DES POLYSACCHARIDES

DESCRIPTION

Domaine de l'invention

La présente invention se rapporte à une nouvelle ulvane lyase, à une séquence d'acide nucléique codant pour cette enzyme, à un vecteur comprenant ladite séquence codante, à un procédé de fabrication de cette ulvane lyase, ainsi qu'à un procédé de production de d'oligosaccharides d'ulvanes à activité biologique utilisant cette enzyme.

La présente invention trouve ses applications principalement dans l'agriculture, les industries de la nutrition animale et humaine, de la cosmétique, de la pharmacie, etc.. mais également dans le domaine de la recherche en laboratoire pour la production de molécules standard, marqueurs de taille, etc .. ou pour l'analyse fine de la structure et des compositions de polysaccharides d'ulvanes de nature et provenance variées.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.

Etats de la technique

Les macroalgues vertes de la famille des Ulvaceae sont présentes partout sur le globe terrestre et sont très communément rencontrées sur les côtes. Ces algues sont fréquemment impliquées dans la prolifération algale favorisée par l'eutrophisation des eaux côtières donnant lieu aux « marées vertes ». Toutefois jusqu'à présent, elles constituent une énorme biomasse sous-exploitée en biotechnologie, et utilisée essentiellement comme compost.

Les polysaccharides anioniques complexes majeurs présents dans la paroi des ulves, les ulvanes, sont des polysaccharides uroniques et sulfatés possédant des structures originales et représentent une source de biopolymères dont les fonctionnalités sont encore peu explorées.

Les ulvanes et les oligosaccharides dérivés ont de nombreuses propriétés biologiques intéressantes, notamment due à leur ressemblance aux glycosaminoglycanes sulfatés des animaux (e.g. héparines, dermatanes sulfates, etc .). Les ulvanes sont composés de différentes unités de répétition disaccharidiques construites avec des unités de L- rhamnoses, acides D-glucuroniques, acides L-iduroniques, D-xyloses et de groupement ester-sulfates. Les deux principaux motifs de répétition sont appelés acide aldobiuronique, ou acides ulvanobiuroniques, ou respectivement A (A3s) et B (B3s), dont les formules sont les suivantes :

Le motif A (A3s) est l'acide beta-D-1 ,4-glucuronique (1→4) alpha-L- 1 ,4-rhamnose 3-sulfate. Le motif B (B3S) est l'acide alpha-L-1 ,4-iduronique (1→4) alpha-L-1 ,4-rhamnose 3-sulfate. Il est noté que l'acide L-iduronique est le C5-epimère de l'acide D-glucuronique. Les acides uroniques sont parfois remplacés par des résidus xylose sulfatés en O-2.

Les ulvanes possèdent des propriétés physicochimiques uniques qui en font des candidats attractifs pour de nouvelles applications agroalimentaires, pharmaceutiques, et cosmétiques. Les ulvanes possèdent des structures très originales composées de sucres ou monosaccharides rares comme le rhamnose et l'acide iduronique. Le rhamnose est un composé important des antigènes de surface de nombreux microorganismes reconnus spécifiquement par les lectines de mammifères. Il est également utilisé pour la synthèse d'arômes. L'acide iduronique est utilisé pour la synthèse des glycosaminoglycanes, par exemple l'héparine. Ainsi les ulvanes peuvent être considérés comme des biomimétiques des glycosaminoglycanes des animaux et de l'homme, en raison de la présence conjointe de sucres sulfatés et d'acides D- glucuroniques et L-iduronique.

En plus des monomères, les ulvanes et oligo-ulvanes présentent des propriétés biologiques intéressantes. En effet, des travaux ont montré, par exemple, que les oligo-ulvanes ont des activités antitumorales, antivirales, notamment antigrippales, et anticoagulantes. Une liste non-exhaustive d'applications potentielles des ulvanes a été proposée par Lahaye et Robic (Biomacromolecules, 8 : 1765-1774, 2007) [1 ].

Dans ce contexte une meilleure compréhension de la structure des ulvanes et le développement de procédés permettant de fragmenter les ulvanes sous forme oligomérique ou monomérique revêt un très grand intérêt.

Actuellement faute de moyens permettant de mieux connaître les ulvanes et de les dégrader plus efficacement, les algues, notamment les algues vertes, sont essentiellement compostées et peu de valorisation industrielle n'en est faite. Ceci est d'autant plus déplorable que la source est abondante et parfois gênante en termes de pollution de nos côtes maritimes. Leur élimination est actuellement réalisée par voie de compost.

L'hydrolyse acide est essentiellement la seule méthode utilisée pour libérer des oligosaccharides d'ulvanes, mais cette méthode est aléatoire et altère la structure du polymère.

Certaines bactéries marines sécrètent des enzymes impliquées dans la dégradation spécifique des polysaccharides algaux. L'utilisation d'enzyme spécifique permet de libérer de façon reproductible des oligosaccharides tout en préservant leur structure et activité biologique. Une ulvane lyase de Nonlabens ulvanivorans PLR (précédemment nommé Persicivirga ulvanivorans PLR) a été décrite et protégée par brevet (Nyvall Collen et al., J. Biol. Chem., 286(49) : 42063-42071 , 201 1 ; Demande internationale WO 201 1 157966) [2,3]. Toutefois cette enzyme est extrêmement faiblement exprimée sous une forme soluble et active dans Escherichia coli [2] (voir aussi résultat propre ci-dessous, Figure 1 ); ce qui empêche en pratique toute exploitation industrielle de cette enzyme.

Il existe donc un réel besoin d'un nouveau moyen et/ou procédé palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un nouveau moyen et/ou procédé permettant de dégrader les ulvanes afin de valoriser cette bio-ressource, issue notamment des algues vertes, et ainsi libérer de façon contrôlée et reproductible de nouveaux oligosaccharides d'ulvanes de structures définies, et ce en préservant la structure fine et donc les propriétés biologiques desdits oligosaccharides dans la perspective d'applications cosmétiques, agroalimentaires et médicales.

Description de l'invention

Les Inventeurs ont répondu à ce besoin en identifiant, clonant et surexprimant de façon hétérologue dans Escherichia coli et purifiant, pour la première fois, une nouvelle ulvane lyase active, à partir du génome complet de la bactérie marine Formosa agariphila DSM 15362 (Mann et al., Appl. Env. Microbiol., 79 : 6813-6822, 2013 ; Nedashkovskaya et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56 : 161 -167, 2006) [4, 5]. Par ailleurs, l'utilisation de cette enzyme pour la dégradation complète de l'ulvane a permis d'isoler et de purifier de nouveaux oligosaccharides d'ulvanes (ou oligo-ulvanes) ayant une structure chimique unique, sulfatée. Ces oligosaccharides sulfatés sont potentiellement intéressants pour des applications en biomédical, cosmétique, nutrition, élicitation de plantes, etc .. Cette enzyme permet également d'augmenter le rendement d'extraction d'autres composés (e.g. protéines, pigments, métabolites secondaires) à partir des macroalgues vertes contenant de l'ulvane. Ainsi les Inventeurs ont mis en évidence que l'ulvane lyase de Formosa agariphila DSM 15 362 permet de : (i) de dépolymariser l'ulvane (polysaccharide majeur des macroalgues vertes), libérant des oligosaccharides à activité biologique en préservant leur structure native ; (ii) dégrader directement des macroalgues vertes pour générer des fractions contenant des oligosaccharides à activité biologique ; et (iii) augmenter le rendement d'extraction d'autres composés (e.g. protéines, pigments, etc ..) à partir de macroalgues vertes.

La présente invention se rapporte donc à l'ulvane lyase de Formosa agariphila DSM 15362 comprenant ou consistant en la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ou à une ulvane lyase comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés ayant au moins 53% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou à une ulvane lyase de Formosa agariphila DSM 15362 comprenant ou consistant en la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 4 ou 5 ou à une ulvane lyase comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés ayant au moins 67% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4. Les séquences SEQ ID NOs : 4 et 5 représentent, respectivement, le module catalytique de l'ulvane lyase de Formosa agariphila DSM 15362 et ledit module produit sous forme recombinante (dans le cytoplasme d'E. coli. La séquence additionnelle en N-terminal est une étiquette poly-histidine pour faciliter la purification). De préférence, la présente invention se rapporte au module catalytique de l'ulvane lyase de Formosa agariphila DSM 15362 consistant en la séquence SEQ ID NO : 4, ou comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 5.

Selon la présente invention, ces ulvanes lyases ou modules catalytiques d'ulvane lyase, quelle que soit leur séquence, peuvent comprendre en outre, à leur extrémité N-terminale, une séquence signal ou séquence d'adressage. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'Homme du métier pour que la protéine, lorsqu'elle est synthétisée dans une cellule hôte, soit dirigée vers un organite ou une zone particulière de la cellule hôte. Il peut s'agir par exemple d'une séquence signal trouvée dans les sites spécialisés dans la prédiction de peptides signaux, par exemple http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP/ [10]. Il peut s'agir par exemple de la séquence SEQ ID NO : 6, par exemple en N-terminale de la séquence SEQ ID NO : 4, du listage de séquences annexé. Cette séquence signal peut être clivée après synthèse de la protéine ou non. Les procédés de clivage connus de l'Homme du métier peuvent être utilisés, par exemple ceux impliquant des protéases spécifiques d'un site de clivage. On choisit alors une séquence signal présentant un tel site.

Toutes ces séquences en acides aminés n'ont jamais été décrites dans l'art antérieur comme étant actives pour dégrader les ulvanes par dépolymérisation selon la présente invention. La présente invention se rapporte donc également à l'utilisation d'une séquence en acides aminés telle que définie ci-dessus pour la dégradation spécifique et complète de l'ulvane pour produire des oligosaccharides d'ulvane (ou oligo-ulvanes).

La présente invention se rapporte également à un acide nucléique codant pour une ulvane lyase selon l'invention. Il peut s'agir par exemple d'un acide nucléique comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 , ou d'un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence ayant au moins 53% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 . Il peut s'agir par exemple d'un acide nucléique comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 3, ou d'un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence ayant au moins 67% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3.

La présente invention se rapporte également à un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention. Le vecteur peut-être un des vecteurs connus de l'Homme du métier pour fabriquer des protéines par recombinaison génétique, par exemple un vecteur d'expression. Il est choisi en général notamment en fonction de l'hôte cellulaire choisi.

La présente invention se rapporte également à une cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention, ou un vecteur selon l'invention. La cellule hôte ou hôte cellulaire peut être tout hôte approprié pour la fabrication de l'ulvane lyase de la présente invention à partir de l'acide nucléique ou du vecteur de l'invention. Il peut s'agir par exemple d'E. coli, de Pischia pastoris, de Saccharomyces cerevisiae, de cellules d'insectes, par exemple un système cellules d'insectes-baculovirus (par exemple cellules d'insecte SF9 utilisant un système d'expression de baculovirus), de mammifères.

La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'une ulvane lyase selon l'invention par recombinaison génétique utilisant un acide nucléique selon l'invention, ou un vecteur selon l'invention. Les procédés de recombinaison génétique connus de l'Homme du métier sont utilisables. L'origine marine ou terrestre n'influence pas la possibilité de recombinaison et d'expression hétérologue. L'ulvane lyase de la présente invention peut également être produite par la mise en culture du microorganisme F. agariphila dans un milieu permettant la croissance dudit microorganisme marin. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture liquide ZoBell. Le pH de culture est de préférence compris entre 7,5 et 8,4, de préférence à pH 8,0. La température de culture est de préférence comprise entre 4 et 33°C, de préférence à 22°C. La culture est de préférence réalisée avec une concentration de NaCI de 10 à 80 g/l, de préférence de 35 g/l [5]. Ces procédés de fabrication de l'ulvane lyase de l'invention peuvent comprendre en outre une étape de récupération de l'ulvane lyase. Cette étape de récupération ou d'isolement peut être réalisée par tout moyen connu de l'Homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d'ammonium, par ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d'ions, une élution sur hydroxyapatite, une séparation par interactions hydrophobes, ou tout autre moyen connu.

Le microorganisme F. agariphila ou toute cellule hôte transformée pour une fabrication par recombinaison génétique selon l'invention, peut également être utilisé directement pour dégrader des ulvanes, dans leur milieu naturel ou en culture. Les conditions permettant la dégradation des ulvanes, lorsqu'on utilise une cellule hôte ou microorganisme sont, en culture, un système discontinu ou continu, par exemple un réacteur de culture contenant un milieu de culture approprié au développement du microorganisme.

La présente invention se rapporte également à un procédé de dégradation d'ulvanes comprenant une étape de mise en contact des ulvanes avec une ulvane lyase selon l'invention, ou avec une cellule hôte selon l'invention, dans des conditions permettant la dégradation des ulvanes par digestion enzymatique par ladite ulvane lyase ou ladite cellule hôte ou ledit microorganisme F. agariphila.

Pour la digestion enzymatique, la détermination des constantes de Michaelis Menten (Km et Vmax) permet aisément à l'Homme du métier de trouver les conditions optimales de concentration de l'ulvane lyase utilisée et de concentration des ulvanes pour la dégradation des ulvanes dans le milieu où elles se trouvent ou dans le milieu dans lequel elles ont été placées. Le pH peut être également compris de préférence entre 6.0 et 8.5, de préférence à 7.5. Il s'agit en effet de la gamme de pH optimale. La température (optimale) est de préférence comprise entre 30 et 40°C. La force ionique peut être comprise de préférence entre 0 et 300 mM NaCI, de préférence à 30 mM NaCI.

La présente invention permet avantageusement de mobiliser la très grande ressource d'algues actuellement inexploitée, notamment d'algues vertes. L'invention permet en outre de favoriser la biodégradation des algues, notamment des algues vertes, de produire des molécules originales, qui sont des fragments d'ulvanes ou oligo-ulvanes, par exemple des oligosaccharides, par exemple aussi des hydrocolloïdes, et d'offrir une source nouvelle de monosaccharides rares pour des applications cosmétiques, agroalimentaires et médicaments ou formulations pharmaceutiques et parapharmaceutiques.

Les produits de dégradation des ulvanes donnent accès à de nouveaux produits qui peuvent être des actifs alimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques utilisables dans les domaines agroalimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques. Ces nouveaux produits peuvent également être des produits non actifs mais présentant une neutralité et/ou stabilité qui est très intéressante pour une utilisation dans chacun de ces domaines.

L'utilisation de l'ulvane lyase de l'invention donne en outre accès à des monosaccharides rares utilisables comme synthons en glycochimie. La dégradation des ulvanes par l'ulvane lyase de la présente invention combinée à d'autres enzymes peut donner accès à l'acide iduronique (sucre rare) utilisé pour la synthèse des glycosaminoglycans de synthèse.

La présente invention ouvre également de nouvelles perspectives d'utilisation de ces algues pour des applications en bioénergie et en chimie. La production de fragments oligosaccharides peut donner de molécules de base pour la fabrication d'autres molécules. La dépolymarisation de l'ulvane devrait faciliter la fermentation par des microorganismes conduisant à la production de méthane par exemple.

D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'Homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annecées.

Brève description des figures

La figure 1 représente la comparaison de l'expression dans E. coli BI2(DE3) du module catalytique de l'ulvane lyase de N. ulvanivorans PLR (A et B) et F. agariphila DSM 15362 (C et D). Les panneaux A et C correspondent à des analyses SDS-PAGE. Les panneaux B et D correspondent à des analyses western-blot avec un anticorps anti-His-Tag. FW= Flow-through de la chromatographie d'affinité au nickel ; E1 et E2 : éluats 1 et 2 de la chromatographie d'affinité au nickel.

La figure 2 représente un test d'activité de l'ulvane lyase recombinante BN863 22190 cat en fonction de la concentration en NaCI (A), de la nature du tampon (B) et du pH (pour le meilleur tampon, C). L'activité a été suivie par spectrophotométrie à 235 nm.

La figure 3 représente une analyse FACE (Fluorophore-assisted Carbohydrate Electrophoresis) des oligo-ulvanes libérés par une digestion extensive d'ulvane par l'ulvane lyase recombinante BN863_22190_cat. Ces échantillons sont nommés FracX où X est un numéro de fraction correspondant à la purification de ces oligosaccharides par chromatographie d'exclusion de taille. Les oligosaccharides DP2 et DP4 sont des oligo-ulvanes standards libérés par l'ulvane lyase sauvage de Nonlabens ulvanivorans PLR [1 ] .

La figure 4 représente un spectre de masse de la fraction 48 enregistré sur la plateforme BIBS (INRA, Nantes). Les pics principaux de masse / charge (m/z) correspondent à un disaccharide A-R3S.

La figure 5 représente un spectre de masse de la fraction 39 enregistré sur la plateforme BIBS (INRA, Nantes). Les pics principaux de masse / charge (m/z) correspondent à un tetrasaccharide A-R3S-Xyl-R3S.

EXEMPLES Exemple 1 : Expression de l'ulvane lyase de Formosa agariphila

Le gène codant pour cette ulvane lyase (BN863_22190) a été identifié dans le génome de F. agariphila DSM 15362 par homologie de séquence avec l'ulvane lyse de Nonlabens ulvanivorans PLR (anciennement Persicivirga ulvanivorans) [2, 3].

La protéine codée par ce gène a une masse moléculaire de

56630 Da (516 résidus). Elle possède une architecture modulaire avec un peptide signal en N-terminal suivie d'un module catalytique, d'un module de fonction inconnue et d'un module de sécrétion de type IX en C-terminal. Sur la totalité de sa séquence, cette protéine possède 52% d'identité de séquence avec celle de l'ulvane lyase de N. ulvanivorans PLR, comme déterminé par alignement de séquence par le logiciel CLUSTALW. Le module catalytique de l'ulvane lyase de F. agariphila DSM 15362 (résidus 25-285, 28738 Da) présente 66% d'identité de séquence avec la séquence du module catalytique de l'ulvane lyase de N. ulvanivorans (résidus 24- 291 ).

La séquence nucléotidique correspondant au module catalytique de l'ulvane lyase de F. agariphila DSM 15362 a été clonée dans le vecteur pFO4 (dérivé du vecteur commercial pET15b, [6]), et la protéine recombinante correspondante a été surexprimée dans Escherichia coli (SEQ ID NO : 5). A titre de comparaison, un travail similaire a été effectué pour le module catalytique de l'ulvane lyase de N. ulvanivorans PLR.

Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que le module catalytique de l'ulvane lyase de N. ulvanivorans PLR n'est pas visible par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant coloré au bleu de Coomassie (figure 1A), même après purification par chromatographie d'affinité au nickel. Cette enzyme a été néanmoins faiblement détectée par un anticorps anti-Histidine-TAG (figure 1 B, cf. flèche) ; ce qui a confirmé une très faible expression soluble de cette protéine (quelques g par litre de culture). Par contraste, le module catalytique de l'ulvane lyase de F. agariphila DSM 15362 (appelé par la suite BN863_22190_cat) est très fortement exprimé sous forme soluble, comme indiqué par la large bande visible à -29 kDa en SDS-PAGE (figure 1 C). Ceci a été confirmé en western-blot (figure 1 D), qui est une technique beaucoup plus sensible que le SDS-PAGE. Le rendement de production de cette protéine recombinante était de 30 mg par litre de culture, soit au moins 10 000 fois plus que l'ulvane lyase recombinante de N. ulvanivorans PLR.

Exemple 2 : Activité biologique de l'ulvane lyase de Formosa agariphila

Un test d'activité classiquement utilisé pour les polysaccarides lyases {e.g. [7, 8]) a été réalisé pour le BN863_22190_cat. Il consiste en le suivie de l'absorbance à 235 nm du milieu réactionnel. En effet les polysaccharide lyases libèrent des oligosaccharides présentant un monosaccharide insaturée à l'extrémité non-réductrice qui absorbent à 235 nm. Ce test a ainsi permis de déterminer pour l'enzyme la salinité optimale du milieu (Figure 2A), le tampon optimal (Figure 2B) et le pH optimal avec le meilleur tampon (Figure 2C).

Une dégradation extensive d'un ulvan pur (ULV100, Elicityl, France) a été également entreprise en utilisant BN863_22190_cat. Les oligo-ulvanes libérés ont purifiés par chromatographie d'exclusion de taille sur un système de trois colonnes Superdex 30 interconnectés (GE Healthcare, France). Ces oligosaccharides purifiés ont été ensuite analysés par la technique appelée FACE (Fluorophore-assisted Carbohydrate Electrophoresis). L'extrémité réductrice des oligosaccharides a ainsi été marquée par une molécule fluorescente (8-aminonaphthalene-1 ,3,6- trisulfonic acid, ANTS) comme précédemment décrit [9]. Les oligosaccharides marqués sont ensuite analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Des oligo-ulvanes précédemment obtenus au laboratoire par l'ulvane lyase sauvage de N. ulvanivorans PLR [2] ont été également utilisés comme standards (DP2 : le disaccharide A-R3S ; DP4 : le tétrasaccharide A-R3S-Xyl-R3S ; les structures de DP2 et DP4 ont été déterminées par RMN [2]). La figure 3 montre que les oligosaccharides terminaux « Fraction 48 » et « Fraction 39 » migrent à la même taille que les standards DP2 et DP4, respectivement. La structure de ces oligosaccharides générés par BN863_22190_cat. a été confirmée par spectrométrie de masse (Plateforme BIBS, INRA, Nantes) (Figures 4 et 5). Par conséquent, comme l'ulvane lyase sauvage de N. ulvanivorans PLR,

BN863_22190_cat. clive la liaison beta-1 ,4 entre les résidus D- glucuronique acide (GIcA) / L-iduronique acide (IduA) et le rhamnose-3- sulfate (R3S) libérant de manière endolytique des oligosaccharides de tailles différentes présentant un sucre insaturé Δ à l'extrémité non réductrice. Les produits terminaux principaux sont le disaccharide A-R3S, et le tétrasaccharide A-R3S-Xyl-R3. Les tétrasaccharides A-R3S-GlcA- R3S et A-R3S-lduA-R3S décrits aussi dans l'article Nyvall Collen et al., JBC, 201 1 ne sont pas observé dans l'expérience en raison de la dégradation extensive de l'ulvane par BN863_22190_cat. En effet ces deux types de tétrasaccharides sont clivés en deux par BN863_22190_cat, libérant des disaccharides A-R3S (Figure 3). Le tétrasaccharide A-R3S- Xyl-R3S est par contre un produit terminal résistant au clivage enzymatique (Figure 3), en raison de la présence d'un résidu xylose en position 3 à partir de l'extrémité non-réductrice.

Les résultats montrent une forte activité de dégradation de l'ulvane par BN863_22190-cat, confirmée par mesure de l'absorbance à 235 nm et par l'analyse électrophorétique et par spectrométrie de masse des oligo- ulvanes purifiés. A titre de comparaison, seule une activité résiduelle a été détectée en suivant la dégradation de l'ulvane par l'ulvane lyase de N. ulvanivorans par spectrophotométrie à 240 nm (données non représentées).

Références Lahaye et Robic, Biomacromolecules, 8 : 1765-1774, 2007

Nyvall Collen et al., J. Biol. Chem., 286(49) : 42063-42071 , 201 1 Demande internationale WO 201 1/157966

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Nedashkovskaya, et al (2006). Formosa agariphila sp. nov., a budding bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from marine environments, and emended description of the genus Formosa. Int.J.Syst.Evol. Microbiol. 56 : 161 -167.

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