L'invention a pour objet une nouvelle souche actinomycète Saccharothrix SA 103 déposée à la CNCM le 6 février 2004 sous le numéro 1-3160 ou une souche mutante de celle-ci, un procédé et un milieu de sélection de cette souche, un procédé de production d'un bouillon de culture, d'un concentrât actif et de composés actifs à partir d'une culture de cette souche SA 103. L'invention a également pour objet les composés actifs susceptibles d'être obtenus par le procédé de production, notamment de nouvelles mutactimycines et aldgamycines, des compositions pharmaceutiques comprenant ces composés actifs et leur utilisation dans le domaine médical et phytopharmaceutique.

Les agents antimicrobiens sont largement utilisés dans de nombreux domaines : santé humaine, vétérinaire, phytopathologie, industrie alimentaire, traitement du cuir et du bois, etc. La plupart de ces agents sont produits par des microorganismes, dont les actinomycètes sont parmi les plus importants.

On cherche toujours de nouveaux agents antimicrobiens, en particulier des antibiotiques antibactériens.

En effet, on sait que de par la nature même des bactéries, celles-ci prolifèrent de manière exponentielle, et augmentent ainsi leurs chances de devenir résistantes à des antibiotiques, ceci suite à des mutations génétiques.

L'utilisation inadéquate d'antibiotiques dans le domaine animal, notamment l'homme, ou végétal, mais aussi dans l'industrie alimentaire ou l'industrie du cuir, accroît la capacité mutationnelle des bactéries, et donc leur résistance à des antibiotiques.

Une solution à ce problème est bien sûr d'administrer à bon escient les antibiotiques, mais cette solution ne peut être que préventive. H existe donc un besion, dans l'état actuel de la technique, de développer de nouveaux antibiotiques. Pour ce faire, les recherches se sont portées sur les microorganismes extrêmophiles.

Ainsi, les inventeurs ont isolé une nouvelle souche actinomycète Saccharothrix SA 103 présente dans le sol sud saharien de l'Algérie, et l'ont déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorgansimes (CNCM) le 16 février 2004 sous le numéro 1-3160.

Ils ont également découvert que cette souche produisait des composés actifs de la classe des anthracyclines, dont certains n'ont jamais été identifiés auparavant, notamment des mutactimycines (PR, F, .G), mais également des composés actifs de la classe des anthracyclines, notamment des aldgamycines (G, H et PlOb). Ces composés actifs présentent une activité antibactérienne, en particulier contre les bactéries Gram-positives, mais également une activité antivirale, antiproliférative et anticancéreuse.

Ils ont dès lors mis au point un procédé d'obtention de ces composés à partir de la souche Saccharothrix SA 103 déposée à la CNCM le 16 février 2004 sous le numéro 1-3160, lequel procédé présente l'avantage d'être simple à mettre en œuvre. Ainsi, ces composés antibiotiques obtenus à partir de la souche Saccharothrix présentent un réel intérêt pharmaceutique, aussi bien pour l'homme que pour l'animal, ainsi qu'un intérêt phytosanitaire, et peuvent être produits à l'échelle industrielle.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

Ainsi, l'invention a tout d'abord pour objet la souche actinomycète Saccharothrix SA 103 déposée à la CNCM le 16 février 2004 sous le numéro 1-3160 ou une souche mutante de celle-ci. " Par « souche mutante »,- « mutant », « souche variante » ou « variant », on entend désigner de manière indifférente dans la présente demande une souche de Saccharothrix pouvant être obtenue par mutation sélective à partir de la souche Saccharothrix SA 103 en conservant la capacité de produire au moins l'un des composés actifs décrits ci-après. Les techniques de mutation sont connues de • - «Bhomme du- métier et consistent à mettre la souche Saccharothrix SA 103 en présence d'un agent mutagène physique, tel qu'un rayonnement, ou d'un agent mutagène chimique, par exemple l'acriflavine, puis à sélectionner dans un milieu " — approprié les mutants d'intérêt restants en utilisant leur spectre antiobiotique (méthode d'inhibition de microorganismes telle que par exemple la méthode de la concentration minimale inhibitrice ou CMI, etc...).

Les caractéristiques de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention sont décrites dans la partie « Exemples » de la présente demande.

La souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention ou l'un de ses mutants est mise en culture dans un milieu contenant une variété de substances nutritives généralement utilisées pour la croissance des actinomycètes. Par exemple, comme - 'Souf-cèr de -.carbone; on- peut -utiliser du- -glucose; de la glycérine., du sucrose, de l'amidon, -du maltose, ou bien des huiles animales ou végétales. Comme source d'azote on peut utiliser, par exemple, de l'azote organique tel que de la farine de soja, des extraits de viande, un extrait de levure, une peptohe, de l'eau de macération du maïs, du tourteau de coton ou de la farine de poisson. On peut utiliser de l'azote inorganique tel que par exemple du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, du nitrate de sodium ou du phosphate d'ammonium. Si cela est nécessaire, on peut encore ajouter du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du, phosphate, de potassium ou des sels métalliques bivalents tels que Mi+, Ca+^, Zn+"1", Fe4+, Cu+"1", Mn+"1" Ou Nf+, et des acides aminés ou des vitamines. On peut utiliser des géloses inclinées. Un autre objet de la présente invention est un procédé de sélection de la souche actinomycète Saccharothrix SA 103 selon l'invention et/ou d'au moins l'une de ses souches mutantes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir ladite souche et/ou au moins l'une de ses souches mutantes avec un milieu de sélection approprié; b) isolement de ladite souche et/ou d'au moins l'une de ses souches mutantes.

Un autre objet de la présente ' invention est un milieu de sélection approprié permettant d'isoler la souche actinomycète SA 103 selon l'invention' et/ou au moins l'une de ses souches mutantes.

Qn entend désigner par milieu de sélection approprié dans la présente demande tout milieu au moyen duquel au moins la souche actinomycète Saccharothrix SA 103 selon l'invention est capable de se développer mais qui empêche la croissance d'au moins une souche différente de. la souche Saccharothrix SA 103 ou d'un autre micro-organisme tel qu'un champignon ; de préférence, le milieu de sélection selon l'invention permet d'empêcher la croissance de toutes les souches différentes de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention ou d'une souche mutante de celle-ci.

Un tel milieu de sélection comprend une variété de substances nutritives telles que définies précédemment et au moins un produit sélectif tel que par exemple un agent antibactérien auquel seule la souche SA 103 selon l'invention et/ou au moins l'une de ses souches mutantes est résistante, et/ou un agent antifongique .pour, éliminer les champignons dont la croissance, rapide pourrait gêner ou même empêcher la souche selon l'invention de croître.

Comme exemple- de. milieu de sélection approprié pour isoler la souche actinomycète SA 103 selon l'invention on peut citer le milieu MIS qui correspond à une gélose humique-vitamines B comprenant également du lysozyme, de préférence à hauteur d'environ 0,005 %, de la cyclosérine, de préférence à hauteur d'environ 10 mg/1, le pH de ce milieu étant compris dans la gamme d'environ 8,5 à environ 9.

Un autre exemple préféré de milieu de sélection approprié pour isoler la souche actinomycète SA 103 selon l'invention est le milieu HV- Vitamine B comprenant également du lysozyme, de préférence à hauteur d'environ 0,005 %, de la cyclosérine, de préférence à hauteur d'environ 10 mg/1, de la pénicilline, de préférence à hauteur d'environ 10 mg/1, ainsi que de la rifampicine, de préférence " a "hauteur d ' environ' 5 mtg/1;" le pH de ce milieu étant compris dans la gamme .-d'environ,,8,5 à.enMrron 9., • . . .. . :

La sélectivité du milieu de sélection approprié selon l'invention peut être renforcée en ajoutant audit milieu d'autres produits sélectifs auxquels la souche SA 103 selon l'invention est résistante, tels que notamment l'azide de sodium, de préférence à hauteur d'environ 0.001%, le tellurite de potassium, de préférence à hauteur d'environ 0.01%, et/ou le crystal violet, de préférence à hauteur d'environ 0.001%.

Comme exemple d'agent antifongique qui peut être ajouté au milieu de sélection approprié selon l'invention, on peut citer l'actidione et/ou lanystatine.

Lorsque l'on souhaite sélectionner une souche mutante de la souche Saccharothrix ,,SA- 1.03,. selon .l'inv.ention,,le. milieu, sélectif. peutégalement consister en un milieu de culture additionné d'un seul acide aminé, comme cela est bien connu de l'homme de l'art.

La souche SA 103 selon l'invention que les inventeurs ont réussi à isoler est une souche extrêmement rare. En effet, une seule colonie a été mise en évidence sur plus de 120 échantillons analysés avec ou sans produits sélectifs tels que par exemple les antibiotiques cités précédemment. Un autre objet de la présente invention est un procédé de production d'un bouillon de culture à partir d'une culture de la souche actinomycète Saccharothrix SA 103 et/ou d'au moins l'une de ses souches mutantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fermentation de ladite souche dans un bouillon nutritionnel afin d'obtenir le bouillon de culture.; b) optionnellement, séparation du bouillon de culture obtenu à l'étape a).

"La fermentation aérobie dans un milieu liquide est préférée, comme dans le cas de la production d'autres antibiotiques, et la production des composés actifs à partir de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention peut être effectuée à n'importe quelle température favorable à la croissance de cette souche, c'est-à-dire allant de la température ambiante jusqu'à 43 °C. De préférence, on utilise une température allant de 25 °C à 32 °C. De manière encore préférée, la température est de 30 0C. Cette culture peut durer plusieurs jours, par exemple de 2 à 10 jours. Normalement, le pH est légèrement alcalin, mais le pH exact peut varier selon le milieu de culture utilisé. On prélève la souche après croissance sur gélose, notamment inclinée, et optionnellement stockée à faible température, et on l'inocule dans un milieu liquide conventionnel constitué de substances nutritives semblables à celles . décrites plus haut , pour la croissance de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention, sous agitation de manière à obtenir un bouillon de culture.

La fermentation peut être réalisée dans des flacons Erlenmeyer et dans des fermentateurs industriels ou de laboratoire ayant diverses capacités. Lorsque l'on procède à la fermentation dans une cuve, il est souhaitable de produire un inoculum dans un bouillon nutritif en inoculant le bouillon nutritif avec un prélèvement d'une culture inclinée ou à plat, ou une culture lyophilisée de l'organisme. Après avoir obtenu de cette manière un inoculum, celui-ci est transféré de manière aseptisée dans le milieu de la cuve de fermentation pour une production à grande échelle des composés actifs. Le milieu dans lequel l'inoculum • .>esi-pro.duit:peut*être- le -même ou- peut être, différent de celui utilisé dans la cuve, pour autant qu'une croissance correcte du microorganisme soit obtenue.

Le bouillon nutritionnel selon l'invention contient de manière générale le même type de substances nutritives que celles du milieu de culture de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention tel que décrit plus haut (source de carbone, source d'azote...). Il peut également contenir des agents anti-mousse tels que de la paraffine liquide, de l'huile de soja, des graisses ou du silicone.

L'étape b) optionnelle de séparation du bouillon de culture peut être effectuée par n'importe quel procédé bien connu de l'homme de l'art, seul ou associé à un autre procédé de séparation, tel que par exemple une centrifugation, une filtration ou une pasteurisation.

Ainsi, de préférence, le procédé de production d'un bouillon de culture selon l'invention est caractérisé en ce que' la sépararation réalisée à l'étape b) optionnelle est une centrifugation et/ou une filtration et/ou une pasteurisation.

L'invention a encore pour objet un bouillon de culture susceptible d'être obtenu selon le procédé selon l'invention.

A partir du bouillon .de culture obtenu selon le procédé de production de l'invention, on procède à l'extraction des composés actifs. Pour cela, on utilise un solvant organique, tel que par exemple, mais sans s'y limiter, le n- butanol, l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane, le n-propanol ou le 2-propanol.

,. Après, l'.étape d'extraction,- la déshydratation .de . la phase organique peut être réalisée de manière facultative ..afin d'éliminer de nombreuses impuretés polaires dans le concentrât actif, ce qui facilitera ultérieurement la purification finale du concentrât actif par HPLC. Pour cela, on peut utiliser du sulfate de sodium anhydre ou du sulfate de magnésium, et/ou on procède au séchage in vacuo de la phase organique. L'utilisation d'une filtration sur gel (gel dextran réticulé), d'une chromatographie sur colonne cellulose, d'une résine échangeuse d'ions ou d'une chromatographie sur couche mince (gel de silice) peut également être envisagée.

De telles méthodes sont bien connues de l'homme de l'art, qui saura utiliser ces différentes techniques seules ou combinées, de la manière la plus appropriée en vue de récupérer un concentrât actif à partir du bouillon de culture de la souche Saccharothrix SA 103 selon l'invention.

Ainsi, encore un autre objet de la présente invention est un procédé de production d'un concentrât actif à partir du bouillon de culture selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraction organique du bouillon de culture avec un solvant organique ;

b) optionnellement, déshydratation de la phase organique obtenue et/ou séchage in vacuo ;

c) optionnellement, mise en suspension du concentrât actif, de préférence filtration de la suspension obtenue, et répétition des étapes a) et b) d'extraction organique et de déshydratation.

Le concentrât actif susceptible d'être obtenu selon le procédé de la présente invention constitue encore un objet de la présente invention.

Le concentrât actif ainsi, obtenu . est ensuite identifié au moyen d'analyses instrumentales telles que le spectre d'absorption des rayons visibles/ultraviolets, le spectre d'absorption des rayons infrarouges, le spectre RMN-1H et le spectre RMN-13C, la spectrométrie de masse, et également l'analyse chromatographique (colonnes chromatographiques gel de silice ou gel dextran, résines échangeuses d'ions, chromatographie en phase liquide, chromatographie liquide haute performance en phase inverse ou HPLC, etc .). Ceci permet de caractériser et de produire les différents composés actifs, également dénommés « fractions actives », susceptibles d'être contenus dans le concentrât actif obtenu. Ainsi, l'invention a encore pour objet un procédé de production d'un composé actif à partir du concentrât actif selon l'invention par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (reverse phase HPLC), de préférence précédée ,,.d'une,.chr.ornatQ.graphi.e...sur . couche. , mince .et/pu, d'une chromatographie liquide à basse pression.

Les composés actifs qui sont susceptibles d'être obtenus par le procédé de production selon l'invention 'correspondent donc à des éluats obtenus par chromatographie HPLC et sont quasiment purs.

La purification par chromatographie HPLC est indispensable pour séparer les composés actifs à partir du concentrât actif. La chromatographie sur couche mince et/ou la chromatographie liquide à basse pression telle que du type Sephadex LH 20 permet l'obtention d'un concentrât actif débarrassé de nombreuses impuretés et facilite ainsi la purification ultérieure par chromatographie HPLC.

,De .préférence, ^.procédé, de..production d'un composé actif selon l'invention est caractérisé en ce que le composé actif est une mutactimycine telle que la mutactimycine PIl, la mutactimycine PR, la mutactimycine F ou la mutactimycine G, ou une aldgamycine telle que l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb, ou les sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que les mélanges de ces composés actifs.

La mutactimycine PIl possède la formule suivante : .

Elle a été identifiée comme correspondant à la mutactimycine C, déjà connue et enregistrée dans la base « Registry » sous le numéro RN 138689-81-3.

La mutactimycine PR possède la formule suivante :

La mutactimycine F possède la formule suivante :

La mutactimycine G possède la formule suivante :

,,L'.aldgamycirie G,(ou P10a).ppssède,la formule suivante

On connaît déjà l'aldgamycine de formule stéréochimique suivante, enregistrée dans la base « Registry » sous le numéro RN 107745-56-2.

L'aldgamycine H (ou P8), possède la formule suivante ;

L'aldgamycine PlOb (ou swalpamycine B) possède la formule suivante :

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est la mutactimycine PR de formule suivante :

ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est la mutactimycine F de formule suivante :

ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est la mutactimycine G de formule suivante :

,,o.u .ses..sels, d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est l'aldgamycine G de formule suivante :

ou 'ses sels d' addition ph'àrmacëûtiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges, à l'exception de l'aldgamycine G de formule stéréochimique suivante :

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que l'aldgamycine G possède la formule stéréochimique suivante :

ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, •diastéréoismèresy ainsi que • leurs -mélanges.-- - • •

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est l'aldgamycine H de formule suivante :

ou ses. sels d'addition .pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantipmères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

De préférence, Faldgamycine H possède la formule stéréochimique suivante :

ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

L'invention a également pour objet un composé actif susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, caractérisé en ce que le composé actif est Faldgamycine PlOb de formule suivante : ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoismères, ainsi que leurs mélanges.

De préférence, l'aldgamycine PlOb possède la formule stéréochimique suivante :

ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéfëoismères, ainsi qμe leurs mélanges.

La mutactimycine PR, la mutactimycine F, la mutactimycine G, l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb selon l'invention peut être obtenue par n'importe quel procédé connu de l'homme de l'art, tel que par exemple des procédés chimiques ou enzymatiques. De préférence, on utilisera le procédé de production comprenant une étape de fermentation à partir de la Saccharothrix SA 103 selon l'invention tel que décrit plus haut.

Un autre objet de la présente invention est un mélange actif d'au moins deux composés actifs choisis parmi la mutactimycine PI l, la mutactimycine PR, la mutactimycine F ou la mutactimycine G, ou une aldgamycine telle que l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb.

Facultativement, le mélange actif selon l'invention peut contenir au moins deux composés actifs choisis parmi la mutactimycine PIl, la mutactimycine PR, la mutactimycine F ou la mutactimycine G, ou une aldgamycine telle que l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb, et un autre composé actif sur le plan antibactérien, antiviral, antiprolifératif ou anticancéreux connu de l'homme de l'art (antibiotiques, etc.). Les composés actifs selon l'invention peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec d'autres agents microbiens, par exemple pour prévenir la croissance . ou réduire le nombre des bactéries Gram-positives. Ainsi, ces composés sont utiles sur le plan médical, notamment dans un but antibactérien, antiviral ou anticancéreux.

Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique contenant une " quantité "thërapeutiquemeήt "efficace "d'un composé "actif selon l'invention, tel que la mutactimycine PR, la mutactimycine F, la mutactimycine G ou l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb, et un excipient pharmaceutiquement acceptable .

Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous n'importe quelle forme pharmaceutique appropriée pour le mode d'administration. Des exemples de telles compositions comprennent les compositions solides pour une administration orale telles que des comprimés, des capsules, des pilules, des poudres et des granules, des compositions liquides pour une administration orale telles que des solutions, des suspensions, des sirops et des préprarations pour une administration pareήtérale telles que des solutions stériles, des suspensions ou des émulsions.

Les composés actifs de la présente invention forment des sels d'addition, le cas échéant pharmaceutiquement acceptables avec des réactifs de formation de tels sels, bien connus de l'homme de l'art.

Les quantités préférées des composés actifs de la présente invention utilisées pourront varier en fonction du composé actif particulier utilisé, de la composition particulière formulée, du mode d'application et du site particulier, de l'hôte et de la maladie à traiter. En général, les composés actifs de l'invention sont injectés en intrapéritonéale, en intraveineuse, en sous-cutané ou local, ou administrés oralement. Divers facteurs qui modifient l'action du médicament seront pris en compte par l'homme du métier, par exemple l'âge, le poids corporel, le sexe, le régime, le temps d'administration, le taux d'excrétion, la condition du patient, les • combinaisons de médicaments, les sensibilités à des réactions et la sévérité de la maladie'. D'administration peut être réalisée de manière continue ou périodique dans la dose maximale tolérée.

Il est à noter que pour une utilisation en tant qu'agents antibactériens, les composés actifs sont en général administrés de manière à ce que la concentration de l'ingrédient actif soit supérieure" à celle delà concentration minimale inhibitrice pour 1 ' organisme particulier à traiter.

Ainsi, l'invention a pour objet un composé actif selon l'invention, tel que la mutactimycine PR, la mutactimycine F, la mutactimycine G ou l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb pour son utilisation en tant que médicament.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, pour la fabrication d'un antibiotique destiné à prévenir et/ou à traiter une infection impliquant une bactérie gram-positif, telle qu'une streptococcie, une infection néonatale, une infection urinaire, une endocardite, une pneumonie, une méningite, une otite, une listériose, la diphtérie, la tuberculose ou la lèpre.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement et/ou de prévention d'une infection impliquant une bactérie gram-positif, telle qu'une streptococcie, une infection néonatale, une infection urinaire, une endocardite, une pneumonie, une méningite, une otite, une listériose, la diphtérie, la tuberculose ou la lèpre, au moyen d'une composition pharmaceutique selon l'invention.

-Ifa- autre ? objet- -est - l'utilisation:: • d'une- composition pharmaceutique selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament antiviral destiné à prévenir et/ou à traiter une infection impliquant le virus de l'immunodéficience acquise (SIDA), . . . .. . .. . 19 . ..

le virus de la vaccine, le cόronavirus, le papillomavirus, le parvoviras, le viras de la fièvre catarrhale du mouton, le viras de la Dengue, le viras Ebola, ou encore la grippe, la variole, la rougeole, la rubéole, la varicelle, l'hépatite A, B, C, D ou E, la mononucléose, la fièvre jaune, l'encéphalite ou l'herpès.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement et/ou de prévention d'une infection le virus de l'immunodéficience acquise (SDDA), le viras de la vaccine, le. coronavirus, le papillomavirus, le parvoviras, le viras de la fièvre " catarrhale du mouton, le viras delà "Dèήguê, le viras Ebôlà, ou encore la grippe, la variole, la rougeole, la rubéole, la varicelle, l'hépatite A, B, C, D ou E, la mononucléose, la fièvre jaune, l'encéphalite ou l'herpès, au moyen d'une composition pharmaceutique selon l'invention.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament anticancéreux destiné à prévenir et/ou à traiter un sujet atteint d'un cancer, tel que le cancer du poumon, de l'utérus, du sein ou de l'ovaire, le cancer colorectal, la leucémie ou un sujet atteint d'une tumeur de la prostate, de la vessie, de la peau, du cerveau, de la gorge.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement et/ou de prévention d'un sujet atteint d'un cancer, tel que le cancer du poumon, de l'utérus, du sein ou de l'ovaire, le cancer colorectal, la leucémie ou un sujet atteint d'une tumeur de la prostate, de la vessie, de la peau, du cerveau, de la gorge, au moyen d'une composition pharmaceutique selon l'invention.

L'invention a également pour objet une méthode de prévention et/ou de traitement d'une maladie chez une plante au moyen d'un produit phytopharmaceutique comprenant un composé actif selon l'invention, tel que la mutactimycine PR, la mutactimycine F, la mutactimycine G ou l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb . Les composés actifs selon l'invention tels que la mutactimycine PR, la mutactimycine F, la mutactimycine G ou l'aldgamycine G, l'aldgamycine H ou l'aldgamycine PlOb peuvent encore être utilisés pour traiter dans l'industrie alimentaire, du cuir ou du bois.

Ils sont également utiles dans des solutions de lavage dans un but sanitaire, par exemple pour le lavage des mains et la désinfection de divers équipements de • laboratoire, dentaires, et médicaux ou d'autres matériaux contaminés.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

LEGENDES DES FIGURES

Figure 1 : Profil de fermentation de la souche Saccharothrix sp. SA 103. Figure 2 : Isolement et purification des produits actifs de la souche Saccharothrix sp. SA 103.

EXEMPLES

Exemple 1 : Matériels et méthodes

1.1 Micro-organisme La souche productrice actinomycète Saccharothrix SA 103 selon l'invention a été isolée à partir d'un sol des régions arides de l'Algérie (Sahara) par mise en suspension d'un échantillon de sol dans de l'eau distillée stérile et dépôt sur une gélose humique-vitamines B contenant 50 μg/ml d'actidione. Une culture pure de la souche SA 103 a été préservée par lyophilisation. Elle a également été maintenue a 6°C à des fins d'utilisation au sein du laboratoire sur un milieu ISP N°2 incliné (Shirling et Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16 :313-340, 1996). 1.2 Taxonomie Les caractéristiques taxonomiques de la souche SA 103 ont été déterminées par culture sur divers milieux décrits dans Shirling et Gottlieb (1996) et dans Waksman (« The actinomycetes », Vol. It, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1961). Les' caractéristiques- morphologiques ont été déterminées après croissance à 30°C pendant 14 jours. Les noms de couleur et numéros de nuance ont été attribués en utilisant le système ISCC-NBS (« Mer Society Color Council » à l'intention du « National Bureau of Standards »). L'observation détaillée des morphologies "dû" mycélium et des sp"ores a été réalisée par microscopie électronique par balayage (Hitachi, modèle S-450). Les propriétés physiologiques ont été examinées à l'aide des méthodes Goodfellow (J. Gen. Microbiol. 69 :33-90, 1971) et Waksman (1961). Le type d'isomères de l'acide diaminopimélique dans la paroi cellulaire, et la composition cellulaire totale en sucres ont été déterminées par les méthodes de Becker et al. (Appl. Microbiol. 12 :421-423, 1964), et Lechevalier et Lechevalier (« In The Actinomycetales », Ed. H. Prauser, pp. 311-316, Fisher Verlag, Jena, 1970). Les phospholipides et les acides mycoliques ont été analysés par la procédure de Minnikin et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 27 : 104-107, 1977 ; J. Chromatography 188 :221-233, 1980).

1.3 Fermentation Un prélèvement de la souche SA 103 à partir d'une culture inclinée mature a été inoculé dans un flacon Erlenmeyer contenant 50 ml de milieu de culture stérile contenant du glucose 0,4 %, un extrait de malt 1 % et un extrait de levure 0,4 % (ajusté au pH 7,2 avant stérilisation) et mis en culture sur un agitateur rotatif (250 rpm) à 30 0C pendant 2 jours. Pour la production d'antibiotiques, 3 ml du milieu de culture ont été transférés dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml, chacun contenant 100 ml du milieu ci-dessus, et mis en culture pendant 10 jours en utilisant les mêmes conditions. La production de l'activité antibactérienne totale a été réalisée sur une gélose nutritive, par un test de diffusion sur gélose contre Bacillus subtilis ATCC 6633. L'inhibition de croissance a été examinée après 24 heures d'incubation à 30°C. L'activité antimicrobienne a été estimée en mesurant le diamètre de la zone d'inhibition. Le poids sec du mycélium a été déterminé dans des tubes Eppendorf remplis avec 1 ml de bouillon de culture homogénéisé et séché à 105°C pendant 24 heures (Pfefferle et al., J. Biotech. 80 : 135-142, 2000).

1.4 Purification d'antibiotiques La production des antibiotiques antibactériens par la souche SA 103 est effectuée en milieu liquide MS + amidon (1 %) + extrait de levure (0,3 %) à pH 7,2 (100 ml de milieu par fiole Erlenmeyer de 500 ml, agitation à 250 rpm, incubation à 30 0C). Une cinétique a montré que la souche SA 103 commence à produire les antibiotiques dès le début de la phase exponentielle (1er jour) et cette production se poursuit jusqu'au début de la phase stationnaire avant de se stabiliser pour décroître durant la phase de déclin (cf. Figure 1). Au- total, huit litres de culture ont • été- réalisées. Les filtrats sont extraits au n- butanol. L'extrait butanolique contenant les antibiotiques antibactériens recherchés est retenu. L'extrait butanolique, de couleur rouge, est concentré au Rotàvapor. Dans un premier temps, une aliquote de cet extrait a été passé à travers une colonne de Séphadex LH 20 en utilisant comme phase mobile du méthanol dans de l'eau bidistillée (80 %). Cependant, la séparation des antibiotiques (visualisation à l'œil nu et par antibiographie) n'a pas été concluante. Cette étape a donc été supprimée et l'extrait butanolique a été purifié directement par HPLC en phase inverse en utilisant une colonne Cl 8 et des conditions isocratiques (63 % de méthanol dans de l'eau), un débit de 1,5 ml/min et une détection à 220 nm. Les fractions correspondant à tous les pics obtenus sur le profil ont été recueillies séparément, concentrées et testées contre Bacillus subtilis. Sept fractions (7 pics) se sont -révélées actives-: -quatre de couleur- rouge vif -(PIl, PR, F et G) et trois non colorées (P8, PlOa et PlOb). Ces antibiotiques sont purifiés par HPLC après 3 à 4 réinjections dans les mêmes conditions que précédemment. Exemple 2 : Résultats et discussion - Caractérisation taxonomique de la souche productrice

2.1 Morphologie de la souche La souche SA 103 a formé un mycélium aérien rosé bien -développé qui se fragmentait en chaînes de spores droites ou flexibles. Les spores étaient en forme de bâtonnets et avaient une taille de 1,9-2,9x0,6-0,7 μm avec une surface lisse (Figure 1). Les endospores, les granules sclérales, les synnemata et les spores à flagelles rPonfpas été observes.' Le mycélium 'substrat était rόuge brunâtre à rouge foncé et ne montrait pas ou peu de fragments. La souche a produit un pigment rouge foncé abondant caractéristique qui a été révélé comme correspondant à des antibiotiques antibactériens.

2.2 Caractéristiques structurales Le tableau 1 montre les caractéristiques de culture de la souche SA 103 sur différents supports de culture. La croissance de la souche était abondante sur gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt, gélose Bennett et gélose nutritive mais était modérée sur gélose flocons d'avoine et gélose sels inorganiques - amidon. La couleur du mycélium rentrait dans la gamme entre rosé jaunâtre à marron rougeâtre clair pour les hyphes aériens et orange brunâtre à rouge très foncé pour le mycélium, substrat. La souche produisait un pigment soluble rouge foncé ou orange brunâtre sur tous les milieux utilisés, mais aucun pigment mélanoïde n'a été observé. L'espèce la moins différente est Saccharothrix syringae qui possède un mycélium aérien blanchâtre-rosâtre, un mycélium du substrat et des pigments solubles violet- rouge-brun.

2.3 Chimiotaxonomie L'étude chimiotaxonomique a montré la présence d'acide me^o-diaminopimélique et l'absence de glycine (paroi cellulaire de type IH). Le motif en sucres de l'ensemble de la cellule a consisté en du rhamnose et du galactose (sucre cellulaire de. type E) (Kroppenstedt, « The genus No.cardiopsis. Jh the Procaryotes » Ed., A. Balows et al., pp. 1139-1156, Springer Verlag, Berlin, 1192) et le phospholipide caractéristique était le phosphatidyl-éthanolamine (phospholipides de type PU). Aucun : acide mycolique n'a été détecté. - •

2.4 Physiologie de la souche Les résultats des tests physiologiques sont rapportés dans le tableau 2. La souche est capable d'utiliser plusieurs composés organiques (caséine, gélatine, tween 80, amidon, tyrosine, etc.) dont la majorité des sucres. Par contre, à l'exception du mannitol, les "dérivés alcooliques des oses (inositol, adonitol, dulcitol, érythritol et sorbitol) ne sont pas dégradés. La souche est capable de croître à 20 0C et 48 0C (avec un optimum à 30°C) et à pH 5 et 9 (avec un optimum entre 7 et 8). Elle est résistante au lysozyme et au violet cristal mais est sensible à tous les antibiotiques testés (11) à l'exception de la pénicilline et de la rifampicine. La souche SA 103 se distingue de Sa. syringae par sa capacité à dégrader le lactose -mais pas- l'hypoxanthine et • le -butyrate de -sodium, par sa sensibilité à l'érythromycine, la gentamicine, l'oxytétracycline et la vancomycine, par sa résistance à la pénicilline, la rifampicine et le violet cristal et par sa croissance à pH 5. De ce fait, la souche SA 103 pourrait être une nouvelle espèce de Saccharothrix ou éventuellement une nouvelle sous-espèce de Sa. syringae.

2.5 Classification En se basant sur les propriétés morphologiques et chimiques, décrites plus haut, il a été considéré que la souche SA 103 appartenait au genre Saccharothrix (Labeda, et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 :426-431, 1984). Comparée à l'espèce la plus proche Saccharothrix syringae NPvRL B-16 468T, la souche SA 103 différait par la capacité à dégrader le lactose mais pas Fhypoxanthine et le butyrate de sodium, •par- -une susceptibilité- -à l'éryjfcomycine, la -gentamycine, roxytétracycline et la vancomycine, par une résistance à la pénicilline, la rifampicine, le crital violet et l'azoture de sodium, et par la croissance à pH 5,0. Ainsi, la souche a été désignée Saccharothrix Sp. SA 103. 2.6 Fermentation L'évolution au cours du temps de la production de l'activité antibactérienne par Saccharothrix sp. SA 103 est montrée dans la figure 1. La production de l'activité biologique contre B. subtilis a commencé lors du premier jour et était à son maximum au jour 4 pour devenir stable. La biomasse a augmenté lors des trois premiers jours, est restée stable, puis a diminué après le jour 8. La cinétique du pH a montré une augmentation remarquable lors du premier jour, puis est redevenue neutre, et a augmenté à la "fui "de " là fermentation. De manière générale, la production des métabolites secondaires par les micro-organismes intervient pendant la phase stationnaire mais dans le présent cas la production de l'activité biologique était fortement corrélée à la croissance et était observée pendant toute l'évolution au cours du temps. La même cinétique de production au cours du temps a été observée pour la production d'antibiotiques dithiolopyrrolone par Saccharothrix sp. SA 233 (Lamari et al., J. Antibiotics 55 -.696-701, 2002) et la production d'acide clavulanique par Streptomyces clavuligerus (Lebrihi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 26 :130-135, 1987).

2.7 Détermination de la structure des antibiotiques Les différentes étapes d'isolement et de purification d'antibiotiques sont résumés dans la figure 2.

2.7.1 Antibiotiques de la famille des anthracyclines I)R>..F..et..G..SQip.t,de. co.μle.ur rpuge vif.à.pH neutre, jaune à pH acide .et violet-bleu à pH basique. PIl est l'antibiotique majoritaire et PR, l'antibiotique minoritaire. Ces antibiotiques ont fait l'objet d'études spectroseopiques suivantes: UV visible, infra-rouge, spectrométrie de masse et RMN du proton et du carbone 13 (avec études des corrélations). Des tests complémentaires, tels que la solubilité, la détermination des Rf par CCM et l'analyse élémentaire (cette dernière uniquement pour PIl) ont été également effectués. Identification de la molécule PIl à la mutactimvcine C La molécule PIl possède un poids moléculaire de 530 et la formule chimique C27H30O11- LeS maxima obtenus dans l'UV-visible (MeOH) sont: 219, 234, 250, 287, 478, 496 et 531 nm. Le spectre est similaire à celui des antibiotiques de la famille des anthracyclines, de même que les changements de couleur à différents pH. Le spectre infra-rouge suggère la présence d'aromatiques, de groupements -hydroxyleSj,. méthyles et méthoxyles: Cependant,- la structure finale a été élucidée après une- étude détaillée par RMN du proton et du carbone 13 (déplacements chimiques, constantes de couplage spin-spin, intensités des signaux et corrélations 1H-1H cosy 45, 1H-13C HMCQ et 1H-13C HMBC). La molécule Pl 1 a pu ainsi être identifiée à la mutactimycine C, connue pour être sécrétée par un mutant de Streptomyces sp. La mutactimycine C est constituée par le noyau anthracycline (4 cycles accolés dont un quinonique compris entre deux benzéniques), relié (par le biais du carbone C7) à un ose (le 6-deoxy-3-O-methyl-α-mannopyranoside). PIl est très soluble dans l'eau, le méthanol, le n-butanol, l'éthanol, le 1- propanol et l'acétone et insoluble dans le n-hexane et le toluène.

Détermination de la structure chimique de nouvelles mutactimycines

Mutactimycine PR .,La molécule -mineure PR possède. un poids.moléculaire de 662 qui .correspond à la formule C32H38O1S. Les maxima obtenus dans l'UV-visible et les bandes dans l'infra-rouge sont identiques à ceux de PIl et les fragments de masse assez proches entre les deux antibiotiques, ce qui suggère une forte ressemblance dans la structure chimique. PR est très soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol et insoluble dans le chloroforme, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle, le n-hexane et le toluène. La RMN du proton et celle du carbone 13 ont permis d'élucider la structure de PR qui s'est révélée être proche de PIl (mutactimycine C) avec comme seule différence la présence d'un second ose lié au carbone 4 du 1er cycle benzénique (à la place de -OCH3). Le second ose est le 6-deoxy-mannopyranoside (différence avec le premier par l'absence d'un méthyle). De par cette structure, la molécule PR appartient à la famille des anthracyclines et au groupe des mutactimycines. Cependant, elle diffère de toutes les mutactimycines connues et représente donc un nouvel antibiotique de ce groupe, nommé mutactimycine PR.

Mutactimycine F L'antibiotique F a un poids moléculaire de 516 (soit 14 de moins que PI l) correspondant à une formule moléculaire C26H28O11. Ses spectres UV-visible et infra-rouge et ses fragments de masse sont très proches de ceux de Pl 1 et PR. Ceci suggère donc une forte ressemblance entre les trois molécules. Le composé F est soluble dans l'eau, le' n-butandl, le 1-prόpanol et l'éthàήol et insoluble dans le n- hexane et le toluène. Les RMN du proton et du carbone 13 ont permis d'établir la structure de la molécule qui s'est révélée être proche de PIl (mutactimycine C), mais avec comme seule différence la présence d'un OH sur le carbone C3 du résidu mannopyranosyl, au lieu d'un groupement -OCH3. L'antibiotique F est différent de toutes les mutactimycines connues et représente une nouvelle molécule dénommée mutactimycine F.

Mutactimycine G La molécule possède un poids moléculaire de 502 correspondant à une formule C25H26O11. De fortes similitudes entre G, F, PR et PIl sont observées dans les spectres UV-visible et infra-rouge, ainsi que les fragments de masse. Le produit G est soluble dans l'eau, le n-butanol, le 1-propanol, le méthanol et l'éthanol et insoluble dans le chloroforme, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle, le n-hexane et le toluène. Les RMN du proton et du carbone 13 ont permis d'élucider la structure de cette molécule qui s'est révélée être proche de PR, avec comme seule différence l'absence du second ose lié au carbone C7 du 4eme cycle du noyau anthracycline. L'antibiotique G représente donc une nouvelle molécule du groupe des mutactimycines et a ainsi été appelé mutactimycine G.

2.7.2 Antibiotiques de la. famille des macrolides Les antibiotiques P8, PlOa et PlOb . ne sont pas colorés. P8 est la molécule majoritairement produite par Saccharothrix sp. SA 103 après PIl (mutactimycine C). Les trois antibiotiques sont très solubles dans le méthanol, le n-butanol, l'éthanol, le 1 et 2-propnol, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le chloroforme et le dichlorométhane, mais insolubles dans l'eau et le n-hexane. Ces antibiotiques ont fait l'objet des mêmes études spectroscopiques que les mutactimycines décrites précédemment, ce qui a permis d'aboutir à la détermination de leurs structures chimiques.

Identification de PlOa à l'aldgamycine G L'antibiotique PlOa possède un poids moléculaire de 740 correspondant à la formule moléculaire C37H56O15. Le spectre UV-visible et très semblable à celui des aldgamycines et a montré un maximum à 216 et deux épaulements à 245 et 278 nnα. Le spectre infra-rouge présente plusieurs bandes d'absorptions qui indiquent la présence de groupements méthyle, méthoxyles, hydroxyles et une fonction carbonate. PlOa est soluble dans le n-butanol, le 1 et 2-propanol, le méthanol, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et l'éthanol et insoluble dans le n-hexane, le toluène et l'eau. La molécule PlOa a pu ainsi être identifiée à l'aldgamycine G, connue pour être sécrétée par Streptomycs avidinii. L'aldgamycine G est un macrolide neutre dont le cycle lactonique comporte 16 atomes sur lequel son reliés deux sucres méthylés, le mycinoe en position C14 et l'aldgarose en position C5.

Détermination des structures chimiques des nouveaux macrolides

Aldgamycine H L'antibiotique P8 possède un -poids .moléculaire de 714, soit une formule moléculaire C36H58O14. Ses propriétés physico-chimiques sont très semblable à celles de PlOa (aldgamycine G). Cependant, le spectre UV-visible de PlOb présente une intensité d'absorbance moindre à 245 et 278 nm et son spectre infra¬ rouge ne contient plus la bande d'absorption à 1800 cm"1 caractéristique du groupement carbonate comme c'est le cas de l'aldgamycine G. Le produit P8, après analyse de toutes ses données spectroscopiques a été identifié à une nouvelle aldgamycine nommée H qui se rapproche de l'aldgamycine E, mais elle diffère par l'absence de la fonction carbonate sur le sucre aldgarose qui est hydrolysée dans ce cas.

Swalpamycine B La molécule PlOb n'a pu être séparée du produit PlOa par HPLC et de ce fait, elle a été analysé en même temps que le produit PlOa sous forme de complexe. Elle possède un poids moléculaire de 698' et la formule chimique C36H58O13. Les analyses RMN du proton et du carbone 13 ont permis d'élucider la structure finale. Ainsi PlOa possède une structure chimique très semblable à celle de P8 et de la swalpamycine.

2.8 Activités microbiologiques des antibiotiques

L'activité microbiologique des mutactimycines PI l, PR, F et G et des macrolides P8, P10(a et b) est dirigée surtout contre les bactéries à Gram positif. Les bactéries les plus sensibles sont Micrococcus luteus et Klebsiella pneumoniae qui est la seule bactérie à Gram négatif à être sensible. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont de 5 μg/ml pour M. luteus et K. pneumoniae, 10 μg/ml pour Staphylococcus aureus CIP 53156, 40 μg/ml pour Bacillus subtilis, 50 μg/ml pour Listeria monocytogenes et 75 μl/ml pour Mycobacterium smegmatis. Les nouvelles molécules PR, F et G sont actives contre les mêmes microorganismes (à l'exception de L. monocytogenes). L'ensemble des molécules n'a aucune action contre S. aureus CIP 7625, les bactéries à Gram négatif Escherichia coli, Pseudomonas syringae pathovar syringae et Agrobacterium tumefasciens et contre la levure Saccharomyces cerevisiae et le champignon filamenteux Mucor romannianus.

L'activité des macrolides (aldgamycines G et H) et swalpamycine B est plus importante que celles des mutactimycines. En effet, les CMI ne sont que de 0,1 μg/ml pour K. pneumoniae, 1 μg/ml pour Bacillus subtilis, Micrococcus luteus et Staphylococcus aureus CIP 53156 qui sont les plus sensibles et respectivement 30 et 50 μg/ml pour Listeria monocytogenes et Mycobacterium smegmatis. Les

bactéries à :Gram négatif (sauf K.. pneumoniae). etles champignons sont résistants.

Test organisme MIC (ug/ml) (swalpamycine)

Bacillus subtilis ATCC 6633 1 Micrococcus luteus ATCC 9314 1 Staphylococcus aureus ClP 7625 > 100 Staphylococcus aureus CIP 53156 1 Listeria monocytogenes CIP 82110 30 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 50 Klebsiella pneumoniae CJP 82.91 0.1 Escherichia co/z ATCC 10536 ' > 100 Ps eudomonas syringae No 1882 > 100 Agrobacterium tumefasciens No 2410 > 100 Mucδfrïïmànniàήus NRRL 1829' - - . > 100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 4226 > 100

Test organisms MIC (μg/ml) of (aldgamycine H)

Bacillus subtilis ATCC 6633 10 Micrococcus luteus ATCC 9314 1 Staphylococcus aureus CIP 7625 > 100 Staphylococcus dur eus CIP 53156 5 Listeria monocytogenes CIP 82110 > 100 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 20 Klebsiella pneumoniae CIP 82.91 0.5 Escherichia co/z ATCC 10536 >100 Pseudomonas syringae No 1882 > 100 Agrobacterium tumefasciens No 2410 >100 Mύcor ramannianus NRKL 1829 >100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 4226 >100 Tableau 1 : Caractéristiques culturales de Saccharothrix sp. SA 103

Milieu Croissance Mycélium Mycélium Pigment aérien du substrat diffusible

Extrait de Bonne Abondant levure- sombre noirâtre extrait de Modéré (14) (16) malt agar Rosé (ISP No 2) jaunâtre

• • (29)

Farine Modérée Modéré Orange Orange d'avoine Rosé brunâtre • brunâtre agar (ISP jaunâtre (54) (54) No 3) pale (31)

Sels Modérée Modéré Orange Orange inorganiqu Rosé brunâtre brunâtre e-amidon brunâtre (54) (54) agar (33) (ISP No 4)

Bennett Bonne Abondant Brun Brun agar Brun rougeâtre rougeâtre rougeâtre sombre sombre clair (42) (44) (44)

Gélose Bonne Modéré à Rouge Rouge nutritive' abondant foncé foncé Rosé (13) (13)

jaunâtre

(29) Tableau 2 : Caractéristiques physiologiques de la souche Saccharothrix sp. SA 103.

Dégradation de Réduction de nitrate '+ Adénine - Production de pigments àrbutine + mélanoides _ Caséine + Gélatine - •+ - ' Décarboxylation du sodium : - rl- Esculine + Acétate - Guanine - Benzoate - Hypoxanthine - Butyrate + Amidon + . ---Citrate - Testostérone + Oxalate + Tween 80 + Propionate + Tyrosine + Pyruvate + Xanthine - Succinate - Adonitol - Tartrate L-Arabinose + Croissance à : + Cellobiose + 48°C + Dextrine + pH 5 + Dulcitol - pH 9 Erythritol - Tolérance au : + D-Fructose + Cristal violet (0.001%) + Galactose + Lysozyme (0.005%) + D-Glucose + Phénol (0.05%) -- Glycérol + Phénol (0.1%) + Inositόl - Tellurite de potassium (0.01%) + Lactose - Azide de sodium (0.001%) - . Mâltose. , . . Azide de.sodium (0.01%) , - D-Mannitol + Chlorure sodium (5%) D~Mann"ose + Résistance au : _ Mélézitose - Chlόramphénicol (25 /.g/ml) - Mélibiose - Cyclosérine (10 /.g/ml) - α-Méthyle-D-glucoside - Erythromycine (10 μg/nû) - ' D-Raffinose - Gentamicine (10 /.g/ml) - L-Rhamnose + Kanamycine (25 μg/nù) - Ribose + Novobiocine (10 /.g/ml) + Sorbitol - Oxytétracycline (25 /.g/ml) + Saccharose + Pénicilline • (25 μg/nû) - Tréhalose + Rifampicine (5 ^g/ml) - D-Xylose + Streptomycine (10 /.g/ml) - Vancomycine . (S μg/mS) Tableau 3 : Spectre antimicrobien des antibiotiques PR et Pl 1 :

Souches test CMI(μg/ml) PR PIl

Bacillus subtilis ATCC 6633 75 40 Micrococcus luteus ATCC 9314 50 5 Staphylococcus aureus CIP 7625 >100 >100 Staphylococcus aureus CIP 53156 50 10 Listeria monocytogenes CIP 82110 >100 50 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 >100 75 Klebsiella pneumoniae CIP 82.91 40 5 Escherichia coli ATCC 10536 >100 >100 JPseudomonas syringae ηo 1882 >100 >100 Agrobacterium tumefadens No 2410 >100 >100 Mucor ramannianus NRRL 1829 >100 >100 Saccharomyces cerevisiae ATCC 4226 >100 >100 Tableau 4. Propriétés physicochimiques des produits PR et Pl 1 (mutactimycine). mutactimycine PR PIl (mutactimycine C) Apparence Poudre rouge Poudre rouge Couleur dans H2O Acide Jaune Jaune Neutre Rouge Rouge Basique Violet-bleu Violet-bleu

Formule chimique C32H38O15 C27H30OH

Poids moléculaire 662 530

Nano-ESI-MS (m/z) Mode négatif 660.8 [M-H]-, 514.9, 528.8 [M-H]-, 351, 333, 354, 337, 319.1, 291.1 315, 294.2, 293.1

Mode positif 685.2 [M+Naf 539, 507, 553.1 [M+Na]+, 375, 360.9, 342.9 356.9, 198.3

UV λmax nm dans MeOH 219, 234, 250, 287, 478, 219, 234, 250, 287, 478, 496, 531 496, 531

IR vmaχ Cellule de diamant 3393, 2969, 2932,2878 3393, 2969, 2932,2878 (cm'1) 2841, 2709, 2360, 2113, 2841, 2709, 2360, 2113, 1611, 1583, 1444, 1408, 1611, 1583, 1444, 1408, 1379, 1352, 1285, 1238, 1379, 1352, 1285, 1238, 1213, 1133, 1110, 1070, 1213, 1133, 1110, 1070, 1048 1048 Solubilité relative Très soluble MeOH, EtOH, H2O MeOH, Me2CO, H2O, 72-BuOH, EtOH, 7-PrOH

Moyennement soluble Me2CO, w-BuOH, CH2Cl2, CHCl3, EtOAc, i-PrOH, 2-PrOH 2-PrOH

Insoluble CH2Cl2, CHCl3 ra-hexane, toluène EtOAc, n-hexane, toluène CCM (Valeur des Rf/ CD 0.16 0.44 OT) 0.58 0.64 (JS) 0.82 0.80

HPLC (Rt)b 31.74 min 35.65 min

aCCM sur gel de silice (MerckNo 5715). (I): EtOAc-MeOH (100:15). (U): n-BuOH- CH3COOH-H2O (3:1:1), (UJ): MeOH-CH2Cl2 (4:1). Conditions d'HPLC: Uptisphere C18 UP5ODB (250x7.8 mm, d.i.), Phase mobile: isocratique à 63% MeOH in H2O, Débit: 1.5 ml/min, Détection: UV (220 nm). Tableau 5. Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit PR dans du DMS0-J6 à 298 K et dans du DMF- dη k 278 K.

Position DMSO DMF δH δc δH δc 1 • ' '8:00 (d)' 121.0 ' ' ' 7,96 (d) 120.6 2 7.84 (br dd) nd 7.81 (dd) 135.3 3 7.66 (br) nd 7.68 (d) 124.1 4 nd 157.9 4a nd . 122.6 7 4.89 (m) 73.2 4.92 (m) 73.7 8 2.10 (dd) / 1.92 (dd) 43.3 2.16 (dd) / 1.98 (dd) 43.6 9 67.8 67.7 10 2.83 (d) / 2.61 (d) 38.3 2.84 (d) / 2.65 (d) 38.2 12a nd 136.0 6-OH nd nd 9-OH 4.70 (br) nd 9-Me 1.30 (s) 29.7 1.32 (s) 29.2 11-OH nd nd

V 5.16 (br s) 104.4 5.22 (br s) 104.7 2' 3.83 (m) 67.0 3.92 (m) 67.1 y 3.00 (dd) 81.5 3.04 (dd) 81.7 4' 3.33 a 71.0 3.44 (dd) 72.0 5' 3.64 (dq) 70.2 3.70 a 69.8 2'-OH 4.88 nd 3'-0Me ' ' 3!22 (s)' ' 56.9' ' 3!17 (S) 56.6 4'-OH 4.90 nd 5'-Me 1.21 (d) 18.7 • 1.17 (d) 18.0

1" 5.69 (br s) 99.1 5.73 (br s) 99.4 2" 4.00 (m) 71.0 4.09 (m) 71.3 3" 4.04 (dd) 70.9 4.10 (dd) 71.3 4" 3.35 a 72.4 3.42 (dd) 72.2 5" 3.52 (dq) 70.9 3.54 a 70.8 2"-OH 5.15 (br) nd 3"-OH 4.89 (br) nd 4"-OH 4.97 nd 5"-Me 1.09 (d) 18.7 1.05 (d) 17.9

Seul les signaux détectés sont représentés. aSignal sous le HOD résiduel, nd: non détecté. Tableau 6. Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit Pl 1 dans du OMSO-ά6 à 298 K.

Position δH δc

1 7.81 (m) 119.4 2 7.83 (m) 136.0 3 7.56 (m) 119.1 4 161.5 4a 120.8 5 186.9 5a 111.1 6 157.4 6a 136.0 7 4,86 (dd) 73.5 2.13 (dd) / 1.93 8 (dd) 42.8 9 68.2 10 2.76 (d) / 2.62 (d) 37.4 10a 136.8 11 155,4 l ia 111.4 12 187.4 12a 135.7 4-OMe 3.95 (s) 56.2 6-OH 14.13 (s)a 9-OH 4.78 (s) 9-Me 1.31 (s) 28.1 H-OH 13.19 (s)a

r 5.12 (d) 104.2 2' 3.87 (m) 67.1 3f 3.02 (dd) 81.2 4' 3.32 (ddd) 71.7 5' 3.63 (dq) 69.8 2'-OH 4.82 (d) 3'-0Me 3.23 (s) 56.1 4'-OH 4.91 (d) 5'-Me 1.21 (d) 17.0

aSignaux pouvant être interchangeables. Tableau 7. Propriétés physico-chimiques du composé F.

Mutactimycine F

apparence Poudre rouge vif Formule chimique C26H28OH

Poids moléculaire 516 Nano-ESI-MS (m/z) Mode négatif 514.9 [M-H]-

Mode positif 539.11 [M+Na]+

UV λmaχ nm ans MeOH 219, 234, 252, 286, 473, 494, 531

IR vmax Cellule de diamant (cm"!) 3351, 2970, 2927,2854, 2360, 2336, 2114, 1981, 1798, 1610, 1582, 1444, 1406, 1381, 1356, 1271, 1240, 1215, 1137, 1091, 1069, 1048

Solubilité relative Très soluble n-BuOH, 7-PrOH

Moyennement soluble MeOH, EtOH

Insoluble H2O, CH2Cl2, CHCl3 EtOAc, Me2CO, w-hexane, toluène

CCM (valeur des Rf)a (I) 0.30 (π) 0.62 (EQ 0.78

HPLC (Rt)b 22.25 min

aCCM sur gel de silice (Merck No 5715). (Tj: EtOAc-MeOH (100:15). (H): n- BuOH- CH3COOH-H2O (3:1:1). (IH): MeOH-CH2Cl2 (4:1). Conditions d'HPLC: Uptisphere C18UP5ODB (250x7.8 mm, d.i.), Phase mobile: isocratique à 63% MeOH in H2O, Débit: 1.5 ml/min, Détection: UV (220 nm). Tableau 8. Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit F dans du DMSO-J6 à 298 K.

Position δH δc 1 7.91 (m) 120.5 . 2 7.90 (m) 137.0 3 . ' 7.64 (m) ' 119.8 4 161.6 4a 119.8 5 187.4 5a 111.4 6 157.5 6a 137.3 7 4.90 (dd) 73.2 8 2.13 (dd) / 1.94 (dd) 43.3 9 67.8 10 2.83 (d) / 2.64 (d) 38.3 10a 137.0 11 155.5 11a 111.5 12 187.3 12a 135.7 OMe-4 3.99 (s) 57.5 OH-6 14.16 (br s)a OH-9 4.78 (s) Me-9 1.30 (s) 29.8 . OH-11 . . I3.26.(br s)a r . 5.07 (d) 104.6 2' 3.61 (m) 71.4 3' • 3.30 (ddd) 71.5 4' 3.24 (ddd) 72.7 51 3.60 (dq) 70.2 OH-2' 4.78 (d) OH-31 4.47 (d) OH-41 4.77 (d) Me-5' 1.20 (d) 19.8 aSignal sous le HOD résiduel, nd: non détecté. Tableau 9. Propriétés physico-chimiques du composé G.

Apparence Poudre rouge vif Formule chimique C25H26O11

Poids moléculaire 502 Nano-ESI-MS (m/z) Mode négatif 500.9 [M-H]-, 355, 337, 319.2, 291.2

UV λmax ran dans MeOH 219, 234, 252, 286, 473, 494, 531

ER vmaχ Cellule de diamant 3351, 2970, 2927,2854, 2360, 2336, (cm"1) 2114, 1981, 1798, 1610, 1582, 1444, 1406, 1381, 1356, 1271, 1240, 1215, 1137, 1091, 1069, 1048

Solubilité relative Très soluble ra-BuOH, i-PrOH,

Moyennement soluble MeOH, EtOH,

Insoluble H2O, CH2Cl2, CHCl3 EtOAc, Me2CO, n-hexane, toluène

CCM (valeurs des Rf)a CQ 0.30 (H) 0.62 (HO 0.78

HPLC (Rt)b 22.24 min

aCCM sur gel de silice (Merck No 5715). (I): EtOAc-MeOH (100:15).

CH3COOH-H2O (3:1:1). (HQ: MeOH-CH2Cl2 (4:1). Conditions d'HPLC: Uptisphere C18UP5ODB (250x7.8 mm, d.i.), Phase mobile: isocratique à 63% MeOH in H2O, Débit: 1.5 ml/min, Détection: UV (220 nm). Tableau 10. Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit G dans du OMSO-d6 à 298 K.

aSignaux pouvant être interchangeables. l'

Tableau 11 : Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit P8 (aldgamycine H) dans du CD3OD et dans du DMSO-D8 à 298K.

nd : non détecté Tableau 12. Propriétés physicochimiques des produits P8 et PlOa.

P8 PlOa Apparence Poudre incolore Poudre incolore Formule chimique C36H58O14 C37H56O15

Poids moléculaire 714 740 Nano-ESI-MS (m/z) Mode positif 737.4 [M+Na]+, 563.3, 763.44 [M+Na]+, 545.2, 389.2, 371.1, 589.27, 563, 571.24, 289.1 559.19, 545.29, 417.16, .389.16, 371.1.6, 289.02 UV λmaχ nm dans MeOH 216.73, épaulements à 216.73, épaulement 245.71 et 280 245.71 et 278.09

IR vmaχ Cellule de diamant 3431, 2970, 2931, 2880, 3361, 2968, 2920, 2851, (cm"1) 1712, 1689, 1654, 1620, 1799, 1712, 1653, 1623, 1581, 1454, 1416, 1382, 1593, 1562, 1508, 1457, 1354, 1326, 1279, 1263, 1417, 1383, 1356, 1324, 1236, 1172; 1159; " 1282, 1238, 1194, 1173, 1117,1082 1159, 1117, 1084, 1047 Solubilité relative Très soluble MeOH, EtOH, Me2CO, MeOH, EtOH, Me2CO, «-BuOH, i-PrOH, 2- R-BuOH, 7-PrOH, 2- PrOH, CH2Cl2, EtOAc3 PrOH, CH2Cl2, EtOAc, CHCl3 CHCl3

Insoluble n-hexane, toluène, H2O n-hexane, toluène, H2O CCM (valeur du Rf/ 00 0.63 0.68 (H) 0.71 0.74 (m) 0.86 0.88

HPLC (Rt)b 23.21 min 28.38 min

aCCM sur gel de silice (MerckNo 5715). (I): EtOAc-MeOH (100:15). (H): n- BuOH- CH3COOH-H2O (3:1:1). (IH): MeOH-CH2Cl2 (4:1). Conditions d'HPLC: Uptisphèfe C18UPSODB (250x7.8 mm, d.i.), Phase mobile: isocratique à 63% MeOH in H2O, Débit: 1.5 ml/min, Détection: UV (220 nm). l'

Tableau 13. Assignements des données RMN du H et du 13 C/ du produit PlOa (aldgamycin G) dans du CD3OD à 298K.

nd : non détecté Tableau 14. Assignements des données RMN du 1H et du 13C du produit PlOb (swalpamycine B) dans du CD3OD à 298K.

nd : non détecté