Résumé

La présente invention a pour objet une nouvelle méthode de synthèse énantiosélective des précurseurs de sphingosines permettant d'obtenir ces sphingosines avec des rendements élevés.

Domaine technique

La sphingosine est la molécule de base des sphingolipides, l'une des deux familles des lipides hydrolysables. Elle est composée d'une part de la sphingomyéline et d'autre part des glycolipides comme les gangliosides, les sulfatides et les cérébrosides.

La sphingosine naturelle (D-érythro sphingosine) a pour formule chimique :

Les céramides sont les dérivés amidifiés de la sphingosine sur l'atome d'azote en position 2 par des acides gras de longueur et de fonctionnalités variables. La nature de l'acide gras dépend des cellules dans lesquelles se trouvent les céramides. Leurs structures varient donc en fonction de la source (animale ou végétale) mais aussi en fonction du tissu (peau, muscle, neurone, ...). Leur formule générale peut s'écrire selon :

où RI est une chaîne alkyle saturée ou insaturée portant éventuellement des fonctions hydroxyles ou dérivés (O-acyl céramide par exemple).

A partir de ces céramides, il est possible d'avoir accès de nombreux composés naturels en fonctionnalisant l'alcool primaire. En fixant un groupement phosphocholine, on obtient une sphingomyéline. En fixant un groupement phosphate on obtient un céramide 1-phosphate. En créant un pont éther avec un ose, on obtient les cérébroside et avec des polysaccharides, on obtient les gangliosides (voir par exemple sur le site : http :www.LipidLibrary.aocs.org).

Les découvertes sur l'utilisation thérapeutique ou cosmétique de ces molécules sont nombreuses car les équilibres chimiques entre sphingosine, céramides, sphingosine phosphate, sphingomyéline et les sphingolipides gouvernent de nombreux phénomènes tels que la gestion du cholestérol (Dobrowski &l J. of Lipid Research, 2005, p 1678), l'inflammation musculaire (WO2010010127) ou la croissance cellulaire (The FASEB Journal, 1996, vol. 10, pl388). Leurs utilisations dans le traitement de certaines maladies se développent de plus en plus (WO2004010987).

Plusieurs voies d'accès à ces molécules existent. Elles peuvent être obtenues par extraction de tissus végétaux ou animaux (EP0689579 Bl ou EP 2308954). Ces méthodes présentent l'inconvénient d'une traçabilité difficile et surtout d'un coût prohibitif pour le développement de produits pharmaceutiques qui exigent cette traçabilité (elles peuvent cependant suffire dans le cas de développements agrochimiques non alimentaires). Les synthèses (antérieures à 1991) ont été décrites par Devant (voir la revue des synthèses de sphingomyliénines dans : Devant &al, Kontakte, 1992, pli). Plus récemment, les revues de Koskinen (Synthesis : 1998, p 1075) sur la synthèse de sphingosines et celle de Weiss (Chemistry and Physics of Lipids, 1999, 102, p 3) sur l'insertion des chaînes phosphocholines sont représentatives du travail de synthèse accompli à ce jour.

Toutes ces voies ont pour point commun l'utilisation de la sphingosine comme précurseur de céramides. Elles nécessitent donc la protection de l'alcool en C3 pour effectuer l'insertion de la chaîne phosphocholine. Toutes ces synthèses, passant par l'intermédiaire sphingosine, souffrent de plusieurs séquences de protection/déprotection pour arriver à un dérivé protégé sur l'alcool allylique et fonctionnalisable sur l'alcool primaire (J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 2000, p2237, Duclos Carbohydrate Research, 2000, p 489 ; Katsumura US 7,232,914 B2). Les synthèses totales de dérivés céramides fonctionnalisés en Cl, tels que la sphingomyéline passent par des étapes de protection/déprotection et ont des rendements faibles rendant difficile un développement industriel.

Seul un exemple décrit l'insertion de la chaîne phosphocholine sur un dérivé céramide non protégé (Bittmann et al, 1994, JOC, p 6495) conduisant à la N-octanoyl-D-érythro- sphingomyéline avec un rendement modeste (30% pour l'insertion de la phosphocholine). Cette méthode insuffisamment sélective ne s'applique pas à des chaînes RI longues. Deux autres exemples par Bittman et Katsumura décrivent l'insertion d'une chaîne phosphocholine sans protection de l'alcool allylique mais elles sont décrites sur des dérivés N-Boc-sphingosine dans les 2 cas (Katsumura et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 2141 ; Katsumura et al. Chem. Lett. 2004, 33, 1592). A noter que Katsumura utilise un réactif de phosphorylation non commercial. Ces méthodes d'accès sans protection de l'alcool allyllique, bien qu'étant originales ne sont pas envisageables sur le plan industriel.

Shoyama et al (Jounal of Lipid Research, vol.19, 1978, pages 250-259) décrit un intermédiaire de céramide dans lequel les alcools sont protégés et en particulier l'alcool en C3 protégé par un groupement CH(OCOCH ₃ )C ₆ H5. Cependant, un tel groupement protecteur est très instable, et ce particulièrement en conditions basiques, empêchant d'assurer une fonctionnalisation satisfaisante en Cl. Par ailleurs l'utilisation simultanée de ce groupement sur l'alcool en C3 et d'un groupement acétyl sur l'atome d'azote rend les étapes de protection peu sélective (l'acétyl pouvant se greffer sur l'alcool ou l'azote indifféremment).

De ces travaux antérieurs, la demanderesse a conclu que la protection sélective de l'alcool en C3 est essentielle pour assurer de bons rendements de fonctionnalisation en Cl, mais qu'à ce jour aucune méthode vraiment efficace pour permettre ces fonctionnalisations n'existait.

De manière surprenante, la demanderesse a découvert qu'en passant par certains nouveaux intermédiaires de synthèse il était possible de simplifier le procédé de synthèse des dérivés de céramides et de sphingosines. Le passage par ces intermédiaires permet de raccourcir le nombre d'étapes par rapport à ce qui est connu de l'homme du métier et d'augmenter ainsi les rendements de synthèse totale des dérivés de sphingosines et/ou de céramides fonctionnalisés en Cl ce qui présente un grand intérêt pour les développements industriels de ces dérivés. L'objet de l'invention est donc constitué par ces nouveaux intermédiaires et de leur procédé de synthèse. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ces dérivés pour fabriquer différentes molécules dérivées de la famille des sphingosines (comme par exemple mais sans limitation les sphingosines-l-phosphate), des céramides (comme par exemple mais sans limitation la sphingomyéline) et sphingolipides naturels ou fonctionnalisés. Description de l'invention

La demanderesse a donc découvert que la synthèse des nouveaux intermédiaires de formules générale F :

permettait de simplifier les méthodes de synthèse des dérivés de la sphingosine fonctionnalisés en position 1, les céramides fonctionnalisés en position 1, la sphingomyéline, et les sphingolipides. Ces composés de formule F sont caractérisés par :

• Ri : une chaîne aliphatique grasse linéaire ou ramifiée, de préférence saturée et de formule générale C _p H _2P+ iO _r , où r est un entier compris entre 0 et 3, de préférence égal à 0 ou 1 ou 2 et où p est un entier supérieur à 5, de préférence compris entre 8 et 35. RI peut aussi comporter des insaturations auquel cas sa formule générale serait du type C _p H _2(p - _q)+ iO _r où q désigne le nombre d'insaturations éventuelles de la chaîne aliphatique de préférence compris entre zéro et 5.

• R ₂ : une chaîne grasse aliphatique de formule générale C _n H ₂ n ₊ i, n étant un entier compris entre 8 et 35 de préférence entre 10 et 20 et de manière plus préférentielle entre 10 et 15 et tout particulièrement n=13. • R ₃ : un radical carboné de type alkyle, aryle, alkyle-aryle éventuellement substitué, de préférence R3 est un radical méthyle, éthyle, propyle ou / 0-propyle.

• R ₄ : est un groupement protecteur des fonctions alcools comme les groupements benzyl, trityl, benzoyl, méthoxyméthyle, méthoxyéthyle, tétrahydropyryle, ou les groupements tri-alkyl ou akyl-aryl silyle tel que le triméthyl silyle, tert-butyl diméthysilyle, triéthyl silyle, tri-isopropyl silyle, tert-butyldiphényl silyle, diméthylphényl silyle, triphényl silyle. De préférence, la demanderesse préfère les groupements tri-alkyl silyle et de manière encore plus particulière les groupements tert-butyl dialkyl silyle, notamment le groupement tert-butyl-diméthyl silyle.

R ₃ peut être un radical carboné de type alkyle en Ci-C ₈ linéaire ou ramifié, de préférence un radical carboné de type alkyle en Ci-C ₄ linéaire ou ramifié et éventuellement substitué, un radical carboné de type cycloalkyle en C ₅ -C ₈ ou un groupe aryl(en C ₆ -Ci ₀ )-alkyle en Ci-C ₈ éventuellement substitué.

R ₃ peut ainsi être un radical carboné de type alkyle en Ci à C ₈ choisi parmi méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, heptyle ou octyle, qui peut être linéaire ou ramifié et éventuellement substitué. De préférence R ₃ est un groupement carboné de type alkyle en Ci à C ₄ choisi parmi méthyle, éthyle, propyle, iso-propyle, ou butyle, qui peut être linéaire ou ramifié et éventuellement substitué.

R ₃ peut aussi être un radical carboné de type aryle choisi parmi phenyle, benzyle, tolyle, xylyle ou naphtyle, éventuellement substitué.

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention vise un composé F dans lequel :

• Ri : une chaîne aliphatique grasse linéaire ou ramifiée, de préférence saturée et de formule générale C _p H2 _P+ iO _r , où r est égal à 0 où p est égal à 15.

• R ₂ : une chaîne grasse aliphatique de formule générale C _n H ₂ n ₊ i, n étant un entier égal à 13. • R ₃ : un radical méthyle, éthyle, propyle ou / ^' so-propyle.

• R ₄ : est un groupement protecteur des fonctions alcools, le tert-butyl- diméthyl silyle. Un procédé passant par de tels intermédiaires F permet d'atteindre des rendements de synthèse totale supérieurs à 15% en évitant le recours à plusieurs séquences de protection/déprotection.

Ces intermédiaires F sont obtenus à partir de dérivés E ou E' eux même objets de l'invention et de formule :

où Ri,R ₂ , ₃ , ₄ ont les mêmes significations que précédemment.

Le schéma suivant résume les étapes de synthèse depuis des aldéhydes accessibles commercialement aux composés F, puis l'uti lisation de ces composés pour synthétiser des sphingosines, des céramides ou des sphingomyélines fonctionnalisées en position 1 (désignés par composés G da ns le schéma). L'uti lisation de F pour accéder à G est donc aussi un objet de l'invention puisqu'elle permet ensuite l'accès aux dérivés sphingosine, sphingomyéline où céramides fonctionnalisés en Cl.



dans lequel R ₅ est un groupement fonctionnel caractéristique du sphingolipide recherché. Le tableau suivant illustre la correspondance entre R5 et les diverses molécules que le procédé de la demanderesse permet d'atteindre.

Description du procédé de synthèse des dérivés E, E' et F :

La demanderesse a découvert 2 façons pour préparer les dérivés F. La première passe par l'intermédiaire E, la seconde par l'intermédiaire E'. De préférence, la demanderesse préfère la voie passant par l'intermédiaire E. Les étapes centrales de l'invention sont donc les étapes faisant passer de D à F via les intermédiaires E ou E'. Pour que cette voie de synthèse soit intéressante, il a aussi fallu découvrir une méthode pour passer avec de bons rendements des aldéhydes commerciaux A aux composés B. Un autre objet de l'invention concerne donc le procédé permettant de passer de A à B.

Description de l'étape hors invention permettant de passer de A à B :

L'étape 1 faisant passer du composé A à B peut être pratiquée en trois réactions successives par réaction de Horner-Wadsworth-Emmons avec un phosphonoacétate pour obtenir l'ester ΕΗΞ insaturé correspondant qui peut ensuite être réduit en alcool allylique par des méthodes de réductions classiques d'ester en alcool à base d'hydrure. Enfin l'alcool allylique ainsi préparé peut être converti en aldéhyde correspondant a u moyen d'un oxydant doux tel que le chlorochromate de pyridinium (ou PCC) ou le dioxyde de manganèse (Solladié-Cavallo A. ; Koessler. J. K.; J. Org. Chem. 1994, 59, 3240-3242 Schroepfer et al. J. Labelled Cpd. Radiopharm. 1999, 42, 815-826). Description de l'étape hors invention permettant de passer de B à D :

La deuxième étape de la synthèse est conçue de manière à éviter le passage par un azoture, toujours problématique lorsqu'il s'agit ensuite de développer le procédé à un niveau industriel et seule méthodologie qui n'emprunte pas un intermédiaire sphingosine pour accéder à des dérivés céramides (Nicolaou, K.C. et al., J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 7910. Zimmermann, P. and Schmidt, R.R. Liebigs Ann. Chem. 1988,663).

La demanderesse a donc choisi une copule chirale : la (+)-2-hydroxy-3-pinanone, pouvant être préparée à partir de pinanediol. Son iminoglycinate correspondant (cf Shioiri & al. Chem Pharm Bul. 1978, p 803) réagit avec B via une réaction d'aldolisation ce qui permet d'isoler l'intermédiaire C sans purification. Cette étape place les deux atomes de carbone chiraux de de la sphingosine (C2 et C3). Le rendement de cette étape est de 91% avec un ratio diastéreomérique élevé erythro/threo supérieur à 95/5 et avec une énantiosélectivité elle aussi élevée. Ces étapes ne sont pas nouvelles et ne permettent pas de revendiquer les produits C ou D comme nouveaux car on les trouve décrits (S. Yamada, T. Oguri, and T. Shioiri, J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1976, 136 ; Oguri, T.; Kawai, N.; Shioiri, T.; Yamada, S-l, Chem. Pharm. Bull. 1978, 2, 803-808 ; Bajgrowicz, J. A et al, Tetrahedron Lett., 1983, 24, 3721- Solladie-Cavallo, A.; Koessler, J. L; J. Org. Chem. 1994, 59, 3240). Il est à noter que l'utilisation de la copule chirale inverse, (-)-2-hydroxy-3-pinanone permet d'obtenir les précurseurs de l'autre énantiomère de la sphingosine à savoir les précurseurs de la L-érythro-sphingosine.

Le composé C est ensuite hydrolysé pour aboutir à la molécule D avec un rendement de 70% (Micouin & al. ChemBioChem, 2003, p 27). Il faut noter que cette hydrolyse régénère la copule chirale qui peut être recyclée pour reproduire l'étape précédente. Ce composé peut être converti en sphingosine par simple réduction de la fonction ester. A la différence des auteurs cités, la demanderesse a choisi de ne pas réduire immédiatement la fonction ester en position 1 de manière à profiter de la présence d'une seule fonction hydroxyle sur le squelette de la molécule en construction.

Description de l'étape selon l'invention permettant de passer de D à F via E ou E' :

Via E :

La synthèse de E est caractérisée en ce qu'on fait réagir le composé D sur une base de préférence de type aminé tertiaire puis on ajoute au mélange réactionnel l'acide gras R1C(0)0H en présence d'un agent de couplage peptidique comme les carbodiimides, les benzotrialzoles ou d'un mélange de tels agents de couplages, de préférence avec le dérivé triazole : N,N,N',N'-Tetramethyl-0-(lH-benzotriazol-l-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) dans un solvant polaire aprotique tel que le DM F (diméthyl formamide), le THF ou de préférence un mélange des deux solvants.

La synthèse de F à partir de E est caractérisée en ce que dans une première étape on mélange E et un réactif porteur d'un groupement protecteur des fonctions alcools comme un halogénure de benzyle, le chlorure de méthoxyméthyle (MOM), le chlorure de méthoxyéthyle (MEM), le dihydropyrane (DHP), un dérivé trityle, un dérivé carboxylique comme le chlorure de benzoyle ou un dérivé silylé comme le triméthyl silyle, tert-butyldiméthysilyle, triéthyl silyle, tri-isopropyl silyle, alkyl aryl silyle : tert- butyldiphényl silyle, diméthylphényl silyle, triphénylsilyle, de préférence en utilisant le chlorure de te/t-butyldiméthyl silyle comme réactif. La réaction est conduite dans un solvant polaire comme le DMF, le dichloroéthane ou l'acétonitrile en préférant le DMF, à une température allant de 25 à 90°C jusqu'à disparition complète du produit de départ. La réaction se fait en présence d'une base faible non nucléophile telle que l'imidazole, les triazoles, ou des alkylamines destinées à piéger le chlorure d'hydrogène qui se dégage dans la réaction. De préférence, la base utilisée est l'imidazole, la pyridine, la diisopropylamine, la diisopropyl-éthylamine (DIPEA), la diméthylaminopyridine (DMAP) ou la triéthylamine.

Via E' La synthèse de E' à partir de D est caractérisée en ce qu'elle consiste à mélanger le produit D dans le DMF avec au moins 2 équivalents, de préférence entre 2 et 2,2 équivalents d'une base faible non nucléophile telle que l'imidazole, les triazoles, ou des alkylamines destinées à piéger le chlorure d'hydrogène qui se dégage dans la réaction. De préférence, la base utilisée est l'imidazole, la pyridine la diisopropylamine, la diisopropyl-éthylamine (DIPEA), la diméthylaminopyridine (DMAP) ou la triéthylamine. On ajoute ensuite au mélange réactionnel 1 équivalent d'un réactif porteur d'une fonction protectrice des fonctions alcools comme un halogénure de benzyle, le chlorure de méthoxyméthyle (MOM), le chlorure de méthoxyéthyle (MEM), le dihydropyrane (THP), un dérivé trityle, un dérivé carboxylique comme le chlorure de benzoyle ou un dérivé silylé le triméthyl silyle, tert-butyldiméthysilyle, triéthyl silyle, tri-isopropyl silyle, alkyl aryl silyle : tert-butyldiphényl silyle, diméthylphényl silyle, triphénylsilyle, de préférence en utilisant le chlorure de te/t-butyldiméthyl silyle comme réactif.

A partir de E', F est obtenu en mélangeant le composé E' avec l'acide gras R1C(0)0H en présence d'un agent de couplage peptidique comme les carbodiimides, les benzotriazoles ou d'un mélange de tels agents de couplages, de préférence avec le dérivé triazole : N,N,N',N'-Tetramethyl-0-(lH-benzotriazol-l-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) dans un solvant polaire aprotique tel que le DMF, le THF ou de préférence un mélange des deux solvants.

Cette étape est une étape clé de notre procédé puisqu'à partir de maintenant, le synthon F voit l'hydroxyle en C3 protégé en milieu basique et porte en Cl une fonction ester dont la réduction permet de créer la fonction alcool primaire présente sur la sphingosine et les céramides.

La demanderesse montrera plus loin que cette structure particulière implique des conditions particulières pour cette réduction. Ces transformations successives sont quasiment quantitatives. Les dérivés de type F sont nouveaux et font partie de l'invention de la demanderesse. Cette découverte peut expliquer pourquoi l'homme du métier n'a pas réussi jusque-là à garder la fonctionnalité ester en Cl et a préféré la réduire avant de passer aux étapes suivantes. Description de l'utilisation de F pour accéder à des sphingosines, sphingomyélines ou céramides fonctionnalisés sélectivement en position 1 :

Le céramide silylé G est obtenu alors par réduction de la fonction ester en Cl avec un rendement de 90%. En particulier la demanderesse a découvert que le borohydrure de lithium permet de réduire l'ester en alcool primaire alors que le sel de sodium, même en présence de chlorure de lithium (LiCI) ne réagit que très peu. La demanderesse comprend cette spécificité comme étant due à la nature chélatante du motif F ci- dessous qui bien que très encombré par le groupement silyle n'empêche pas le lithium d'être chélaté par les trois atomes azote et oxygène favorisant ainsi l'approche des ions hydrures pour la réduction de la fonction carbox lique.

F

Le composé G est similaire aux intermédiaires décrits dans l'art antérieur, mais la demanderesse revendique un accès à ce synthon en seulement 6 étapes. Les intermédiaires F sont quant à eux originaux et portent la signature de la simplicité de la stratégie de synthèse que la demanderesse a découverte et sont de fait un des objets de l'invention.

Les étapes ultérieures ne sont pas originales puisque décrites dans plusieurs documents et ne font pas partie de l'invention. Cependant dans le but de comparer les travaux de l'art antérieur avec ce nouveau procédé de synthèse les synthèses globales des dérivés de la sphingosine ont été pratiquées avec des rendements compris entre 15 et 30% depuis l'aldéhyde de départ.

Parmi les différents sphingolipides visés, tous ont pour synthon de départ le céramide G qui est fonctionnalisé à travers différentes routes. Le céramide-l-phosphate est obtenu simplement en deux étapes par réaction de G sur POCI ₃ puis une déprotection de l'alcool allylique. La sphingomyéline est obtenue à partir de G comme dans le brevet US5220043 ou encore selon Dong. ; J. A. Butcher. ; Tetrahedron Letters 1991, 32, 5291 en 3 étapes. Exemples

Les analyses par résonance magnétique nucléaire ont été conduites sur un spectromètre Brucker 400 MHz. Les délacements chimiques 0 sont indiqués pour chaque produit caractérisé par rapport aux fréquences de résonance de chaque atome ('H OU ¹³ C).

Les suivis réactionnels et identification de produits ont été effectuées par chromatographie sur couche mince (Merck, CCM gel de silice 60 F ₂ 5 ₄ ) ou alternativement par HPTLC (HPTLC gel de silice 60 F ₂ 5 ₄ ) à l'aide d'un robot déposeur CAMAG (Automatic TLC sampler 4) pour des mesures précises de concentration en substrat ou impuretés le cas échéant.

Les suivis GC sont effectués sur un appareil GC-FID, HP 5890 série II monté d'une colonne HP5 (30m x 0.53 mm x 0.88 um).

Les I.R. ont été enregistré sur un appareil FT-IR, spectrum one, PerkinElmer.

Les points de fusion ont été mesurés sur un appareil electothermal.

Pour les exemples de 1 à 6 : n=13, p=23 et q=0.

Les exemples 1 à 6 montrent qu'à partir de tetradécaldéhyde, il est possible de préparer la sphingomyéline qui est un céramide fonctionnalisé en Cl par un groupement phosphocholine. L'exemple 4 sert à comparer la voie qui passerait par la synthèse via la sphingosine qui nécessite 2 étapes supplémentaires ce qui met bien en évidence dans l'exemple 6 l'intérêt d'aller directement la sphingomyléine via E et F.

Exemple 1 : Synthèse du 2-e-Hexadécénal (de A à B) selon l'art antérieur : 1-Tetradécanal (composé A avec n=13) : Le tetradécanal utilisé dans cet exemple a été soit acheté chez Boc Science (85% de pureté) soit fabriqué selon le protocol décrit dans . De Luca, L. ; Giacomelli, G. ; Porcheddu, A. Org. Lett. 2001, 3, 3041-3043 ; O'Doherty et al. J. Org. Chem, 2006, 71, 6686-6689.

Synthèse de l'éthyl 2-Hexadécénoate : A une suspension d'hydrure de sodium (2.4 g, 58.85 mmol) dans le THF anhydre (40 mL) est additionné goutte à goutte et à 0 °C, le phosphonoacetate de triéthyle (9.4 mL, 47.08 mmol). Après 30 minutes d'agitation à 0°C, le tetradécanal (10.0 g, 47.08 mmol) en solution dans le THF anhydre (40 mL) est introduit en une seule fois puis le milieu réactionnel est laissé remonter à l'ambiante. La réaction est quenchée par addition d'une solution saturée en NaCI (50 mL). La phase aqueuse est alors extraite à l'éther diéthylique (3 X 200 mL). Les phases organiques sont combinées puis séchées sur MgS0 ₄ , filtrées et concentrées sous vide. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (Heptane - AcOEt : 95/5) pour conduire à un liquide incolore (12 .3 g ; 92%).

Rf = 0.24 (Hexane/Et ₂ 0 : 95/5).

CPG : tr = 13.13 min (triéthylphosphonoacetate) ; tr = 15.80 min (1-tétradécanal) ; tr = 20.60 min (éthyl 2-Hexadecenoate). H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.87 (t, 3H, CH ₃ ) ; 1.25 (br, 20H) ; 1.28 (t, 3H, CH ₃ ) ; 1.44 (m, 2H, CH ₂ ) ; 2.18 (qd, 2H, CH2, ³ J = 6.5 Hz, ⁴ = 1.5 Hz) ; 4.18 (q, 2H, CH ₂ ) ; 5.80 (dt, 1H, ³ J = 15.5 Hz, ⁴ J = 1.5 Hz) ; 6.96 (dt, 1H, CH ₂ , ³ V = 15.5 Hz, ³ V = 6.5 Hz).

2-e-Hexadécèn-l-ol : Le DIBAI-H (54.5 mL, 1 M dans le cylohexane, 2.4 equiv) est ajouté goutte à goutte et à 0 °C à une solution d'éthyl hexadécènoate (6.4 g, 22.66 mmol) dans le THF anhydre (20 mL). Le système est agité à 0°C et l'avancement de la réaction est suivi par CCM. De l'éther diéthylique (50 mL) et une solution aqueuse saturée en tartrate de sodium (50 mL) sont successivement introduits et l'agitation est maintenue jusqu'à l'observation de deux phases distinctes. La phase aqueuse est extraite à l'éther diéthylique (2 x 50 mL). Les phases organiques sont réunies, séchées sur MgS0 ₄ et concentrées sous vide pour conduire à une cire blanche (5.3 g ; 97%). Rf = 0.31 (Hexane/Et O : 1/1).

2

CPG : tr = 19.1 min

H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.87 (t, 3H, CH ₃ ) ; 1.25 (br, 22H) ; 2.03 (q, 2H, CH ₂ , ³ V = 6 Hz) ; 4.09 (d, 2H, ³ V = 5 Hz) ; 5.66 (m, 2H). 2-e-Hexadécèn-l-al (Composé B) : A une solution de 2-€-Hexadécèn-l-ol (5.2 g ;

21.63 mmol) dans 30 mL de CH ₂ CI ₂ anhydre, est additionné à 0°C, le PCC (16,3 g ; 43.26 mmol) en suspension dans 30 m L de CH ₂ CI ₂ et le Cla rcel (20 g). Après 3h d'agitation à

0°C, le mélange est dilué par 20 mL d'éther, puis filtré sur silice. Le filtrat est concentré. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (Heptane - AcOEt : 95/5) pour conduire à un solide blanc (2,86 g ; 55%).

Rf = 0.14 (Hexane/Et O : 95/5)

2

CPG : tr = 18.9 min

H NMR (400 M Hz, CDCI ₃ ) : 0.88 (t, 3H, CH ₃ ) ; 1.26 (br, 20H) ; 1.50 (m, 2H, CH ₂ ) ; 2.35 (qd, 2H,3 = 7 Hz, ⁴ J = 1.5 Hz) ; 6.1 (ddt, 1H, ³ J = 15.5 Hz, ³ J = 8 Hz, ⁴ J = 1.5 Hz) ; 6.85 (td, 1H, ³ = 15.5 Hz, ³ J = 7 Hz) ; 9.5 (d, 1H, ³ V= 8 Hz).

Exemple 2 de B à D

(1R, 2R, 3S, 5/?)-(-)-Pinanediol : Dans un ballon tricol de 250 m L sont introduits le 5-(-)- 0-pinène (24.3 g ; 178.37 mmol), l'osmate de potassium dihydrate (0.36 ; 132 mg), la A/-oxide-/V-méthylmorpholine (60% dans l'eau ; 214.04 mmol ; 41.7 g) dissous dans 17.3 mL de pyridine, 107 mL d'acétone et 11.9 mL d'eau déionisée. Le mélange est alors chauffé au reflux pendant 60 heures. La réaction est alors diluée par addition de 300 mL de MTBE et 60 mL d'hexane. 200 mL d'eau sont introduits et la phase organique est décantée, lavée avec une solution d'acide citrique à 10% (on effectue cette opération avec 3 foislOO mL de la solution citrique), une solution aqueuse saturée en NaHC0 ₃ (100 mL), de la saumure (100 mL), séchée sur MgS0 ₄ et concentrée sous vide pour conduire à une huile orange foncée (24.5 g).

CPG : tr = 12.0 min (diol) ; tr = 10.9 min (lfl^SflH+^-hydroxy-S-pinanone ; 5 à 10%) (1R, 2R, 5/?)-(+)-2-hydroxy-3-Pinanone : A une solution du diol (24.5 g ; 143.9 mmol) dans 154 mL d'un mélange DMSO/CH ₂ CI ₂ (1/1) est additionné à 10°C la triéthylamine (80.2 mL ; 575.6 mmol). Le complexe S0 ₃ . Pyridine (68.7 g ; 431.72 mmol) est alors ajouté par portions en 30 minutes tout en maintenant une température inférieure à 20°C. Le mélange est alors agité 2 heures à 10°C puis dilué avec 300 mL d' AcOEt. La phase organique est lavée avec une solution d'HCI 0.5 N (2*150 mL), de la saumure (150 mL), séchée sur MgS0 ₄ et concentrée sous vide pour conduire à une huile orange marron. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (Mecyclohexane - AcOEt : 9/1) pour conduire à une huile jaune (19.2 g ; 63% sur deux étapes).

CPG : tr = 10.9 min ;

H NMR (400 M Hz, CDCI ₃ ) : 0.90 (s, 3H) ; 1.30 (s, 3H) ; 1.40 (s, 3H) ; 1.70 (d, 1H, J = 12.0 Hz) ; 2.10 (m, 2H) ; 2.30 (s, 1H) ; 2.50 (m, 1H) ; 2.60 (brs, 2H).

Synthèse du (1R, 2R, 5 î)-éthyl-((2-hydroxypinan-3-ylène)amino)acétate (composé C)

Dans un monocol de 250 mL est introduit le chlorhydrate du glycinate d'éthyle (16.6 g ; 118.9 mmol) en suspension dans 100 mL de toluène distillé. De l'ammoniaque gazeux est alors fait buller dans le milieu réactionnel pendant 1 heure. Le chlorure d'ammonium généré est ensuite éliminé par simple filtration. Au filtrat est additionné la (lR,2R,5R)-(+)-2-hydroxy-3-p ^' manone (10.0 g ; 59,4 mmol) et quelques gouttes d'éthérate de trifluorure de bore (BF ₃ .OEt ₂ ). Le système, équipé d'un Dean-Stark, est chauffé au reflux pendant 5 heures puis le mélange est concentré sous vide.

Le produit brut peut être purifié sur colonne de silice préimprégnée avec de la triéthylamine (5% dans l'éther) et élué à l'éther éthylique, distillé ou être utilisé tel quel dans l'étape suivante.

Rf = 0,35 (Cyclohexane - AcOEt : 1/1)

H NMR (400 M Hz, CDCI ₃ ) : 0.88 (s, 3H, CH ₃ ) ; 1.30 (t, 3H, CH ₃ ,J = 7.0 Hz) ; 1.34 (s, 3H, CH ₃ ) ; 1.53 (s, 3H, CH ₃ ) ; 1.57 (d, 1H, J = 10.0 Hz) ; 2.07 (m, 2H) ; 2.36 (dtt, 1H, J = 10.0 Hz ; J = 6.0 Hz ; J = 1.5 Hz) ; 2.50 (d, 2H, J = 1.5 Hz ; J = 1.0 Hz) ; 2.61 (s, 1H, OH) ; 4.17 (s, 2H, =N-CH ₂ ) ; 4.23 (q, 2H, CH ₂ CH ₃ , J = 7.0 Hz).

¹³ C NMR (100 M Hz, CDCI ₃ ) : 180,0 (C-l quat. Ester) ; 170,2 (C-l' quat. Amide) ; 76,5 (C- 2' quat.) ; 60,9 (ÇJH -CH ) ; 52,6 (C-2) ; 50,4 (C-3') ; 38,6 (C quat) ; 38,3 (C-5) ; 33,7 (C-6)

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; 28,2 (CH ₃ ) ; 28,1 (C-4') ; 27,3 (CH ₃ ) ; 22,8 (CH ₃ ) ; 14,2 (CH ₂ - ÇH ₃ ).

Le (1R, 2R, 5 ?)-ethyl-((2-hydroxypinan-3-ylene)amino)acétate (5.0 g ; 19.88 mmol) est dissous dans 9 .6 mL de CH ₂ CI ₂ anhydre. Le système, placé sous atmosphère d'a rgon, est refroidi à 0°C. Le chlorure d'isopropoxyde de titane (5 .2 g ; 19.88 mmol) en solution dans 15.3 mL de CH ₂ CI ₂ anhydre, le 2-€-Hexadécén-l-al (3.7 g ; 15.53 mmol) en solution dans 7.7 mL de CH ₂ CI ₂ anhydre, et la triéthylamine anhydre (4.8 mL ; 34.17 mmol) sont successivement ajoutés à 0°C. Le milieu réactionnel est maintenu 4 heures à 0°C puis quenché par addition d'une solution de saumure (25 m L). La phase aqueuse est alors extraite à l'acétate d'éthyle, séchée sur MgS0 ₄ et concentrée sous vide pour conduire à une huile jaune-orangée (9.7 g, 100%) (Mélange 73/27 d'ester isopropylique et éthylique).

Rf = 0,7 (Cyclohexane - AcOEt : 1/1)

H NMR (400 M Hz, CDCI ₃ ) : 0.88 (t, 3H, J = 6.5 Hz) ; 1.50-1.10 (m, 28H, (CH ₂ )i ₂ + 2 CH ₃ ) ; 1.50 (s, 3H, CH ₃ ) ; 1.53 (d, 1H) ; 2.13 (q, 2H) ; 2.18-1.95 (m, 2H) ; 2.34 (dtd, 1H) ; 2.51 (m, 1H) ; 3.25 (s, 1H) ; 3.75 (s, 1H) ; 4.15 (d, 1H, J = 6.7 Hz) ; 4.20 (dt, 1H, J = 7.0 Hz ; J = 4.0 Hz) ; 4.55 (t, 1H, J = 6.7 Hz) ; 5.05 (hept, 1H, J = 6.3 Hz, Ç_H(CH ₃ ) ₂ ) ; 5.55 (dd, 1H, J = 15.4 Hz ; J = 7.1 Hz) ; 5.70 (dt, 1H, J = 15.4 Hz ; J = 6.5 Hz).

¹³ C NMR (100 M Hz, CDCI ₃ ) : 180,4 (C-l' quat. Ester) ; 170,0 (C-l quat amide) ; 134,6 (C- 5) ; 127,8 ; 76,7 ; 73,8 ; 68,9 (Ç_H(CH ₃ ) ₂ ) ; 67,3 ; 50,2 ; 38,6 ; 38,5 ; 34,3 ; 28,4 (CH ₃ ) ; 28,1 ; 27,4 (CH ₃ ) ; 22,8 (CH ₃ ) ; 34,3 -32,4 ; 32,1 ; 29,8 ; 29,5 ; 29,4 ; 29,2 ; 23,0 ; 22,9 ; 21,9 (C-6 à C-17, CH(CH ₃ ) ₂ ) ; 14,3.

A une solution du brut d'aldolisation (9.7 g ) da ns le THF (34 mL) est ajouté goutte à goutte une solution aqueuse d'HCI 1.2 M (133 mL). Le mélange est alors agité 72 heures à température ambiante. Le précipité blanc formé au fur et à mesure de la réaction est filtré pour donner 3.0 g du chlorhydrate d'ester (composé D) (50% sur les 2 étapes). L'extraction de la phase aqueuse à l'acétate d'éthyle permet de recycler le (1R, 2R, 5 ?)-(+)-2-hydroxy-3-pinanone. Exemple 3 : Synthèse de sphingosine et céramide selon l'art antérieur

D-erythro-sphingosine

L'aminoester chlorhydrate D (2.2 g ; 5.82 mmol) est mis en suspension dans 40 mL d'un mélange EtOH/eau (3/1). A cette suspension est ajouté le borohydrure de sodium (7.10 g ; 187.7 mmol. Le système est agité 72 heures à 0°C. La réaction est traitée par addition d'une solution saturée de NH ₄ CI (40 mL). La phase aqueuse est extraite au CH ₂ CI ₂ (on extrait 4 fois avec 100 mL de ce solvant), lavée avec de la saumure, séchée sur MgS0 ₄ , filtrée et concentrée sous vide pour conduire à la sphingosine sous la forme d'un solide blanc (1.5 g ; 86%).

Rf = 0,3 (CHCI ₃ - MeOH - H ₂ 0 : 13/6/1)

mp = 79-82°C

H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.90 (t, 3H, J = 6.5 Hz) ; 1.50-1.20 (m, 22H, (CH ₂ )i ₂ ) ; 2.00 (q, 2H, J = 7.8 Hz) ; 3.15 (s, 1H, OH) ; 3.70 (m, 4H) ; 4.30 (s, 1H, OH) ; 5.40 (dd, 1H, J = 15.5 Hz ; J = 6.3 Hz) ; 5.80 (dt, 1H, J = 15.5 Hz ; J = 7.8 Hz).

¹³ C NMR (100 MHz, CDCI ₃ ) : 134,5 ; 129,2 ; 74,4 ; 63,1 ; 56,4 ; 32,6 ; 32,1 ; 29,8 ; 29,5 ; 22,8 (C-6 à C-17) ; 14,2 (C-18).

/V-palmitoyl-D-erythro-sphingosine (céramide)

A une suspension d'HBTU (1.4 g ; 3.67 mmol) dans le DMF (7 mL) est successivement additionné l'acide palmitique (0.86 g ; 3.34 mmol) et la D-erythro-sphingosine (1.0 g ; 3.34 mmol) en solution dans le THF (45 mL). La suspension blanche obtenue est alors refroidie à 0°C et la triéthylamine (1.1 mL ; 8.04 mmol) est introduite. Le milieu réactionnel est alors agité 12 heures à température ambiante puis une solution aqueuse d'acide citrique à 5% (20 mL) est ajoutée. La suspension est filtrée puis le solide blanc obtenu est repris dans l'eau (30 mL) à température ambiante. La suspension blanche est filtrée, lavée à l'eau et séchée pendant 12 heures sous vide et à 40°C pour conduire à la /V-palmitoyl-D-erythro-sphingosine (1.6 g ; 90.0 %). H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.97 (6H, t) ; 1.10-1.40 (m, 46H) ; 1.62 (2H, m) ; 2.04 (2H, m, ÇJH ₂ -CH) ; 2.21 (t, 2H, J = 8.2 Hz, ÇJH ₂ CONH) ; 2.71 (m, 2H) ; 3.69 (m, 1H) ; 3.80-4.00 (m, 2H) ; 4.28 (m, 1H, ÇJH(OH)CH) ; 5.52 (ddt, 1H, J = 15.4 Hz ; J = 6.4 Hz ; J = 1.0 Hz, CH(OH)ÇJH) ; 5.77 (dtd, 1H, J = 15.4 Hz ; J = 6.7 Hz ; J = 1.1 Hz, CH ₂ ÇJH) ; 6.22 (d, 1H, J = 6.8 Hz, NH). Exemple 4 Hors invention : Synthèse de céramide protégé en C3 uniquement à partir de l'exemple 3 selon l'art antérieur (composé G)

Synthèse de la 3-0-Benzoyl-/V-Palmitoyl-D-eryfhro-sphingosine

Protection en Cl

Une solution de /V-palmitoyl-D-erythro-sphingosine (0.58 g, 1.08 mmol), de triéthylamine (1.2 ml), de DMAP (5 mg) et de chlorure de trityle (0.45 g, 1.62 mmol) dans le CH Cl (14 mL) est portée à reflux pendant 60 h. Le milieu réactionnel est alors

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concentré sous vide puis redissous dans 30 mL d'acétate d'éthyle. La phase organique est alors lavée avec une solution aqueuse d'HCI 1 N (30 mL), une solution aqueuse saturée en NaHC0 ₃ (30 mL), et de la saumure (30 mL), séchée sur MgS0 ₄ et concentrée sous vide. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice (Heptane/AcOEt : 7/3) pour conduire au A/-palmitoyl-l-0-trityl-D-erytftro-sphingosine (0.39 g, 46%).

Rf = 0.49 (CH ₂ CI ₂ /EtOAc/Et ₃ N : 97/3/0.1). H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.88 (6H, t), 1.40-1.15 (46H, m), 1.64 (2H, m), 1.91 (2H, m), 2.20 (2H, t, J = 8.2 Hz), 3.28 (1H, dd, J = 9.6 Hz, J = 4.0 Hz), 3.40-3.35 (2H, m), 4.04 (1H, m), 4.17 (1H, m), 5.24 (1H, dd, J = 15.4 Hz, J = 6.2 Hz), 5.62 (1H, dt, J = 15.4 Hz, J = 6.6 Hz), 6.06 (1H, d, J = 7.5 Hz, NH), 7.35-7.20 (9H, m), 7.35-7.45 (6H, m).

Protection en C3

A une solution de A/-Palmitoyl-l-0-trityl-D-erytftro-sphingosine (0.39 g, 0.50 mmol) dans la pyridine est additionné la DMAP (10 mg) puis le chlorure de benzoyle (0.1 ml, 0.85 mmol). Le système est alors agité 20 heures à température ambiante, concentré sous vide puis repris dans l'acétate d'éthyle (25 mL). La phase organique est alors lavée avec une solution aqueuse saturée en NaHCO ₃ (30 mL), lavée avec de la saumure (30 mL), séchée sur MgS0 ₄ , filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice (Heptane/AcOEt : 85/15 à 1/1) pour conduire au 3-0- benzoyl-A/-palmitoyl-l-0-trityl-D-erytftro-sphingosine (207 mg, 60%). Η NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) : 0.88 (6H, t), 1.31-1.23 (46H, m), 1.56 (2H, m), 1.99 (2H, m), 2.08 (2H, t), 3.17 (1H, dd, J = 7.4 Hz, J = 3.9 Hz, CH(H')OH), 3.43 (1H, dd, J = 9.7 Hz, 3.9 Hz, CH(H')OH], 4.47 (1H, m, CH- (NHCOR)), 5.43 [1H, dd, J = 15.3 Hz, J = 7.3 Hz, CH(OCOPh)CH=], 5.75-5.60 [2H, m, NH, CH(OCOPh)], 5.86 (1H, dt, J = 15.3 Hz, J = 7.9 Hz, CH ₂ CH=), 7.25-7.10 (9H, m), 7.40-7.30 (8H, m), 7.54 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.92 (2H, d, J = 7.3 Hz).

Déprotection en Cl

Une solution de 3-0-Benzoyl-/V-palmitoyl-l-0-trityl-D-eryi^ro-sphingosine (1.10 g, 1.24 mmol) et d'acide-p-toluène sulfonique monohydrate (0.23 g, 1.36 mmol) dans un mélange CH ₂ CI ₂ (18 ml) et méthanol (18 ml) est agitée 3 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors concentré sous vide puis redissous dans l'acétate d'éthyle (30 mL), lavée avec une solution aqueuse saturée en NaHC0 ₃ , lavée avec de la saumure (30 mL), séchée sur MgS0 ₄ et concentré sous vide. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice (Heptane/AcOEt : 1/1) pour conduire au 3-0-Benzoyl-A/-Palmitoyl-D-erytftro-sphingosine (0.64 g ; 80%) qui est le composé G.

Η NMR (400 MHz, CDCI ₃ , CD ₃ OD) : 0.87 (6H, t), 1.30-1.10 (46H, m), 1.54 (2H, m), 1.96 (2H, m), 2.14 (2H, m), 2.77 (2H, br s), 3.71 (2H, m, CH ₂ 0), 4.24 (1H, m, CHN), 5.60-5.40 [2H, m, CH(OCOPh)CH=], 5.79 (1H, dt, J = 15.0 Hz, J = 6.8 Hz, CH ₂ CH=), 6.18 (1H, d, J = 9.6 Hz, NH), 7.38 (2H, dd, J = 7.6 Hz, J = 7.2 Hz), 7.52 (1H, dd, J = 7.6, J = 7.6 Hz), 7.96 (1H, d, J = 7.2 Hz).

Exemple 5 selon l'invention : Synthèse des composés E, F et G selon l'invention.

Fixation de la chaîne grasse de l'amide (composé E) :

A une suspension d'HBTU (3.30 g ; 8.72 mmol), de sel de chlorhydrate d'ester obtenu dans l'exemple 2 (3.0 g ; 7.94 mmol) et d'acide palmitique (2.04 g ; 7.94 mmol) dans le DMF (17 mL) et le THF (106 mL) est additionné, à 0°C,la triéthylamine (2.7 mL ), goutte à goutte. Le milieu réactionnel est alors agité 6 heures à température ambiante. 120 ml de MTBE sont alors introduits et la phase organique est lavée avec de la saumure (2x100 mL), séchée sur MgS0 ₄ , filtrée et concentrée sous vide. Le solide résiduel est purifié par flash chromatographie sur gel de silice pour conduire au céramide sous la forme d'un solide blanc (4.6 g ; 100%). Protection de l'alcool en C3 (composé F):

A une solution de céramide ester (4.60 g ; 8.72 mmol) et d'imidazole (1.56 g ; 23.00 mmol) dans le DMF (35 mL) est additionné le TBDMSCI (3.00 g ; 19.83 mmol) en solution dans 15 ml de DMF goutte à goutte. Le milieu réactionnel est agité 60 h à température ambiante. 150 mL de MTBE et 150 ml d'eau sont introduits. La phase organique est décantée et la phase aqueuse est extraite au MTBE (3x50 mL). Les phases organiques sont alors réunies, lavées à l'eau (lOOmL) puis avec de la saumure (100 mL), séchées sur MgS0 ₄ , filtrées et concentrées sous vide. L'huile résiduelle obtenue est alors purifiée par flash chromatographie sur gel de silice pour conduire au céramide silylé (5.30 g ; 96%). On obtient alors le composé F selon l'invention.

Déprotection de l'alcool en Cl (Synthèse du composé G selon l'invention)

A une solution de céramidé silylé (1.50 g ; 2.16 mmol) dans le THF anhydre (15 mL) est additionné goutte à goutte une solution de LiBH (11.9 mL ; 2M dans le THF). Le système est alors agité 24 heures à température ambiante. 70 mL de CH ₂ CI ₂ sont introduits puis la réaction est quenchée par addition de 70 ml d'une solution aqueuse saturée en NH ₄ CI. La phase organique est alors lavée avec de la saumure (60 mL), séchée sur MgS0 ₄ , filtrée et concentrée sous vide pour conduire à une huile incolore. Une purification sur gel de silice conduit à la 3-0-ieributyldimethylsilyl-/V-palmitoyl-D- erythro-shingosine (1.2 g ; 85%) sous la forme d'un solide blanc.

Comparaison entre la voie selon l'invention et la voie de l'art antérieur :

Le composé F obtenu selon les exemples 1, 2,3 et 5 a été obtenu avec un rendement molaire global de 23% à partir du tétradécaldéhyde. Le rendement pour le même composé selon la voie connue de l'art antérieur est de 3,2%. Ceci met bien en évidence l'importance d'utiliser l'intermédiaire de type E pour accéder aux précurseurs des sphyngolipides F.

Exemple 6 : synthèse d'une sphingomyléine ( à partir du composé G selon art antérieur)

/V-palmitoyl-D-eryfhro-sphingomyéline

A une solution de 3-0-t-butyldimethylsilyl-/V-palmitoyl-D-éryi^ro-sphingosine (0.5 g, 0.77 mmol) et de TMEDA (0.12 mL, 0.81 mmol) dans le toluène anhydre (12.5 ml) est additionné goutte à goutte le 2-chloro-2-oxo-l,3,2-dioxaphospholane (0.17 mL, 1.84 mmol) dissous dans 0.25 mL d'acétonitrile. Le milieu réactionnel est agité 3 heures à température ambiante puis transféré sous argon dans un tube scellé. 12.5 mL d'acétonitrile puis la triméthylamine gaz (3 mL) sont successivement introduits. Le système est alors chauffé 14 heures à 70°C, refroidit et concentré sous vide.

La 3-0- ieributyldimethylsilyl-/V-palmitoyl-D-eryi^ro-sphingomyélin e est alors dissoute dans du THF (5.0 mL) puis le TBAF (1M dans le THF, 2.3 mL) est additionné. Le mélange est chauffé 14 heures à 45°C. 2.3 mL supplémentaires de TBAF sont introduits. Après 2 heures supplémentaire à 45°C la réaction est complète. La solution est concentrée sous vide puis dissoute dans 15 mL de CH ₂ CI ₂ , lavée à l'eau et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est dissous dans lmL de CH ₂ CI ₂ et de ml de MeOH. 7 mL d'acétone sont additionnés et le système est refroidit 2 heures à 0°C. Le précipité formé correspondant à la /V-palmitoyl-D-eryi^ro-sphingomyéline est alors filtré et séché sous vide (260 mg ; 48% sur les 3 étapes).