Descripción

Nuevas cepas de las especies Lactobacillus brevis para la elaboración de masas madres pananas.

La presente invención se refiere a las cepas CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 de Lactobacillus brevis y su uso para la producción de ácido γ-amino butírico (GABA), de medios enriquecidos en GABA, para la fabricación de alimentos funcionales, complementos nuthcionales y/o farmacéuticos, así como un método para la producción de GABA en masas madres ácidas de pan o sourdough mediante dichas cepas.

Introducción

La hipertensión es una de las principales causas de las enfermedades cardiovasculares, ocupando el primer lugar de ingreso hospitalario e incluso la muerte en muchos países desarrollados. Esta enfermedad ha sido objeto de numerosos estudios en los últimos años en lo que se ha puesto de manifiesto que lo hábitos alimentarios pueden ayudar a prevenirla.

El causante más importante de hipertensión es el consumo elevado de sal. Se considera que el 87,5% de la población consume más sal de la recomendada y que ésta se ingiere de forma mayo ta a a través de la alimentación. Actualmente, las dietas procuran incluir menos sal en sus composiciones, y los nuevos sistemas de conservación (pasteurizados, refrigerados y congelados, alimentos envasados al vacío, etcétera.) permiten evitar por completo el empleo de la salazón en algunos alimentos. No obstante, su reducción implica una disminución de la intensidad del sabor del producto. Por este motivo, la inclusión de moléculas con capacidad funcional para la reducción de la hipertensión en alimentos resulta novedosa y, lo que es más importante, tiene una escasa incidencia en la calidad sensorial del producto. En la actualidad, una de las familias más estudiadas son los péptidos bioactivos procedentes de la fermentación de productos lácteos. Estos péptidos tienen acción inhibitoria sobre el enzima convertidor de la angiotensina (IECA) que impide la formación de angiotensina II, un potente vasoconstrictor, evidenciándose clínicamente su eficacia en la disminución de la presión arterial (Ricci et al, 2010). Otra molécula funcionalmente activa con un gran potencial de desarrollo es el Ácido γ-Amino Butírico o GABA que ha demostrado sus efectos hipotensores en modelos animales (Hayakawa et al, 2004), así como en ensayos de intervención humana. Este aminoácido actúa a nivel cerebral como neurotransmisor de tipo inhibidor uniéndose a receptores específicos de las membranas plasmáticas tanto en procesos neuronales pre-sinápticos como en post-sinápticos. La función del GABA como reductor de la presión arterial no reside en una respuesta vasodilatadora de las arterias, sino en la inhibición de la liberación de noradrenalina a través de la activación en los receptores pre- sinápticos. La noradrenalina es liberada por la médula suprarenal en el torrente sanguíneo como una hormona y también es un neurotransmisor en el sistema nervioso central y sistema nervioso simpático. Las acciones de la noradrenalina se llevan a cabo a través de la unión de los receptores adrenérgicos, los cuales se activan y producen una respuesta de vasoconstricción y una subida de la presión arterial al aumentar el tono vascular. Al inhibir el GABA la liberación de noradrenalina se contrarrestan los efectos citados. En el ensayo de intervención humana de Shimada et al. (2009) se utilizó un suplemento dietético de algas rico en GABA y en el de Inoue et al. (2003), leche fermentada conteniendo GABA. En este último trabajo, una dosis de 10-12 mg/día de GABA reducía significativamente la presión sistólica y diastólica en pacientes hipertensos.

Del GABA también se han estudiado sus efectos tranquilizantes (Guin et al. , 2003), antidepresivos (Okada et al. , 2003), beneficiosos para tratamientos de alcoholismo (Oh et al. , 2003) y para el sistema inmune (Oh y Oh, 2003). Otros trabajos han demostrado que el GABA podría ayudar a incrementar la concentración de hormonas de crecimiento en plasma y la tasa de síntesis de proteína en el cerebro (Tujioka et al. , 2009). Además, en los últimos estudios consideran el GABA como un potente segregador de insulina en el páncreas (Adeghate et al. , 2002) lo que podría ayudar a prevenir estados de diabetes. El GABA es calificado, por tanto, como un eficaz componente bioactivo para su uso en alimentos, así como en productos farmacéuticos por sus numerosas propiedades demostradas.

La aplicación del GABA como ingrediente funcional ha sido estudiada en una gran variedad de productos, fundamentalmente en Oriente, donde existe gran multiplicidad de vegetales fermentados (L¡ y Cao, 2009), habiéndose desarrollado incluso técnicas de optimización para la síntesis del mismo (Lu et al. , 2008). En uno de los escasos trabajos sobre este compuesto realizados en Europa, algunas BAL aisladas de quesos muestran una buena síntesis de GABA, concretamente de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus lactis (Siragusa et al. , 2007), cuyo campo aplicativo ha sido la elaboración de masas ácidas para su empleo en panificación (Rizzello et al. , 2008).

El empleo de masa agria, masa madre o sourdough para la fabricación del pan es una práctica panadera muy antigua, actualmente generalizada a aquellos países que utilizan la harina de trigo y centeno para elaborar productos, sobretodo en países como Francia, Alemania e Italia. Desde tiempos remotos la masa madre ha sido conocida por su capacidad de mejorar la calidad y la conservación del pan (Decock y Capelle, 2005). Los ácidos orgánicos producidos, fundamentalmente láctico y acético, afectan al gluten y a las fracciones del almidón. Adicionalmente, la bajada del pH asociada con la producción de ácidos causa un incremento de la actividad de las proteasas y am ¡lasas, favoreciendo la reducción del envejecimiento y generando gran cantidad de aminoácidos que, a través del metabolismo de la levadura y/o bacterias lácticas, se convertirán en alcoholes y cetonas con elevado valor aromático (Gántzle et al. , 2008). Además de mejorar la textura del pan, desde el punto de vista nutricional, la fermentación de la masa madre tiene como resultado un incremento de la biodisponibilidad de los minerales presentes y una reducción del contenido de fitatos. Estos datos, hacen que la masa madre esté muy indicada en los panes integrales por su alto contenido en estas sustancias que limitan la absorción mineral por el organismo. También cabe destacar que los panes ácidos dan lugar a un índice Glicémico (IG) menor que los panes convencionales debido al mayor tiempo de tránsito en el estómago y a una mayor interacción entre almidón y gluten (Fardet et al. , 2006).

Las bacterias del ácido láctico (BAL) son un grupo de bacterias Gram positivas, cocos o bacilos inmóviles anaeróbicos aerotolerantes o microaerófilos, acidófilos y tolerantes a la sal. Su fuente de energía deriva exclusivamente de la fermentación de azúcares, de la que obtienen, ácido láctico como principal producto final. Estas bacterias son realmente útiles en la fabricación de alimentos fermentados o materias primas como frutas, vegetales, granos de cereal, carne y leche (Hufner et al., 2007) en los cuales contribuyen al sabor, la textura y la vida útil del producto. Además su importancia está evidenciada por su consideración de microorganismos generalmente seguros (Generally Regarded As Safe, GRAS, en inglés) por la FDA (Food and Drug Administration) debido a su presencia en gran variedad de alimentos ya que contribuyen como flora saprofita de las superficies mucosas humanas, favoreciendo la inhibición del crecimiento de microorganismos patógenos, la reducción de colesterol en plasma y la modulación en el sistema immune (Holzapfel et al., 2001 ; Tsai et al., 2008). Las BAL han sido tradicionalmente clasificadas en diferentes géneros basados en las colonias, la morfología celular, la fermentación de azúcares, el crecimiento a distintas temperaturas, la producción de ácido láctico, la habilidad de crecimiento en presencia de altas concentraciones de sal, la tolerancia acídica o los análisis en la pared celular (Kandler et al, 1986). Los géneros de bacterias lácticas identificadas en masas madres o sourdough son diversos, principalmente Lactobacillus, Pediococcus y Streptococcus. Entre las BAL, las especies del género Lactobacillus son ampliamente usadas como probióticos promoviendo, independientemente del valor nutritivo, los efectos saludables de estos alimentos, especialmente en una amplia gama de productos lácteos fermentados, ya sean líquidos, como el kéfir, o densos y semisólidos como queso o yogurt.

La producción de GABA se origina por la descarboxilación irreversible del L- glutamato mediante la acción del enzima Ácido Glutámico Descarboxilasa (GAD) que es dependiente de la molécula piridoxal 5'-fosfato o Vitamina B ₆ . La enzima se encuentra ampliamente distribuida entre el reino eucariota y el procariota (Ueno H, 2000). Numerosos estudios han demostrado la presencia de GAD en algunas bacterias del ácido láctico y la resistencia que ofrece el GABA bajo condiciones acídicas (Cotter et al., 2003)

La adición química de GABA resulta poco natural y entraría dentro del campo farmacéutico, por lo que se hace necesario encontrar métodos innovadores para producir e incrementar las concentraciones de GABA en alimentos. La producción de GABA por parte de las BAL resulta de especial interés para su aplicación en alimentos o ámbitos biotecnológicos.

Antecedentes de la invención

Gracias al vasto conjunto de vegetales fermentados que caracteriza el mercado asiático, las bacterias del ácido láctico han sido allí ampliamente estudiadas en base a su producción de GABA. Los más recientes: un grupo de Myoung-hee Jeon de Korea patentó en Abril de 2012 un método para el incremento de GABA mediante la fermentación de las habas de soja (Manufacturing method for fermented soybeans having increased gamma- aminobutyric acid content) y en 201 1 , en Japón, los autores Go Monma y Hayakawa patentaron un método para la producción de comida y bebida rica en ácido gamma aminobutirico así como las comidas y bebidas obtenidas por este método, consistente en la producción de GABA en productos de tomate procesados basados en el contenido de azúcar fermentable (Production method of food and beverage producís with high content of gamma- aminobutiric acid and food and beverage producís with high content of GABA). También en Japón el grupo de Yoshiki Hanya patentó recientemente (Julio de 2009) algunas especies de bacterias ácido lácticas capaces de producir GABA en coexistencia con otras bacterias lácticas y en presencia de sal común en el medio, en concreto la cepa Lactobacillus renmini aislada de aceite de soja refinado (Lactic acid bacterium capabie of producing gamma-aminobutiric acid). En el estudio Food material including much GABA and method of manufacturing the same patentado en el mismo país por Ichijo et al., 2005 propusieron un método para la producción de una matriz alimentaria elaborada a base de habas de soja ricas en GABA por acción descarboxiladora de las bacterias ácido lácticas. Otras patentes coreanas hacen referencia a alimentos ricos en GABA y sus métodos de producción, por ejemplo, la que usan glutamato a partir de algas (Method for preparing GABA using natural glutamate from seaweed through fermentation), para la elaboración de Kimchi {Strain for high gamma-aminobutiric acid production, a starter for kimchi fermentation and a method for producing) o a partir de levadura con habilidad productora de GABA (Method for producion gamma-aminobutiric acid- containing food and yeast having high ability to producte gamma-aminobutiric acid). También se ha patentado la tecnología de incremento de GABA y otros aminoácidos en alimentos, incluyendo el pan, por medio de la adición de cereales germinados (Kihara et al.: Foods containing large amount of functional components and method of producing the same).

En Europa, recientes estudios del GABA han sido publicados y, especialmente, en Italia la patente internacional encabezada por Giuliani Giammaria mostró el posible uso de la cepa Lactobacillus plantarum DSM 19563 para la fermentación del mosto de uva y su producción de GABA para ámbitos agroindustriales y farmacéuticos (Process for the preparation of gamma-amino butyric acid by the use of lactic acid bacteria on agro-and food industry surplus).

Explicación de la invención

En base a los conocimientos de los efectos beneficiosos del GABA y de los múltiples estudios que lo han corroborado, en este trabajo se demuestra la alta capacidad de producción de ácido gamma aminobutírico por parte de las cepas CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 de Lactobacillus brevis, que han sido aisladas de quesos españoles artesanales.

Los alimentos caseros fermentados con un periodo medio o largo de curación, como los quesos, contienen más cantidad de aminoácidos que los de producción industrial debido a la alta proporción de proteína en la materia prima, la actividad de las enzimas proteolíticas y los microorganismos involucrados en el proceso (Yvon y Rijnen, 2001 ).

Las bacterias del ácido láctico (BAL) son esenciales para la producción de alimentos fermentados. Su presencia en la materia prima es bien conocida, incluso sin ser añadidas (10 ² -10 ³ ufe/gramo), dominando rápidamente la fermentación. Su habilidad para disminuir el pH de la matriz alimentaria produciendo ácidos a través de la fermentación de los carbohidratos permite obtener un producto final con notables características organolépticas. Las prácticas modernas de fabricación implican el uso de starters comerciales permitiendo una producción a gran escala sin riesgos. No obstante, su uso conlleva a la obtención de productos con un perfil microbiológico muy estandarizado y menos variable en comparación con los que han sido fermentados de forma natural.

Las ventajas que supone esta invención engloban la posibilidad de emplear sustratos de fermentación natural a bajo coste permitiendo el uso de estos microorganismos y su biosíntesis de GABA, un tipo de fermentación que permite un alto valor fisiológico enriquecido de forma natural en GABA con la ventaja de poder ser conservado por largos penodos de tiempo y la posibilidad de crear un alimento potencialmente funcional apto para el consumo humano.

Materiales y métodos

Medios y reactivos Solución de agua de peptona (APT) y Tween 80 (5 g/l) (AES Chemunex): El agua de peptona tamponada compuesta por peptona pancreática de carne (10 g/l), fosfatos disódico anhidro (3.57 g/l) y monopotásico (1 .5 g/l) y cloruro de sodio (5 g/l) se usó como diluyente. El tween 80 o polisorbato formado por diferentes ésteres oleicos facilitó la homogeneización de la muestra al tratarse de productos con alto contenido graso.

MRS agar (Biokar Diagnostics): El agar Man-Rogosa-Sharpe usado para el crecimiento y recuento de bacterias ácido lácticas mesófilas en productos lácteos y otros alimentos se compone de polipeptonas (10 g/l), extracto de carne (10 g/l), extracto de levadura (5 g/l), glucosa (20 g/l), Tween 80 (1 .08 g/l), fosfato dipotásico (2 g/l), acetato de sodio (5 g/l), citrato de amonio (2 g/l), sulfato de magnesio (0.2 g/l), sulfato de manganeso (0.05 g/l) y agar (15 g/l). El medio se preparó a partir de MRS deshidratado diluido en agua destilada, se llevó a ebullición agitando hasta su completa disolución y se esterilizó en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Ringer ¼ (AES Chemunex): Para obtener la solución de Ringer se disolvió un comprimido en 500 mi de agua destilada, que se distribuyó en frascos y se autoclavaron 15 minutos a 121 °C. El ringer se usó como diluyente isotónico. El medio de reacción para la producción de GABA fue compuesto de L- Glutamato monosodico hidratado (Bioreactivo con pureza 99-100%) que se usó como precursor de la producción de GABA y de Tween 80 o polisorbato como estimulador enzimático. Ambos fueron adquiridos de Sigma Aldrich. El cloruro de sodio de Panreac se empleó para el lavado de pellet.

La solución de glutamato y Tween 80 y la sal fueron autoclavadas a 121 °C durante 15 minutos antes de ser usadas.

Para el indicador ácido base se usaron los reactivos rojo de metilo (ácido rojo 2 ^* -2(-4-D¡metilaminofen¡lazo) ácido benzoico), azul de metileno (cloruro de tretametiltionina ^* 3,7-bis (dimetilamino) fenazationio) obtenidos de Sigma y etanol absoluto que fue adquirido de Panreac. Screening

En este estudio se realizó un screening para bacterias ácido lácticas de más de 65 quesos preferentemente artesanales que representaban los diferentes tipos y marcas del mercado español.

Para el aislamiento y crecimiento de las cepas, se preparó una dilución 1/10 de la muestra pesando 10 gramos y mezclándolos con 90 mi de agua de peptona y Tween 80. La suspensión fue homogeneizada mediante el homogeneizador stomacher (UIL Instruments HO001 ) y se realizaron 3 diluciones decimales de cada muestra. Un mililitro de una de las diluciones fue sembrado en una placa de petri estéril a la que previamente se añadió 15 mi de MRS agar y se dejó enfriar. Posteriormente, las placas fueron incubadas a 30°C en condiciones de anaerobiosis (BD GasPak Ez Container Systems). Ensayo cualitativo de la actividad GAD

Tras 48 h de incubación se tomaron un mínimo de 10 colonias aisladas de cada producto y a continuación se evaluó la actividad GAD de cada una de ellas mediante el Método del Indicador de pH (PIM) (Yang et al., 2006). El Indicador de pH se preparó mezclando en 1 : 1 (v/v) rojo de metilo (0.2%) y metileno de azul (0.1 %) en etanol. A pH<5.4 el indicador es de color magenta mientras que a pH>5.4 el color es verde. Una vez obtenido crecimiento en MRS a 30°C, los tubos fueron centrifugados a 5000 g durante 15 min, los pellets se lavaron tres veces en una solución de NaCI al 0.85% y se resuspendieron en 10 veces (p/v) en una solución de L-glutamato monosódico (10 mM que contenía 0.1 mM de Tween 80) ajustada a un pH de 4.7. Los tubos se dejaron incubar a 37°C durante 1 a 4 días en los que el sobrenadante era analizado cualitativamente a diario con el indicador. Tras la adición de unas gotas del complejo la cepa mostraba actividad GAD si el color cambiaba de magenta a verde.

Como población control para los ensayos se tomó la cepa contrastada Lactobacillus brevis NBRC 12005 (lleno et al., 1997; procedente de la Biological Resource Center (NITE) de Japón conocida por su alta actividad de la enzima GAD, con la que se estableció la concentración óptima de L- glutamato para obtener el mayor rendimiento de conversión a GABA. Tras las pruebas con diversas concentraciones (entre 0.01 y 0.5 mM) y dos temperaturas de incubación (30 y 37 °C) se observó que 0.01 mM y 37°C eran las condiciones ideales para la realización de esta prueba pese a que la biomasa bacteriana crecía indistintamente a ambas temperaturas.

Tras comprobar la actividad GAD de las 10 colonias de BAL aisladas de todos los producto analizados, se obtuvieron un total de 12 cepas positivas que fueron identificadas y conservadas en forma de cultivo puro en criobolas a - 80°C. De ellas, se seleccionaron 3, las denominadas como cepas 77, 89 y 91 ya que según los análisis que se describen a continuación, superan las prestaciones de la cepa control para síntesis de GABA en las condiciones de cultivo planteadas.

Caracterización fenotípica de las cepas

Para la identificación fenotípica mediante el perfil fermentativo de las 12 cepas se usaron las galerías API 50CHL o índice de Perfil Analítico (Biomérieux, Francia). Cada colonia aislada se suspendió e inoculó en cada pocilio de la galería. Durante la incubación (48h a 30°C), el catabolismo de los glúcidos produce ácidos orgánicos que hacen virar el indicador del pH. Los resultados obtenidos que se muestran en la Tabla 2 corresponden únicamente a las cepas CECT 8183, CECT 8181 , y CECT 8182, y constituyen el perfil bioquímico en base a las fermentaciones de los 50 carbohidratos que componen la galería. Estos patrones fermentativos permitieron la caracterización del microorganismo con la ayuda del Software informático de identificación API WEB. Caracterización genotípica de las cepas A fin de asegurar los resultados obtenidos de la caracterización fenotípica se procedió a secuenciar el ARN ribosómico 16S de las cepas a fin de obtener su identificación. Para ello se extrajo el ARN _r bacteriano empleando un método automatizado basado en el uso de sílica magnética y se midió su concentración y pureza espectrofotométricamente. A continuación se realizó la amplificación mediante PCR del ADNr 16S con el uso de marcadores universales en un termociclador (7300PCR System de Applied Biosystems). Posteriormente se verificó el amplificado en gel de agarosa y se purificó con el uso de kits comerciales. Finalmente se secuenció el fragmento de amplificación y se procedió a su análisis e identificación por comparación con bases de datos universales (NCBI).

Ensayos para la determinación de producción de GABA

Con el fin de evaluar la producción de GABA en una masa madre de harina integral por parte de las cepas, se procedió a recuperar biomasa bacteriana de las criobolas haciéndolas crecer en MRS durante 48 h a 30°C. Tras el crecimiento, el pellet se centrifugó y lavó con Ringer ¼. La suspensión obtenida de cada una de estas cepas fue inoculado en un matraz de 500 mi en un medio no optimizado constituido finalmente por un 20% de harina integral y un 80% de agua destilada cuidando las condiciones estériles. Después de 24 h incubando a 30°C se determinó la concentración de GABA, se hizo un seguimiento del pH (Fig. 2) y una evaluación del recuento microbiano de BAL al inicio y al final de la incubación (Fig. 3). El análisis se realizó por triplicado bajo la comparativa de un blanco, que contenía un 20% de harina integral y un 80% de agua.

Inicialmente no se realizó ningún ajuste de pH en los medios, por lo que los valores obtenidos corresponden a la evolución natural de la fermentación en la disolución de harina de las cepas ocurrida en las 24 h de incubación.

Tras preparar los frascos con el medio e inocular la cepa a ensayar, se extrajo una alícuota de 1 mi y se realizaron diferentes diluciones en agua de peptona. 1 mi de cada dilución fue sembrado en una placa de petri estéril a la que se añadió 15 mi de MRS agar. Tras dejar enfriar, las placas fueron incubadas a 30°C en anaerobiosis (BD GasPak Ez Container Systems) durante 48 h para realizar el recuento. Tras las 24 h de incubación de la disolución en harina, se obtuvo el recuento bacteriano final bajo el mismo procedimiento.

Tabla 1. Origen de las cepas aisladas, variación de pH y concentración de GABA obtenida después de 24h en una disolución de harina del 20%.

Concentración de pH inicial pH final GABA (mM) en

ESPECIE ORIGEN

screening screening disolución de

harina al 20%

Control

L.brevis NITE 4,7 6,8 0,83

12005

CECT

Queso de cabra 0.96 8183 4,7 6,8

CECT

Queso de oveja 4,7 7, 1 0,94 8181

CECT

Queso de cabra 4,7 6,3 0,99 8182

Determinación y estimación cuantitativa de GABA

La extracción de GABA de los medios se realizó centrifugando a 20.000 g durante 15 min a 4°C. Tras filtrar una alícuota del sobrenadante, se realizó una derivatización en precolumna mediante la metodología del reactivo 6- aminoquinolil-N-hidroxisuccinil carbamato (AccQTag) de Waters para poder cuantificar a través del detector de absorción ultravioleta en Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en fase reversa. Para derivatizar, 10 μΙ de muestra se mezclaron con 70 μΙ de tampón borato Acc Q flúor (Waters) que tras homogeneizar en vórtex unos segundos se le añadió 10 μΙ del reactivo reconstituido AccQ flúor. La mezcla fue nuevamente homogeneizada y tras un minuto de reposo a temperatura ambiente, se calentó 10 min en un bloque calentador a 55°C para finalmente añadir 100 μΙ del diluyente cromatográfico A e inyectar en el cromatógrafo de gradiente modelo Waters 600 consistente en un módulo controlador, una bomba Waters Delta 600 y un inyector automático (Waters 717 plus). La separación cromatográfica se llevó a cabo con una columna C18 AccQTag de Waters (4 pm 3,9 x 150 mm) que estuvo mantenida en un horno a temperatura constante (37°C). La fase móvil consistió en una mezcla de diluyente A (concentrado comercial de una mezcla de solución tampón fosfato-acetato y acetonitrilo) y acetonitrilo, con un flujo de 1 ml/min. Descripción de las figuras

Como complemento a la descripción se muestran unas figuras con tablas y gráficos de los diferentes datos referentes a las tres cepas. Figura 1.- Concentraciones de GABA (milimoles/Litro) obtenidas con las distintas cepas.

Figura 2.- Variación de pH en cultivo de harina diluida (1 :5) a 30°C.

Figura 3.- Logaritmo de unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo (log cfu/ml) respecto al tiempo (horas) en cultivos de harina integral diluida (1 :5) a 30°C.

Figura 4.- Muestra tres gráficos del crecimiento (log cfu/ml) y acidificación (pH) para las diferentes cepas.

Resultados

Identificación

La caracterización genotípica de las bacterias estudiadas da como resultado que las numeradas por la Colección Española de Cultivos Tipo con los números CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 corresponden a la especie Lactobacillus brevis, aunque en las pruebas bioquímicas se evidenció que corresponden a cepas distintas, con algunas vanantes en sus perfiles fermentativos. Las secuencias del 16S ARNr de las diferentes cepas se muestra en el Anexo 1 . Screening

Los rápidos cambios de color y los altos valores de pH observados permitieron distinguir entre las cepas con alta actividad GAD de las de baja actividad. Tal como se ha comentado anteriormente, las cepas seleccionadas corresponden a una alta actividad de conversión, que en el medio utilizado de disolución de harina, son superiores a la cepa 12005 utilizada como control.

Los resultados indicaron que el rápido incremento de pH y cambio de color en el medio con L-glutamato y Tween 80 de las cepas de Lactobacillus brevis fue debido a la descarboxilación irreversible del L-glutamato por la enzima GAD mientras que las ligeras variaciones observadas en otras cepas podían ser atribuidas al uso de pequeños péptidos presentes en el medio. Por tanto, el aumento de pH por encima de 5.4 reflejó directamente la actividad GAD de las cepas.

Concentración de GABA

La gráfica de la figura 1 muestra las concentraciones de GABA obtenidas de las cepas CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 de Lactobacillus brevis en disolución de harina, alcanzando valores superiores a la cepa control. Se observó cómo estas concentraciones presentan cierta correlación con las pruebas del screening para la actividad GAD, siendo en general las cepas con alta actividad las que produjeron concentraciones de GABA más elevadas.

Variación de pH

La figura 2 muestra el descenso gradual del pH durante las 24h de incubación de las cepas CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 de Lactobacillus brevis respecto al blanco estando el pH inicial alrededor de 6 y que tras las 24h se alcanza valores por debajo de 4 lo cual significó que 24 horas fue tiempo suficiente para que se completara la fermentación.

Cinética de crecimiento El crecimiento bacteriano para las diferentes cepas CECT 8183, CECT 8181 y CECT 8182 de Lactobacillus brevis se muestra muy similar y con poca variación para las distintas cepas (Figura 3). Esto se debe al poco tiempo de incubación al que las muestras fueron sometidas. El blanco, en cambio, mostró también crecimiento muy intenso debido a la carga natural de BAL que, de por sí, contiene la harina.

En la siguiente tabla se muestran diferentes datos de identificación de las cepas.

Tabla 2. Identificación bioquímica API. +: positivo, -: negativo; d: reacción débil; (1 ): 5% de las cepas positivas; (2): 7% de las cepas positivas; (3): 13% de las cepas positivas; (4): 1 % de las cepas positivas.

Cepas

CECT CECT CECT

Carbohidrato 8183 8181 8182

Glicerol - - -

Eritritol - - -

D-Arabinosa - - -

L-Arabinosa - - -

D-Ribosa + + +

D-Xilosa + + +

L-Xilosa + + +

D-Adonitol - - -

Metil-pD-xilopiranosida - - + (1 )

D-Galactosa - - +

D-Glucosa + + +

D-Fructosa + + +

D-Mamnosa + + +

L-Sorbosa - - -

L-Rhamnosa - - -

Dulcitol - - -

Inositol - - -

D-Manitol - - -

D-Sorbitol - - -

Metil-aD-manopiranosida - - -

Metil-aD-glucopiranosida - - -

N-acetilglucosamina + + -

Amigdalina + + + Arbutina - - -

Esculina citrato férrico + (2) + (2) + (2)

Salicina + + +

D-Celobiosa - - -

D-Maltosa - - -

D-Lactosa + (3) + (3) + (3)

D-Melibiosa + + +

D-Sacarosa + + +

D-Trehalosa - - -

Inulina - - -

D-Melezitosa - - -

D-Rafinosa - - -

Almidón - - -

Glicógeno - - -

Xilitol - - -

Gentiobiosa - - -

D-Turanosa - - -

D-lixosa - - -

D-Tagatosa - - -

D-Fucosa - - -

L-Fucosa - - -

D-Arabitol - - -

L-Arabitol - - -

Gluconato potásico + d +

2-cetogluconato potásico + - -

5-cetogluconato potásico + + +

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