USALL I RODIE JOSEP (ES)
TEIXIDO I ESPASA NEUS (ES)
SANCHIS ALMENAR VICENTE (ES)
VINAS ALMENAR INMACULADA (ES)
USALL I RODIE JOSEP (ES)
TEIXIDO I ESPASA NEUS (ES)
SANCHIS ALMENAR VICENTE (ES)
| WO1992018009A1 | 1992-10-29 | |||
| WO1991001641A1 | 1991-02-21 | |||
| WO1995002964A1 | 1995-02-02 |
C.L.WILSON ET AL.: "A selection strategy for microbial antagonists to control postharvest diseases of fruits and vegetables", SCIENTIA HORTICULTURAE, vol. 53, no. 3, 1993, AMSTERDAM, NL, pages 183 - 189, XP002006220
R.J.MCLAUGHLIN ET AL.: "Effect of Inoculum Concentration and Salt Solutions on Biological Control of Postharvest Diseases of Apple with Candida sp.", PHYTOPATHOLOGY, vol. 80, no. 5, 1990, pages 456 - 461, XP002006221
| 1. | El cultivo biológico substancialmente puro de la cepa de la especie Candida sake, depositado con el número CECT10817. |
| 2. | La utilización del cultivo de la reivindica¬ ción 1 como antagonista para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de los frutos de postcosecha. |
| 3. | La utilización, de acuerdo con la reivindica¬ ción 2, caracterizada porque los hongos patógenos perte necen a cualquiera de las especies Bo tryti s cinérea , Penicillium expansum y Rhizopus nigricans . |
| 4. | La utilización, de acuerdo con la reivindica¬ ción 2, caracterizada porque los frutos son de los cono cidos como de pepita, especialmente, manzanas, peras y membrillos, en cualquiera de sus variedades. |
| 5. | La utilización, de acuerdo con la reivindica¬ ción 2, caracterizada porque los frutos son cítricos, especialmente naranjas, limones y mandarinas, en cual¬ quiera de sus variedades. |
| 6. | La utilización, de acuerdo con la reivindica¬ ción 2, caracterizada porque los frutos son fresas o de los conocidos como de hueso, especialmente, melocotones, albaricoques y ciruelas, en cualquiera de sus varieda¬ des. |
| 7. | La utilización del cultivo de la reivindica ción 1 como antagonista para el control biológico de los hongos patógenos de los frutos antes de la recolección. |
| 8. | Un método para prevenir la podredumbre de los frutos caracterizado porque la fruta se trata, antes o después de su recolección, con un preparado del cultivo de CECT10817 de la reivindicación 1. |
| 9. | Un método, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el tratamiento se efectúa por medio de la pulverización, mojado o inmersión de los frutos en o con una dispersión acuosa del antagonista CECT10817. |
| 10. | Un método, de acuerdo con las reivindicacio¬ nes 8 y 9, caracterizado porque la concentración del antagonista CECT10817 en la dispersión acuosa está com prendida entre 10s y 107 u.f.c./ml. |
| 11. | Un método, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque las condiciones de almacenamien¬ to de los frutos son las de temperatura y atmósfera de oxígeno ambientales. |
| 12. | Un método, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque las condiciones de almacenamien¬ to de los frutos son las de temperatura inferior a 5o C y atmósfera con un contenido de oxígeno inferior al 5%. HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26). |
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una nueva cepa de la levadura Candida sake y a su utilización como antagonista para el control biológico de las infecciones fúngicas de la fruta recolectada, con el objeto de preve¬ nir la podredumbre de la fruta en condiciones de almace¬ namiento.
Estado de la técnica
Las enfermedades de postcosecha de las frutas producen pérdidas anuales en la agricultura que se esti¬ man, a nivel mundial, en una cantidad del orden de un 15% a un 20% del total de las cosechas.
En la actualidad, el sistema más utilizado para combatir a los hongos causantes de la podredumbre de las frutas después de su recolección es el control químico, mediante tratamiento de las cosechas con productos fungicidas. El empleo de los fungicidas está bastante extendido a nivel mundial y se estima que supone hasta el
26% de los pesticidas de los mercados europeo y asiático y , en el caso del mercado norteamericano, hasta el 6%.
La utilización masiva de dichos productos fungicidas ha generado una serie de problemas, tales como la aparición de cepas patogénicas resistentes - lo que repercute en el incremento progresivo de los costes de los tratamientos y en el aumento de los niveles de pérdi¬ das por podredumbre - y el incremento de residuos de fungicidas en los frutos que provoca problemas de tipo sanitario y dificulta las exportaciones a los países que
poseen una reglamentación sanitaria restrictiva sobre el tema.
Ante dicho problema se ha comenzado a desarro¬ llar, hace relativamente pocos años, una actividad in- vestigadora con el fin de encontrar nuevos métodos alter¬ nativos para el control de las enfermedades de los frutos en su etapa de postcosecha, siendo una de las vías de desarrollo más destacadas el control biológico de los hongos causantes de la podredumbre. Dicho control bioló- gico se fundamenta en la acción inhibidora de algunos microorganismos sobre el crecimiento y acción de los hongos patógenos. Así, Janisiewicz, .J. , Phytopathology 77:481-485 (1987) , ha descrito un tratamiento de control biológico del moho azul de las manzanas; Janisiewicz, W.J. and Roitman, J., Phytopathology 77 : 1776 (1987) , des¬ criben la utilización de Pseudowonas cepacia como agen¬ te de biocontrol postcosecha para combatir la podredum¬ bre de las manzanas; Janisiewicz, W.J. and Roitman, J. , Phytopathology 78:1697-1700 (1988) , describen la utili- zación de Pseudomonas cepacia como agente de biocontrol postcosecha para combatir los mohos gris y azul de las manzanas y las peras.
Entre los antagonistas de los hongos causantes de la podredumbre de la fruta, resultan de particular inte- res las levaduras, que pueden colonizar la superficie del fruto durante largos períodos de tiempo, produciendo polisacáridos extracelulares que potencian su supervi¬ vencia y que limitan los lugares de colonización y la germinación de los propágulos fúngicos, debido a que utilizan más rápidamente los nutrientes disponibles. Así, McLaughlin, R.J. et al . , Phytopathology 80 :456-461 (1990) , describen los efectos de la concentración de las levadu¬ ras Candida sp . en el control biológico de las enfermeda¬ des de postcosecha de la manzana; la solicitud de patente PCT WO-91/1641 describe la utilización, como agentes para el control biológico de enfermedades de postcosecha de
productos vegetales, de varias levaduras, entre ellas cepas o aislados pertenecientes a la especie Candida guilliermondii . Dichos aislados muestran actividad con¬ tra, entre otras, las siguientes especies de hongos patogénicos: Penicillium i talicum, Peni cillium digi ta tum, Botrytis cinérea, Rhizopus stolonifer, Geotrichum candidum, Penicillium expansum y Al ternaría al terna ta . La patente norteamericana US-5041384, que proviene de la misma prio¬ ridad que la mencionada solicitud de patente PCT, se centra en la actividad de tres cepas concretas de Candida guilliermondii .
La solicitud de patente PCT WO-92/18009 describe también el empleo de levaduras como agentes de control biológico de enfermedades de postcosecha en frutos, ci- tando concretamente aislados de las especies Rhodotorula glutinis , Rhodotorula mucilaginosa , Candida parapsilopis y Candida guill iermondii. Por último, Wilson, C.L., en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796, publi¬ cada como documento NTIS (National Technical Information Service) número PB92-102334, describe el empleo como agen¬ tes de control biológico, contra las enfermedades postcosecha de frutos tales como manzanas, melocotones y naranjas, de tres cepas concretas de Candida sake , aisla¬ das de la piel de tomates, depositadas, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest, en The Northern Regional Research Center U.S. Department of Agriculture, Peoría Illinois 61604, con los números de depósito NRRL Y-18844, NRRL Y-18845 y NRRL Y-18846.
No obstante las grandes diferencias de actividad antifúngica que se pueden dar entre aislados o cepas diferentes de levaduras de la misma especie y la falta de datos sobre la efectividad de los mismos en las diferen¬ tes condiciones de almacenamiento de los frutos recolec¬ tados, hacen que se plantee la necesidad de seguir inves- tigando con el fin de encontrar agentes de control bioló¬ gico, cada vez más eficaces y de acción más duradera, que
sean capaces de ejercer su acción preventiva en condicio¬ nes extremas de almacenamiento.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es proporcio¬ nar una nueva cepa de la levadura Candida sake capaz de actuar como antagonista altamente efectivo para el con¬ trol biológico de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de la fruta de postcosecha y que mantiene su efectividad en condiciones de baja temperatura y en at¬ mósfera empobrecida en oxígeno.
Otro objeto de la presente invención consiste en la utilización de dicho antagonista para prevenir la podredumbre de la fruta recolectada, durante su almace¬ namiento.
Todavía otro objeto de la presente invención con¬ siste en proporcionar un método para la mejor conserva¬ ción de la fruta recolectada en diferentes condiciones de almacenamiento.
Breve descripción de los dibujos
Se adjuntan a la presente descripción, para una mejor comprensión de la misma, pero sin efectos limitativos, siete hojas con dibujos de los que, a continuación, se expone una breve descripción.
La figura 1 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, en condiciones de baja temperatura.
La figura 2 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, a las temperaturas de 15° C, 26° C y 30° C.
La figura 3 es una representación gráfica de la curva de crecimiento de la cepa CECT-10817, en medio NYDB , a las temperaturas de 34° C y 37° C.
La figura 4 es una representación gráfica del desarrollo de la población de la cepa CECT-10817 sobre manzana "Golden Delicious" a 25° C de temperatura.
La figura 5 es una representación gráfica del desarrollo de la población de la cepa CECT-10817 sobre manzana "Golden Delicious" en condiciones de frigoconservación: en frío convencional (a I o C de tempe¬ ratura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%); en atmósfera controlada (a 1° C de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 3%); y en atmósfera controlada a ultrabajo oxígeno (a 1° 2 de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 1%) .
La figura 6 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Botryti s ci nérea , causados por la inocu¬ lación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos des¬ pués de seis días de incubación a 20° C. La figura 7 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Peni cilli um expansum, causados por la ino¬ culación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos des- pues de siete días de incubación a 20° C.
La figura 8 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Rhi zopus ni gri cans, causados por la ino- culación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos des¬ pués de seis días de incubación a 20° C.
La figura 9 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Peni cilli um expansum, causados por la ino¬ culación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos des-
pues de sesenta días de incubación en condiciones de frigoconservación: en frío convencional (a I o C de tempe¬ ratura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%) ; en atmósfera controlada (a I o C de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 3%) ; en atmósfera controlada a ultrabajo oxígeno (a I o C de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 1%) .
La figura 10 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Botrytis cinérea , causados por la inocu¬ lación del antagonista CECT-10817. Datos obtenidos des¬ pués de sesenta días de incubación en condiciones de frío convencional (a I o C de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%) .
La figura 11 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Penicillium expansum, causados por el baño de los frutos con el antagonista CECT-10817. Datos obte¬ nidos después de sesenta días de ensayo a gran escala en condiciones de frío convencional (a I o C de temperatura, y con una atmósfera con un contenido en oxígeno del 21%) . La figura 12 es una representación en forma de diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción de la podredumbre, en manzanas "Golden Delicious" inoculadas con Peni cill ium expansum, causados por la pul¬ verización con 7 x 10 6 u.f.c./ml del antagonista CECT- 10817 y por la aplicación del fungicida químico Imazalil a una concentración del 7,5%. Datos comparativos obteni¬ dos después de ocho días de incubación a 20° C de tempe¬ ratura.
La figura 13 es una representación gráfica de la evolución de la población del antagonista CECT-10817 so¬ bre manzana "Golden Delicious", aplicado en el campo
mediante pulverización, a lo largo del proceso de reco¬ lección, manipulación y conservación en condiciones de frío convencional (a I o C de temperatura, y con una atmós¬ fera con un contenido en oxígeno del 21%) .
Descripción de la invención
Los autores de la presente invención han logrado aislar una nueva cepa de la especie Candida sake (Saito and Ota) van Uden and Buckley que muestra una efectividad muy elevada como antagonista de las especies de hongos causantes de las enfermedades de las frutas de postcosecha, en una amplia gama de temperaturas y atmósferas de oxíge¬ no, lo que permite su utilización industrial para el control biológico de dichas especies fúngicas y prevenir la podredumbre de la fruta en condiciones de almacena¬ miento.
La cepa objeto de la presente invención se ha aislado de la superficie de manzanas, mediante repetidos lavados con agua estéril, y se ha depositado un cultivo de la misma, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Co- lección Española de Cultivos Tipo, con domicilio en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valen¬ cia, 46100 Burjasot (Valencia) España, que le ha asignado el número de depósito CECT-10817.
El aislado de CECT-10817 fue identificado como Candida sake por el "Centraalbureau voor Schimmelcultures" de Holanda y, tras su aislamiento, se cultivó en el medio NYDA, consistente en extracto de levadura, dextrosa y agar, y en el medio NYDB, consistente en caldo de extrac¬ to de levadura y dextrosa. El aislado de CECT-10817 forma colonias de color blanco-cremoso, redondas, bien defini¬ das, con borde liso y con una ligera elevación central,
observándose pseudohifas en los cultivos.
La cepa CECT-10817 presenta las características bioquímicas que se detallan en las tablas I y II.
Tabla I. Ensayos de oxidación
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 23)
Tabla II. Ensayos de asimilación
Además, la cepa CECT-10817 resulta resistente al antibiótico sulfato de estreptomicina, a una concentra¬ ción de 0,5 g/ml. El crecimiento "in vitro" del microorganismo de la cepa CECT-10817, en medio NYDB, a pH 7, se produce, en
condiciones aeróbicas, en un amplio margen de temperatu¬ ras de incubación, mostrando un crecimiento satisfacto¬ rio a las temperaturas comprendidas entre I o C y 34° C. Como se observa en las figuras 1, 2 y 3, el máximo poblacional se alcanza a I o C, siendo éste muy superior al producido en cualquiera de las otras temperaturas estu¬ diadas .
Tal como muestran los gráficos de las figuras 4 y 5, la inoculación del microorganismo en fruta muestra un gran crecimiento en condiciones aeróbicas, tanto a tem¬ peratura ambiente (25° C) como a la temperatura de I o C, ya sea en atmósfera ambiente (21% de oxígeno) o en atmós¬ fera controlada de 3% de oxígeno y de 1% de oxígeno (ultra bajo oxígeno) , que son propias de las condiciones de almacenamiento en las centrales hortofrutícolas .
El aislado CECT-10817 se puede obtener, tanto a nivel de laboratorio como para su uso industrial, median¬ te su cultivo en un medio apropiado, por medio de técni¬ cas convencionales suficientemente conocidas por el ex- perto. Por ejemplo, se puede obtener mediante el cultivo de la cepa original en medio NYDB, a pH 7, en un recipien¬ te provisto de agitación y aireación, a temperaturas comprendidas entre I o C y 34° C, durante períodos de tiempo del orden de 20 a 50 horas. El máximo poblacional, para el medio NYDB, se alcanza a las 37 horas a 25° C. Una vez finalizado el período de incubación, se procede a separar los microorganismos del medio de cultivo median¬ te técnicas convencionales de sedimentación, centrifugación o filtrado, y el cultivo se puede conservar, por ejemplo, mediante congelación con gel de sílice.
El antagonista CECT-10817 se puede aplicar a la superficie de los frutos mediante cualquier técnica con ¬ vencional. Por ejemplo, se puede preparar una dispersión del cultivo en agua y proceder a la pulverización o ducha del fruto en el campo antes de la recolección, o bien efectuar el tratamiento durante el proceso de manipula-
ción del fruto recolectado, antes de proceder al almace¬ namiento, en cuyo caso el tratamiento se puede realizar también por inmersión.
Tal como se observa en la figura 13, cuando el tratamiento de los frutos se efectúa mediante pulveriza¬ ción de los mismos en el árbol, el aislado de CECT-10817 mantiene su viabilidad e incluso aumenta su población en la superficie del fruto a lo largo del proceso de reco¬ lección y almacenamiento. Las concentraciones efectivas del antagonista CECT-
10817 en la dispersión de aplicación para el tratamiento de las frutas pueden ser variables en función de factores tales como el tipo de fruto, la madurez del mismo, la concentración del hongo patógeno en el fruto, el tipo de herida o lesión que afecte al fruto, la temperatura y humedad de la conservación, etc. Habitualmente el rango de concentraciones efectivas oscila entre 10 5 y 10 7 u . f . c . / mi (unidades formadoras de colonias por mililitro) , pero dichos márgenes no deben ser considerados como limitativos del objeto de la presente invención.
El aislado de CECT-10817 es muy efectivo en el control biológico de un gran número de especies de hongos patógenos de las frutas que incluyen, pero no se limitan, a Botrytis cinérea , Penicillium expansum y Rhizopus nigri cans . Su efectividad en la prevención de la podre¬ dumbre de la fruta no se limita al almacenamiento de la misma en condiciones de temperatura y concentración de oxígeno ambientales, sino que, debido a las caracterís¬ ticas del microorganismo ya comentadas anteriormente, su empleo da también excelentes resultados en condiciones de almacenamiento de frigoconservación y atmósfera con¬ trolada, habitualmente utilizadas por las centrales hortofrutícolas industriales.
La efectividad del aislado CECT-10817 en el con- trol de los hongos patógenos es comparable a la del fungicida Imazalil, producto químico derivado del imidazol
(1- [2- (2 , 4-diclorofenil) -2- (2 -propeniloxi) etil] -1H- imidazol) , uno de los fungicidas más empleado en el mundo en postcosecha de frutos, lo que supone que el aislado CECT-10817 constituye una alternativa eficaz para dicho producto químico, con la ventaja de carecer de las carac¬ terísticas de toxicidad del mismo.
El aislado CECT-10817 puede ser empleado con efec¬ tividad para combatir la podredumbre de todo tipo de frutos en cualquiera de sus variedades, especialmente los frutos de pepita, tales como manzanas, peras y mem¬ brillos; los cítricos, tales como naranjas, limones y mandarinas; los de hueso, tales como melocotones, alba- ricoques y ciruelas; y otros frutos tales como, por ejem¬ plo, las fresas. Los autores de la presente invención no tienen conocimiento de que, hasta la presente invención, se hubiera descrito ningún agente de control biológico an¬ tagonista específico contra los hongos patógenos de la especie Rhi zopus nigri canε . Dicha especie resulta muy agresiva en términos patológicos, ya que posee enzimas pectinolíticos que le permiten degradar el tejido del fruto sin que la infección precise de heridas o lesiones para iniciarse. Por ello puede ser causa de podredumbre en frutos sanos en caso de contacto de los mismos con frutos afectados (efecto nido) . Además, la podredumbre que causa dicha especie es de desarrollo rápido y se caracteriza porque los tejidos del fruto se vuelven muy acuosos y blandos por lo que, al desprenderse un gran volumen de líquido contaminado, la infección se extiende con facilidad al resto de cajas almacenadas. Por estos motivos, la presencia de Rhizopus nigricans en una cámara frigorífica industrial produce unos porcentajes de po¬ dredumbre muy elevados. Por otra parte, tampoco existe, que conozcan los autores de la presente invención, ningún fungicida químico específico contra Rhizopus nigri cans . Esta situación hace que, por ejemplo en España,
país con una elevada producción hortofrutícola, los hon¬ gos de la especie Rhizopus nigricans se estén convirtien¬ do en unos de los patógenos más peligrosos, causantes de graves pérdidas en la postcosecha de frutas de pepita.
Es de resaltar, en consecuencia, que el antago¬ nista CECT-10817, objeto de la presente invención, cons¬ tituye el primer tratamiento eficaz descrito para comba¬ tir los efectos perniciosos producidos por los hongos de la mencionada especie Rhizopus nigricans .
E emplos
Los ejemplos que se exponen a continuación se deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.
Ejemplo 1. Obtención de una dispersión acuosa de CECT-
1Q817 Se sembró el antagonista CECT-10817 en un tubo de ensayo con medio NYDA y se incubó a 25° C durante 24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un matraz Erlenmeyer con 50 mi de medio NYDB que se incubó en un agitador orbital a 150 rpm y a 25° C durante 24 horas. A continuación se centrifugó el conte¬ nido del matraz a 6.000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en 50 mi de agua destilada estéril y, a partir de dicha disper¬ sión, se prepararon las concentraciones deseadas del an- tagonista mediante el cálculo de la transmitancia de la suspensión microbiana en un espectrofotómetro, como me¬ dida indirecta de la concentración del antagonista. La equivalencia entre la transmitancia y la concentración de microorganismos se efectuó mediante una cámara Thoma de recuento de microorganismos. Las concentraciones se expresan en u.f.c./ml (unidades formadoras de colonias
por mililitro) .
F.jemplo 2. Efectividad de CECT-108 7 en frutos almacpna- dos - temperatura ambiente El ensayo se realizó en manzanas "Golden Delicious" sanas que fueron limpiadas con agua y dejadas secar y en las que se realizaron dos perforaciones por cada manzana de dimensiones 3x3x3 m aproximadamente. Las dos inci¬ siones se situaron en la misma cara de la manzana, lóca¬ lizadas una en la parte superior y otra en la inferior. La unidad de muestra estaba formada por tres manzanas y por cada tratamiento se realizaron tres repeticiones.
Las tres especies fúngicas patógenas ensayadas fueron Botrytis cinérea , Peni cill i um expansum y Rhizopus nigri cans y la titulación de las suspensiones de esporas de las mismas se realizó a partir de cultivos jóvenes de 5-7 días, sembrados en medio PDA (patata, dextrosa y agar) , e incubados a 28° C de temperatura, mediante el raspado de las colonias en agua destilada estéril con Tween 80. A continuación se procedió al recuento de espo¬ ras en cámara Thoma, fijándose la concentración deseada, expresada en u.f.c./ml.
Lotes de tres manzanas preparadas como se ha ex¬ plicado anteriormente se inocularon con 25 μl de la sus- pensión de antagonista CECT-10817, a las concentraciones de 2,62 x 10 6 u.f.c./ml, 7,0 x 10 6 u.f.c./ml 1,15 x 10 7 u.f.c./ml. Una vez secas las frutas, se procedió a la inoculación de 20 μl de las suspensiones tituladas de patógenos de las tres especies seleccionadas, a las con- centraciones de 10 3 u.f.c./ml, 10" u.f.c./ml y 10 s u.f .c./ mi. Paralelamente se preparó la prueba control en donde únicamente se inocularon manzanas con la suspensión ti¬ tulada de patógeno y agua destilada estéril.
Todas las frutas tratadas se colocaron en alveolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su incubación a 20° C, en atmósfera ambiente. Para las frutas inocula-
15
das con Penicilli um expansum el tiempo de incubación fue de siete días, para Botryti s cinérea de 6 días y para Rhizopus nigricans de 5 días. El período de incubación se fijó en base al tiempo que se precisa para que las manza- ñas control presenten diámetros de podredumbre grandes. Tras dicho período de incubación se procedió a la lectura de los resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de todas las perforaciones realizadas.
Los datos de lectura del diámetro de podredumbre de las diferentes repeticiones se sometieron a un análi¬ sis estadístico consistente en efectuar un análisis de la varianza y, una vez comprobado que dicho análisis de varianza resultaba significativo (α<0, 01 a α<0,05), se efectuó una separación de medias de acuerdo con la Prueba de Rango Múltiple de Duncan, cuyos resultados se expresan con las letras del alfabeto minúsculas (a, b, c, d, ... ) , de manera que tratamientos con la misma letra son estadísticamente iguales y tratamientos con letras dife¬ rentes son estadísticamente diferentes. En la tabla III se exponen los resultados obteni¬ dos en el caso del control biológico de Botryti s cinérea , en la tabla IV en el de Peni cil li um expansum , y en la V en el de Rhi zopus nigricans.
La expresión gráfica de los resultados de dichas tablas se encuentran, respectivamente, en las figuras 6, 7 y 8.
HOJA DE SUSTITUCIOI\l_(REGLA 26)
16
Tabla III. Control de CECT-10817 sobre B . cinérea
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
17
Tabla IV. Control de CECT-10817 sobre P. expansum
10
15
20
25
JU
35
DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
18
Tabla V. Control de CECT-10817 sobre R . nigricans
Los datos recogidos en las mencionadas tablas III, IV y V. así como su representación gráfica en las figuras 6, 7 y 8, muestran la alta efectividad del anta- gonismo CECT-10817 en el control de las tres especies de hongos patógenos ensayados y, en consecuencia, en la prevención de la podredumbre de las frutas.
Si se efectúa una comparación de los resultados obtenidos con lo descrito en la solicitud de patente norteamericana US-7-745796 (Wilson) , anteriormente men ¬ cionada, resulta especialmente significativo el hecho de que la eficacia de la cepa de Candida sake CECT-10817 resulta ser claramente superior, en el caso del control d e las especies Botrytis cinérea y Penicillium expansum , a la mostrada por las cepas de Candida sake NRRL Y- 18844, NRRL Y-18845 y NRRL Y-18846 descritas en dicha
19 solicitud de patente.
Ejemplo 3. Efectividad de CECT-10817 en frutos almacena¬ dos a bajas temperaturas y diferentes atmósferas de oxí¬ geno.
Siguiendo el método de trabajo explicado en el ejemplo 2, se efectuaron ensayos con veinte manzanas "Golden Delicious" por repetición y tres repeticiones por tratamiento. Se inocularon 25 μl de dispersión acuosa del an¬ tagonista CECT-10817, a las tres concentraciones emplea¬ das en el ejemplo 2, y 20 μl de inoculo de Peni cill i um expansum, a la concentración de 10 4 u.f.c./ml. A conti¬ nuación se separaron tres lotes de manzanas inoculadas, y se almacenaron durante sesenta días: un lote en condi¬ ciones de frío convencional (I o C y oxígeno ambiente) , otro lote en condiciones de atmósfera controlada (I o C y 3% de oxígeno) y el último lote en condiciones de ultrabajo oxígeno (I o C y 1% de oxígeno) . Los resultados se leyeron y trataron estadísticamente de la misma manera que en el ejemplo 2 y se exponen en las tablas VI, VII y VIII. Su representa¬ ción gráfica conjunta se expone en la figura 9.
Tabla VI. Almacenamiento a I o C y 21% O
20
Tabla VII. Almacenamiento a I o C y 3% O
Tabla VIII. Almacenamiento a I o C y 1% O
Como se observa en las tablas anteriores y en la figura 9, los resultados obtenidos muestran un elevado grado de eficacia en el control de P . expansum en condi¬ ciones de frío convencional y dicha eficacia todavía se ve sensiblemente aumentada cuando los ensayos se efec ¬ túan en almacenamiento a baja temperatura y condiciones de atmósfera baja en oxígeno.
Ejemplo 4. Control de B. cin rea en condiciones de frío convencional .
Se efectuó un ensayo, bajo las mismas condiciones del ejemplo 3, utilizando como inoculo de hongo patógeno 20 μl de inoculo de Botrytis cinérea , a la concentración de 10 4 u.f.c./ml. El ensayo se realizó en condiciones de
21 almacenamiento de frío convencional (I o C y oxígeno am¬ biente) .
Los resultados obtenidos, después del tratamien¬ to estadístico ya mencionado, se exponen en la tabla IX y su representación gráfica en la figura 10.
Tabla IX. Control de B. cin rea a I o C y 21% O,
Los resultados de reducción del diámetro de po¬ dredumbre fueron excelentes, sobre todo a una concentra- ción de inhibidor CECT-10817 de 7 x 10* u.f.c./ml.
Ejemplo 5. Control de Pen i ci l l i um expansum en ensavo a gran escala. Para este ensayo la dispersión de antagonista se preparó, en una escala mayor, de la siguiente manera:
Se sembró el antagonista CECT-10817 en un tubo de ensayo con medio NYDA y se incubó a 25° C durante 24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo de ensayo, se sembró en un fermentador, provisto de agitador y sistema de aireación, con 2.000 mi de medio NYDB y se incubó a 25° C durante 37 horas. A continuación se centrifugó el contenido del fermentador a 6.000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento se dispersó en agua destilada estéril y, a partir de dicha disper ¬ sión, se prepararon las concentraciones deseadas del an-
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tagonista de la misma manera que en el ejemplo 1.
Se utilizó una caja de manzanas "Golden Delicious" (70 frutos) por repetición y cuatro repeticiones por tratamiento. Las manzanas recogidas en el campo fueron perforadas en su zona ecuatorial (4 heridas por manzana) con un bisturí y se trataron con el antagonista CECT- 10817, mediante la introducción de las cajas con los frutos en baños que contenían dispersiones de antagonis¬ ta a concentraciones de 7 x 10 5 y 7 x 10 β u.f.c./ml. Se utilizó también un lote control sin tratar. A continua¬ ción, una vez secas las manzanas, las cajas se introduje¬ ron en un baño con una dispersión titulada de esporas de Penicillium expansum a la concentración de 10 4 u.f.c./ml. Las cajas de manzanas se almacenaron durante se- senta días en condiciones de frío convencional (1° C y oxígeno ambiente) , al cabo de los cuales se procedió a la lectura de los resultados en las mismas condiciones y con el mismo tratamiento estadístico que en los ejemplos anteriores . Los resultados se exponen en la tabla X y su representación gráfica en la figura 11.
Tabla X. Control de P. expansum a gran escala
Como se observa en la tabla y figura mencionadas, el ensayo a gran escala permite confirmar los excelentes resultados de control de P. expansum obtenidos en los
23 ensayos anteriores. Es de destacar que la reducción del diámetro de podredumbre es prácticamente del 90% cuando se utiliza una concentración de antagonista CECT-10817 de 7 x 10 β u.f.c./ml.
Ejemplo 6. Comparación con el fungicida Imazalil.
El ensayo se efectuó con veinte manzanas "Golden delicious" por repetición y tres repeticiones por trata¬ miento y en cada fruto se efectuaron cinco perforaciones.
Tanto el antagonista CECT-10817 como el fungicida Imazalil se aplicaron mediante baño de los frutos en soluciones o dispersiones de los mismos. El antagonista se aplicó a una concentración de 7 x 10 e u.f.c./ml y el Imazalil a una concentración del 7,5% en peso.
A continuación las manzanas se inocularon con el patógeno de la especie Penicillium expansum a una concen¬ tración de 10 4 u.f.c./ml. En un lote de las manzanas tratadas con el antagonista la inoculación del patógeno se efectuó 24 horas después del tratamiento.
Los frutos se incubaron a 20° C durante ocho días, al cabo de los cuales se procedió a la lectura de los resultados y a su tratamiento estadístico.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla XI y su representación gráfica en la figura 12.
Tabla XI. Control de P. expansum, comparación con
Imazalil
Se observa que, cuando la inoculación del patóge¬ no se produce a las 24 horas del tratamiento, la efecti¬ vidad del antagonista CECT-10817 y del imazalil son prác¬ ticamente iguales.
Información sobre el depósito de la cepa CECT-10817
El depósito del microorgasnismo se ha efectuado, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest so- bre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , con residencia en el Departamen¬ to de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) . El depósito se efectuó el 6 de julio de 1994 y el CECT le asignó el número de depósito CECT-10817.
El depósito está a disposición del público, bajo las condiciones previstas en el mencionado Tratado de Budapest, si bien dicha disponibilidad no se puede inter¬ pretar como una licencia para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los derechos del solici¬ tante de la presente patente.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)