q C. Por ello, es útil en procesos de clarificación del mosto de uva- Este proceso se puede realizar a bajas temperaturas, por ejemplo, a un temperatura de 8°C- elaboración de vinos blancos, o a una temperatura 12°C, en la elaboración de vinos tintos.

La presente invención también se refiere a una formulación líquida o polvo liofilizado que comprende dicha enzima y excipientes apropiados, la que es útil para degradar pectina a temperaturas entre 5-15 ^Q C. También se refiere a la secuencia de nucleotídica sintética que la codifica o que codifica una secuencia de amino ácidos teniendo al menos alrededor de 85% de identidad, y más preferentemente, al menos 90% de homología o porcentaje de identidad, y aún más preferentemente, al menos 95% de homología con la presente enzima, y que también es altamente eficiente a bajas temperaturas, particularmente, a un rango de temperatura entre 5 ^Q C-15 ^Q C.

Dicha secuencia nucleotidica también comprende una variante de ácido nucleico que codifica una enzima que difiere de la presente enzima por no más de alrededor de 55 sustituciones de amino ácidos, y más preferentemente, no más de 18 sustituciones de amino ácidos, y que mantiene la misma actividad poligalacturonasa a temperaturas entre 5 ^Q C-15 ^Q C.

La presente invención también se refiere al método de obtención de la presente enzima mediante cepas transformantes de la levadura Pichia pastoris. Asi como también, la presente invención se refiere al vector de expresión recombinante ppinka-HC (Invitrogen que permite la transformación apropiada de la levadura Pichia pastoris.

Para obtener la enzima con actividad poligalacturonasa de la presente invención que es altamente eficiente a bajas temperaturas, preferentemente, a temperaturas en el rango de 5 ^Q C-15 ^Q C, se evaluó la presencia de pectinasas extracelulares en una colección de levaduras y hongos aislados que pertenecen a los géneros Cryptococcus, Mrakia, Cysto f ¡lobas id ium, Aureobasidium, Naganishia, Articulospora, Rhodotorula, Rhodosporídium, Leucosporídella, Dioszegia, Sporobolomyces, Udeniomyces y Candida ("Diversity y extracelular enzymatic activities de yeasts isolated from King George Island, the sub-Antartic región", Carrasco et al BMC Microbiology 2012, 12:251 , http:www.biomedcentral.com/1471 -2180/12/251 ). En el ensayo, se sembró cada colonia de levadura en placas con pectina, y luego, se las incubó a la temperatura óptima de cada levadura, y posteriormente, se incubó con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (1 %). Esto permitió seleccionar colonias de levaduras y hongos que presentaron actividad pectinasa, lo que se evidenció por la presencia de un halo de hidrólisis, ver figura 1 1 . Así, se seleccionó el hongo Articulospora proliferata, el cual presentó la mayor actividad enzimática pectinasa en comparación con las demás, destacándose también por ser capaz de crecer entre 4 y 37 ^Q C, y mostrar el mayor halo de hidrólisis entre 10 y 30 ^Q C.

Posteriormente, se prepararon cultivos del hongo Articulospora proliferata y se analizó su actividad pectinasa. Para el desarrollo de dicho análisis, se usó un cultivo control conteniendo glucosa 1 %, extracto de levadura 0.3%, extracto de malta 0.3% y peptona 0.5%, y un cultivo inducido principalmente del mismo contenido que el cultivo control pero reemplazando glucosa 1 % por una pectina comercial, 1 %.

Entonces, los cultivos en fase exponencial tardía de crecimiento se cosecharon por centrifugación y el sobrenadante fue filtrado. Las proteínas presentes en los sobrenadantes libres de células, fueron precipitadas, y luego, sometidas a diálisis por membrana. Los extractos proteicos fueron entonces ensayados para actividad pectinasa utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS).

Este método se basa en la reacción de! DNS con cualquier azúcar reductor. El ácido galacturónico (un azúcar reductor) es el producto de degradación de la pectina, el que al liberarse reacciona con el DNS, provocando un aumento de la absorbancia a 540nm. Si este valor se compara con respecto a una curva de calibración previa y separadamente construida, que posee concentraciones conocidas de ácido galacturónico, ver Figura 9, y de esta forma, es posible determinar el contenido de ácido galacturónico, en una muestra.

Así, en base a este método, se desarrolló un protocolo de actividad enzimática poligalacturonasa donde se incuban los extractos proteicos con una pectina comercia!, para luego adicionarles DNS, e incubar las reacciones a 100 ^Q C, y luego, enfriar. Por último, la absorbancia de las muestras fue cuantificada a 540nm, estimándose la concentración de ácido galacturónico mediante la curva de calibración ante mencionada, ver Figura 9.

Como el extracto proteico obtenido desde el medio del cultivo inducido presentó mayor actividad pectinasa en relación al cultivo control, tal medio fue utilizado en las siguientes etapas de semi-purificación e identificación de la enzima pectinasa.

Entonces, se hizo crecer en el medio del cultivo inducido, el hongo Articulospora proliferata, y se precipitaron las proteínas extracelulares totales utilizando diferentes porcentajes de sulfato de amonio. En estas condiciones, se produjo un enriquecimiento en ciertas proteínas en la fracción 60% y esto coincidió con la presencia de actividad enzimática de las muestras, ver Figura 1 .

Debido a la menor cantidad de proteínas y a la presencia de actividad poligalacturonasa en esta fracción, esta muestra se empleó para una cromatografía de intercambio iónico, y así, obtener la enzima suficientemente pura para un análisis de espectrometría de masas.

Las proteínas fueron eluidas de la columna cromatográfica utilizando un gradiente de 0-1 M de cloruro de sodio. Cada fracción obtenida fue evaluada para actividad enzimática (método del DNS) y SDS-PAGE. Los resultados obtenidos, mostraron que la pectinasa era una proteína de aproximadamente 40kDa, ver Figura 2. Se cortó esta banda proteica desde el gel SDS-PAGE y se envió a analizar mediante un servicio de huella peptídica (Alphalyse) para determinar la secuencia aminoacídica completa de la proteína. De esta forma, los resultados indican que la proteína identificada corresponde a una enzima poligalacturonasa, lográndose obtener sólo fragmentos de la secuencia aminoacídica.

Se secuenció entonces, el genoma del hongo seleccionado {Articulospora proliferata) para obtener la secuencia nucleotidica completa del gen productor de la enzima poligalacturonasa de la presente invención, y sus posibles variantes. Para ello, se obtuvo DNA genómico puro y de alta calidad y se secuenció el genoma de dicho hongo mediante un secuenciador. Luego, el DNA obtenido fue sometido a secuenciación de genomas en Macrogen. En dicha secuenciación, el DNA fue fragmentado en diferentes tamaños mediante sonicación, generando dos librerías. La primera librería que se generó fue una tipo "Pair-end" con insertos de 180 pares de bases y la segunda librería, correspondió a una librería multiplexada con tamaños de inserto de 3 y 10 Kilobases. A partir de ambas librerías, se ensambló de manera eficiente, el genoma del mencionado hongo. A partir del ensamblaje, se generaron Scaffolds que contenían el genoma de dicho hongo, identificándose 1 1 .302 genes, y se elaboró un modelo de genes utilizando la herramienta Augustus disponible en el programa Geneious (Biomatters).

Para validar este modelo de genes, se secuenció el transcriptoma de Articulospora proliferata mediante RNA-seq. Para esto, se extrajo RNA desde cultivos del hongo crecido en el cultivo control y en el cultivo inducido, ambos cultivos fueron descritos en los párrafos anteriores. Para la extracción de RNA, se colectaron por centrifugación, los "pellet celulares" obtenidos desde cultivos en fase exponencial tardía de crecimiento, los que fueron posteriormente lavados con agua destilada, y luego, el RNA extraído mediante el kit Ribopure Yeast RNA purif ¡catión (Ambion).

Los RNAs así obtenidos fueron sometidos a electroforesis (ver Figura 3) y se determinó su absorbancia a 260 y 280nm, calculándose las razones A260/A280. Entonces, los RNAs que presentaron la menor degradación y razones de absorbancia 260/280 mayores a 1 .8, se sometieron a RNA-seq en la empresa Macrogen, y además, se determinó la concentración de RNAs purificados y de RNA total. Se determinó el estado de degradación de los RNAs esencialmente, mediante un chip que los separó, y posteriormente, se generó una librería de cDNAs a partir de estos RNAs. Esta librería fue secuenciada completamente a través del secuenciador Ilumina Hi-seq2000. Mediante esta metodología, se identificaron mRNAs y por ende, las proteínas que se expresaron en la condición inducida (cultivo inducido) y en la condición control (cultivo control). Luego, se analizó el proteoma de dicho hongo mediante la herramienta blastp (NCBI) para identificar la posible enzima poligalacturonasa que expresa.

Hecho este análisis, se observó la presencia de la poligalacturonasa en el genoma secuenciado, que fue previamente identificada mediante espectrometría masas, se realizó un alineamiento entre las secuencias de amino ácidos de los péptidos obtenidos mediante esta aproximación y las secuencias de amino ácidos del proteoma del hongo, ver Figura 12. De esta forma, se logró identificar la secuencia de amino ácido completa de la presente poligalacturonasa, la que se indica como SEQ ID No.:1 en el presente listado de secuencias, y en la Figura 4, se representa gráficamente la secuencia de amino ácido completa de 369 aminoácidos. Con estos resultados se puede concluir que la enzima encontrada corresponde a la enzima que se estaba buscando.

Luego, a partir de la información derivada de los experimentos de RNA-seq y de la secuenciación del genoma se elaboró un modelo de genes final para el gen que codifica para esta enzima (ver Figura 5). Luego, se buscó e identificó la secuencia nucleotídica completa del cDNA, ver SEQ ID No.:5, que codifica para dicha poligalacturonasa madura (sin señal de exportación), utilizando herramientas disponibles en el programa Geneious (Biomatters).

Una secuencia nucleotídica de 1066pb, que codifica para la poligalacturonasa, se sintetizó químicamente mediante la síntesis de oligonucleótidos de Genescript. Para esto, se diseñó el cDNA maduro que codificaría para la presente enzima con actividad poligalacturonasa. En primer lugar, se eliminó de la secuencia original los primeros 57 nucleótidos, ya que estos codifican para un péptido de exportación al medio extracelular, un péptido señal que es necesario para exportar la enzima al medio extracelular. Como el vector ppinka-HC que se empleó para expresar la presente enzima con actividad poligalacturonasa posee la señal de exportación de la feromona alfa de Saccharomyces cerivisiae, no fue necesario mantener la señal nativa. Luego, se optimizó la secuencia del cDNA que codificaría para la presente enzima con actividad poligalacturonasa, cambiando el uso de codones nativo por el uso de los codones de la levadura Pichia pastoris, en la que se iba a expresar posteriormente esta enzima. De esta forma, se obtuvo un fragmento de DNA al cual se denomina con el nombre arbitrario "pect".. De esta forma, la secuencia ID NO 5 corresponde a la secuencia nucleotídica original y la secuencia ID NO 6 corresponde a la secuencia nucleotídica optimizada mediante el uso de codones de Pichia pastoris.

También, se adicionó a este fragmento pect, dos sitios de corte para dos enzimas de restricción. En el extremo 5', se adicionó un primer sitio de corte para la enzima de restricción Mlyl, la secuencia nucleotídica GAGTCCATAG, la cual corresponde a un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mlyl. Mientras que en el extremo 3', se adicionó un segundo sitio de corte para la enzima de restricción Kpnl, la secuencia nucleotídica GGTACC, la cual corresponde al sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Kpnl.

De esta forma, la secuencia nucleotítica que se sintetizó es la secuencia SEO ID No.:4, un cDNA de 1066 pares de bases que codifica para la enzima con actividad poligalacturonasa de la invención pero que es capaz de ser expresado en la levadura Pichia pastoris al ser clonado en el vector de expresión apropiado. El fragmento resultante (desde ahora pect2) fue clonado en el vector de clonamiento pUC57, por Genscript. El plasmidio resultante (desde ahora pUC57-pect2) fue transformado posteriormente en células electrocompetentes de la bacteria E. coli DH5a mediante electroporacion y siguiendo los protocolos ampliamente conocidos y publicados, específicamente, en Sambrook J y Rusell DW. 2001 . Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

10 clones transformantes fueron seleccionados en placas LB-agar (triptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, cloruro de sodio 0.5% y agar 1 .5%) suplementadas. La selección de clones fue mediante resistencia a ampicilina y luego, se confirmó mediante PCR. Posteriormente, se obtuvo DNA plasmidial desde cultivos líquidos de clon mediante el kit GeneJet plasmid Miniprep (Thermoscientific). Es importante notar que la selección del clon se hace libremente ya que en una etapa de clonamiento, no es relevante que clon se selecciona. Luego, este DNA plasmidial fue digerido con las enzimas de restricción Mlyl y Kpnl (Thermoscientific) de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y posteriormente, se visualizó los fragmentos DNA obtenidos, el vector linearizado y el fragmento pect, mediante geles de agarosa (amortiguador TAE 1 %, agarosa 1 % y Safe view nuclei acid stain 1 X) , ver Figura 13.

El fragmento de DNA de 1050pb (pect) fue purificado desde geles mediante el método del genclean (Sambrook J y Rusell DW. 2001 . Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En paralelo, se digirió el vector de expresión ppinka-HC (Invitrogen) para levaduras con las enzimas de restricción Stul y Kpnl (Themoscientific) de acuerdo a especificaciones del fabricante. Luego, se ligó el fragmento pect al vector ppinka-HC, digerido a través de la enzima T4 DNA ligasa (Thermoscientific), empleando las especificaciones del fabricante. Células competentes de la bacteria E. coli Top10 (Invitrogen) fueron transformadas mediante electroporación de acuerdo a las especificaciones del proveedor, con el vector ppinkaHC-pect obtenido según se describió anteriormente.

Se seleccionaron los clones que fueron capaces de crecer en un medio míni mo de cultivo (glucosa 2%, infusión de papas 20% y agar 1 .5%), en ausencia de suplementación con adenina, lo que fue confirmado a través de PCR, utilizando como molde DNA genómico obtenido desde los clones transformantes. En las reacciones de PCR, se utilizaron los partidores Pectfwd (5 ^' - GCACCTACAGTCTCATCATTG-3 ^' ) y Pectrev (5 ^' -

GCAGGAAGCAGGGGATGGGAA-3 ^' ), que hibridan con la secuencia nucleotídica del fragmento pect. Todas las reacciones de PCR, se realizaron con la enzima Taq DNA polimerasa (Thermoscientific), de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

A 4 clones se les extrajo DNA plasmidial mediante el kit GeneJet Plasmid Miniprep (Thermoscientific). Luego, el DNA plasmidial obtenido fue digerido a 37 ^Q C con la enzima de restricción Aflll (Thermoscientific), siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. El vector linearizado (ppinkaHC-pect), se purificó desde la solución de digestión mediante la adición de acetato de sodio 3M y etano! 100%. Luego, la solución se centrifugó para colectar el DNA, y entonces, este fue lavado con etanol 80%. El DNA se dejó secar a temperatura ambiente y luego fue suspendido en agua estéril. Finalmente, el vector linearizado (ppinkaHC-pect) a transformar fue sometido a diálisis por membrana con agua, utilizando membranas VSWP de tamaño de poro 0,025μιη (Millipore, Merck), con el objetivo de eliminar las sales presentes, en la solución.

En paralelo, se prepararon células electrocompetentes de la levadura Pichia pastorís, cepa Pichiapink strain 1 flnvitrogenj, la que sembró con una asa estéril, y un cultivo de la cepa Pichiapink strain 1 sobre una placa YPD (glucosa 2%, extracto de levadura 1 %, peptona 2% y agar 2%), se incubó. Luego, con una de las colonias formadas, se inoculó un matraz conteniendo medio líquido YPD, para posteriormente, inocular con este cultivo, un matraz conteniendo en su interior, de medio líquido YPD (DO6Q0^ 0.2).

Este cultivo se creció, monitoreando la densidad óptica hasta alcanzar una DO600 entre 1 .3 y 1 .5. Luego, las células se centrifugaron y se suspendieron en agua helada estéril, para luego ser sometidas nuevamente a centrifugación después de haber sido suspendidas, en agua helada estéril. Dichas células, se centrifugaron una vez más y se suspendieron en sorbitol helado para ser nuevamente, centrifugadas y suspendidas, en sorbitol.

Las células se transformaron con el vector linearizado obtenido (ppinkaHC- pect) como se describió antes. Para esto, se mezclaron en una cubeta de electroporación, las células electrocompetentes de la cepa Pichiapink strain con dicho vector linearizado. La mezcla se incubó en hielo y fue sometida a un pulso eléctrico. Inmediatamente después del pulso, se adicionó a la cubeta, medio líquido frío YPDS (glucosa 2%, extracto de levadura 1 %, sorbitol 18.2% y pepona 2%) y se incubó las células transformadas para luego, sembrarla en un medio selectivo (infusión de papás 20%, glucosa 2% y agar 1 .5%) e incubarlas nuevamente.

Sólo las colonias de las células transformadas que adquieran dicho vector linearizado que contiene el gen que codifica para adenina, fueron capaces de crecer en el medio selectivo, ya que la cepa que se transformó, no es capaz de crecer en un medio con ausencia de adenina (el medio PDA, no contiene este requerimiento).

Además la cepa parental, Pichiapink strain 1, presenta una coloración rojiza ya que no es capaz de metabolizar un compuesto debido a la ausencia de un gen de la ruta biosintética de adenina. Esto corresponde a un segundo método de selección, ya que las colonias transformantes adquirieron un color blanco a diferencia de la cepa parental, ver figura 1 1 . Por estas razones, como primer método de selección, se aislaron 4 colonias blancas transformantes, y se volvieron a sembrar placas PDA.

Luego, a los 4 clones antes mencionados se les extrajo DNA genómico utilizando el kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) conforme a las especificaciones del fabricante. Por último, se utilizaron estos DNA genómicos como molde para realizar reacciones de PCR siguiendo los mismos pasos de las reacciones PCR descritas antes, en donde se chequeó la presencia del fragmento pect que codifica para la presente enzima con actividad poligalacturonasa, secuencia SEQ ID No.:2. Estas reacciones se realizaron con los partidores Pectfwd (5 ^' -GCACCTACAGTCTCATCATTG-3 ^' ) y Pectrev (5 ^' - GCAGGAAGCAGGGGATGGGAA-3 ^' ) que son complementarios al fragmento pect y que no amplifican ningún gen endógeno de la cepa Pichiapink strain 1, Por lo tanto, la presencia positiva de amplicones (los 4 clones mostraron amplificación) fue indicativo de una transformación exitosa.

Para demostrar la expresión de la enzima poligalacturonasa en la levadura Pichia pastorís transformada, se creció una colonia de cada uno de los 4 clones en medio BMGY (extracto de levadura 1 %, peptona 2%, amortiguador fosfato de potasio 100mM pH 6.0, YNB 1 .34%, biotina 0.0004% y glicerol 1 %), a 30 ^Q C y con agitación. Luego, la levadura Pichia pastorís transformada fue colectada por centrifugación, y se suspendió en medio BMMY (composición idéntica al medio BMGY, donde solo se reemplaza glicerol por metanol al 0.5%). La composición de proteínas del sobrenadante fue analizada mediante SDS- PAGE. Los "pellet" celulares obtenidos fueron lisados utilizando una solución de ruptura (fosfato de sodio 50mM pH 7.4, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM y glicerol 5%) y vortex. Esta fracción de proteínas intracelulares y el sobrenadante libre de células de cada clon fueron separadas mediante SDS-PAGE y visualizados a través de tinción de plata. Con este análisis se determinó el clon que expresó la mayor concentración de la proteína recombinante al medio extracelular, ver Figura 6. Como se observa en la Figura 6, el clon número 1 presenta una mayor intensidad de una banda de proteína en relación a los clones 2, 3 y 4. Es por esta razón que se eligió este clon como la cepa recombinante para la purificación de la enzima. Por lo tanto, los ensayos posteriores se realizaron con este clon No.1 .

En la purificación de la enzima poligalacturonasa, el sobrenadante del cultivo a partir del clon número 1 , fue filtrado, y utilizando distintos cortes de sulfato de amonio (20, 40, 60 y 80%), se hizo precipitar ¡as proteínas presentes en este sobrenadante libre de células. Y luego, cada una de ¡as fracciones de proteínas se sometió a diálisis contra un amortiguador para luego cuantificar el contenido proteico y determinar ¡a actividad enzimática mediante el método del DNS, descrito anteriormente. Se determinó que la fracción 80%, presentó ¡os mayores nive¡es de actividad enzimática.

A continuación las proteínas presentes en esta fracción fueron separadas mediante cromatografía de intercambio aniónico, que fue equilibrada con una solución amortiguadora, y la elución de las proteínas, se realizó a través de un gradiente linea! de NaCI (0.1 M). Cada fracción fue monitoreada a 280nm para evaluar el contenido proteico. Las fracciones que presentaron absorbancia a 280nm fueron analizadas para actividad enzimática mediante el método del DNS.

De esta forma se logró identificar las fracciones que contenían la enzima poligalacturonasa. Las fracciones que contenían la enzima poligalacturonasa fueron concentradas mediante sistemas de centrifugación y las proteínas resultantes fueron separadas, a través de filtración en gel. Para esto, una columna cromatográfica de alta resolución fue equilibrada con un amortiguador fosfato 50mM, NaCI 0.15M, pH 7.0, y luego, se cargó el extracto de proteínas a separar. Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas espectrofotométricamente a 280nm y cada fracción que presentó proteínas, fue evaluada para actividad enzimática. De esta forma, se logró obtener la enzima poligalacturonasa purificada con un nivel de pureza sobre el 95%, ver Figura 7. Para evaluar la eficiencia de la presente enzima poligalacturonasa en condiciones de laboratorio y semi-industriales, una solución de pectina comercial se mezcló con una solución de la presente enzima poligalacturonasa purificada o con una de una enzima poligalacturonasa comercial. Los ensayos fueron incubados a 37 ⁹ C para luego ensayar, la actividad enzimática poligalacturonasa mediante el método del DNS, También, se realizó el mismo ensayo de actividad enzimática descrito en el párrafo anterior pero imitando condiciones industriales. Para esto, se incubó mosto de vino blanco (pH 3.0) con una solución de la presente poligalacturonasa purificada o con una solución de una enzima poligalacturonasa comercial. Los ensayos fueron incubados a 15 ^g C y 5 ^C' C, y luego, las soluciones se ensayaron para la actividad enzimática poligalacturonasa mediante el método del DNS, ver figura 15.

A continuación, se incluyen ejemplos de realización para la presente invención tal como fue antes descrita:

Ejemplos: Obtención de una poligalacturonasa altamente eficiente a temperaturas entre 5-15 ^e C

Ejemplo 1 : Evaluación de la producción de enzimas pectinasas por material biológico proveniente de la Antártida

Se evaluó la presencia de pectinasas extracelulares en una colección de material biológico aislado desde la Antártida, principalmente seleccionado del grupo consistente de: Cryptococcus terrícola, Cryptococcus gastrícus, Cryptococcus victoríae, Cryptococcus gilvescens, Mrakia robertii, Mrakia blollopis, Mrakia gélida, Mrakia psychrophila, Rhodotorula glacialis, Rhodotorula laryngis, Dioszegia crocea, Dioszegia fristingensis (ahora, Articulosporta proliferata), Sporídiobolus salmonicolor, Leucosporídella creatinivora, Candida sake. En el ensayo se sembró cada colonia del material biológico antes mencionado, en placas YM-pectina (producto Sigma-Aldrich P91 35, pectina comercial, Número CAS 9000-69-5, Número EC 232-553-0, numero MDL MFCD00081 838) 1 %, extracto de levadura 0.3%, extracto de malta 0.3%, peptona 0.5% y agar 1 ,5%, y luego, se incubó por 3 días, cada colonia a la temperatura óptima de crecimiento de cada levadura ("Diversity y extracelular enzymatic activities de yeasts isolated from King George Island, the sub- Antartic región", Carrasco et al BMC Microbiology 2012, 12:251 , http:www.biomedcentral.com/1471 -2180/12/251 ), esto es, 4-22 ^Q C para C. sake, Cr. gastrícus, Cr. gilvescens, Le. creatinivora, M. blollopis; 4-15 ^Q C para Cr. victoríae, M. gélida, M. psychrophila, M. robertii, Rh. Glacialis y 4-30 ^Q C para Rh. laryngis, Sp. salmonicolor.

A continuación, las placas se incubaron con bromuro de hexadeciltrimetilamonio 1 % por 10 minutos. Se seleccionaron de las colonias que presentaron actividad pectinasa positiva, lo que se evidenció por la presencia de un halo de hidrólisis, ver figura 14. El hongo denominado Articulospora proliferata presentó actividad enzimática pectinasa y destacó por sobre las demás debido a que: (1 ) es capaz de crecer entre 4 y 37 ^Q C, y (2) presentó los mayores halos de hidrólisis entre 10 y 30 ^Q C. Dicha levadura fue la que se seleccionó para futuras caracterizaciones en cuanto a la producción de enzimas pectinasas.

Ejemplo 2: Análisis de la actividad pectinasa de los extractos proteicos extracelulares obtenidos desde cultivos de Articulospora proliferata.

Articulospora proliferata fue crecida en dos medios de cultivo líquido: (1 ) cultivo control (glucosa 1 %, extracto de levadura 0.3%, extracto de malta 0.3% y peptona 0.5%) y (2) cultivo inducido (idéntico al anterior sólo que se reemplazó la glucosa 1 % por YM-pectina del ejemplo 1 , 1 %). Un cultivo de Articulospora proliferata en fase exponencial tardía de crecimiento (DO ₆ oonm= 15), se cosechó por centrifugación a 5.000g por 10 minutos y el sobrenadante fue filtrado a través de filtros de 0.45μιη (Millipore, Merck). Las proteínas presentes en estos sobrenadantes libres de células, fueron precipitadas con sulfato de amonio 80% y luego, sometidas a diálisis usando membranas de diálisis de 10kDa (Sigma Aldrich) y amortiguador Tris-HCI 20mM pH 7.0. Los extractos proteicos obtenidos desde el cultivo control y el cultivo inducido, fueron ensayados para actividad pectinasa utilizando el método del DNS, de modo que 50μΙ de extractos proteicos, se incubaron con 50μ! de YM-pectina, por una hora a 22 ^e C. Luego, se adicionó 10ΟμΙ de DNS, se incubaron las reacciones a 100 ³ C por 10min y entonces, fueron enfriadas en hielo por 5 minutos. Por último, la absorbancia de las muestras fue cuantificada a 540nm, estimándose la concentración de ácido galacturónico, utilizando la curva de calibración construida previamente, ver Figura 9. El extracto proteico obtenido desde el medio inductor presentó mayor actividad pectinasa en relación al cultivo control. Por lo tanto, este fue el medio que se utilizó para las siguientes etapas.

Ejemplo 3: Semi-purificación e identificación de la enzima pectinasa desde Articulospora proliferata.

Se creció Articulospora proliferata en el medio de cultivo inductor descrito anteriormente y se precipitaron las proteínas extracelulares totales utilizando diferentes porcentajes de sulfato de amonio (40, 60 y 80%). En estas condiciones, se produjo un enriquecimiento en ciertas proteínas en la fracción 60% y esto coincidió con la presencia de actividad enzimática de las muestras, ver Figura 1 . Debido a la menor cantidad de proteínas y a la presencia de actividad poligalacturonasa en esta fracción, esta muestra se empleó para las siguientes etapas. A continuación, mediante cromatografía de intercambio iónico se obtuvo la enzima suficientemente pura para los análisis de espectrometría de masas. Para esto, una columna cromatográfica de dietiletilaminoetil, DEAE-sephadex® (General Electrics) fue equilibrada con amortiguador Tris-HCI 20mM, pH 8.0 y se cargó 2ml de la fracción 60% en esta columna. Las proteínas fueron eluidas de la columna utilizando un gradiente de 0-1 M de cloruro de sodio. Se seleccionaron 141 fracciones y se evaluaron para actividad enzimática (método del DNS) y SDS-PAGE, ver tabla 1 . Los resultados obtenidos, mostraron que la pectinasa de interés es una proteína de aproximadamente 40kDa, ver Figura 2. Se cortó esta banda proteica desde el gel SDS-PAGE y se analizó mediante el servicio huella peptídica (Alphalyse), con el objetivo de determinar la secuencia aminoacídica completa de la proteína. Los resultados indican que la proteína identificada corresponde a una enzima con actividad poligalacturonasa. Sin embargo, no se logró obtener la secuencia aminoacídica completa sino sólo los siguientes fragmentos: VIFSGTTTFGYK y SGAVVQNQDDC.

Tabla 1 :

Actividad Actividad Actividad

FracciomAU enzimática FracciomAU enzimática FracciomAU enzimática nes (DO280nm) (DNS) nes (DO280nm) (DNS) nes (DO280nm) (DNS)

1 -2,63 0,085 48 9,82 1 ,627 95 5,04 0,096

2 -0,04 0,085 49 10,03 0,865 96 4,54 0,089

3 -0,07 0,085 50 10,12 0,682 97 4,08 0,096

4 -0,11 0,085 51 9,65 0,286 98 3,64 0,089

5 -0,13 0,085 52 8,83 0,292 99 3,31 0,096

6 -0,16 0,085 53 7,63 0,18 100 3,05 0,048

7 -0,19 0,085 54 6,72 0,154 101 4,89 0,05

8 -0,21 0,085 55 6,90 0,126 102 4,07 0,05

9 -0,22 0,085 56 8,54 0,1 1 103 3,89 0,052

10 -0,23 0,085 57 1 1 ,03 0,098 104 4,17 0,051

1 1 -0,25 0,085 58 12,54 0,089 105 4,50 0,058 -0,26 0,085 59 13,06 0,094 106 4,31 0,051

-0,26 0,085 60 13,73 0,098 107 3,58 0,053

-0,28 0,085 61 15,07 0,633 108 2,78 0,048

-0,30 0,085 62 17,32 0,102 109 2,19 0,05

-0,32 0,085 63 20,38 0,095 110 1,84 0,054

-0,32 0,085 64 24,06 0,099 111 1,64 0,051

-0,34 0,085 65 27,89 0,095 112 1,49 0,064

-0,35 0,085 66 31,38 0,109 113 1,37 0,15

-0,34 0,085 67 34,34 0,098 114 1,27 0,1

-0,36 0,085 68 36,68 0,102 115 1,18 0,093

-0,36 0,085 69 38,34 0,096 116 1,08 0,15

-0,37 0,085 70 39,30 0,094 117 1,00 0,051

-0,38 0,085 71 39,51 0,088 118 0,93 0,048

-0,38 0,085 72 39,21 0,098 119 0,87 0,05

-0,39 0,085 73 38,66 0,092 120 0,83 0,052

-0,39 0,085 74 37,44 0,097 121 0,85 0,055

-0,39 0,085 75 35,06 0,104 122 1,01 0,066

-0,39 0,085 76 32,04 0,092 123 1,23 0,059

-0,39 0,101 77 28,90 0,092 124 1,34 0,05

-0,40 0,089 78 25,94 0,093 125 1,23 0,05

-0,40 0,085 79 23,31 0,083 126 1,08 0,05

-0,39 0,092 80 21,00 0,105 127 0,99 0,05 34 -0,35 0,085 81 19,05 0,103 128 0,94 0,05

35 -0,18 0,088 82 17,28 0,089 129 0,81 0,05

36 0,12 0,101 83 15,56 0,094 130 0,63 0,05

37 0,52 0,097 84 13,90 0,089 131 0,49 0,05

38 1 ,43 0,1 13 85 12,43 0,096 132 0,41 0,05

39 2,14 0,27 86 1 1 ,30 0,089 133 0,36 0,05

40 4,94 1 ,771 87 10,52 0,096 134 0,31 0,05

41 15,53 2,508 88 9,98 0,089 135 0,29 0,05

42 17,47 2,449 89 9,31 0,06 136 0,28 0,05

43 14,71 2,344 90 8,40 0,06 137 0,27 0,05

44 13,20 2,519 91 7,54 0,06 138 0,30 0,05

45 12,26 2,303 92 6,78 0.050 139 0,40 0,05

46 1 1 ,20 2,201 93 6,1 1 0,05 140 0,55 0,05

47 10,19 1 ,683 94 5,58 0,04 141 0,67 0,05

Se secuenció, el genoma del hongo Articulospora proliferata con el fin de obtener la secuencia completa del gen y sus posibles variantes.

Ejemplo 4: Obtención de las secuencias de nucleotidos y amino ácidos de la enzima poligalacturonasa.

Para obtener las secuencias de nucleotidos y amino ácidos, se secuenció el genoma de Articulospora proliferata mediante un secuenciador Ilumina Hi- seq2000. Para esto, se obtuvo DNA genómico puro y de alta calidad desde dicho hongo, mediante el Kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega). Luego, 550μ9 del DNA obtenido fue sometido a secuenciación de genomas y el DNA fue fragmentado en diferentes tamaños mediante sonicación, generando dos librerías. La primera librería que se generó fue una tipo "Pair-end" con insertos de 180 pares de bases (pb) y la segunda, correspondió a una librería multiplexada con tamaños de inserto de 3 y 10 Kilobases. El uso de ambas librerías, permitió ensamblar el genoma de manera eficiente.

Se generaron así Scaffolds que contenían el genoma de dicho hongo, identificándose 1 1 .302 genes y se elaboró un modelo de genes para cada uno de ellos. Para validar este modelo de genes, se secuenció el transcriptoma de dicho hongo mediante RNA-seq. Para esto, se extrajo RNA desde cultivos de dicho hongo crecidos en dos condiciones experimentales: un cultivo control (glucosa 1 %, extracto de levadura 0,3%, extracto de malta 0,3% y peptona (0,5%) y un cultivo inducido (idéntico al anterior sólo que se reemplazó la glucosa por pectina 1 %).

Se colectaron por centrifugación (5,000g por 10min), los "pellet celulares" obtenidos desde cultivos en fase exponencial tardía de crecimiento (DO ₆ oonm= 15), crecidos en ambas condiciones (cultivo control y cultivo inducido). Estos cultivos fueron lavados con agua destilada, y posteriormente, el RNA desde cada condición fue extraído. Los RNAs obtenidos fueron sometidos a electroforesis, ver Figura 3 y determinación de su absorbancia a 260 y 280nm, respectivamente, ver Tabla 2.

Tabla 2 Razones A260/A280 > 1 ,8 para las muestras de RNAs extraídas, concentración de los RNAs purificados y cantidad de RNA total.

Los RNAs que presentaron la menor degradación (ver Figura 3, carril D) y razones de absorbancia 260/280 mayores a 1 ,8, se sometieron a RNA-seq. Se determinó, la degradación de los RNAs, y posteriormente, los que presentaron menor degradación se usaron para generar una librería de cDNAs. Esta librería fue secuenciada completamente a través de un secuenciador Ilumina Hi- seq2000. Mediante esta metodología, se identificó el mRNA y por ende, la poligalacturonasa que se expresa en la condición del cultivo inducido y en la condición del cultivo control.

Con esta información, se analizó el proteoma de dicho hongo mediante la herramienta blastp (NCBI) con el objetivo de identificar la posible enzima con actividad poligalacturonasa expresada. Este análisis arrojó la presencia de la enzima con actividad de poligalacturonasas en el genoma secuenciado, la que previamente fue identificada mediante espectrometría masas. Se realizó un alineamiento entre las secuencias amino ácidos de los péptidos obtenidos mediante esa aproximación y las secuencias amino ácidos de las poligalacturonasas identificadas en el genoma, ver Figura 12.

De esta forma, se logró identificar la secuencia aminoacídica completa de la enzima con actividad poligalacturonasa, la que se indica como SEQ ID No.:1 en el listado de secuencias, y en la Figura 4, se representa gráficamente la secuencia aminoacídica completa de 369 aminoácidos. Con estos resultados, se puede concluir que la enzima encontrada corresponde a la enzima que se estaba buscando.

Luego, a partir de la información derivada del RNA-seq, se buscó la secuencia nucleotídica completa del cDNA que codifica para dicha enzima con actividad poligalacturonasa madura (sin señal de exportación), SEQ ID.: 5 del listado de secuencias, utilizando el programa Geneious (Biomatters). En paralelo, se elaboró un modelo de genes final para el gen que codifica para esta enzima, ver figura N ^Q 5.

Ejemplo 5: Clonamiento del gen que codifica para la poligalacturonasa. La secuencia nucleotídica de 1 066pb, SEQ ID NO.:4, que codifica para la enzima con actividad poligalacturonasa de la invención, se sintetizó químicamente mediante la síntesis de oligonucleótidos de Genescript. Para esto, se diseñó el cDNA maduro que codifica dicha enzima, eliminando de la secuencia original, los primeros 57 nucleótidos, luego, optimizando la secuencia del cDNA que codificaría para dicha enzima con actividad poligalacturonasa, al cambiar el uso de codones nativo por el uso de los codones de la levadura Pichia pastoris, en la que se iba a expresar posteriormente, la presente enzima con actividad poligalacturonasa.

También, se adicionó a este fragmento de DNA (pect2), dos sitios de corte para dos enzimas de restricción. En el extremo 5', se adicionó un primer sitio de corte para la enzima de restricción Mlyl, la secuencia nucleotídica GAGTCCATAG, la cual corresponde a un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mlyl. Mientras que en el extremo 3', se adicionó un segundo sitio de corte para la enzima de restricción Kpnl, la secuencia nucleotídica GGTACC, la cual corresponde al sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Kpnl.

De esta forma, la secuencia nucleotídica que se sintetizó es la secuencia SEQ ID No.:4, un cDNA de 1066 pares de bases que codifica para la enzima con actividad poligalacturonasa original pero que es capaz de ser expresado cuando es clonado en un vector de expresión apropiado en la levadura Pichia pastoris. El fragmento pect resultante fue clonado en el vector de clonamiento pUC57, por Genscript. El plasmidio pUC57-pect2 resultante fue transformado posteriormente en células electrocompetentes de la bacteria E. coli DH5a mediante electroporación de acuerdo a protocolos previamente publicados (Sammbrook y Rusell, 2002).

Se seleccionaron clones transformantes en placas LB-agar (triptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, cloruro de sodio 0.5% y agar 1 .5%) suplementadas con 100 g/ml, según su resistencia a ampicilina, lo que se confirmó mediante PCR. Posteriormente, se obtuvo DNA plasmidial desde cultivos líquidos del clon transformante número 4 mediante el kit GeneJet plasmid Miniprep (Thermoscientific), el que fue digerido posteriormente con las enzimas de restricción Mlyl y Kpnl (Thermoscientific) de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y de esta forma, se visualizó los fragmentos obtenidos mediante geles de agarosa (amortiguador TAE 1 %, agarosa 1 % y Safe view nuclei acid stain 1 X), ver Figura 1 .

El fragmento de DNA de 1050pb (pect) fue purificado desde geles mediante el método del genclean (Sambrook J y Rusell DW. 2001 . Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En paralelo, se digirió el vector de expresión ppinka-HC (Invitrogen) para levaduras con las enzimas de restricción Stul y Kpnl (Themoscientific) de acuerdo a especificaciones del fabricante. Luego, se ligó el fragmento pect al vector ppinka-HC, digerido a través de la enzima T4 DNA ligasa (Thermoscientific), empleando las especificaciones del fabricante. Células competentes de la bacteria E. coli TopW (Invitrogen) fueron transformadas mediante electroporación de acuerdo a las especificaciones del proveedor, con el vector ppinkaHC-pect obtenido según se describió anteriormente.

Se seleccionaron clones transformantes, en placas LB-agar (triptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, cloruro de sodio 0.5% y agar 1 .5%) según su capacidad para crecer en un medio de cultivo suplementado con ampicilina. Los resultados fueron confirmados a través de PCR utilizando como molde, DNA genómico obtenido de estos clones transformantes y verificados mediante reacciones de PCR utilizando los partidores Pectfwd (5 ^' - GCACCTACAGTCTCATCATTG-3 ^' ) y Pectrev (5 ^' -

GCAGGAAGCAGGGGATGGGAA-3 ^' ), los que hibridan con la secuencia nucleotídica pect. En las reacciones de PCR se usó la enzima Taq DNA polimerasa (Thermoscientific), de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Ejemplo 6: Obtención de cepas transformantes de la levadura Pichia pastoris.

A los 4 clones seleccionados, se les extrajo DNA plasmidial mediante el kit GeneJet Plasmid Miniprep (Thermoscientific). Luego, 10μο del DNA plasmidial (200μΙ) obtenido fue digerido a 37 ^Q C por 3 horas con la enzima de restricción Aflll (Thermoscientific), siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. El vector linearizado (ppinkaHC-pect), se purificó desde la solución de digestión mediante la adición de 20μ! de acetato de sodio 3 y 500μΙ de etanol 100%. Luego, la solución se centrifugó a 14.000g por 10 minutos para colectar el DNA, el que luego fue lavado con 400μΙ de etanol 80%, y se dejó secar a temperatura ambiente para después ser suspendido en 10μ! de agua estéril. Finalmente, el fragmento DNA a transformar fue dializado con agua utilizando unas membranas VSWP de tamaño de poro 0,025μϊϊΐ (Millipore, Merck) de modo de eliminar las sales presentes en la solución.

En forma separada, se prepararon células electrocompetentes de la levadura Pichia pastoris, cepa Pichiapink strain 1 lnvitrogen). Para ello, se sembró con una asa estéril, un cultivo de la cepa Pichiapink strain 1 sobre una placa YPD (glucosa 2%, extracto de levadura 1 %, peptona 2% y agar 2%), y se incubó a 30 ^a C por 3 días. Luego, con una de las colonias, se inoculó un matraz de 125ml que contenía 10ml de medio líquido YPD. Finalizado el período de incubación, se inoculó con este cultivo un matraz de 1 L que contenía en su interior 10Qmi de medio líquido YPD (DO600= 0.2). Este cultivo se creció por un día a 30 ^Q C, monitoreándose la densidad óptica hasta alcanzar una DO800 entre 1 .3 y 1 .5. Luego, las células se centrifugaron a 1 ,500g a 4 ^S C por 5 minutos y entonces, dichas células se suspendieron en 250ml de agua helada estéril para volverlas a centrifugar a 1 ,500g a 4 ^e C por 5 minutos, pero antes suspendíéndolas en 50ml de agua helada estéril. Dichas células se centrifugaron nuevamente y se suspendieron en 10mí de sorbitol 1 M helado, y una vez más, se centrifugaron y suspendieron en 300μΙ de sorbitol 1 M.

Dichas células se emplearon el mismo día para ser transformadas con el fragmento DNA linearizado (ppinkaHC-pect) obtenido en la etapa anterior. Para ello, se mezclaron en una cubeta de electroporación de 0.2cm, 80μΙ de las células eíectrocompetentes de la cepa Pichiapink sírain 1 obtenida en la etapa anterior con los 10μΙ de dicho fragmento de DNA linearizado. La mezcla se incubó en hielo por 5 minutos y entonces, se dio un pulso eléctrico (200V, 25μF, 200Ω) en un electroporador GenePulserXcell (Biorad). Inmediatamente después del pulso, se adicionó a la cubeta, 1 ml de medio líquido frío YPDS (glucosa 2%, extracto de levadura 1 %, sorbitol 18.2% y pepona 2%) y se incubó dichas células eíectrocompetentes a 30 ^e C por 2 horas. Después de la incubación, se sembraron 300μΙ de la mezcla en un medio selectivo (infusión de papás 20%, glucosa 2% y agar 1 .5%) y se incubó a 30 ^Q C por 10 días.

Además la cepa parental, Pichiapink sírain 1 que presenta una coloración rojiza que la diferencia de las colonias transformantes que adquieren un color blanco, lo que se usó como primer método de selección, y permitió aislar 4 colonias blancas transformantes, las que se volvieron a sembrar en placas PDA, ver figura 1 1 .

Luego, se extrajo el DNA genómico de dichos clones, utilizando el kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) según las especificaciones del fabricante. Dicho DNA genómico se usa entonces como molde para realizar reacciones de PCR siguiendo los mismos pasos de las reacciones PCR descritas antes, en donde se chequeó la presencia del fragmento de DNA (pect) que codifica para la poligalacturonasa. Estas reacciones se realizaron con los partidores Pectfwd (5 ^' -GCACCTACAGTCTCATCATTG-3 ^' ) y Pectrev (5 ^' - GCAGGAAGCAGGGGATGGGAA-3 ^' ) que son complementarios al fragmento de DNA pect.

Ejemplo 7: Expresión de la enzima poligalacturonasa en la levadura pichia pastorís.

Una colonia de cada uno de los 4 clones anteriores, se creció en 10ml de medio BMGY (extracto de levadura 1 %, peptona 2%, amortiguador fosfato de potasio 100mM pH 6.0, YNB 1 .34%, biotina 0,0004% y glicerol 1 %), por un día a 30 ^Q C y 300rpm. Luego, las células de Pichia pastorís fueron colectadas por centrifugación a 1 ,500g por 5 minutos, y se suspendieron en medio BMMY (composición idéntica al medio BMGY, solo se reemplazó el glicerol por metanol al 0.5%). Los cultivos se crecieron por 24 horas a 30 ^Q C y entonces, se cosecharon dichas células y se analizó la composición de proteínas del sobrenadante mediante SDS-PAGE.

Los "pellet" celulares de Pichia pastorís obtenidos fueron lisados utilizando una solución de ruptura (fosfato de sodio 50mM pH 7.4, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM y glicerol 5%) y vortex. Esta fracción de proteínas intracelulares y el sobrenadante libre de células de cada clon fueron separadas mediante SDS- PAGE y visualizados a través de tinción de plata.

Con este análisis, se determinó el clon que expresó la mayor concentración de la proteína recombinante al medio extracelular, ver Figura 6. Como se observa en la Figura 6, el clon número 1 presenta una mayor intensidad de una banda de proteína en relación a los clones 2, 3 y 4. Es por esta razón que se eligió este clon como la cepa recombinante para la purificación de la enzima. Por lo tanto, los ensayos posteriores se realizaron con este clon No.1

Ejemplo 8: Purificación de la enzima poligalacturonasa.

Se obtuvo 1 litro de sobrenadante de cultivo a partir del clon número 1 , el cual mejor expresa la presente enzima con actividad poligalacturonasa, utilizando condiciones de crecimiento idénticas al ejemplo anterior. Luego, este sobrenadante fue filtrado a través de filtros de 0,45μηΊ (Millipore, Merck) con e! objetivo de eliminar cualquier resto celular. Posteriormente, se precipitaron las proteínas presentes en este sobrenadante libre de células, utilizando distintos cortes de sulfato de amonio (20, 40, 60 y 80%). Cada una de las fracciones de proteínas se sometió a diálisis contra un amortiguador Tris-HCI 20mM utilizando bolsas de diálisis de 10kDa de tamaño de poro (Sigma Aldrich). Luego, se cuantificó el contenido proteico mediante el Kit BCA (Thermo Scientiíic) y se determinó la actividad enzimática mediante el ensayo del DNS. Se determinó que la fracción 80% presentó los mayores niveles de actividad enzimática.

A continuación las proteínas presentes en esta fracción fueron separadas mediante cromatografía de intercambio aniónico DEAE sephadex (General Electrics) en un sistema de purificación AKTA prime (General Electrics). Para esto, la columna fue equilibrada con una solución amortiguadora 20m Tris- HCI pH 8.0 y la elución de las proteínas se realizó a través de un gradiente lineal de NaCI (0.1 M). Cada fracción fue monitoreada a 280nm para evaluar el contenido proteico. Las fracciones que presentaron absorbancia a 280nm fueron analizadas para actividad enzimática mediante el método del DNS, ver tabla 1

De esta forma, se logró identificar las fracciones que contenían la enzima con actividad poligalacturonasa. Las fracciones positivas fueron concentradas mediante sistemas de centrifugación Amicons de 10kDa (Millipore, Merck) y las proteínas resultantes fueron separadas, a través de filtración en gel. Para esto, una columna Superdex 75 10/300GL (General Electrics) fue equilibrada con un amortiguador fosfato 50mM, NaCI 0.15M, pH 7.0 y luego, se cargaron 500μΙ del extracto de proteínas a separar. Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas espectrofotométricamente a 280nm y cada fracción que presentó proteínas, fue evaluada para actividad enzimática. De esta forma, se logró obtener la enzima con actividad poiigalacturonasa purificada con un nivel de pureza sobre e! 95%, ver Figura 7,

Ejemplo 9: Evaluación de la enzima poiigalacturonasa en condiciones de laboratorio y semi-industriales.

Para evaluar la eficiencia de la presente enzima en condiciones de laboratorio y semi- industriales. Primero, 300μΙ de una solución de pectina comercial 10mg/ml, la misma pectina comercial de los ejemplos anteriores, se mezcló con 300μΙ de una solución 0.25mg/ml de la presente enzima poiigalacturonasa purificada o con 300μΙ de una solución 0.25mg/ml de una enzima poiigalacturonasa comercial (Lafazym®, Laffort) Los ensayos fueron incubados por una hora a 37- ^? C y luego, las soluciones se ensayaron para la actividad enzimática poiigalacturonasa mediante el método del DNS.

En paralelo, se realizó el mismo ensayo de actividad enzimática descrito en el párrafo anterior pero imitando condiciones industriales. Para esto, se incubaron 300μΙ de mosto de vino blanco de Viña del Aromo (pH 3.0) con 300μΙ de una solución 0.25mg/ml de la presente poiigalacturonasa purificada o con 300μΙ de una solución 0,25mg/ml de una enzima poiigalacturonasa comercial (Lafazym®, Laffort). Los ensayos fueron incubados por una hora a 15 ^e C y luego, las soluciones se ensayaron para la actividad enzimática poiigalacturonasa mediante el método del DNS.

Como se observa en la ver Figura 8A, la presente enzima poiigalacturonasa libera aproximadamente el doble de ácido galacturónico, en comparación a la enzima poiigalacturonasa comercial (Lafazym®, Laffort) ensayada.

Estos resultados se confirmaron ai ensayar ambas enzimas en condiciones semi- industriales, empleando mosto de vino blanco como sustrato e incubando la reacción enzimática a 15 ⁹ C y 5 ^Q C, ver Figuras 8B y 15.

Los resultados obtenidos se incluyen en las Tablas 3 y 4 siguientes que muestran la actividad pectinasa cuantificada a través del método del DNS en condiciones de laboratorio y semi-industriales. Tabla 3: Resultados de los ensayos de actividad enzimática poligalacturonasa en condiciones de laboratorio realizados por una hora a 37 ^e C sobre pectina comercial (Sigma-Aldrich)

Concentraμιτιοΐββ Actividad ción ácido ácido Enzima específica

DO540nm galacturógalactuagregada ^moles/mg

Enzima (DNS) nico (Mg/μΙ)* rónico** (mg) enzima)

Enzima

commercial

(Lafazym®,

0,21

Laffort) 0,204 0,41 0,0125 16,8

Enzima con

actividad

poligalacturonasa de

la presente

invención 0,533 0,94 0,48 0,0125 38,4

Tabla 4: Resultados de los ensayos de actividad enzimática poligalacturonasa en condiciones semi-industriales, realizados a 15 ^e C sobre pectina comercial (Sigma- Aldrich) por una hora sobre mosto de vino blanco

Concentración μιτιοΐθβ Actividad ácido ácido Enzima específica

DO540nm galacturónico galactuagregada ^moles/mg

Enzima (DNS) (Mg μΙΓ rónico** (mg) enzima)

Enzima

commercial

(Lafazym®,

Laffort) 0, 151 0,32 0,16 0,0125 12,8 enzima con

actividad

Poligalac- turonasa de

la presente

invención 0,338 0,62 0,32 0,0125 25,6

La tabla 5 resume los resultados de los ensayos de actividad pectinasa evaluados mediante el método del DNS utilizando una pectina comercial (Pectin from citrus peel, Sigma Aldrich). Se incubó tanto la poligalacturonasa antártica como la enzima comercial (Lafazym®, Laffort) con una solución de dicha pectina comercial (10mg/ml) a pH 3.0 por una hora y dos horas a 5 ^e C. Posteriormente, 100μΙ de la reacción enzirnática fue ensayada para actividad enzimática (en cada punto), mediante el método del DNS. En esta tabla se observa el ácido galacturónico liberado por ambas enzimas, siendo el liberado por la enzima poligalacturonasa de la invención el doble que el de la enzima comercial.

Tabla 5: Resultados de los ensayos de actividad enzimática poligalacturonasa en condiciones semi-industriales, realizados a 5 ^e C sobre pectina comercial (Sigma- Aldrich) por una hora sobre mosto de vino blanco

1 hora 2 horas

Concentrad

ón

galacturonat Concentración

Enzimas DNS 0 DNS galacturonato

Poligalacturona

sa de la 0,24 0,47 0,283 0,54 invención

Lafazym 0,1 3 0,28 0,144 0,31

Ejemplo 10: Evaluación de la enzima poligalacturonasa en jugo de frutas

Para evaluar la eficiencia de la presente enzima en jugo de frutas, se adquirió un jugo comercial de pulpa de Ciruela (Marca AFE). Se escogió este jugo para realizar los ensayos de actividad poligalacturonasa, debido a su bajo pH (alrededor de 3,0) y a su alto contenido en pectina. Primero, 100μΙ de jugo de pulpa de ciruela (Marca AFE) se mezcló con 100μΙ de una solución 0,25mg/ml de la presente enzima poligalacturonasa purificada o con 100μΙ de una solución amortiguadora Tris-HCI 20mM, pH 8,0. Los ensayos fueron incubados por una hora a 5 ^e C y luego, se determinó la concentración de ácido gaiacturónico (por la acción de la poligalacturonasa) mediante el kit comercial D-glucuronic assay kit (Megazyme).