技术领域

本发明属于蛋白质技术领域， 具体而言,本发明提供了猪干扰素蛋白， 其单 独或者组合用于动物体内可以有效降低其受猪 繁殖与呼吸综合症病毒感染的死 亡率。 背景技术

猪繁殖与呼吸综合症 (porcine reproductive and respiratory syndrome, 简称为 PRRS)又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病� ��（PRRS virus,简称为 PRRSV) 引起的高度接触性传染病， 其以妊娠母猪的繁殖障碍（如， 流产、 死胎、 木乃伊 胎等）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病 为特征，其危害已几乎遍极世界所 有养猪国家。 早期的 PPRSV主要是欧洲型 （如， Lelystad毒株） 和美洲型 （如， VR-2332毒株）， 尤其是近几年 PRRS高致病性变异毒株（如， 江西 A1株， 简称为 JXA1 毒株）在中国的暴发流行， 具有高发病率、 高死亡率和低治愈率的流行特 点， 使养猪业面临着巨大的疫病风险。

对于猪繁殖与呼吸综合症，当前主要是采用弱 毒疫苗和灭活疫苗进行预防和 治疗。然而， 弱毒疫苗的毒株可以在猪群体中传播， 导致未免疫的猪出现繁殖障 碍等蓝耳病症状； 现有报告说明， 至今国内外已研究制备的多种灭活疫苗， 对免 疫猪的保护效果很低， 尤其是本发明人发现， 对于近年来出现的 PRRS高致病性 变异毒株 （如， JXA1 毒株）， 灭活疫苗虽能在一定程度上减轻 PRRS的症状， 但 是却无法有效地降低感染该病的猪的死亡率。

另外， 尽管有报道表明干扰素 alpha足以完全保护口蹄疫病毒（FMDV)攻毒 的猪， 但是对于被 PRRS V攻毒的猪， 仅仅能延缓 PRRSV复制并只能减轻猪的症 状 （如肺损伤）， 而且该报道明确认定： 不能下结论认为干扰素 alpha对适应性免 疫应答起作用 （参见 Brockmeier, SL,等. Adenovinis-Mediated Expression of Interferon-a Delays Viral Replication and Reduces Disease Signs in Swine Challenged with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. VIRAL IMMUNOLOGY, 22(3): 173-180 ) ₀ Charerntantanakul, W.的综述 （Adjuvants for porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines. Veterinary Immunology and Immunopathology, 129: 1-13 )详细列举了干扰素 alpha禾口 gamma作 为佐剂治疗和预防 PRRS的实验结果； 尽管某些动物实验上认为干扰素 alpha (尤 其是干扰素 alpha的 DNA疫苗） 可以增加针对 PRRSV的应答， 但是另外一些动物 实验 （采用更高剂量的干扰素 alpha的 DNA疫苗） 的结果却又不能相对于对照显 著增加针对 PRRSV的应答； 而干扰素 gamma无法增强 PRRSV DNA疫苗的细胞介 导的免疫。 干扰素对 PRRSV的效果是如此的莫衷一是， 表明疫苗在动物体内的 抗病毒机制并非理论上所想象的那样， 无法帮助研究人员预料干扰素对感染 PRRSV的猪的切实疗效， 甚至使得研究人员受困于这些含糊的结果。

Sang, Y等 (Differential expression and activity of the porcine type I interferon family. Physiol Genomics, 42: 248-258) 详细报道了猪 I型干扰素的种类， 但是其 体外实验结果仍然无法帮助研究人员预料干扰 素对感染 PRRSV的猪的实际疗 效， 并进一步使得研究人员受困于甚至相反的结果 。 例如， 体外实验表明， 干扰 素 beta和大多数的干扰素 delta和 omega对猪肺泡巨噬细胞以一定的抗 PPRRSV的 保护作用， 但是对于对 PRRSV敏感的非洲绿猴肾细胞 （本文简称为 MARK-145, 在 Sang, Y等的论文中简称为 MARC-145 ) 来说， 它们却没有保护作用。 Sang, Y 等的论文没有提供体内实验结果，无法用于解 除上述困惑； 但其部分体外实验表 明， 大多数受试的干扰素 alpha都是体外高抗 PRRSV活性的， 而所有受试的干扰 素 delta和 omega以及其他一些干扰素都是体外低抗 PRRSV活性的（当然对于非洲 绿猴肾细胞来说， 都是几乎没有抗 PRRSV活性的）。

本发明人克服了现有技术的困扰， 尤其在现有技术认定的体外高抗 PRRSV 活性的干扰素 alpha无法有效降低 PRRSV感染的猪的死亡率的失败试验下， 没有 根据现有技术的启示而放弃， 令人意外地从体外低抗甚至不抗 PRRSV的干扰素 中发现了能够降低 PRRSV感染的猪的死亡率的干扰素， 从而能够切实有效地治 疗或预防 PRRS。 另外， 本发明人还偶然获得了新的猪干扰素。 发明内容

即使药物能够延缓或减轻 PRRS的症状， 但是如果不能降低 PRRSV感染的猪 的死亡率的话， 则该药物对于避免或减轻 PRRSV对养猪业的威胁的实际意义并 不大， 甚至没有。 因此， 本发明要解决的技术问题是利用猪干扰素来有 效预防或 治疗 PRRS，不但能延缓或减轻 PRRS的症状，更需要能够降低 PRRSV感染的猪的 死亡率。

具体而言， 在第一方面， 本发明提供了猪干扰素蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.7或 SEQ ID N0.9所示。 这些猪干扰素蛋白是新发现的猪干扰素蛋白， 在 不受现有技术以及失败的干扰素抗 PRRSV动物实验的困扰下， 它们具有抗 PRRSV的潜力。

本发明还提供了本发明第一方面的猪干扰素蛋 白的编码基因，优选所述基因 的核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.8或 SEQ ID NO.10所示。 在第二方面，本发明提供了氨基酸序列如 SEQ ID N0.1所示的猪干扰素蛋白 或其编码基因在制备用于预防或治疗猪繁殖与 呼吸综合症并能降低受猪繁殖与 呼吸综合症病毒感染的猪的死亡率的药物组合 物中的应用方法。

相应地， 本发明提供了降低受猪繁殖与呼吸综合症病毒 感染的猪的死亡率的 方法，其包括向有需要的猪施用有效量的药物 组合物，其中所述药物组合物包含 氨基酸序列如 SEQ ID N0.1所示的猪干扰素蛋白或其编码基因。

由于兽用药物的安全性等标准与人用药物的有 一定区别， 因此在本文中， 如 未加说明， 药学和药物等术语分别指兽药学和兽用药物， 其中兽优选指猪， 如有 需要的猪，包括已经有 PRRS症状的猪，正处在或者流行病研究预计将� � PRRSV 爆发疫区的猪， 以及计划免疫的猪。 当前对于高致病性 PRRSV (如， 江西 A1 株）所导致的 PRRS还没有有效的灭火疫苗能够降低猪的死亡� �， 而使用弱毒疫 苗又存在变异扩散的风险， 因此本发明优选用于针对高致病性 PRRSV, 如江西 A1株。

在本文中， 死亡率可以通过动物试验进行测量。 优选本发明第二方面的方法 能够降低猪死亡率 20%以上， 更优选降低 30%以上， 在本发明的具体实施方式 中， 可以降低猪死亡率约 40%。 在本发明第二方面的方法中， 可以提供猪干扰素蛋白， 也可以提供猪干扰素 蛋白的编码基因， 或是提供这两者的混合物。 根据 《分子克隆实验指南》 （第三 版） （科学出版社， 2002) 等教课书和实验手册， 本领域技术人员熟知通过蛋白 质的氨基酸序列推导出其编码基因，并利用重 组 DNA技术等制备相应的蛋白质。 优选在本发明第二方面的方法中，提供猪干扰 素蛋白编码基因， 即所述猪干扰素 蛋白或其编码基因是猪干扰素蛋白编码基因， 更优选其中，所述猪干扰素蛋白编 码基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2所示。

在本发明第二方面的方法中， 尽管可以提供游离的猪干扰素蛋白编码基因， 但是优选以表达载体或者宿主细胞的形式提供 猪干扰素蛋白编码基因，并通过施 用表达载体或者宿主细胞的方式来施用猪干扰 素蛋白编码基因； 即，提供的是载 体或者细胞，其中克隆入猪干扰素蛋白编码基 因， 而且所述载体或者细胞能够表 达猪干扰素蛋白编码基因。 根据重组 DNA技术等， 本领域技术人员能够熟练实 施这些克隆和表达技术。

提供的表达载体可以是原核表达载体， 但在本发明中优选是真核表达载体； 即，优选在本发明第二方面的方法中，所述猪 干扰素蛋白编码基因是以真核表达 载体提供的。在本文中， 真核表达载体具有本领域技术人员所熟知的含 义， 通常 指的是具有真核启动子的 DNA表达载体， 如真核表达质粒， 为了克隆的方便， 其往往还包括原核复制子以及原核抗性基因等 。当前， 已经有许多成熟的真核表 达载体能够通过商业渠道获得， 如 Invitrogen公司的 pcDNA™ 4系列真核表达质 粒， 其在带有 SV40复制子和 CMV启动子的同时带有 pUC ori复制子和 amp抗性基 因。 在本发明的具体实施方式中， 真核表达载体就采用的是特定的 pcDNA 4表达 载体， 并且直接施用包含猪干扰素蛋白编码基因的 pcDNA 4表达载体。

提供的宿主细胞通常是活的但对动物体无害的 细胞， 从而可以使得其中的猪 干扰素蛋白编码基因复制和表达， 并能安全地施用。 宿主细胞可以是原核细胞， 也可以是真核细胞。优选在本发明第二方面的 方法中，所述猪干扰素蛋白编码基 因是以活的弱毒¾霍乱沙门氏菌提供的，即活� ��弱毒猪霍乱沙门氏萌包含猪干扰 素蛋白编码基因并能使其表达。当前， 已经有多种弱毒猪霍乱沙门氏蘭表达体系 可供使 如复旦学报 (自然科学版 ),2005,44(4):484-4888所述的。 通常， 干扰素 蛋白编码基因克隆在表达载体上然后转化入宿 主细胞。因此， 更优选在本发明第 二方面的方法中，所述弱毒的猪霍乱沙 Π氏 i包含以真核表达载体提供的猪干扰 素蛋白编码基因。在本发明的具体实施方式中 ，所述弱毒的猪霍乱沙门氏菌包含 以 pcDNA 4表达载体提供的猪干扰素蛋白编码基因， 并且直接施用该猪霍乱沙 门氏菌。

猪干扰素蛋白编码基因可以是单独作为药物组 合物的有效成分的， 也可以和 其他抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的物质一起作 为药物组合物的有效成分。根据本 发明的具体实施方式， 单独施用猪干扰素蛋白编码基因， 如单独施用包含猪干扰 素蛋白编码基因的 pcDNA 4表达载体，可以有效地即时治疗 PRRSV对猪的感染， 降低死亡率。

在本文中， 抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的物质指的是在理 论上或实践中能够 延缓或减轻 PRRS的症状的物质，而无论其能否降低 PRRSV感染的猪的死亡率。 优选在本发明第二方面的方法中，猪干扰素蛋 白编码基因和猪繁殖与呼吸综合症 病毒灭活疫苗一起作为药物组合物的有效成分 。根据本发明的具体实施方式，这 一联合施用， 可以有效地预防四周后 PRRSV对猪的感染， 使原猪繁殖与呼吸综 合症病毒灭活疫苗无法降低死亡率的局限得以 突破， 降低了死亡率。 在第三方面， 本发明提供了降低受猪繁殖与呼吸综合症病毒 感染的猪的死亡 率的药物组合物， 其包含氨基酸序列如 SEQ ID NO. l所示的猪干扰素蛋白或其 编码基因和药学上可接受的载体，并任选包含 其他抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的 物质， 优选所述物质是猪繁殖与呼吸综合症病毒灭活 疫苗。

药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体 、 赋形剂、 稀释剂等， 它们与 有效成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备 药物组合物对本领域普通技术人员 来说是公知的。 本发明的药物组合物将活性成分和药学上可接 受的辅剂 (如本领 域普通技术人员所熟知的载体、 赋形剂、 稀释剂等)组合在一起， 配制成各种制 齐 U， 优选为注射用制剂， 从而适合各种施用方式， 例如肌肉、 静脉内或皮下注射 等给药形式。 预防或治疗的有效量通常由兽医根据猪的状况 （如， 品种、 体重、 症状出现时间等）、 疫病严重程度以及制剂形式等来确定， 也可以参考本发明具 体实施方式的施用量。

优选本发明第三方面的药物组合物中，所述猪 干扰素蛋白或其编码基因是猪 干扰素蛋白编码基因， 优选所述猪干扰素蛋白编码基因的核苷酸序列 如 SEQ ID N0.2所示。

也优选本发明第三方面的药物组合物中，所述 猪干扰素蛋白编码基因是以真 核表达载体提供的， 更优选其中所述真核表达载体是 pcDNA 4表达载体。

另外优选本发明第三方面的药物组合物中，所 述猪干扰素蛋白编码基因是以 活的弱毒猪霍乱沙门氏菌提供的，更优选所述 弱毒的猪霍乱沙门氏菌包含以真核 表达载体提供的猪干扰素蛋白编码基因。 为了便于理解， 以下将通过具体实施例对本发明进行描述。需 要特别指出的 是， 这些描述仅仅是示例性的描述， 并不构成对本发明范围的限制。 另外， 本发 明引用了现有文献， 它们全部纳入本文参考， 就好像它们在本文中全部重复叙述 过一样。 具体实施方式

以下结合具体的实施例进行说明， 其中试剂以及样品均可通过商业渠道获 得， 实验步骤如有未尽之处， 均可参见《分子克隆实验指南》（第三版）（ 科学出 版社， 2002)等教课书和实验手册， 并可以按照商业化的酶、 试剂盒的厂商说明 来进行。 实施例 1 猪干扰素基因的克隆

委托复旦大学复旦大学生命学院遗传工程国家 重点实验室根据我们的方案 从家猪肝脏样品并抽提其基因组， 通过 PCR方法获得各种猪干扰素完整基因， 分别插入原核克隆载体 pMD-19T(TaKaRa公司产品)中，并转化大肠杆菌 DH5-a， 经测序， 共发现其编码的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2、 4、 6、 8和 10所示， 分 别编码氨基酸序列如 SEQ ID NO.1、 3、 5、 7和 9所示的猪干扰素。

将插入 SEQ ID N0.2多核苷酸的 pMD-19T以分别带有 « /和 ^ge /酶切位 点的正向弓 I物 ( CGACTGGTACCATGGCCCACATCTATAAGC ) 禾口反向弓 I物 (CGACTACCGGTTATAAGGGAAAGACACAC)进行 PCR扩增之后， 以 Kpn I 和 I双酶切， 然后插入同样经双酶切的表达载体 pcDNA 4/TO/myc-His A (购 自 Invitrogen公司） ，连接并转化大肠杆菌， 抽提获得的阳性质粒命名为 p-IFN。 以 LB培养液为发酵液， 37°C培养过夜并收集上述转化了 p-IFN菌体， 以碱裂解 法大规模抽提质粒 DNA。 将得到的质粒与聚氮丙啶 （polyethylenimine (PEI)， 可购自 Poly sciences公司）以 lmg: 3mg的比例混合溶于生理盐水， 并用生理盐 水稀释配成质粒浓度为 lmg /ml的溶液， 通过 0.22μιη滤膜去除不溶物， 即可获 得实施例 3动物实验中第 4组所用的药物。

根据刘明秋等 （以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗 0 型口歸疫病毒重组活菌 苗在 家兔体 内 免疫应答 的 初步研究 . 复旦 学报（ 自 然科学 版;) ,2005,44(4；):484-4888 ) 所述的方法， 将 p-IFN 质粒转化猪沙门氏菌弱毒株 ( C500), 经鉴定后将所得阳性活菌株命名为 scho-p-IFN。 将 scho-p-IFN以 LB 培养液为发酵液， 37°C培养过夜并收集菌体。 经梯度稀释， 菌落计数后， 将菌体 用生理盐水配置成 10 ⁹ (个活菌 yml的浓度， 即可获得实施例 3动物实验中第 1组 所用的佐剂。

重复以上方法，只是将 SEQ ID N0.2换成干扰素 -alphal2 (其核苷酸序列序 列如 Genbank登录号 DQ249003号所示），插入表达载体 pcDNA 4/TO/myc-His A, 并将抽提获得的阳性质粒（被命名为 alpha-IFN)转化猪沙门氏菌弱毒株（C500)， 经鉴定后将所得阳性活菌株命名为 scho-alpha-IFN, 发酵后将菌体用生理盐水配 置成 10 ⁹ (个活菌 )/ml的浓度， 即可获得实施例 3动物实验中第 2组所用的佐剂， 作为对照。 实施例 2干扰素的细胞学检测

取实施例 1制备的 p-IFN质粒和 alpha-IFN质粒转染非洲绿猴肾细胞系 （简 称为 MARK-145， 其对 PRRSV敏感）来观察对 PRRSV的保护状况,期间以不加 入质粒的样品作为对照。过程简而言之为，先 将 MARK-145细胞铺于 96孔板上， 培养 24小时至每孔细胞长满孔的 80%左右后，分别将 p-IFN和 alpha-IFN以 0.5ng/ 孔的量用脂质体 lipofactamin2000转染入 MARK-145细胞， 转染 24小时后， 分 别将梯度稀释 (1~10 ⁴ TCID _5Q )的 PRRSV加入已转染的细胞板上进行病毒感染，然 后培养 7天， 观察并计算对 PRRSV的保护效率。 根据观察的保护情况， 确定了 以上构建的重组质粒都可以表达活性的干扰素 蛋白。 实施例 3抗 PRRSV的动物实验

攻毒所用毒株为猪高致病性蓝耳病江西 A1株 （简称为 JXA1 毒株， 可购自 扬州优邦生物制药有限公司）。 25头 10周龄的家猪被分为 5个组， 每组 5头， 经过 PRRSV抗原抗体检测均为阴性。

分组用药及攻毒情况如下： 第 1组 （scho-p-IFN+灭活苗）： 对每头动物肌肉 注射 scho-p-IFN佐剂 1ml和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗 NVDC-JXA1株 （规 格： 100ml/瓶） （购自扬州优邦生物制药有限公司） 2ml， 28天后肌肉注射 3><10 ⁵ TCID ^5Q /头的毒株攻毒； 第 2组 （ _SC h ₀ - _a lpha-IFN+灭活苗）： 对每头动物肌肉注射 scho-alpha-IFN佐剂和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫� �� NVDC-JXA1 株 （规格： 100ml/瓶） (购自扬州优邦生物制药有限公司）2ml，28天后 肌肉注射 3><10 ⁵ TCID ⁵⁰ / 头的毒株攻毒； 第 3组 （灭活苗）： 对每头动物肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征灭 活疫苗 NVDC-JXA1株 （规格： 100ml/瓶） （购自扬州优邦生物制药有限公司） 2ml, 28天后肌肉注射 3xl0 ⁵ TCID ^5Q /头的毒株攻毒； 第 4组 （p-IFN): 对每头 动物肌肉注射 p-IFN药物 2ml， 同时肌肉注射 3><10 ⁵ TCID ^5Q /头的毒株攻毒； 第 5 组（对照组）： 不免疫， 只肌肉注射 3xl0 ⁵ TCID ^5Q /头的毒株攻毒。攻毒后 21天的 动物存活情况如表 1所示。 表 1 猪的存活情况表

组 攻击猪头 死亡猪头 病毒攻击剂 存活 注射内容 華: 别

1 scho- -IFN+灭活苗 5 1 3xl0 ⁵ TCID ₅₀ 80%

3 灭活苗 5 3 3χ10 ⁵ TCID ₅₀ 40%

4 p-IFN 5 1 3χ10 ⁵ TCID ₅₀ 80%

5 无 5 3 3χ10 ⁵ TCIDso 40% 所有 5组的 25头实验动物 （如果未死亡）分别在攻毒后第 0、 4、 9、 14、 21 天抽血， 取血清检测其病毒血症。 过程简而言之为， 先将 MARK-145细胞铺于 96孔板上， 培养 24小时至每孔细胞长满孔的 80%左右， 然后分别加入经过过滤 膜除菌并用细胞培养基梯度稀释的各取样的血 清， 取不加血清的培养基做为对 照， 细胞于 37°C培养 7天， 观察细胞病变情况。 结果表明， 各组死亡的猪均有 明显血症， 其中对照组最明显； 对照组 （第 5组） 中全部存活的猪和第 2、 3组 中各有一头存活的猪至 21天后仍检出血症， 说明这些动物虽存活， 但存在病毒 感染， 在 21天时体内仍有未清除的病毒残留； 然而， 第 1、 4组中存活的 8头至 第 21天实验动物均未检出病毒血症， 说明没有病毒残余。

以上实验结果表明， 灭活苗虽然能够在一定程度上相对于对照组能 够减轻病 毒感染的症状 （如， 病毒血症有一定降低）， 但是病毒血症仍然存在， 不能清除 病毒， 最主要的是， 对感染 PRRSV动物的死亡率没有显著降低； 虽然理论上多 种干扰素，尤其是干扰素 alpha能够在细胞水平上保护 PRRSV,但是到了实际动 物体内， 非常令人意外的是， 理论上说看好的干扰素 alpha虽能减缓病毒复制， 但是不能清除动物体内的病毒， 尤其是对感染 PRRSV动物的死亡率的降低几乎 没有作用， 而本发明的猪干扰素却能够显著降低感染 PRRSV动物的死亡率， 不 出现病毒血症，而且这种存活率的显著提高几 乎都是由本发明的猪干扰素所带来 的。 而且， 单独用本发明的猪干扰素的核酸疫苗来实验， 也能够显著保护感染 PRRSV的动物， 不出现病毒血症。 这进一步证明了本发明的猪干扰素能够对实 际的动物体取得针对 PRRSV感染的保护作用， 无论是作为佐剂还是单独使用， 都显著提高了动物的存活率。

序列表

<iio> 复旦大学

<120> 新型的猪干扰素蛋白

<130> PCT申请

<150> 中国专利申请第 201010208935.0号

<151> 2010-06-24

<160> 10

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 家猪

<400> 1

Met Ala His He Tyr Lys Leu Leu Ala Gly Val He Leu Cys Ser He 1 5 10 15

His Ala Cys Ser Leu Gly Gin Asn Leu Ser Gly lie Glu Asn Arg Lys

20 25 30

Thr Phe Met He Leu Arg Gin Met Lys Arg He His Ser His Leu Cys

35 40 45

Leu Lys Asp Arg Thr Asp Phe Gin Phe Pro Trp Lys Arg Gly Asn Thr

50 55 60

Thr Gin Asn Lys Met Thr Gin Gly Ser Cys Tyr His Pro Leu Met Leu 65 70 75 80

Gin Gin He He Asn Leu Phe Asn Thr Glu Asn Ser Arg Ala Ala Trp

85 90 95

Asn Asn Ala Leu Leu Asp Gin Leu Leu Ser Arg Leu Asp His Gly Leu

100 105 110

Glu Gin Leu Glu Gin Met Glu Asp Asp Asn Leu Ala Cys Ala Tyr Leu 115 120 125

Gly Ser Val Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie His His Tyr Leu Lys

130 135 140

Lys Lys Glu Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Val Glu He

145 150 155 160

Val Val Cys Leu Ser Leu lie

165 ^f :修改了标号位置）

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> 家猪

<400> 2

atggcccaca tctataagct tctggcagga gtgatactct gctccatcca tgcttgctct 60 cttggccaga acttgtctgg catagagaac aggaaaacct tcatgatttt gagacagatg 120 aaaaggattc actctcattt atgcctaaag gacagaactg acttccaatt tccttggaaa 180 agagggaata ccacccaaaa caagatgact caaggctcct gttaccaccc tctgatgctc 240 cagcagatca tcaacctctt caacacagag aacagccgtg ctgcttggaa caacgccctc 300 ctcgatcaac tactctctcg ccttgatcac ggcctggaac aactagagca aatggaagat 360 gacaatctgg cttgtgccta tttgggaagt gttgtccgga aatatttcca aagaatccat 420 cactatctca aaaagaagga atatagttcc tgtgcctggg aggttgtcag agtagaaatt 480 gtagtgtgtc tttcccttat ataa 504

<210> 3

<211> 171

<212> PRT

<213> 家猪

<400> 3

Met Ala Gin He Tyr Leu Leu Val Ala Gly Val Met Leu Cys Ser Thr

1 5 10 15 Pro Ala Cys Ser Leu Gly Gin Asn Leu Ser Gly lie Pro Ser Gin Glu

20 25 30

Asn Arg Glu lie Ser Thr Tyr Leu Trp Trp Met Lys Arg lie Pro Ser

35 40 45

Gin Leu Cys Leu Lys Glu Arg Thr Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys Arg

50 55 60

Asp Asn Asn Thr Pro He Gin Met Thr Gin Gly Thr Cys Tyr His His 65 70 75

Leu lie Leu Gin Gin lie Ser Asn Leu Phe Asn Thr Glu Glu Ser Arg

85 90

Ala Ala Trp Asn Asn Thr Leu Leu Asp Gin Leu Leu Ser Arg Leu Asp

100 105 110

His Ser Leu Glu Gin Leu Trp Lys Gin Met Asp Lys Asp Asn Leu Ala

115 120 125

Cys Pro Tyr Trp Glu Thr Val Val Arg Lys Tyr Phe Gin Gly lie His

130 135 140

Arg Tyr Leu Lys Gly Lys Glu Tyr Ser Leu Cys Ala Trp Glu Val Val 145 150 155

Arg Val Lys He Gly Glu Cys Leu Ser Leu Met

165 170

<210> 4

<211> 516

<212> DNA

<213> 家猪

<400> 4

atggcccaaa tctacttgct ggtggcagga gtgatgctct gctccactcc tgcttgctct 60 cttggccaga acttgtctgg gatccctagc caagaaaata gggaaatctc cacatatttg 120 tggtggatga aaaggatccc ctctcagttg tgtctaaagg aaagaactga tttcaaattt 180 ccctggaaac gagacaataa caccccaatc cagatgactc aaggcacctg ttaccaccat 240 ctgatactcc agcagatcag caacctcttc aacacagagg agagccgagc tgcgtggaac aacactctcc ttgatcaact gctctctagg cttgatcaca gcctggaaca actgtggaag

caaatggaca aagacaatct ggcttgtccc tactgggaaa ctgttgtccg gaaatatttc

caaggcatcc atcgctatct gaaaggaaag gaatatagcc tctgtgcctg ggaggttgtc agggtcaaaa ttggagagtg tctctccctc atgtaa

<210> 5

<211> 171

<212> PRT

<213> 家猪

<400> 5

Met Ala Gin Val Tyr Leu Leu Val Ala Gly Val Met Leu Cys Ser Thr

1 5 10 15

Pro Ala Cys Ser Leu Gly Gin Asn Leu Ser Gly lie Pro Ser Gin Glu

20 25 30

Asn Arg Glu lie Ser Thr Tyr Leu Trp Trp Met Lys Arg lie Pro Ser

35 40 45

Gin Leu Cys Leu Lys Glu Arg Thr Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys Arg

50 55 60

Asp Asn Asn Thr Pro He Gin Met Thr Gin Gly Thr Cys Tyr His His

65 70 75 80

Leu lie Leu Gin Gin lie Ser Asn Leu Phe Asn Thr Glu Glu Ser Arg

85 90 95

Ala Ala Trp Asn Asn Thr Leu Leu Asp Gin Leu Leu Ser Arg Leu His

100 105 110

His Ser Leu Glu Gin Leu Trp Lys Gin Met Asp Lys Asp Asn Leu Ala

115 120 125

Cys Pro Tyr Trp Glu Thr Val Val Arg Lys Tyr Phe Gin Gly lie His

130 135 140

Arg Tyr Leu Lys Gly Lys Glu Tyr Ser Leu Cys Ala Trp Glu Val Val 145 150 155 160

Arg Val Lys He Gly Glu Cys Leu Ser Leu Met

165 170

<210> 6

<211> 516

<212> DNA

<213> 家猪

<400> 6

atggcccagg tctacttgct ggtggcagga gtgatgctct gctccactcc tgcttgctct 60 cttgggcaga acttgtctgg gatccctagc caagaaaata gggaaatctc cacatatttg 120 tggtggatga aaaggatccc ctctcagttg tgtctaaagg aaagaactga tttcaaattt 180 ccctggaaac gagacaataa caccccaatc cagatgactc aaggcacctg ttaccaccat 240 ctgatactcc agcagatcag caacctcttc aacacagagg agagccgagc tgcgtggaac 300 aacaccctcc ttgatcaact gctctctagg cttcatcaca gcctggaaca actgtggaag 360 caaatggaca aagacaatct ggcttgtccc tactgggaaa ctgttgtccg gaaatatttc 420 caaggcatcc atcgctatct gaaaggaaag gaatatagcc tctgtgcctg ggaggttgtc 480 agggtcaaaa ttggagagtg tctctccctc atgtaa 516

<210>

<211> 184

<212> PRT

<213> 家猪

<400> 7

Met Ala His He His Leu Leu Leu Ala Gly Val He Leu Ser Ser Thr

1 5 10

Ala Ala Gly Thr Leu Gly Gin Phe Ser Gly He His Arg Leu Glu Asn

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