METAGENÓMICAS

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el desarrollo de transposones para suplir parcialmente la maquinaria transcripcional durante el análisis funcional de librerías genómicas/metagenómicas, y por lo tanto, para aumentar la identificación de nuevos compuestos con potencial biotecnológico para librerías de ADN genómicas/metagenómicas, superando parcialmente las limitaciones de los hospederos bacterianos, que previenen que éstos reconozcan la mayoría de los genes foráneos de las librerías de ADN.

Antecedentes de la invención

Actualmente se estima que tan sólo alrededor del uno por ciento de todos los microorganismos presentes en ambientes naturales pueden ser cultivados en condiciones estándar de laboratorio, por lo que todavía es desconocido el gran potencial de compuestos novedosos, actividades enzimáticas y reguladores genéticos útiles para la industria, derivados de la mayor proporción de organismos de la biosfera terrestre.

En vista de lo anterior, es decir, debido a las limitaciones para caracterizar una alta proporción de las enzimas y metabolitos producidos por bacterias no cultivables, la metagenómica ha emergido como una aproximación alternativa al análisis microbiológico convencional. Esta estrategia se basa en la extracción del ADN total a partir de una muestra ambiental (mezcla genómica de la comunidad microbiana conocida como metagenoma) y su clonación subsecuente en una bacteria fácilmente cultivable. Con esta aproximación se han construido librerías genómicas/metagenómicas y se han usado para identificar aislados bacterianos capaces de producir enzimas y metabolitos novedosos. Luego se realizan análisis funcionales basados en la expresión heteróloga del ADN foráneo, lo cual se refleja en un rasgo particular (fenotipo)

i expresado por algunos aislados bacterianos de la librería genómica/metagenómica.

Por lo tanto, los análisis funcionales de la mayoría de las librerías de ADN dependen de la expresión eficiente de los genes heterólogos en el hospedero bacteriano para lograr la identificación de funciones derivadas de genes conocidos-desconocidos o de grupos genéticos complejos. El éxito de un ensayo funcional dado dependerá en gran medida del método de detección y de la actividad de interés, pudiéndose distinguir tres tipos generales de análisis: 1) Detección directa de actividad, donde la expresión de una enzima particular o metabolito se usa para identificar los clones bacterianos; 2) Detección modulada, la cual involucra la expresión de genes requeridos para el crecimiento bacteriano bajo condiciones selectivas; y 3) Inducción por substrato, como una estrategia que promueve la expresión génica en presencia de un substrato dado.

Sin embargo, independiente del tipo de detección, los análisis funcionales son frecuentemente problemáticos debido al hecho de que la identificación de los fenotipos deseados depende de muchos factores, como son el sistema vector- hospedero seleccionado, el tamaño del gen de interés (individual o del grupo de genes), su abundancia en la fuente metagenómica, el método de detección usado y la eficiencia de la expresión heteróloga de genes en el hospedero seleccionado.

En la mayoría de los estudios genómicos/metagenómicos realizados, E. coli ha sido el hospedero preferido para la construcción de librerías y la realización de análisis funcionales debido en gran parte al entendimiento actual de la genética molecular de esta bacteria y a su amplio uso por décadas como modelo en áreas como la microbiología y la biología molecular. Además, el desarrollo e implementación de técnicas sofisticadas de modificación genética, junto con su simple manipulación, rápido crecimiento, facilidad de procesamiento y versatilidad en un amplio rango de herramientas genéticas, han hecho de E. co// el hospedero preferido en experimentos de biología molecular.

A pesar de estas ventajas, la maquinaria genética de E. coli puede ser incapaz de realizar correctamente la expresión génica de ADNs foráneos. Los metagenomas son mezclas complejas de genomas de un amplio rango de microorganismos e incluso una librería de un solo genoma podría ser obtenida de un microorganismo distantemente relacionado. Gabor et al. cuantificaron la probabilidad teórica de E. coli de expresar genes derivados de fragmentos clonados al azar de 32 genomas procariontes completos (Env. Microbiol. 2004, 6:879-886). Esto fue determinado in silico basado en la presencia de señales funcionales de E. coli sobre dichos genomas y la longitud de los insertos genómicos. Usando tres modelos teóricos de expresión de genes, se encontró que en promedio 40% de las actividades enzimáticas codificadas por los genomas procarióticos podían ser accesibles a la maquinaria de la E. coli. Esto significa que una porción significativa de genes de estos genomas (60%) todavía sería incompatible para las maquinarias transcripcionales y traduccionales del sistema de expresión bacteriano.

Un estudio más reciente para determinar la habilidad de E. coli de transcribir globalmente diferentes genes, tanto procariontes como eucariontes, fue evaluado por microarreglos y RT-PCR (Warren RL, et al.; Genome Res. 2008, 18:1798-1805). Se observó que la E. coli fue capaz de transcribir alrededor de la mitad de los genes de Haemophilus influenzae, una menor proporción de genes de P. aeruginosa y solo un número mínimo de genes humanos. Adicionalmente, los genes que mostraron niveles de expresión significativamente mayores en E. coli tuvieron regiones promotoras relacionadas a los sitios de reconocimiento de la subunidad sigma-70 de la ARN polimerasa bacteriana, resaltando la selectividad de la maquinaria transcripcional del hospedero durante los primeros pasos de la expresión del ADN foráneo.

Por lo tanto, la selectividad de la maquinaria transcripcional es evidente durante las etapas iniciales de la expresión del ADN foráneo, lo que implica que cualquier estrategia encaminada a incrementar la expresión génica en estudios genómicos/metagenómicos funcionales, independiente del hospedero bacteriano seleccionado, tiene que superar esta limitación inicial.

Se han reportado diferentes estrategias para mejorar la expresión heteróloga de genes de ADN genómico/metagenómico. Así, por ejemplo, el uso de hospederos alternativos, ya sea que la librería de ADN sea construida simultáneamente en algunos de ellos o que sea transferida de un hospedero a otro, ha mostrado ser exitoso en el incremento de la expresión génica. Esta estrategia está usualmente asociada con el desarrollo de vectores de expresión novedosos que puedan ser mantenidos de forma estable en más de un sistema bacteriano.

Un ejemplo de desarrollo (pero no de implementación funcional) de vectores de amplio espectro de hospedero o vectores "shuttle" fue el pSR44 (divulgado por Aakvik T. et al; FEMS Microbiol Lett 2009, 296:149-58). Este vector puede ser inducido desde un número bajo de copias hasta un número alto de copias con L-arabinosa y contiene un origen de transferencia RK2 para permitir la conjugación en hospederos adicionales como Pseudomonas fluorescens y Xanthomonas campestris. Pese a que en años recientes se ha incrementado el repertorio de vectores "shuttle", todavía pocos estudios han confirmado la versatilidad de estas herramientas genéticas para incrementar la expresión heteróloga de genes en análisis funcionales de librerías metagenómicas.

Otra modificación en vectores usados para la construcción de librerías genómicas/metagenómicas es la adición de promotores adyacentes a los sitios de múltiple clonaje con el fin de aumentar la transcripción del ADN foráneo. Por razones obvias, la efectividad de esta estrategia está más restringida a librerías construidas con insertos pequeños de ADN. Este es el caso del plásmido pJOE930, que al tener dos promotores-lac convergentes e inducibles a ambos lados de un sitio simétrico de múltiple clonaje permitió la identificación de un gran número de aislados bacterianos activos, expresando enzimas lipolíticas, amilasas, fosfatasas y dioxigenasas (Lámmle K, et al.; J. Biotechnol. 2007, 127:575-92).

La solicitud de patente WO 2012/069668 se relaciona con el desarrollo de vectores y cepas como sistemas de expresión, ofreciendo la posibilidad de identificar genes de interés que no son expresados en bacterias que hospedan la librería metagenómica, y permitiendo de esta forma la detección de las funciones codificadas, las cuales, de otra manera permanecerían silenciadas y no podrían ser detectadas. Específicamente, dicha solicitud de patente revela la inclusión del promotor derivado del fago T7 en vectores de tipo cósmido y fósmido para promover la transcripción de insertos genómicos/metagenómicos como resultado de la expresión de la T7RNA polimerasa (T7RNAP) desde el hospedero. El éxito de esta estrategia está basado en la alta procesividad y eficiencia de la T7RNAP para transcribir genes, pero se restringe al análisis de las regiones flanqueantes de los insertos genómicos/metagenómicos.

Otra aproximación es el uso de elementos de ADN móviles o transposones, los cuales han sido ampliamente usados en una variedad de estudios genéticos avanzados, tal como mutagénesis, secuenciación (US2014/0162897), manipulación genómica, transgenésis, terapia génica y modulación funcional de la expresión de genes (Ivics Z. et al.; Nal Methods 2009, 6:415-22).

Una de las maquinarias de transposición mejor caracterizadas es la del bacteriófago Mu, pues en contraste con la relativa complejidad del mecanismo de transposición in vivo de este fago, que involucra un número importante de factores auxiliares, se han observado substancialmente menos condiciones para las reacciones de transposición in vitro. Así, los componentes mínimos de reacción para la transposición de tipo Mu incluyen el buffer de reacción, la transposasa MuA purificada, el mini transposón Mu y el ADN de interés (ADN blanco). Estos parámetros han mostrado ser suficientes para eventos de transposición eficientes con bajo sesgo de inserción sobre múltiples ADNs blanco, haciendo de la implementación del transposón Mu una herramienta ideal y ajustable en diferentes campos de investigación.

En términos de aplicaciones en biología molecular el transposón Mu ha facilitado el análisis de secuenciación, la detección de polimorfismos y la determinación precisa de interacciones proteicas. En el campo de la ingeniería de proteínas el transposón Mu ha sido básicamente usado para generar proteínas truncadas con el fin de caracterizar actividades enzimáticas diferenciales. A nivel genómico los transposones Mu han promovido ampliamente eventos de mutagénesis y transgénesis, enfocados a disminuir o aumentar la expresión funcional de genes, respectivamente, en diferentes organismos. Específicamente, Leggewie C. et al. (J. Biotechnol. 2006, 123:281-7) revelan la construcción del transposón MuExpress que de forma aleatoria se integra in vitro en librerías existentes de cromosomas artificiales bacterianos (BACs, por sus siglas en inglés) o en librerías de cósmidos, favoreciendo la expresión inducible de sus regiones flanqueantes en ambas direcciones y permitiendo la secuenciación bidireccional de los respectivos clones a partir de sitios únicos de unión de los iniciadores.

Dicho transposón MuExpress fue desarrollado como una herramienta genética para abordar la dificultad de la transcripción génica al interior de insertos largos de ADN de librerías metagenómicas. Teóricamente este transposón incrementa el nivel de transcripción de insertos de ADN porque incluye en cada uno de sus extremos una región promotora T7 de lectura hacia el exterior. Sin embargo, un análisis detallado del diseño y construcción original del transposón MuExpress reveló un error importante que hace inviable el reconocimiento de una de las dos regiones promotoras T7 por la T7RNAP.

Otro transposón conocido por insertar de forma aleatoria un único promotor T7, pero derivado del sistema de transposición Tn5, es el EZ-Tn5 <T7/KAN-2> (Epicentre-lllumina, Madison, Wl, USA). Sin embargo, ni el MuExpress ni el EZ- Tn5 <T7/KAN-2>, los cuales están basados en la alta procesividad de transcripción de la T7RNAP, reportaron suficiente evidencia de inserción de los transposones ni su relación con la mejora en la expresión génica. Adicionalmente, los transposones MuExpress y EZ-Tn5 <T7/KAN-2> dependen de hospederos bacterianos que expresen la T7RNAP (por ejemplo E. coli BL21 DE3, Invitrogen), lo cual restringe ampliamente su uso en ensayos funcionales, especialmente con ADN metagenómico, ya que la mayoría de los kits de construcción de librerías dependen de otras cepas bacterianas especializadas (por ejemplo E. coli Epi300, Epicentre-lllumina, Madison, Wl, USA).

Con base en la versatilidad de los transposones Mu en la investigación en biología-biotecnología molecular, así como en la necesidad actual de mejorar eficientemente la expresión heteróloga de genes de librerías de ADN genómico/metagenómico, se hacía necesario crear nuevas herramientas y estrategias genéticas usando éste elementó móvil de ADN. Resumen de la invención

La presente invención involucra el diseño de un nuevo transposón Mu y los métodos para lograr una expresión eficiente de genes alojados en ADNs episomales de librerías genómicas/metagenómicas, que bajo aproximaciones tradicionales de análisis no son detectados en ensayos funcionales. La eficiencia en el uso de la invención se refleja en una proporción incrementada de aislados bacterianos que muestran el fenotipo deseado, comparado con la proporción de aislados bacterianos que pueden ser identificados en los análisis funcionales originales. El primer aspecto de la invención se basa en el desarrollo secuencial de plásmidos para la construcción del nuevo transposón Mu.

En una realización, la invención se dirige al desarrollo de un gen sintético (Tn_A), el cual es una secuencia de ADN artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) una secuencia promotora T7,

(ii) un sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa

MuA,

(iii) múltiples sitios flanqueantes de reconocimiento para endonucleasas de restricción.

En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del plásmido pUC57_Tn, el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un vector esqueleto con un origen de replicación de alto número de copias y un marcador de selección,

(ii) una secuencia promotora T7 en una orientación específica,

(iii) un sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa MuA en una orientación específica. En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del plásmido pUC57_Tn_kanAB, el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un vector esqueleto con un origen de replicación de alto número de copias y un marcador de selección,

(¡i) una secuencia promotora T7 de lectura hacia el exterior,

(iii) un sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa

MuA,

(iv) un marcador de selección diferente de aquel que está localizado en el vector esqueleto.

En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del plásmido pBAD18- Cm_t7rnap, el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un vector esqueleto con un origen de replicación de alto número de copias y un marcador de selección,

(ii) un gen que codifica la T7RNA polimerasa regulado por un promotor inducible.

En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del plásmido pUC57_Tn_kanAB_t7, el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un vector esqueleto con un origen de replicación de alto número de copias y un marcador de selección,

(ii) una secuencia promotora T7 de lectura hacia el exterior,

(iii) un sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa

MuA,

(iv) un marcador de selección diferente de aquel que está localizado en el vector esqueleto, (v) un gen que codifica la T7RNA polimerasa regulado por un promotor inducible.

En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del plásmido pUC57_TnC_T7 el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un vector esqueleto con un origen de replicación de alto número de copias y un marcador de selección,

(ii) un marcador de selección diferente de aquel localizado en el vector esqueleto,

(iii) un gen que codifica la T7RNA polimerasa bajo un promotor inducible,

(iv) dos promotores flanqueantes T7 de lectura hacia el exterior,

(v) dos sitios flanqueantes de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa MuA.

En otra realización, la invención se dirige al desarrollo del fósmido F076 GFP el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN, que comprende:

(i) un fósmido esqueleto con orígenes de replicación de bajo a alto número de copias y un marcador de selección,

(¡í) un inserto de ADN metagenómico,

(iii) un gen que codifica una variante de la proteína verde fluorescente (GFP) con un sitio de unión al ribosoma (RBS) corriente arriba, ambos localizados específicamente dentro del inserto de ADN metagenómico.

En otra realización, la presente invención está dirigida de forma amplia a un método para aumentar la transcripción de ADN, como paso inicial para la expresión foránea de genes, que comprende:

(i) generar librerías de transposición de ADN episomal, como resultado de la inserción aleatoria del transposón TnC_T7 purificado, donde dicho ADN episomal incluye plásmidos, fósmidos, cósmidos o BACs, (i¡) introducir las librerías de transposición de ADN episomal de (i) dentro de células hospederas,

(iii) expresar la T7RNA polimerasa codificada en el transposón TnC_T7, para proporcionarle a las poblaciones de células hospederas bacterianas una colección diversa de transcritos de ARN derivados del ADN episomal,

(iv) analizar dicha población de células hospederas bacterianas para identificar los aislados bacterianos que expresan un gen reportero o cualquier otra función deseada.

En otra realización, la presente invención incluye ocho plásmidos, los cuales corresponden a vectores artificiales resultado de inserciones aleatorias del transposón TnC_T7 en el plásmido pKR-C12, cada uno comprendiendo:

(i) un vector esqueleto con su propio marcador de selección y un gene reportero silenciado,

(ii) una inserción diferencial del transposón TnC_T7 a lo largo de la

secuencia de ADN de (i).

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente descripción y se incluyen para demostrar adiclonalmente ciertos aspectos de ésta. La invención puede entenderse mejor a través de la referencia a una o más de éstas figuras, en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas aquí presentadas.

La FIG. 1 muestra la estructura de la secuencia de ADN Tn_A, la cual comprende la secuencia R1 -R2 de unión para la transposasa MuA, correspondiente a uno de los sitios de reconocimiento de repetición Invertida, y a la región promotora T7 en la misma molécula de ADN, pero en la hebra opuesta. La longitud del gen Tn_A es de 138 pb e incluye sitios flanqueantes de reconocimiento para las siguientes endonucleasas de restricción: EcoRI, BglW, Asc\ y 8amHI. La FIG. 2 esquematiza la clonación de la secuencia de ADN Tn_A en el vector pUC57 para generar el plásmido pUC57_Tn. La clonación directa fue lograda usando los sitios de restricción EcoRI y Bam \ en el gen y en el plásmido pUC57, como un requerimiento para los pasos subsiguientes con el fin de construir el plásmido que alberga el transposón TnC_T7. AmpR, gen de resistencia a ampicilina; M13 fwd, sitio de hibridación para el iniciador M13 directo; M13 rev, sitio de hibridación para el iniciador M13 reverso; ori, origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC de alto número de copias; sitio de unión CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito.

La FIG. 3 describe la clonación en pUC57_Tn del gen de resistencia a la kanamicina (Kan) incluyendo su promotor, para generar el plásmido pUC57_Tn_kanAB. Primero se amplificó Kan en dos pasos, con el fin de reemplazar el sitio de restricción BglW por Spel. El producto ligado se insertó en los sitios de restricción Asc\ y BamH\ de pUC57_Tn. AmpR, gen de resistencia a ampicilina; M13 fwd, sitio de hibridación para el iniciador M13 directo; M13 rev, sitio de hibridación para el iniciador M13 reverso; ori, origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC de alto número de copias; sitio de unión CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito; NeoR/KanR, gen de resistencia a neomicina y kanamicina; FRT, sitio de escisión pero no integración mediado por FLP.

La FIG. 4 muestra la clonación de la secuencia que codifica la T7RNA polimerasa (T7RNAP) en el sitio de restricción único Kpn\ (posterior a la reparación de los extremos) del plásmido pBAD18-Cm (Guzmán LM, et al.; J. Bacterio!. 1995, 177:4121-30), para generar el plásmido pBAD18-Cm_t7rna. La secuencia codificante de la T7RNAP se localiza corriente abajo del promotor inducible con arabinosa (PBAD) y corriente arriba de los terminadores transcripcionales rrnB T1 y T2. CmR, gen de resistencia a cloranfenicol; f1 ori, origen de replicación del bacteriófago f1 ; o , origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC de alto número de copias; bom, base de la región de movilidad para pBR322; araC, proteína regulatoria de L-arabinosa; promotor araBAD, promotor del operón de L-arabinosa de E. coli. La FIG. 5 representa la detección del péptido AA en un ensayo de western blot, como resultado de la expresión de la T7RNAP derivada de diferentes extractos de cultivos bacterianos. 1 , control positivo de la expresión del péptido AA a partir del clon bacteriano E. coli BL21 DE3 transformado con el plásmido pET28a_AA y suplementado con kanamicina e IPTG; 2, clon bacteriano E. coli TOP10 transformado con los plásmidos pET28a_AA y pBAD18-Cm_t7rnap y suplementado con kanamicina, cloranfenicol y D-glucosa; 3-6, clones bacterianos E. coli TOP10 transformados con los plásmidos pET28a_AA y pBAD18-Cm_t7rnap y suplementados con kanamicina, cloranfenicol y L- arabinosa.

La FIG. 6 esquematiza la clonación del promotor inducible con arabinosa y de la secuencia codificante de la T7RNAP, como un solo amplicón, en el sitio único de restricción >Ascl de pUC57_Tn_kanAB, generando el plásmido pUC57_Tn_kanAB_t7. El amplicón P _B AD_T7RNAP se localiza entre las secuencias de ADN del Tn_A y del gen de resistencia a kanamicina. AmpR, gen de resistencia a ampicilina; M13 fwd, sitio de hibridación para el iniciador M13 directo; M13 rev, sitio de hibridación para el iniciador M13 reverso; ori, origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC de alto número de copias; sitio de unión CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito; NeoR/KanR, gen de resistencia a neomicina y kanamicina; FRT, sitio de escisión pero no integración mediado por FLP; T7RNAP, secuencia codificante de la T7RNA polimerasa; promotor araBAD, promotor del operón de L- arabinosa de E. coli.

La FIG. 7 esquematiza la clonación del segundo extremo del transposón (Tn_B) en pUC57_Tn_kanAB_t7 para generar el plásmido pUC57_TnC_T7. Tn_B incluyó el otro sitio R1-R2 de unión para la transposasa MuA, la segunda región promotora T7 de la construcción final del transposón TnC_T7 y dos sitios flanqueantes de restricción Hind\\\, que permiten su clonación en el vector blanco. Se resaltan además los sitios de restricción BglW que son necesarios para liberar el transposón TnC_T7 del plásmido. AmpR, gen de resistencia a ampicilina; M13 fwd, sitio de hibridación para el iniciador M13 directo; M13 rev, sitio de hibridación para el iniciador M13 reverso; ori, origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC de alto número de copias; sitio de unión CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito; NeoR/KanR, gen de resistencia a neomicina y kanamicina; FRT, sitio de escisión pero no integración mediado por FLP; T7RNAP, secuencia codificante de la T7RNA polimerasa; promotor araBAD, promotor del operón de L-arabinosa de E. coli.

La FIG. 8 representa a escala las regiones estructurales del transposón TnC_T7. Cada uno de los dos sitios de unión para la transposasa MuA está adyacente a un promotor T7 individual. En cursiva se resaltan los sitios de restricción más representativos en la construcción del transposón. La distancia entre los dos sitios de restricción BglU es de 4,575 pb. KanR, gen de resistencia a kanamicina; promotor araBAD (promotor inducible por arabinosa (PBAD)), promotor del operón de L-arabinosa de E. coli; T7RNAP, secuencia codificante de la T7RNA polimerasa.

La FIG. 9 representa el principio del método aquí revelado, dirigido a aumentar la transcripción de ADN como el paso inicial de la expresión de genes foráneos. Específicamente, el método comprende el uso del transposón TnC_T7, un transposón Mu, para suplir parcialmente la maquinaria transcripcional durante los análisis funcionales de librerías genómicas/metagenómicas. Este transposón fue concebido y construido para tener la habilidad de integrarse de forma aleatoria dentro de cualquier ADN episomal, permitiendo la expresión inducible de las regiones adyacentes de ADN en ambas direcciones. A, B y C muestran ejemplos de eventos de transposición del TnC_T7 sobre ADN blanco y la habilidad en cada caso de aumentar la expresión génica como resultado de su inserción específica. En caso de que haya un gen de interés (cajas negras con flechas blancas mostrando la orientación de lectura) en un ADN blanco particular, la inserción aleatoria del transposón TnC_T7 puede promover la transcripción del ADN (flechas punteadas), lo cual conducirá eventualmente a la expresión de proteínas particulares (círculos negros) y a la detección del fenotipo deseado.

La FIG. 10 representa la detección inicial de clones .bacterianos que expresan GFP, con base en la inserción aleatoria del transposón TnC_T7 en pKR-C12 (1 -15). La detección de la fluorescencia fue realizada por espectrofotometría y expresada en términos de Unidades Relativas de Fluorescencia (RFUs). Como controles negativo (-) y positivo (+) de fluorescencia se incubó E. coli Epi300 pKR-C12 en ausencia y presencia de A/-(3-oxododecanoil)-L-homoserina lactona (3-oxo-C12-HSL) 5 μΜ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), respectivamente.

La FIG. 1 1 esquematiza las inserciones del transposón TnC_T7 en pKR-C12 y la detección de fluorescencia de aislados bacterianos seleccionados posttransposición. A, diagrama a escala del plásmido pKR-C12. El fragmento del plásmido resaltado muestra la localización exacta de las inserciones del transposón (asociadas a los clones bacterianos 1-8) localizadas en la cercanía del gen codificante de GFPmut3 ^* (GFP). Las flechas punteadas orientadas de arriba hacia abajo representan los sitios de inserción del transposón en los cuales el gen t7rnap está localizado en la hebra sentido del ADN blanco, mientras que las flechas de abajo hacia arriba representan el mismo gen localizado en la hebra antisentido del ADN. pBBR1 , origen de replicación del plásmido; LasR, regulador transcripcional; P-O, promotor Lac y sistema operador Lac; GFP, proteína verde fluorescente; CmR, gen de resistencia a cloranfenicol; GmR gen de resistencia a gentamicina; CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito; ^* , dos inserciones independientes de TnC_T7 en la misma posición. B, detección de fluorescencia por espectrofotometría expresada en términos de RFUs/Densidad Óptica6oonm (GFP/OD); 1-8, aislados de E. coli Epi300 alojando los plásmidos con las inserciones del transposón mostradas en A; (-) control negativo de la expresión de GFP; (+) control positivo de la expresión de GFP. C, detección de fluorescencia por el detector de Sistema de Imágenes IVIS; 1-8, aislados de E. coli Epi300 alojando los plásmidos con las inserciones del transposón mostradas en A.

La FIG. 12 representa un fósmido derivado de pCC2FOS, el cual incluye un inserto de ADN metagenómico de suelo (F076) y en donde la secuencia codificante de GFPmut3 ^* fue clonada, para generar el fósmido F076_GFP. El sitio de restricción AscI se usó para la clonación de la secuencia codificante de GFPmut3 ^* dentro del inserto metagenómico del fósmido F076. M13 fwd, sitio de hibridación para el iniciador M13 directo; M13 rev, sitio de hibridación para el iniciador M13 reverso; sitio de unión CAP, sitio de unión de proteína de activador de catabolito; CmR, gen de resistencia a cloranfenicol; oriV, origen de replicación para el plásmido F bacteriano; ori2, origen secundario de replicación para el plásmido F bacteriano; repE, proteína de iniciación de replicación para el plásmido bacteriano F; incC, región de incompatibilidad del plásmido F bacteriano; sopA y B, proteínas de partición del plásmido F bacteriano; sopC, región de partición similar al centromero del plásmido F bacteriano; loxP, sitio de recombinación mediado por Cre.

La FIG. 13 esquematiza la detección de fluorescencia de aislados bacterianos de E. coli transformados con F076_GFP post transposición con TnC_T7 y la localización de las inserciones del transposón a lo largo de la secuencia del fósmido. A, detección de fluorescencia usando el Sistema de Imágenes IVIS para aislados de E. coli Epi300 transformados con la reacción de transposición de TnC_T7 en F076_GFPmut3*. Se incluyeron los controles negativo (-) y positivo (+) de la expresión de GFP, correspondientes a los aislados bacterianos 2 y 4 de E. coli Epi300, respectivamente, de la FIG. 1 1 C. La fluorescencia basal de fondo se corrigió con base en la señal de auto fluorescencia del control negativo usado. B, revalidación de la expresión de GFP para aislados bacterianos que alojan el fósmido F076_GFPmut3 ^* , usando el Sistema de Imágenes IVIS después de la recuperación de los aislados en agar LB con cloranfenicol 20 pg/mL, kanamicina 40 pg/mL y L-arabinosa 0.2%. C, diagrama a escala de F076_GFPmut3 ^* con los sitios identificados de inserción del transposón TnC_T7. GFP, secuencia codificante de la proteína verde fluorescente. Las cajas y las flechas blancas representan los genes y secuencias regulatorias del esqueleto fosmídico pCC2FOS. Las flechas pequeñas segmentadas orientadas de arriba hacia abajo representan los sitios de inserción del transposón en el cual el gen t7rnap está localizado en la hebra sentido del ADN blanco, mientras que las flechas de abajo hacia arriba representan el mismo gen localizado en la hebra antisentido del ADN. Se resalta la secuencia del inserto de ADN metagenómico (MI), así como los ORFs con longitud mayor a 150 codones localizados en la hebra sentido del ADN fosmídico. El recuadrado sombreado incluye las inserciones de TnC_T7 que promovieron la expresión GFP. CmR, gen de resistencia a cloranfenicol. La FIG. 14 esquematiza la degradación del 4-nitrofenil butirato a partir de los extractos de clones bacterianos. BL21 , clon bacteriano E. coli BL21 DE3 usado como control negativo; LipN, clon bacteriano E. coli BL21 transformado con el plásmido pET100_LipN (clon bacteriano amablemente proporcionado por Luis Peña - Biotecnología Molecular, CorpoGen, Bogotá, Colombia) usado como un control positivo; 14gF2, E. coli Epi300 transformado con el fósmido pCC2FOS_14gF2; 1-15, aislados bacterianos de £ coli Epi300 transformados con el fósmido pCC2FOS_14gF2 post transposición con TnC_T7.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos de que se defina o describa específicamente lo contrario en alguna parte de este texto, los siguientes términos y descripciones relacionados con la invención deben ser entendidas como se describen a continuación.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ADN artificial" significa una secuencia de ADN diferente de cualquiera encontrada en la naturaleza o producida por un proceso no natural, como resultado de técnicas in vitro o síntesis de ADN en fase sólida.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "gen sintético" significa un fragmento de ADN sintetizado en el laboratorio por la combinación de nucleótidos, sin secuencias de ADN pre-existentes. En particular, el término se refiere a una molécula de ADN de doble hebra completamente sintética.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "sitios de reconocimiento" se refiere a localizaciones sobre una molécula de ADN que contienen secuencias de nucleótidos específicas, las cuales son reconocidas por proteínas o enzimas específicas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "endonucleasas de restricción" significa enzimas que cortan moléculas de ADN de doble hélice en sitios de reconocimiento específicos. El término referido en la presente invención se relaciona con endonucleasas de restricción o enzimas que reconocen específicamente secuencias de ADN de 6-8 nucleótidos, en las cuales la secuencia de nucleótidos de una de las hebras del ADN se lee en orden inverso a aquella de la hebra de ADN complementario (palindrómicas).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "elemento transponible" o "transposón" se refiere a una secuencia de ADN o a un segmento génico capaz de moverse de un genoma o posición genética para ser insertado en otra posición (por ejemplo otro genoma, cromosoma, ADN episomal). La definición mencionada incluye sólo elementos transponibles o transposones que están basados en moléculas de ADN intermediarias y que requieren de la actividad enzimática de proteínas particulares, denominadas como transposasas, para moverse a lo largo de diferentes posiciones genéticas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "transposición" o "reacción de transposición" se refiere a la reacción en la cual el transposón es insertado dentro de un ADN blanco en sitios aleatorios, a través de la actividad catalítica de una transposasa.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "repetición invertida" significa una secuencia identificada en los extremos 5' o 3' de los transposones que son reconocidos específicamente por transposasas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "transposasa" pretende significar una enzima que tiene la capacidad de reconocer y unirse a un extremo de un transposón o a las secuencias finales de un transposón en una reacción de transposición, para promover la movilización del transposón.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "inserciones de transposón" significa las localizaciones específicas donde el transposón es insertado dentro de un ADN blanco, como resultado de la reacción de transposición realizada por una transposasa específica.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ADN blanco" o "vector blanco" significa un ADN de doble cadena que es adecuado para ser modificado usando técnicas de biología molecular. En esta invención, la definición está asociada con secuencias de ADN episomal que incluyen sitios específicos de reconocimiento para endonucleasas de restricción o que pueden ser modificadas por transposasas como resultado de la inclusión de elementos de ADN transponibles.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "transcripción de ADN" significa el proceso de sintetizar una copia de ARN a partir de una molécula de ADN. Éste corresponde al primer paso de expresión génica y es llevado a cabo por una enzima especializada, una ARN polimerasa.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "promotor" se refiere a una región en una secuencia de ADN sobre la cual una ARN polimerasa específica puede unirse (por ejemplo el promotor T7 es reconocido únicamente por la T7RNAP), con el fin de empezar el proceso de transcripción de ADN.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "promotor inducible" significa que el reconocimiento del promotor por la ARN polimerasa y por lo tanto la actividad transcripcional puede ser controlada por la ausencia o presencia de factores químicos o físicos. Para propósitos de la presente patente, si un promotor es inducido por un factor específico esto llevará a la síntesis de una proteína específica (por ejemplo la T7RNAP).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "gen constitutivo" o "gen constitutivamente expresado" significa un gen que se transcribe continuamente a un nivel relativamente constante. Este término implica que un promotor constitutivo regula la transcripción de ADN para el gen (por ejemplo el gen de resistencia a kanamicina) y por lo tanto la expresión constante de la proteína resultante.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "lectura hacia al exterior" se refiere a la dirección de la transcripción del ADN desde un promotor específico, el cual está localizado particularmente dentro de una secuencia de ADN definida, (como puede ser un transposón) y que se localiza en los extremos 5' o 3' del segmento de ADN. En este caso, la lectura hacia el exterior se restringe al proceso de transcripción de ADN desde el promotor mencionado, en el cual la síntesis de ARN comienza desde el transposón, pero se extiende principalmente hacia el ADN adyacente al mismo. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "vector" se refiere a una molécula circular de doble cadena de ADN usada como un vehículo para transportar artificialmente ADN foráneo al interior de una célula bacteriana blanco.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "vector artificial" se refiere a cualquier ADN artificial como un vector, que es capaz de auto replicarse dentro de una célula bacteriana y por lo tanto ser mantenido de forma estable dentro de la célula bacteriana hospedera.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "auto replicación" y "episomal" se refieren a la capacidad de un vector o un vector artificial de no estar integrados dentro del ADN genómico de un cierto hospedero celular, sino de replicarse automáticamente en una célula hospedera y, por lo tanto, estar presente cuando la célula hospedera crece y se divide. En particular, este término asume la permanencia del vector o el vector artificial por varias generaciones de crecimiento dentro de la célula hospedera. Este término incluye plásmidos, fósmidos, cósmidos y cromosomas bacterianos artificiales (BACs).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "origen de replicación" se refiere a secuencias particulares en ADNs episomales en los cuales se inicia la replicación, con base en el reclutamiento de proteínas involucradas en la replicación de ADN.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "transformación" significa el proceso de introducción de material genético nuevo específicamente en células bacterianas. En la presente invención el término mencionado está asociado a la introducción de vectores, vectores artificiales o vectores artificiales modificados dentro de células bacterianas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "marcador de selección" se refiere a un gen localizado dentro de la bacteria (a nivel genómico o episomal) que confiere una característica para selección artificial. Este término está asociado a genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo el gen de resistencia a cloranfenicol) localizados en vectores o vectores artificiales para la selección de aislados de bacteria después de la transformación.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "corriente arriba" y "corriente abajo" son empleados para diferenciar posiciones relativas en secuencias de ADN o ARN. La posición corriente arriba es una posición hacia el extremo 5' de otro segmento de ácido nucleico (por ejemplo un promotor, gen, sitio de restricción, etc.) en una hebra sencilla de ADN o en una molécula de ARN. La posición corriente abajo es una posición hacia el 3' de otro segmento de ácido nucleico en una hebra sencilla de ADN o en una molécula de ARN.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ADN metagenómico" se refiere a la totalidad del ADN genómico asociado a microbios, aislado de muestras complejas como ambientes naturales abiertos (por ejemplo suelo, agua) o a partir de microbiomas de organismos multicelulares (por ejemplo humanos).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "inserto" o "inserto de ADN" significa una parte o fragmento o secuencia de ADN que es insertado por técnicas de biología molecular dentro de un vector o un vector artificial para su subsiguiente selección, manipulación o expresión dentro de un organismo hospedero.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "sitio de unión a ribosoma" se refiere a una secuencia de ARN en la cual los ribosomas pueden unirse para iniciar el proceso de síntesis de proteínas (traducción) dentro de la célula hospedera u organismo, como parte del proceso de expresión de proteínas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "expresión de gen foráneo" significa la totalidad del proceso por el cual la información de un gen particular es usada para sintetizar un producto, que para los propósitos de la presente invención significa sintetizar una proteína. En el mencionado término, "foráneo" significa que el gen evaluado pertenece a un organismo diferente de aquel usado para promover la expresión del gen. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "gen reportero" significa un gen cuya expresión en un hospedero bacteriano puede ser fácilmente monitoreada o detectada. En el contexto de la presente invención, el gen reportero codifica una variante de la proteína verde fluorescente (GFP).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "gen silenciado" se refiere a un gen que es incapaz de expresar la proteína asociada a su secuencia codificante, ya sea por impedimentos durante el proceso de transcripción o de traducción dentro de la célula hospedera.

Una realización de la invención aquí revelada se dirige al diseño y desarrollo de un gen sintético (Tn_A), el cual es una secuencia artificial de ADN de doble hebra de 138 pares de bases (pb) resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN. Este fragmento de ADN incluye un sitio de unión MuA correspondiente al sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa, una secuencia promotora T7 que permite la interacción especifica de la T7RNAP y los siguientes sitios flanqueantes de reconocimiento para endonucleasas de restricción: EcoRI, BglW, Asc\ y SamHI. El diseño del gen sintético mencionado fue pensado para localizar el sitio de unión MuA y el promotor T7 en hebras de ADN diferentes (FIG. 1 ), con el fin de alcanzar la actividad deseada en la construcción final del transposón.

En una realización, la presente invención incluye el plásmido pUC57_Tn, que corresponde un vector artificial de 2,795 pb que puede ser mantenido dentro de una célula hospedera bacteriana y donde dicho plásmido es el resultado de una combinación específica de ciertos elementos de ADN (FIG. 2). pUC57_Tn tiene un vector esqueleto con el origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC y un gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección después de su transformación en la célula hospedera. pUC57_Tn es el resultado de clonar el gen sintético Tn_A en los sitios únicos EcoRI y SamHI, después de un tratamiento con enzimas de restricción del vector esqueleto y del gen sintético. Por lo tanto, el vector pUC57_Tn en la presente realización incluye un promotor T7 de lectura hacia el exterior y un sitio de reconocimiento de repetición invertida para la transposasa MuA, ambos localizados de manera específica. Una realización de la invención incluye el plásmido pUC57_Tn_kanAB, el cual es un vector artificial de una longitud total de 3,983 pb que puede ser replicado de manera episomal en una célula hospedera bacteriana. El plásmido pUC57_Tn_kanAB resulta de la combinación de ciertos elementos de ADN (FIG. 3), ya que éste incluye las mencionadas regiones ADN del pUC57_Tn más un gen de resistencia adicional. En la presente invención, el plásmido pUC57_Tn_kanAB es el resultado de la clonación del gen de resistencia a kanamicina, incluyendo su promotor y su señal de terminación de la transcripción en los sitios de restricción Asc\ y BamH\ de pUC57_Tn. Para la presente realización, la clonación del gen de resistencia a kanamicina fue llevada a cabo de una manera específica con el fin de asegurar una adecuada adición de las regiones de ADN subsiguientes.

En una realización, la presente invención es orientada al desarrollo del plásmido pBAD18-Cm_t7rnap (FIG. 4), el cual es un vector artificial que puede ser mantenido de forma estable dentro de una célula hospedera bacteriana. Este vector tiene un tamaño total de 8,738 pb y es el resultado de la combinación de los siguientes elementos de ADN: origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC, un gen de resistencia a cloranfenicol y la secuencia codificante de la T7RNAP clonada en el sitio único de restricción Kpn\. Adicionalmente, el pBAD18-Cm_t7rnap descrito en esta invención tiene la secuencia codificante de la T7RNAP localizada corriente abajo del promotor inducible con arabinosa y corriente arriba de los terminadores transcripcionales rrnB T1 y T2.

Una realización de la invención se relaciona con el plásmido pUC57_Tn_kanAB_t7, el cual es un vector artificial de 7,097 pb (FIG. 6), resultado de la combinación específica y orientación de ciertos elementos de ADN y que puede mantenerse dentro de una célula hospedera bacteriana. El plásmido pUC57_Tn_kanAB_t7 incluye los elementos de ADN mencionados del pUC57_Tn_kanAB, los cuales son un origen de replicación ColE1/pMB1/pBR322/pUC, un gen de resistencia a ampicilina, el gen sintético Tn_A y el gen de resistencia a kanamicina, más el promotor inducible con arabinosa y la secuencia codificante de la T7RNAP del vector pBAD18- Cm_t7rnap. El vector artificial pUC57_Tn_kanAB_t7 resulta específicamente de la clonación del promotor inducible con arabinosa y la secuencia codificante de la T7RNAP en el sitio único de restricción Asc\ de pUC57_Tn_kanAB, entre las secuencias de ADN de Tn_A y de resistencia a kanamicina en el vector artificial.

Una realización de la invención aquí revelada está dirigida al desarrollo del plásmido pUC57_TnC_T7 (FIG. 7), el cual es un vector artificial resultado de la combinación específica de ciertos elementos de ADN y que puede mantenerse en una célula hospedera bacteriana. Este vector artificial incluye todos los elementos estructurales del vector pUC57_Tn_kanAB_t7 más el segundo extremo del transposón, denotado aquí como Tn_B. El plásmido pUC57_TnC_T7 tiene una longitud total de 7,240 pb y tiene clonado específicamente la región Tn_B en el sitio único de restricción Hind\\\ de pUC57_Tn_kanAB_t7. Como consecuencia, el vector artificial pUC57_TnC_T7 tiene dos promotores T7 flanqueantes de lectura hacia el exterior, así como dos sitios de reconocimiento de repeticiones invertidas para la transposasa MuA. Por lo tanto, pUC57_TnC_T7 tiene clonado la secuencia completa del transposón TnC_T7, la cual a su vez puede ser liberada por medio del tratamiento con la enzima de restricción BglW.

En una realización la presente invención se relaciona con el desarrollo del fósmido F076_GFP (FIG. 1 1 ), el cual es un vector artificial que comprende 45,619 pb. Este vector resulta de combinar de una manera específica un esqueleto fosmídico, un inserto de ADN metagenómico y la secuencia codificante de un gen reportero. El esqueleto fosmídico corresponde al vector comercial pCC2FOS (Epicentre-lllumina, Madison, Wl, USA). El inserto metagenómico resulta de la clonación aleatoria de ADN metagenómico en el pCC2FOS. El gen reportero corresponde a la secuencia codificante de GFP incluyendo un sitio de unión a ribosoma (RBS), ambos fragmentos de ADN siendo clonados como un solo amplicón en un sitio único de restricción Asc\ localizado en el inserto metagenómico.

Una realización de la invención revelada es un método para aumentar la transcripción de ADN, incluyendo, pero no limitado a la expresión de genes foráneos (FIG. 9), el cual comprende: (i) Generar librerías de ADN basadas en la transposición aleatoria o en inserciones de transposón en ADN episomal. Las librerías de ADN basadas en transposición pueden ser obtenidas a partir de secuencias purificadas de de ADN episomal, como plásmidos, fósmidos, cósmidos o BACs, que tienen insertos únicos de ADN o a partir de conjuntos de secuencias de ADN episomal cada una teniendo un inserto de ADN diferente.

(ii) Introducir una o más de dichas librerías de ADN episomal basadas en transposición de (i) dentro de células hospederas bacterianas por métodos estándar de transformación.

(iii) Inducir la expresión de la T7RNA polimerasa en los aislados bacterianos resultantes transformados con las secuencias de ADN episomal basadas en transposición. La expresión específica de la T7RNA polimerasa a partir de cada inserción del transposón TnC_T7 proporciona una colección diversa de transcriptos de ADN o secuencias de ARN en la población de células bacterianas resultantes.

(iv) Analizar dicha población de células hospederas bacterianas para identificar los aislados bacterianos específicos que expresan, pero no limitándose a, un gen reportero que codifica GFP. La expresión del gen reportero, como cualquier otro tipo de fenotipo bajo estudio usando el método revelado en la presente invención, se asocia con las secuencias específicas de ARN generadas en la bacteria analizada, lo cual a su vez se correlaciona con inserciones específicas del transposón TnC_T7 en las librerías originales de ADN episomal.

En una realización, la presente invención incluye ocho plásmidos correspondientes a vectores artificiales que resultan de inserciones aleatorias del transposón en pKR-C12, siendo este un plásmido que incluye un gen reportero silenciado que codifica para GFP. Los plásmidos incluidos en esta realización están caracterizados por tener un transposón TnC_T7 diferencial insertado en el plásmido blanco original y por tener la misma longitud total. La localización específica de la inserción del transposón en cada caso define la eficiencia del respectivo aislado bacteriano transformado para expresar el gen reportero.

Ejemplos

Ejemplo 1 : Expresión inducible de la T7RNAP a partir del promotor PBAD

Un vector artificial para la expresión recombinante de la T7RNAP fue generado al clonar la secuencia codificante de la proteína mencionada en el sitio de múltiple clonaje del plásmido pBAD18-Cm. Para esto, la secuencia codificante de la T7RNAP se amplificó con Accuzyme como polimerasa de alta fidelidad (Bioline, Londres, Reino Unido), usando como molde ADN genómico purificado de la cepa BL21 de E. coli (Invitrogen-Life Technologies, Carisbad, CA, USA) y los iniciadores proporcionados en Seq-ID1 y Seq-ID2. Por otro lado, el vector pBAD18-Cm (Guzman LM, et al.; J. Bacteriol. 1995, 177:4121-30) fue linealizado por restricción enzimática con Kpn\ y sus extremos de ADN reparados con la T4 ADN polimerasa (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Después de la purificación del amplicón de PCR y del vector, se llevó a cabo una reacción de ligación y transformación en E. coli TOP10 (Invitrogen- Life Technologies, Carisbad, CA, USA), de acuerdo con métodos estándar conocidos en el estado del arte. La orientación correcta del inserto fue verificada por digestión con enzimas de restricción, PCR de colonia y/o secuenciación del ADN plasmídico aislado a partir de los clones bacterianos resultantes (FIG. 4).

En un paso siguiente, un clon de E. coli TOP10 alojando el pBAD18-Cm_t7rnap fue transformado con un plásmido que incluye la secuencia codificante del péptido AA localizado corriente abajo de un promotor T7 (pET28a_AA). La selección de los aislados bacterianos resultantes que incluyen ambos plásmidos fue realizada usando los marcadores de selección correspondientes para ambos vectores.

Para evaluar la expresión de la secuencia codificante de la T7RNAP a partir del promotor P _B AD del vector pBAD18-Cm_t7rnap, cultivos de células bacterianas fueron inducidos con isopropil β-D-l-tiogalactopiranósido (IPTG) o L-arabinosa, dependiendo del hospedero receptor final de los plásmidos mencionados (ya sea E. coli BL21 o E. coli TOP10, respectivamente). La detección del péptido AA por anticuerpos anti-poli-histidina en ensayos de western blot fue llevada a cabo empleando extractos bacterianos totales, evidenciando las condiciones en las cuáles la T7RNAP pudo ser exitosamente expresada (FIG. 5).

Ejemplo 2: Instrucción para la clonación de la secuencia del transposón

TnC_T7

Con el fin de construir el plásmido que alberga la secuencia completa del transposón TnC_T7 se realizaron los siguientes pasos:

La Seq-ID3 fue diseñada para incluir el sitio R1-R2 de unión para la transposasa MuA, una región promotora T7 y los sitios para las enzimas de restricción EcoRI, BglU, Asc\ y SamHI (FIG.1 ). La secuencia de ADN resultante (Tn_A) fue sintetizada (Genscript, Piscataway, NJ, USA) y fue subsecuentemente clonada en los sitios únicos de restricción EcoRI y fíamHI del plásmido pUC57. La orientación correcta de la inserción del Tn_A se verificó por digestiones con enzimas de restricción y/o secuenciación de ADN. El plásmido resultante se denota aquí como pUC57_Tn y se proporciona en Seq-ID4 (FIG. 2).

El gen de resistencia de kanamicina, incluyendo su promotor, se amplificó por PCR en dos reacciones independientes desde el plásmido pKD4 (Datsenko KA, et al.; Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97:6640-5). Con el fin de reemplazar el sitio de restricción BglU en la secuencia de ADN ensamblada, los fragmentos amplificados resultantes del gen de resistencia a kanamicina fueron ligados después de la digestión enzimática con Spel. La secuencia resultante del gen de resistencia al antibiótico se proporciona en Seq-ID5 (el sitio de restricción Spel se muestra subrayado).

La secuencia de 1 ,214 pb proporcionada en Seq-ID5 fue digerida con Asc\ y SamHI, purificada y clonada en pUC57_Tn (Seq-ID4), después de la digestión del vector con las mismas enzimas de restricción. La orientación correcta del inserto se verificó en ADN plasmídico aislado de clones bacterianos resultantes por medio de digestión con enzimas de restricción, PCR de colonia y/o por secuenciación de ADN del constructo final, el cual se denota aquí como el vector pUC57_Tn_kanAB (FIG. 3).

La secuencia codificante de la T7RNAP y el promotor inducible con arabinosa fueron amplificados con Accuzyme como polimerasa de alta fidelidad (Bioline, Londres, Reino Unido), usando ADN purificado del plásmido pBAD18- Cm_t7rnap (FIG. 4) como molde y los iniciadores proporcionados en Seq-ID6 and Seq-ID7 (los sitios de restricción Asc\ se muestran subrayados y no se incluyeron nucleótidos adicionales en las secuencias de los iniciadores para permitir una apropiada digestión de la enzima de restricción sobre el producto de PCR resultante). El amplicón de 3,122 pb, correspondiente a la secuencia PBAD_ T7RNAP (Seq-ID8), fue insertado en el sitio único de restricción Asc\ de pUC57_Tn_kanAB (FIG. 3), generando el plásmido pUC57_Tn_kanABJ7 (FIG. 6). La orientación correcta del inserto se verificó por digestión con enzimas de restricción, PCR de colonia y/o por secuenciación de ADN, en ADN plasmídico aislado a partir de los clones bacterianos resultantes transformados con la correspondiente reacción de ligación.

La clonación del segundo extremo del transposón, denotado aquí como Tn_B se llevó a cabo en el vector pUC57_Tn_kanAB_t7 (FIG. 6) para generar el plásmido pUC57_TnC_T7 (FIG. 7). El Tn_B fue amplificado por PCR con Accuzyme como polimerasa de alta fidelidad (Bioline, Londres, Reino Unido), usando el ADN del plásmido pUC57_Tn (FIG. 2) como molde y los iniciadores proporcionados en Seq-ID9 y Seq-ID10 (los sitios de restricción Hind\\\ se muestran subrayados y 3 nucleótidos adicionales en los extremos 5' de los iniciadores fueron incluidos para permitir una adecuada digestión enzimática sobre el producto de PCR correspondiente). El amplicón de 155 pb (Seq-ID1 1 ) y el plásmido pUC57_Tn_kanAB_t7 fueron ligados después de la digestión con la enzima Hind\\\. La orientación correcta de la inserción de Tn_B fue verificada por digestión con enzimas de restricción y/o por secuenciación de ADN.

Como resultado, el plásmido pUC57_TnC_T7 aloja el transposón TnC_T7, el cual en consecuencia incluye dos sitios flanqueantes R1-R2 de unión para la transposasa MuA, dos regiones promotoras T7, el gen de resistencia a kanamicina y la secuencia codificante de la T7RNAP bajo la regulación del promotor P _B AD (FIG. 8). El diseño final del plásmido pUC57_TnC_T7 permite liberar el transposón por restricción con BglW, haciendo que esté listo para reacciones in vitro con la transposasa MuA y con cualquier ADN episomal blanco. El realizar esta restricción enzimática con BglW ha mostrado ser crucial para generar los nucleótidos 5' sobresalientes requeridos para un ensamble y estabilidad eficientes del transpososoma Mu, así como para realizar las reacciones de transferencia de hebra {Savilahti H, et al.; EMBO J. 1995, 14:4893-903).

Ejemplo 3: Identificación de células bacterianas que expresan GFP como resultado de la transposición de TnC_T7 en ADN plasmídico

Para evaluar si el transposón TnC_T7 puede aumentar la expresión de genes en ADN episomal, se llevaron a cabo eventos de transposición con el transposón TnC_T7 en el plásmido sensor pKR-C12 (Riedel K, et al.; Microbiology. 2001, 147:3249-62), el cual es incapaz de expresar GFP en E. coli porque este hospedero bacteriano carece del sistema de quorum sensing necesario para dicha expresión (Riedel K, et al.; Microbiology. 2001, 147:3249- 62). Por lo tanto y para efectos de la presente invención, la expresión de GFP a partir de pKR-C12 en E. coli sólo es posible si el proceso de transcripción empieza a partir de cualquiera de los promotores T7 proporcionados por TnC_T7.

El plásmido pKR-C12 purificado fue empleado como ADN episomal blanco para reacciones de transposición in vitro de TnC_T7 con la enzima transposasa MuA (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las reacciones resultantes fueron transformadas en la cepa bacteriana E. coli Ep¡300 (Epicentre-lllumina, Madison, Wl, USA), de acuerdo con métodos estándar conocidos en el arte, empleando gentamicina y kanamicina como marcadores de selección. Los clones de E. coli Epi300 posttransposición de TnC_T7 en pKR-C12 fueron crecidos independientemente en medio LB hasta que alcanzaron una Densidad Óptica (OD) ₆ oonm de 0.4 e inducidos con L-arabinosa 0.2% por 5 horas adicionales a 30°C. Los ensayos de detección de fluorescencia por espectrofotometría fueron llevados a cabo en un Synergy Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Cada cultivo bacteriano fue evaluado en placas negras de poliestireno de 96 pozos con fondo claro (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) y analizado con una longitud de onda de excitación a 474 nm y emisión a 515 nm. Como resultado de este tipo de ensayos, clones bacterianos expresando GFP resultantes de la transposición de TnC_T7 en pKR-C12 fueron finalmente identificados (FIG. 10). Se analizaron los clones bacterianos post-transposición para localizar los sitios de inserción del TnC_T7 en pKR-C12, llevando a cabo análisis de secuenciación por Sanger desde iniciadores hibridados en la secuencia del transposón.

Alternativamente, ensayos de detección de fluorescencia en clones bacterianos post-transposición fueron realizados después de crecer las bacterias a 37°C por 14-16 horas en platos de LB-agar suplementado con L-arabinosa al 0.2% y los correspondientes marcadores de selección. En este caso, la expresión de GFP fue analizada usando el Sistema de Imágenes in vivo IVIS 200 (PerkinElmer, Waltham, MA USA) con los filtros de excitación y emisión de GFP y 15 s de exposición de luminiscencia (FIG. 1 ).

En consecuencia, el transposón TnC_T7 tuvo la habilidad de iniciar la transcripción de genes en ADN plasmídico y su validación como una herramienta genética en una cepa de E. coli diferente de BL21 indicó que la expresión de la T7RNAP ocurrió desde su gen correspondiente localizado dentro del transposón. Los plásmidos resultantes post-transposición en pKR- C12, obtenidos a partir de los clones bacterianos 1-8 mostrados en la FIG. 1 1 , exhibieron patrones diferenciales de expresión de GFP dependiendo de la inserción específica del transposón TnC TT.

Ejemplo 4: Instrucción para la clonación de la secuencia codificante de GFP en contexto metagenómico

Se generó un fósmido que incluye la secuencia codificante de GFP dentro de su inserto de ADN metagenómico, por la clonación de dicha secuencia en un sitio único de restricción. Para esto, la secuencia codificante de GFP (también denotada como gfp) fue amplificada, incluyendo un RBS corriente arriba, con Accuzyme como polimerasa de alta fidelidad (Bioline, Londres, Reino Unido), usando ADN purificado del plásmido pKR-C12 como molde y los iniciadores proporcionados en Seq-ID12 y Seq-ID13 (se subrayan los sitios de restricción Asc\ y no se incluyeron nucleótidos adicionales en las secuencias de los iniciadores para permitir una adecuada digestión enzimática de restricción sobre el producto de PCR resultante). El amplicón de gfp de 918 pb (Seq-ID14) fue introducido dentro del inserto de ADN de un clon metagenómico. Por ejemplo, el ADN fosmídico purificado de un clon metagenómico que alberga un inserto de ADN perteneciente a una muestra de suelo fue linearizado por restricción enzimática y usado para insertar el amplicón de gfp descrito anteriormente. Por lo tanto, se digirió el aislado original de ADN fosmídico, denotado aquí como pCC2FOS_F076 con la enzima de restricción Asc\ y se ligó con el amplicón gfp, para generar el fósmido F076_GFP (Seq-ID15; FIG. 12). La precisa orientación del inserto se verificó por digestión con enzimas de restricción, PCR de colonia y/o por secuenciación de ADN del constructo final, a partir de ADN fosmídico aislado de los clones bacterianos resultantes transformados con la correspondiente reacción de ligación.

Ejemplo 5: Identificación de células bacterianas que expresan GFP como resultado de la transposición de TnC_T7 en ADN fosmídico

Para evaluar la capacidad del transposón TnC_T7 de aumentar la expresión de genes en ADN fosmídico, se llevaron a cabo eventos de transposición en el fósmido F076_GFP (FIG. 12). Por lo tanto, se usó el fósmido F076_GFP purificado como ADN episomal blanco para reacciones de transposición in vitro de TnC_T7 con la enzima transposasa MuA (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las reacciones resultantes se transformaron en la cepa bacteriana E. coli Epi300 (lllumina Inc., San Diego, CA, USA), de acuerdo con métodos estándar conocidos en el arte, empleando kanamicina como marcador de selección.

Los ensayos de detección de fluorescencia en clones bacterianos posttransposición en F076_GFP se llevaron a cabo después de crecer las bacterias a 37°C por 14-16 horas en platos de LB-agar suplementado con L-arabinosa al 0.2% y el correspondiente marcador de selección. La expresión de GFP fue evaluada usando el Sistema de Imágenes in vivo IVIS 200 (PerkinElmer, Waltham, MA USA) con los filtros de excitación y emisión de GFP y 15 s de exposición de luminiscencia (FIG. 13). Se llevaron a cabo análisis de secuenciación por Sanger desde los iniciadores de hibridación sobre la secuencia del transposón, para identificar los sitios de inserción de TnC_T7 en F076_GFP, a partir de los clones bacterianos resultantes post-transposición. En consecuencia, la validación en el uso del transposón TnC_T7 para iniciar la transcripción génica en ADN fosmídico se logró siguiendo los procedimientos aquí descritos.

Ejemplo 6: Identificación de células bacterianas que expresan actividad lipolítica como resultado de la transposición de TnC_T7

Se evaluó el aumento de otras actividades enzimáticas, diferentes de la expresión de GFP, en clones derivados de la metagenómica usando el transposón TnC_T7.

Por ejemplo, el vector fosmídico pCC2FOS_14gF2 aislado de una librería metagenómica construida con ADN derivado de suelo se empleó para detectar actividad lipolítica, ya que previamente se había identificado por análisis in silico un potencial sitio activo de Iipasa (InterProScan: IPR002168) sobre el inserto del ADN metagenómico secuenciado.

Se usó el fósmido pCC2FOS_14gF2 como ADN episomal blanco para reacciones de transposición in vitro de TnC_T7, como se describe en los ejemplos 3 y 5, ya que los ensayos funcionales previos para evaluar la degradación de tributirina en medio LB-agar o de degradación de 4-nitrofenil butirato (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) del clon metagenómico (alojando pCC2FOS_14gF2) no exhibieron diferencias significativas comparadas con la línea base para el control negativo de actividad lipolítica (E. coli Epi300 pCC2FOS).

Las reacciones de transposición de TnC_T7 sobre pCC2FOS_14gF2 fueron transformadas en la cepa bacteriana E. coli Epi300 y seleccionadas con cloranfenicol y kanamicina. Clones post-transposición · fueron crecidos independientemente en medio LB hasta que alcanzaron una OD ₆ oonm de 0.4 e inducidos con L-arabinosa al 0.2% por 5 horas adicionales a 37°C. Los cultivos bacterianos resultantes fueron normalizados por OD y sus respectivos pellets lavados con solución tampón Tris-HCI y re-suspendidos en 1/5 de su volumen original en el tampón de Tris. Se obtuvieron extractos bacterianos completos luego de la lisis de células usando un Mini-Beadbeater-96 (Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) y purificación por filtración. Siguiendo los métodos descritos, los ensayos funcionales con un set de clones de E. coli Epi300 pCC2FOS_14gF2 post-transposición mostraron incrementos significativos en actividad lipolítica por la degradación del 4-nitrofenil butirato (FIG. 1 ), al cuantificar por absorbancia a 410 nm en un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (FIG. 14).