Die vorliegende Erfindung betrifft neue Wirkstoffe (Spiröbenzofuranlactam-Derivate), die von dem Mikroorganismus Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, während der Fermentation gebildet werden, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung als Arzneimittel, Spirobenzofuranlactam-Derivate enthaltende Arzneimittel sowie den Mikroorganismus Stachybotris atra ST002348, DSM 14952.

Das Plasminogen-Aktivierungssystem umfaßt eine Enzymkaskade, welche die kontrollierte, lokale Bildung des proteolytischen Enzyms Plasmin ermöglicht. Die Bildung von Plasmin spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Innerhalb dieser Enzymkaskade wird die Umwandlung des Zymogens Plasminogen in das proteolytisch aktive Plasmin entweder durch tPA (tissue type plasminogen activator) oder uPA (urokinase type plasminogen activator) aktiviert. Die Plasminaktivtät kann auf verschiedenen Ebenen kontrolliert bzw. geregelt werden. Die Aktivität von tPA und uPA wiederum wird durch PAI-1 und PAI-2 kontrolliert. Während tPA der wichtigste Plasminogen-Aktivator bei der Fibrinolyse ist, spielt uPA eine wichtige Rolle bei der Plasminbildung an Stellen, wo ein Abbau extrazellulärer Matrix stattfindet. Während uPA sowohl durch PAI-1 (Plasminogen-Aktivator Inhibitor 1) als auch PAI-2 reguliert wird, gibt es Hinweise darauf, daß tPA nur von PAI-1 beeinflusst wird. PAI-1 spielt somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Fibrinbildung und Fibrinolyse (J. D. Vassalli et al., J. Clin. Invest., 1991,88, 1067-1072). Viele Studien erbrachten Hinweise darauf, daß ein erhöhter PAI-1 Spiegel einen Risikofaktör für kardio- vaskuläre Erkrankungen darstellt. Erhöhte PAI-1 Konzentrationen wurden unter anderem nachgewiesen bei koronarer Herzerkrankung, akutem Myokardinfarkt, instabiler Angina pectoris, Venenthrombose und venösen Thromboembolien (P. J.

Declerck et al., J. Intern. Med., 1994,236, 425-432 ; H. A. Dawsons, Atherosclerosis, 1992,95, 105-117). Diese klinischen Studien weisen darauf hin, daß PAI-1 ein neuartiges Target darstellt für die Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verminderten Fibrinolyse einhergehen, beispielsweise verminderter Wundheilung (Charlton P., Exp. Opin. Invest. Drugs, 1997,6, 539-554).

Erhöhte PAI-1 Werte werden auch mit arterieller Thrombose, Arteriosklerose, Insulinresistenz und makrovaskulären Verletzungen bei Typ- !) Diabetes mellitus- Patienten, Hypoxie, septischem Schock, Lungenentzündung und Lungenfibrose in Verbindung gebracht, sowie darüber hinaus mit Krebserkrankungen, insbesondere Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Gehirntumoren, Ovarialtumoren, Speiseröhrenkrebs, Nierenkrebs, Muskelzellkarzinom, insbesondere Kopf-und Nackenmuskelkarzinom, wobei PAI-1 eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten und der Metastasierung von Krebserkrankungen zugesprochen wird, insbesondere bei der Proteolyse, Adhäsion, Mobilisierung, Invasion, Chemotaxe, Proliferation und Angiogenese (P. Carton, Exp. Opin. Invest. Drugs (1997), 6 (5), 539-554 ; F.

Frankenne et al., Expert Opinion on Therapeutic Targets, 1999,3 (3), 469-481). Eine Behandlung der einleitend genannten Erkrankungen ist daher durch Inhibierung von PAI-1 möglich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Inhibitoren des Plasminogen- Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) bereitzustellen.

Es ist überraschend gefunden worden, dass der Mikroorganismus-Stamm Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, Verbindungen zu bilden vermag, die den Plasminogen-Aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) in sehr geringen Konzentrationen wirksam hemmen. Die Verbindungen der Formel I hemmen die Inhibierung der enzymatischen Aktivität von tPA durch PAI-1 und sind demzufolge geeignet für die Behandlung und/oder Prophylaxe von koronarer Herzerkrankung, akutem Myokardinfarkt, instabiler Angina pectoris, Venenthrombose und venösen Thromboembolien, arterieller Thrombose, Arteriosklerose, Insulinresistenz und makrovaskulären Verletzungen bei Typ-li Diabetes mellitus-Patienten, Hypoxie, septischem Schock, Lungenentzündung und Lungenfibrose, sowie Krebserkrankungen, insbesondere Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Gehirntumoren, Ovarialtumoren, Speiseröhrenkrebs, Nierenkrebs, Muskeizelikarzinom, insbesondere Kopf-und Nackenmuskelkarzinom.

Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen für eine antithrombotische Therapie zur Behandlung und Prophylaxe bei Patienten mit koronaren Herzerkrankungen und thrombotischen Erkrankungen des peripheren, venösen Systems geeignet.

Die Erfindung betrifft somit Verbindungen der Formel (I), im folgenden auch Spirobenzofuraniactam-Derivate genannt, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C1-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C2-C6-Alkinyl oder C5-C14-Aryl bedeutet, worin Alkyl, Alkenyl, Alkinyl und Aryl unsubstituiert oder ein-bis dreifach durch einen Rest aus der Gruppe-OH, =O, -O-C1-C6-Alkyl, -O-C2- C6-Alkenyl,-O-Cs-C14-Aryl,-N H-C1-C6-Alkyl,-NH-C2-C6-Alkenyl,-NH [-C (=O)-(C1- C6-Alkyl)],-NH [-C (=0)- (C5-C14-Aryl)],-NH2 oder Halogen substituiert sind, R3-OH,-O-R1 oder-NH-R1, und R4 H, C1-C6-Alkyl, C2-C6-Alkenyl, C5-C14-Aryl oder- (C1-C6-Alkyl)- (C5-C14-Aryl) bedeutet, sowie deren physiologisch verträglichen Salze und/oder offensichtliche chemische Äquivalente.

Vorzugsweise sind RI und R2 unabhängig voneinander gleich H oder C1-C6-Alkyl, besonders bevorzugt H, R3 gleich OH oder-O-(C1-C6-Alkyl), besonders bevorzugt OH, und R4 gleich C1-C6-Alkyl oder- (C1-C6-Alkyl)- (C5-C14-Aryl), besonders bevorzugt Benzyl, 2-Butyl oder 1-(2-Methyl-propyl).

Besonders bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (I), wobei R1 und R2 H bedeuten, R3 OH bedeutet und R4 die oben genannte allgemeine oder bevorzugte Bedeutung hat.

Ferner betrifft die Erfindung bevorzugt eine Verbindung der Formel (I) gekennzeichnet durch eine Verbindung der Formel (II), eine Verbindung der Formel (III) oder eine Verbindung der Formel (IV) oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.

Chiralitätszentren in den Verbindungen der Formel (I), (II), (III) und (IV) können, wenn nicht anders angegeben, in der R-oder in der S-Konfiguration vorliegen. Die Erfindung betrifft sowohl die optisch reinen Verbindungen als auch Stereoisomerengemische wie Enantiomerengemische und Diasteromerengemische.

C1-C6-Alkyl bedeutet ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 C-Atomen, bevorzugt mit 1 bis 4 C-Atomen, z. B. Methyl, Ethyl, i-Propyl, tert. Butyl und Hexyl.

C2-C6-Alkenyl bedeutet ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 6 C- Atomen, das einfach, zweifach oder dreifach ungesättigt ist, z. B. Allyl, Crotyl, 1- Propenyl, Penta-1, 3-dienyl und Pentenyl.

C2-C6-Alkinyl bedeutet ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 6 C- Atomen, das einfach oder zweifach ungesättigt ist, z. B. Propinyl, Butinyl und Pentinyl.

C5-C14-Aryl bedeutet eine Arylgruppe mit 5 bis 14 C-Atomen, z. B. Phenyl, Benzyl oder 1-oder 2-Naphthyl, die substituiert oder mit ein, zwei oder drei Substituenten aus der Gruppe Halogen, z. B. Chlor, Brom, Fluor, C1-C4-Alkyl, z. B. Methyl, Hydroxy, C1- C4-Alkoxy, z. B. Methoxy oder mit Trifluormethyl unsubstituiert sind.

Halogen bedeutet ein Element aus der Gruppe Fluor, Chlor, Brom oder lod.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, oder einer seiner Varianten oder Mutanten unter geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium fermentiert wird, bis sich eine oder mehrere der Verbindungen der Formel (I) in dem Kulturmedium anhäufen und anschließend aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls in chemische Äquivalente und/oder ein physiologisch verträgliches Salz umgewandelt wird.

Vorzugsweise wird der Stamm Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, seine Mutanten und/oder Varianten in einer Nährlösung oder einem Festmedium (auch als Kulturmedium bezeichnet) mit Kohlenstoff-und Stickstoffquelle sowie den üblichen anorganischen Salzen fermentiert, bis sich die erfindungsgemäßen Verbindungen in dem Kulturmedium anhäufen, anschließend werden die Verbindungen aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls in die einzelnen aktiven Komponenten aufgetrennt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Fermentation im Labormaßstab (Milliliter-bis Literbereich) und für den industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) eingesetzt werden.

Eine stark produzierende Kolonie von Stachybotris atra wurde in einer Vorkultur vermehrt. Der Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, 3300 Braunschweig, Deutschland, nach den Regeln des Budapester Vertrages am 23.04. 2002 unter der Nummer DSM 14952 bzw. dem vom Hinterleger zugeteiltem Bezugszeichen ST002348 von Aventis Pharma Deutschland GmbH hinterlegt.

Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, besitzt auf Malz-Agar ein weiß bis orangefarbenes Mycel. Der Stamm bildet für die Art charakteristische hyaline ellipsoide warzige Konidien (8-11 x 6-11 pm).

Anstelle des Stammes Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisieren.

Eine Mutante ist ein Mikroorganismus, in dem ein oder mehrere Gene des Genoms modifiziert wurden, wobei das Gen oder die Gene funktionell und vererbbar erhalten bleiben, die für die Fähigkeit des Organismus verantwortlich sind, die erfinderische Verbindung zu produzieren.

Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) ; 2-Hydroxy-4- methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden, oder wie von Brock et al. in"Biology of Microorganisms", Prentice Hall, Seite 238-247 (1984) beschrieben.

Eine Variante ist ein Phenotyp des Mikroorganismus. Mikroorganismen haben die Fähigkeit, sich an ihre Umgebung anzupassen und zeigen daher ausgeprägte physiologische Flexibilität. Bei der phenotypischen Anpassung sind alle Zellen des Mikroorganismus involviert, wobei die Art der Veränderung nicht genetisch konditioniert ist und unter veränderten Bedingungen reversibel ist (H. Stolp, Microbial ecology: organismus, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, Seite 180, 1988).

Das Screening nach Mutanten und Varianten, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisieren, erfolgt nach folgendem Schema : -Herstellen von Mutanten und/oder Varianten nach ansich bekannten Methoden ; - Kultivieren der dabei erhaltenen Mutante und/oder Variante ; - Lyophilisierung der Schüttelkulturen ; - Extraktion des Lyophilisats mit einem organischen Lösungsmittel ; -Extraktion der Verbindung aus dem Kulturfiltrat mit Festphasen ; -Analytik mittels HPLC, DC oder durch Testen der biologischen Wirksamkeit ; -optional Aufklärung der Taxonomie der Mutante und/oder Variante.

Die im folgenden beschriebenen Fermentationsbedingungen gelten für Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, sowie Mutanten und Varianten davon.

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, die Spirobenzofuranlactam-Derivate.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose, Saccharose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt oder Stärke. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht : Aminosäuren ; Peptide ; Proteine ; Abbauprodukte von Proteinen und Peptiden, insbesondere synthetisch bzw. biosynthetisch gewonnene Peptide, beispielsweise Casein, Peptone oder Tryptone ; Fleischextrakte ; Hefeextrakte ; gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze ; Destillationsrückstände der Alkoholherstellung ; Fleischmehle oder Hefeextrakte ; Ammoniumsalze ; Nitrate. Übliche anorganische Salze sind beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate eines Alkali-oder Erdalkalimetalles, von Eisen, Zink, Kobalt oder Mangan.

Die Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die etwa 0,1 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 2 % Stärke, 0,2 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 1 % Hefeextrakt und 0,2 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 2 % Glucose enthält. Die Angaben in Prozent sind jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

In dieser Nährlösung bildet Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, ein Gemisch aus Spirobenzofuranlactam-Derivaten. Je nach Zusammensetzung der Nährlösung kann der mengenmäßige Anteil eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Spirobenzofuranlactam-Derivate variieren.

Die Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Sie kann in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 30°C, insbesondere bei 22 bis 27°C durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 4 und 8 liegen, vorzugsweise zwischen 5 und 6. Man kultiviert den Mikroorganismus unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 48 bis 200 Stunden, vorzugsweise 72 bis 168 Stunden.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigent-liche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10 bis 1 : 100, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man, z. B., indem man ein Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 36 bis 12Q Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 3 bis 21 Tage, bevorzugt 4 bis 10 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Malz-Hefe-Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes der Kulturen oder des Mycelvolumens sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Hochleistungs- flüssigchromatographie (HPLC), oder Ausprüfen der biologischen Aktivität überwacht werden.

Das im folgenden beschriebene Isolierungsverfahren dient zur Aufreinigung der erfindungsgemäßen Spirobenzofuranlactam-Derivate der Formel (I) : Die Isolierung bzw. Aufreinigung eines erfindungsgemäßen Spirobenzofuranlactam- Derivates aus dem Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Naturstoffe. Zum Testen der Konzentration der jeweiligen Spirobenzofuranlactam- Derivate im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen kann die HPLC verwendet werden, wobei die Menge der gebildeten Substanz zweckmäßig mit einer Eichlösung verglichen wird.

Zur Isolierung werden die Kulturbrühe oder die Kultur samt Festmedium lyophilisiert, anschließend werden die Spirobenzofuranlactam-Derivate vom Lyophilisat mit einem gegebenenfalls mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die organische Lösungsmittelphase enthält die erfindungsgemäßen Naturstoffe, sie wird gegebenenfalls im Vakuum konzentriert und weiter aufgereinigt.

Die weitere Aufreinigung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Materialien, vorzugsweise z. B. an Molekularsieben, an Kieselgel, Aluminiumoxid, an lonenaustauschern oder an Adsorberharzen bzw. an Umkehrphasen (reversed phase, RP). Mit Hilfe dieser Chromatographie werden die Spirobenzofuranlactam-Derivate getrennt. Die Chromatographie der Spirobenzofuranlactam-Derivate erfolgt mit gepufferten wässrigen Lösungen oder Gemischen von wässrigen und organischen Lösungen.

Unter Gemischen von wässrigen oder organischen Lösungen versteht man alle mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel, vorzugsweise Methanol, 2-Propanol und Acetonitril, in einer Konzentration von 5 bis 80 % Lösemittel, vorzugsweise 20 bis 50 % Lösemittel oder auch alle gepufferten wässrigen Lösungen, die mit organischen Lösemitteln mischbar sind. Die zu verwendenden Puffer sind die gleichen wie oben angegeben.

Die Trennung der Spirobenzofuranlactam-Derivate aufgrund ihrer unterschiedlichen Polarität erfolgt mit Hilfe der Reversed Phase Chromatographie, beispielsweise an MCI (É) (Adsorberharz von Mitsubishi, Japan) oder Amberlite XADd3 (TOSOHMS), oder an weiteren hydrophoben Materialien, wie zum Beispiel an RP-8-oder RP-18-Phasen.

Außerdem kann die Trennung mit Hilfe der Normalphasen-Chromatographie, zum Beispiel an Kieselgel, Aluminiumoxid und ähnlichen erfolgen.

Die Chromatographie der Spirobenzofuranlactam-Derivate erfolgt mit gepufferten oder angesäuerten wäßrigen Lösungen oder Gemischen von wäßrigen Lösungen mit Alkoholen oder anderen, mit Wasser mischbaren organischen Lösemitteln. Als organisches Lösemittel wird vorzugsweise 2-Propanol und Acetonitril verwendet.

Unter gepufferten oder angesäuerten wäßrigen Lösungen versteht man z. B. Wasser, Phosphatpuffer, Ammoniumacetat, Citratpuffer in einer Konzentration von bis zu 0,5 M sowie Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder allen handelsüblichen, dem Fachmann bekannten Säuren, vorzugsweise in einer Konzentration von bis zu 1 %.

Bei gepufferten wäßrigen Lösungen wird 0,1 % Ammoniumacetat besonders bevorzugt.

Chromatographiert wurde mit einem Gradienten, der mit 100 % Wasser beginnt und mit 100 % Lösemittel endet, vorzugsweise wurde ein linearer Gradient von 20 bis 100 % 2-Propanol oder Acetonitril gefahren.

Alternativ kann auch eine Gelchromatographie oder die Chromatographie an hydro- phoben Phasen erfolgen. Die Gelchromatographie wird an Polyacrylamid-oder Mischpolymergelen durchgeführt, wie z. B. Bioge !-P 2@ (Fa. Biorad) oder Fractogel TSK How. 40 (Fa. Merck, Deutschland oder Toso Haas, USA). Die Reihenfolge der vorgenannten Chromatographien ist umkehrbar.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin alle offensichtlichen chemischen Äquivalenten der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I). Solche Äquivalente sind Verbindungen, die einen geringfügigen chemischen Unterschied aufweisen, also die gleiche Wirkung haben oder sich unter milden Bedingungen in die erfindungsgemäßen Verbindungen umwandeln. Zu den genannten Äquivalenten gehören z. B. auch Salze, Reduktionsprodukte, Oxidationsprodukte, Ester, Ether, Acetale oder Amide der Verbindungen der Formel (I) sowie Äquivalente die der Fachmann mit Standardmethoden herstellen kann, darüber hinaus alle optische Antipoden, Diastereomere und alle stereomere Formen.

Unter physiologisch verträglichen Salzen von Verbindungen der Formel (I) versteht man sowohl deren organische als auch anorganische Salze, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418 (1985)) beschrieben sind. Aufgrund der physikalischen und chemischen Stabilität und der Löslichkeit sind für saure Gruppen unter anderem Natrium-, Kalium-, Calcium- und Ammoniumsalze bevorzugt ; für basische Gruppen sind unter anderem Salze der Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder von Carbonsäuren oder Sulfonsäuren, wie z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure und p-Toluolsulfonsäure bevorzugt.

Ester, Ether, Amide und Acetale können nach literaturbeschriebenen Methoden hergestellt werden, z. B. in Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992 oder Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, T. W.

Greene & P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise mit LiAIH4 zum Alkohol reduziert werden oder unter Zugabe katalytischer Mengen einer anorganischen Säure (beispielsweise H2SO4 oder HCI) verestert werden. Die Hydroxygruppen können beispielsweise unter den Bedingungen der Williamson'schen Ethersynthese verethert werden.

Zum Nachweis der Inhibitoren von PAI-1 bedient man sich eines Testes, bei dem die Aktivierung eines spezifischen Substrates durch tPA in Anwesenheit einer definierten Menge PAI-1 und der jeweils zu untersuchenden Substanz gemessen wird. tPA wird durch PAI-1 inhibiert. Eine Hemmung von PAI-1 wirkt sich in einer erhöhten tPA- Aktivität aus. Die enzymatische Aktivität von tPA wird colorimetrisch vermessen, indem ein chromogenes Substrat eingesetzt wird, welches sich nach Amidolyse färbt.

IC5o-Werte für die Spirobenzofuranlactam-Derivate sind in der Tabelle 1 angegeben : ICso-Wert Verbindung der Formel (II) 41 uM Verbindung der Formel (III) 66, uM Verbindung der Formel (IV) 35 uM Als Inhibitoren von PAI-1 können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe der einleitend genannten Erkrankungen verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung der Formel (I) oder eines physiologisch verträglichen Salzes derselben als Arzneimittel in der Human-oder Tiermedizin bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels in der Human-oder Tiermedizin, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronarer Herzerkrankung, akutem Myokardinfarkt, instabiler Angina pectoris, Venenthrombose und venösen Thromboembolien, arteterieller Thrombose, Arteriosklerose, Insulinresistenz und makrovaskulären Verletzungen bei Typ-t ! Diabetes mellitus-Patienten, Hypoxie, septischem Schock, Lungenentzündung und Lungenfibrose, sowie Krebserkrankungen, insbesondere Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Gehirntumoren, Ovarialtumoren, Speiseröhrenkrebs, Nierenkrebs, Muskeizelikarzinom, insbesondere Kopf-und Nackenmuskelkarzinom, besonders bevorzugt eines Arzneimittels zur Gerinnungshemmung zur Behandlung von und/oder als Prophylaxe für thromboembolische Erkrankungen.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel mit einem Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel (I), wobei die Verbindung oder die Verbindungen der Formel (I) grundsätzlich als solche in Substanz verabreicht werden kann oder bevorzugt in Mischung mit einem oder mehreren der üblichen pharmakologisch geeigneten Träger-oder Hilfsstoffen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im festen Zustand und in Lösungen im pH-Bereich zwischen 3 und 8, insbesondere 5 und 7, stabil und lassen sich damit in übliche galenische Zubereitungen einarbeiten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-) Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit-oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden.

Übliche pharmakologisch geeignete Träger-oder Hilfsstoffe sind beispielsweise Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische oder pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole.

Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis einer oder mehrerer Verbindungen der erfindungsgemäßen Spirobenzofuranlactam-Derivate enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 500 mg, bevorzugt jedoch etwa 0,1 bis 200 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 200 mg, vorzugsweise aber etwa 0,5 bis 100 mg, pro Tag betragen.

Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten äls auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) optional mit einem oder mehreren der üblichen Träger-oder Hilfsstoffe in eine geeignete Darreichungsform bringt.

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert.

Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.

Beispiel 1 : Herstellung einer Glycerinkultur von Stachybotris atra ST002348, DSM 14952 100 mL Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glukose 1,0% (NH4) 2HPO4 0,05 %, pH 6,0) wurden in einem sterilen 300 mL Erlenmeyerkolben mit dem Stamm Stachybotris atra ST002348, DSM 14952, beimpft und 6 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 1, 5 mL dieser Kultur wurden anschließend mit 2,5 mL 50 % igem Glycerin verdünnt und bei-135°C gelagert.

Beispiel 2 : Herstellung einer Vorkultur im Erlenmeyerkolben von Stachybotris atra ST002348, DSM 14952 Ein 300 mL Erlenmeyerkolben mit 100 mL der folgende Nährlösung : Malzextrakt 2,0 %, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4) 2HPO4 0,05 %, pH 6,0 wurde mit einer auf einem Schrägröhrchen/Petrischale (gleiche Nährlösung, jedoch mit 2 % Agar) gewachsenen Kultur oder mit 1 mL einer Glycerinkultur (s. Beispiel 1) beimpft und auf. einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25 °C inkubiert.

Beispiel 3 : Herstellung einer Hauptkultur im Erlenmeyerkolben von Stachybotris atra ST002348, DSM 14952 Ein 300 mL Erlenmeyerkolben mit 100 mL der folgende Nährlösung : 0,5 % lösliche Stärke, 0,5 % Maisstärke, 1 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 0. 5%"cornsteep"und 0.2% CaCO3, wurde mit 2 mL einer Vorkultur (s. Beispiel 2) beimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25° C inkubiert. Die maximale Produktion einer oder mehrerer Verbindungen der erfindungsgemäßen Spirobenzofuranlactam-Derivate ist nach ca. 120 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 L Fermentern genügte eine 48 bis 96 Std. alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 10 %) aus der gleichen Nährlösung.

Beispiel 4 : Herstellung der Spirobenzofuranlactam-Derivate Ein 30 L Fermenter wurde unter folgenden Bedingungen betrieben : Nährmedium : 5 g/L Stärke 5 g/L Maisstärke 5 g/L Cornsteep flüssig 5 g/L Hefeextrakt 5 g/L CaC03 pH 6,0 (vor der Sterilisation) Inkubationszeit : 96 Stunden Inkubationstemperatur : 25° C Rührergeschwindigkeit : 150 UpM Belüftung : 15 L Min'1 Durch wiederholte Zugabe von ethanolischer Polyollösung konnte die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum wurde nach ca. 72 bis 120 Stunden erreicht.

Beispiel 5 : Isolierung der Spirobenzofuranlactam-Derivate aus den Schüttelkulturen von Stachybotris atra ST002348, DSM 14952 Nach Beendigung der Fermentation Stachybotris atra ST002348, DSM 14952 wurde die Kulturbrühe von 50 Schüttelkolben (jeweils 100 mL Kulturbrühe) mitsamt der Biomasse lyophilisiert und das Lyophilisat mit 2 x 5 Liter Methanol extrahiert. Die wirkstoffhaltige, methanolische Lösung wurde durch Filtration vom Rückstand befreit und im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde mit Wasser verdünnt und auf eine vorbereitete 1,0 Liter MCI GEL, CHP20P-Säule aufgetragen. Eluiert wurde mit einem Gradienten von Wasser nach 100% Acetonitril in 60 Minuten. Der Säulendurchfluß (30 mL pro Minute) wurde fraktioniert aufgefangen (je 30 mL) und die Spirobenzofuranlactam-Derivate enthaltenden Fraktionen (Fr. 26-40) zusammengefaßt. Nach Konzentrieren im Vakuum und anschließender Lyophilisierung wurden 2,9 g eines hellrosa Pulvers isoliert.

Beispiel 6 : Vortrennung der Spirobenzofuranlactam-Derivate durch RP18- Chromatographie.

Circa 1 g des nach Beispiel 5 gewonnenen Produktes wurden auf eine LiChrospher 100 RP-18 (e) Säule (Größe : 50 mm x 250 mm ; Fa. Merck, Darmstadt) aufgetragen und mit einem Gradienten von 20 % Acetonitril (+ Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure-Zusatz) nach 90 % Acetonitril mit einer Flußrate von 45 mL pro Minute eluiert. Der Säulenausfluß wurde fraktioniert (45 mL) aufgefangen, wobei sich hauptsächlich in den Fraktionen 95 bis 112 Spirobenzofuranlactam-Derivate befanden. Sie wurden zusammengefaßt, im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und anschließend lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 170 mg.

Beispiel 7 : Reinigung der Spirobenzofuranlactam-Derivate.

100 mg des nach Beispiel 6 isolierten und angereicherten Gemisches wurden auf eine LUNA 5p C18 (2) Säule (Größe : 21 mm x 250 mm) aufgetragen und mit einem Gradienten von 30 bis 85 % Acetonitril (+ Wasser mit 0,05 % TFA-Zusatz) chromatographiert. Der Durchfluß des Elutionsmittels betrug 25 mL pro Minute, die Fraktionsgröße 25 ml. Fraktion 32 enthielt die Verbindung der Formel (II) und ergab nach Lyophilisieren 6,1 mg. Fraktion 33 enthielt die Verbindung der Formel (III) und ergab nach Lyophilisieren 5,5 mg. Fraktion 34 enthielt die Verbindung (IV) und ergab nach Lyophilisieren 5,2 mg.

Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen lassen sich wie folgt zusammenfassen : Beispiel 8 : Charakterisierung der Verbindung der Formel (tt) : Summenformel : C32H39NO6 Molekulargewicht : 533,67 UV-Maxima : 248,348 Tabelle 2 : 1H-und 13C-chemische Verschiebungen von Verbindung (II) in DMSO- d6 bei 300K 1H 13C a) 1 1. 73/0. 92 23. 8 2 1. 81/1. 40 24. 8 3 3. 18 73. 3 5 2.01 39.3 6 1. 46/1. 40 20. 4 7 1. 53/1. 39 30. 7 8 1.77 36.4 11 3. 10/2. 73 31. 6 12 0. 59 15. 5 13 0.88 28. 6 14 0. 79 22. 3 15 0. 94 15. 8 2'-OH 9. 68 3' 6.49 100. 8 8' 4. 26 44.3 2"5. 11 54. 5 3" 3.33/3.27 34.4 5"7. 22 128. 2 6" 7.25 128. 4 7"7. 14 126. 4 a) Die Werte für die 13C-chemischen Verschiebungen werden nur auf eine Nachkommastelle angegeben, da sie aus dem HMQC-Spektrum bestimmt wurden.

Beispiel 9 : Charakterisierung der Verbindung der Formel (III) : Summenformel : C29H41NO6 Molekulargewicht : 499,65 UV-Maxima : 248,348 Tabelle 3 : 1H-und 13C-chemische Verschiebungen von Verbindung (III) in DMSO- d6 bei 300K 1H 13C a) 1 1. 74/0. 92 23. 8 2 1. 79/1.39 24.8 3 3.18 73.4 3-OH 4. 07 4-37. 3 5 2. 03 39. 4 6 1. 44 20. 4 7 1. 52/1. 41 30. 7 8 1.79 36.5 9 98. 0 10 41. 8 11 3. 12/2. 77 31. 6 12 0. 66 15. 5 13 0. 88 28. 6 14 0. 80 22. 3 15 0. 95 15. 7 1' - 117. 0 2'-153. 8 2'-OH 9, 73 3' 6.58 100. 9 4' - 132.8 5' - 112. 2 6' - 155. 8 7'167. 9 8' 4.39/4.28 44.2 1" - 172.1 2" 4.55 58.3 3" 2.12 33.8 4" 0.96 15.7 5" 1.31/1.05 25.1 6" 0.84 10.3 a) Die Werte für die 13C-chemischen Verschiebungen werden nur auf eine Nachkommastelle angegeben, da sie aus den 2D-Spektren bestimmt wurden.

Beispiel 10 : Charakterisierung der Verbindung der Formel (IV) : Summenformel : C29H41NO6 . Molekulargewicht : 499,65 UV-Maxima : 248,348 Tabelle 4 : 1H-und Verschiebungen von Verbindung (IV) in DMSO- d6 bei 300K 1H 13C 1 1. 75/0. 94 23. 80 2 1. 80/1. 41 24. 77 3 3.18 73. 38 3-OH 4. 09 4 37. 22 5 2. 03 39. 32 6 1.41 20. 37 7 1. 52/1. 41 30. 65 8 1.79 36. 47 9 - 97. 96 10 41. 72 11 3.13/2. 77 31. 63 12 0. 65 15. 48 13 0. 88 28. 53 14 0. 79 22. 29 15 0. 95 15. 75 11-116. 85 2' - 153. 68 2'-OH 9. 72 3' 6.58 100. 83 4' - 133.12 59-112. 22 6' - 155. 85 7' - 168. 03 8' 4. 30/4. 25 43. 77 1" - 173. 03 2" 4.81 51. 50 3"1. 98/1. 70 37. 41 4" 1.40 24. 50 5" 0.91 22. 82 6" 0.87 20. 78 Beispiel 11 : Bioassay auf PAI-1 Inhibitoren Reaktion : Die Inhibierung der enzymatischen Aktivität von tPA durch PAI-1 wird durch die Amidolyse des chromogenen Substrates H-D-Ile-Pro-Arg-pNA (Fa. Chromogenix ; pNA = para-Nitroanilin) als optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

Testsubstanzen : Extrakte oder Reinsubstanzen, beispielsweise die in den Beispielen 4-10 hergestellten bzw. charakterisierten Spirobenzofuranlactam-Derivate, die in DMSO gelöst vorliegen, wurden in geeigneter Weise mit TRIS-Puffer pH 8.4 verdünnt.

Methode : 5 pl Testsubstanz und 5 pl PAI-1 werden 30 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschliessend werden 10 pI tPA-Lösung und 20 pI Substrat-Lösung zugesetzt. Die Endkonzentrationen in der Probe betragen 50 uM Testsubstanz, 4,5 nM PAI-1, 7,5 nM tPA und 1 mM Substrat in TRIS-Puffer pH 8.4. Unmittelbar nach Zusatz des Substrats wird die Anfangsabsorption bei 405 nm gemessen. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37° C wird die Absorption erneut gemessen.

Es werden jeweils Blank-Proben (Puffer anstelle von tPA),. Positiv-Kontrollen = B (Puffer anstelle von Testsubstanzen) und tPA-Kontrollen = A (Puffer anstelle von PAI- 1) mitgetestet.

Nach Korrektur mittels der Blank-Proben wird die Inhibierung nach der folgenden Gleichung ermittelt : DOD Mittelwert A-OD Pr obe % Inlaibitiora-100-405 nm 405 nm : 100 AOD405nm Mittelwert A-AOD405zm Mittelwert B 405n7K 405n Die Ergebnisse des Assays sind als ICso-Werte in Tabelle 1 wiedergegeben.