本发明涉及骨骼肌细胞周期调控和细胞增殖的 调节，特别是涉及 乙酰乙酸在细胞周期相关蛋白的调控和骨骼肌 细胞增殖的调节中的 新用途。本发明还涉及乙酰乙酸在制备治疗骨 骼肌损伤的药剂中的用 途。 背景技术

长期以来对细胞增殖的研究大多集中在生长因 子及其它细胞因 子对细胞的生长调控方面，细胞对营养物质的 摄取也受到生长因子的 调控，并且已经发现了部分生长因子信号通路 及其转录水平的调节网 络。

胰岛素样生长因子 1 (IGF1 ) 的结构与功能与胰岛素类似， 对正 常的机体生长和细胞的增殖、 分化、 代谢都有重要作用。 IGF在肝脏 中产生， 通过循环到达全身各组织发挥生物效应， 骨骼肌就是其中重 要的靶器官。 IGF1对骨骼肌的发育以及维持都有重要作用。� �失 IGF1 受体的小鼠会出现严重的肌萎縮，并且在出生 后不久由于不能进行正 常肺呼吸而死亡。 相反， 过表达 IGF1的小鼠的骨骼肌体积明显增大

[1]。 同时， 在肌肉肥大模型， 比如由于运动导致的肌肉肥大模型中， IGF1的表达量明显上升 [2]。

IGF1 与其受体结合， 可以激发 Ras-raf-MEK-ERK信号通路和 PI3K-Akt信号通路。 这两条通路对细胞的增殖和生存是必要的。 其 中与 IGF1相关的研究较多的是 Akt通路。 有研究表明 PI3K的活化 对于骨骼肌的肥大是必不可少的 [3]。 PI3K接着活化下游 Akt, mTOR 等一系列蛋白， 上调与蛋白质翻译有关的转录调控因子， 通过增加翻 译的起始与延伸促进蛋白质合成， 进而导致骨骼肌肥大。

MSTN 属于 TGF-β超家族中的一员， 在不同物种中是高度保守 的， 其主要在骨骼肌中表达 [4] , 在非骨骼肌组织比如腺体、 心肌中 也有表达 [5, 6]。 MSTN基因敲除小鼠的骨骼肌是野生型小鼠的 3倍， 说明 MSTN对骨骼肌的生长具有抑制作用， MSTN基因发生突变而 骨骼肌异常强壮的双肌牛也提供了同样证据 [7]。 同时利用原位杂交 技术对 MSTN在小鼠胚胎发育过程中表达的研究也提示� � MSTN对 骨骼肌发育也起着至关重要的作用 [4]。

对 MSTN调控细胞增殖的分子机制， 研究发现 MSTN可以上调 细胞周期抑制因子 p21， 从而抑制 CDK2的活性， 同时通过 Rb蛋白 抑制 E2F的转录活性，最终阻滞细胞由 G1期向 S期的转换 [8]。另外 也有研究发现， MSTN通过 p21还能抑制细胞由 G2向 M期的转换 [9]。 本实验室的研究提供了 MSTN作用机制的另一条通路， 即 MSTN可 以通过 PI3K-Akt-GSK3P通路下调 cyclinDl的表达， 从而把细胞周期 阻滞在 G1期， 同时发现这种作用可以和 IGF1的作用想拮抗， 提出 MSTN可能与 IGF1共同作用调节细胞增殖的作用模型 [10]。 此外， 体内以及体外研究均显示， MSTN还能通过上调 p21的表达抑制卫星 细胞的增殖， 提示 MSTN在骨骼肌再生中的重要作用 [11]。 现有技术中对于内源性代谢产物与细胞增殖的 研究并不多，并且 没有提出统一的理论模式。但是越来越多的研 究表明， 代谢产物比如 胆固醇、某些不饱和脂肪酸都可以调节细胞增 殖。另外糖代谢中非常 重要的内源性代谢产物乳酸作为一个信号分子 的概念最近已经被提 出 [12]。 最近研究发现乳酸在伤口愈合过程中起一定作 用， 提示其在 代谢过程之外有独立的生物学功能。

内源性代谢产物乙酰乙酸是 β-羟丁酸（β-ΗΒ) 的下游代谢产物。 作为酮体的主要组分，乙酰乙酸和 β-羟丁酸在肝脏中合成进入循环系 统， 在肝外组织中分解代谢产生 ΑΤΡ, 为机体提供能量。尤其在长期 饥饿状态下， 酮体可以作为糖的替代物被大脑、 心脏、 肾脏以及骨骼 肌的组织器官利用， 维持机体的生命活动。 已有文献报道， 在肾脏细 胞系中代谢产物 β-ΗΒ可以调控细胞的增殖， 而乙酰乙酸并没有这种 作用； 在内皮细胞中则发现了相反的结果 [13]。 乙酰乙酸和 β-ΗΒ的 作用可能具有不同组织细胞的特异性。 发明内容

本发明的第一个方面提供了乙酰乙酸在调节细 胞周期相关蛋白 中的新用途。 本发明人发现， 乙酰乙酸对细胞周期蛋白 cyclinDl 具 有调节作用。特别地， 本发明人发现， 乙酰乙酸可以在转录以及翻译 水平上通过上调 cyclinDl 的表达水平。 同时， 本发明人证明， 乙酰 乙酸通过激活 ERK通路而上调细胞周期蛋白的表达。

本发明的第二个方面提供了乙酰乙酸促进骨骼 肌细胞增殖的新 用途。 特别地， 所述骨骼肌细胞为成肌细胞。 本发明人证明， 乙酰乙 酸以剂量和时间依赖的方式通过增加 s 期的比例促进成肌细胞的增 殖。 具体地， 本发明人证明， 内源性代谢物乙酰乙酸通过激活 ERK 通路上调细胞周期蛋白 cyclinDl的表达， 从而促进成肌细胞的增殖。

在第三个方面，本发明提供了一种用于促进骨 骼肌细胞增殖的药 物组合物， 其包括乙酰乙酸和胰岛素样生长因子 1， 以及药学上可接 受的载体。 本发明人发现， 乙酰乙酸可以协同类胰岛素生长因子 (IGF1 ) 或拮抗 MSTN对细胞周期的调控作用。

在第四个方面， 本发明进一歩提供了一种治疗骨骼肌损伤的方 法， 包括向有需要的个体施用有效量的乙酰乙酸。 此外， 本发明还提 供了一种治疗骨骼肌损伤的方法，包括向有需 要的个体施用一种药物 组合物， 其包括乙酰乙酸和胰岛素样生长因子 1， 以及药学上可接受 的载体。

在另一个方面，本发明进一歩提供了乙酰乙酸 在制备治疗骨骼肌 损伤的药剂中的用途。特别地， 所述的骨骼肌损伤为环磷酸胺诱导产 生的。

结合以下实施例并参考附图， 可以更清晰地理解本发明。 附图说明

图 1A， IB, 1C， ID. 乙酰乙酸（AA)可以促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖， 而 β-ΗΒ的作用不明显 (** : ρ<0.01) ο

图 2. 乙酰乙酸（ΑΑ)以剂量依赖的方式促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖 (**: p<0.01) o

图 3. 乙酰乙酸 (AA)以时间依赖的方式促进 C2C12细胞增殖 (**: p<0.01, p<0.001)。

图 4. 乙酰乙酸 （AA) 通过上调 cyclinDl的表达。

图 5. 乙酰乙酸 （AA ) 可以激活 ERK 通路 (* * : p<0.01, ***: p<0.001) o

图 6. 乙酰乙酸（AA)通过激活 ERK通路促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖 (*: p<0.05, **: p<0.01) o

图 7. 乙酰乙酸 (AA)可以协同 IGF1促进细胞增殖或拮抗 MSTN 对细胞抑制的功能 (* : p<0.05, **: p<0.01) o

图 8. 乙酰乙酸 （AA) 明显减弱环磷酸胺 （CTX对骨骼肌组织 造成的损伤。 具体实施方式

1.细胞的培养

(¾( ₁₂ 细胞是由 Yaffe和 Saxel建立的小鼠成肌细胞系。该细胞在 正常生长状态下呈现成纤维细胞的形态， 在适当条件下（如细胞密度 过高或血清饥饿） C ₂ C ₁₂ 细胞可以分化形成具有收縮能力的肌管细 胞 (myotubes)并且表达特异性的肌肉分化标志蛋白� �若以骨形成蛋白 2 (bone morphogenic protein 2, BMP-2) 处理该细胞可以导致其由成 肌细胞向成骨细胞的转化。 C ₂ C ₁₂ 细胞在增殖阶段的培养条件为含 10%胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培养基， 抗生素含量为 100 Units/mL青霉素和 100 g/mL链霉素，该生长基为 生长培养基（growth medium, GM)。 细胞的培养环境为 37°C， 含 5% C0 ₂ 。

需要注意的是：（^ ₂ ( ₁₂ 细胞的培养过程中严禁细胞生长密度过大 ， 即不可达到 100% confluent。 所以当细胞密度达到大约 60%时即需要 以消化液 （0.25% Trypsin, 0.53 mM EDTA) 以 1 : 2或 1 : 3的比例 传代。

细胞的复苏

取出保存在液氮中的细胞，迅速放入 37°C水浴中融化。 1000 rpm 离心 5 min后弃上清收集细胞， 加入 10%胎牛血清的完全培养基， 轻 轻吹打细胞， 移入 25cm ² 的培养瓶中， 加入完全培养基 5 mL， 37 °C， 5% C0 ₂ 孵箱中培养。

细胞的冻存

冻存细胞的前夜换新鲜培养基。 冻存时以胰蛋白酶消化收集细 胞。 加入适量冻存液（含 10%的二甲基亚砜， 20%胎牛血清的完全培 养基），重悬细胞后转入冻存管中， -70°C冷冻过夜后转入液氮中保存。

2. 乙酰乙酸促进成肌细胞 C ₂ C ₁₂ 的增殖

首先， 我们检测了乙酰乙酸 （购自 Sigma-Aldrich, catalog no. A8509) 以及 β-ΗΒ (购自 Sigma-Aldrich, catalog no. 54965 )对成肌细 胞 C ₂ C ₁₂ 增殖的影响。分别用 5mM 乙酰乙酸以及 5mM β-ΗΒ处理成 肌细胞 C ₂ C ₁₂ ， 48小时后收集细胞分别作流式以及 MTT检测。 流式 结果表明 （图 1A,B,C)， 乙酰乙酸显著提高 S期细胞比例， 即乙酰乙 酸可以促进细胞由 G1 期向 S期的转换， 但是内源性代谢产物 β-ΗΒ 对细胞周期却没有作用 （其中 IGF1作为阳性对照）。 ΜΤΤ法检测也 得到与流式一致的结果，乙酰乙酸可以明显提 高细胞活力，然而 β-ΗΒ 对细胞活力的提高没有明显作用 （图 1D)。

为进一歩确定乙酰乙酸促进成肌细胞 C ₂ C ₁₂ 增殖的作用是否是剂 量依赖的， 我们用浓度为 O.lmM, 0.5mM， ImM, 5mM的乙酰乙酸 分别处理 C ₂ C ₁₂ 细胞， 48小时后收集细胞分别做 H ³ TdR以及流式检 测。 H ³ TdR结果显示， 随着乙酰乙酸剂量的增大细胞 DNA合成逐渐 增多， 当剂量增加到 ImM以上时， DNA合成增多与对照组相比有统 计学上的显著差异。 即乙酰乙酸可以剂量依赖的促进 C ₂ C ₁₂ 细胞的 DNA合成 （图 2A)。 同时流式结果进一歩表明， 随着乙酰乙酸剂量 的增大， 细胞 S期所占比例逐渐增大， 当剂量增加到 5mM时， S期 增多与对照组相比有统计学的显著性差异。即 乙酰乙酸可以剂量依赖 的促进 C ₂ C ₁₂ 细胞由 G1期向 S期的转换 （图 2B)。 上述结果表明， 乙酰乙酸可以剂量依赖的方式促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖。

根据以上剂量试验， 我们进一歩用乙酰乙酸 5mM处理 C ₂ C ₁₂ 细 胞， 在 24小时、 36小时以及 48小时后收集细胞， 检测乙酰乙酸促 进细胞增殖的时间依赖性。 H ³ TdR结果显示随着处理时间的延长， 细 胞 DNA合成逐渐增多。处理 24小时的细胞 DNA合成增多与对照组 相比即有显著性差异 （p<0.01 ); 处理 36小时以后， DNA合成增多 与对照组相比的显著性差异更大（p<0.001 )。 即乙酰乙酸可以时间依 赖性方式促进 C ₂ C ₁₂ 细胞的 DNA合成 （图 3A)。 同时流式分析结果 表明， 处理 24小时的细胞其 S期所占比例没有明显变化； 但随着处 理时间的延长， 细胞 S期所占比例逐渐增大， 处理 48小时的细胞的 S期增多与对照组相比有显著性差异。表明乙� �乙酸可以时间依赖的 方式促进 C ₂ C ₁₂ 细胞由 G1期向 S期的转换 （图 3B)。 综上所述， 乙 酰乙酸可以时间依赖的形式促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖。

3. 乙酰乙酸通过上调 cyclinDl表达促进细胞增殖

上述结果表明，乙酰乙酸以剂量和时间依赖的 方式通过增加 S期 的比例促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖。 细胞周期的变化是由细胞周期蛋白表达 的变化来调节的。 因此， 我们进一歩研究了乙酰乙酸是通过影响哪些 细胞周期相关蛋白来促进 C ₂ C ₁₂ 细胞的增殖。 首先我们用 5mM 乙酰 乙酸处理增殖的( ₂ ( ₁₂ 细胞， 48小时后收集细胞， 用 Western blot检 测细胞周期相关蛋白的表达。结果显示， 与对照组相比乙酰乙酸处理 后的细胞中 cyclinDl的表达有明显上调， cyclinE的表达也有一定的 上调 （图 4A)。 由于 cyclinDl与 cyclinE主要调节细胞由 G1期向 S 期的转换， 因此这与上述细胞周期分析的结果是一致的。 进一歩用不 同浓度的乙酰乙酸处理 C ₂ C ₁₂ 细胞， 在 RNA水平以及蛋白水平分别 检测 cyclinDl的表达变化。 Realtime-PCR以及 Western blot结果均显 示，乙酰乙酸在 RNA和蛋白水平上以剂量依赖的方式促进 cyclinDl 的表达 （图 4B,C)。 4. 乙酰乙酸通过激活 ERK通路促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖

乙酰乙酸可以通过上调 cyclinDl的表达促进 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖。根 据已知的 MAPK信号通路与细胞周期调控的关系， ERK可以通过调 节 cyclinDl的表达影响细胞周期。 因此， 我们首先检测了 ERK通路 上的相关蛋白对乙酰乙酸调节 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖的作用。 收集 5mM 乙 酰乙酸处理不同时间的细胞进行蛋白水平的检 测，蛋白免疫印迹结果 显示， 随着处理时间的延长， 磷酸化的 ERK蛋白水平逐渐升高 （图 5A,5B)。 为进一歩确定 ERK参与了乙酰乙酸作用的信号传导过程， 我们检测了 ERK信号通路中上游蛋白 p-MEKl/2和 p-c-Raf的变化。 结果显示，随着乙酰乙酸处理时间的延长，磷 酸化的 MEK1/2和 c-Raf 的蛋白水平也表现出逐渐升高的的趋势（图 5A,5C,5D)。 表明乙酰乙 酸激活了 raf-MEK-ERK通路。

虽然乙酰乙酸激活了 raf-MEK-ERK通路， 但该信号传导通路是 否直接参与了乙酰乙酸对细胞周期的调控？ 为了回答这个问题， C ₂ C ₁₂ 我们用 ERK通路的抑制剂 PD98059来阻断 ERK通路， 同时检 测细胞增殖以及 cyclinDl 的表达变化。 H ³ TdR结果显示， 与对照相 比， PD98059单独处理细胞可以抑制 DNA的合成， 说明抑制剂是有 效的。 乙酰乙酸单独处理细胞可以促进 DNA的合成。 但乙酰乙酸与 抑制剂联合处理后， DNA的合成相比乙酰乙酸单独处理组有所下降， 并且这种下降随着抑制剂浓度的增加而更加明 显（图 6A)。这就说明 ERK通路的激活参与了乙酰乙酸促进细胞增殖的 调控。 同时， 我们 检测了 cyclinDl 的表达变化。 蛋白免疫印迹结果显示， PD98059单 独处理细胞可以降低 ERK磷酸化水平， 乙酰乙酸单独处理细胞可以 升高磷酸化 ERK蛋白水平。 乙酰乙酸与抑制剂联合处理， 磷酸化的 ERK蛋白水平相比仅处理乙酰乙酸的有所下降， 并且这种下降的趋 势随着 PD98059剂量的加大而更加显著 （图 6B,6C)。 CyclinDl的表 达变化趋势与 p-ERK的变化趋势一致 （图 6B,6D)。 上述结果说明， 内源性代谢物乙酰乙酸通过激活 ERK通路上调 cyclinDl的表达， 从 而促进 C ₂ C ₁₂ 细胞的增殖。

5. 乙酰乙酸可以协同 IGF1或拮抗 MSTN对 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖的 影响

用乙酰乙酸（5 mM)、 IGF1 ( 50 ng/ml) 以及 MSTN (500 ng/ml) 分别或者联合处理增殖的 C ₂ C ₁₂ 细胞。 流式分析与前期结果一致， 乙 酰乙酸和 IGF1单独处理可以分别增加细胞 S期的比例，而 MSTN单 独处理则使 S期的比例减少。 十分重要的是， 乙酰乙酸与 IGF1联合 处理比 IGF1单独处理细胞的 S期又有所增加， 说明乙酰乙酸可以协 同 IGF1对细胞增殖起到叠加的促进作用。 相反， 乙酰乙酸与 MSTN 联合处理可以使 MSTN单独处理所减少的 S期回复到对照水平， 说 明乙酰乙酸可以拮抗 MSTN对细胞周期的的抑制作用 （图 7A)。 进 一歩用不同剂量的乙酰乙酸与 IGF1或者 MSTN联合处理，流式结果 显示乙酰乙酸以剂量依赖的方式协同 IGF1或者拮抗 MSTN对 C ₂ C ₁₂ 细胞周期的调控作用 （图 7B)。

已知 IGF1或者 MSTN可以通过 ERK信号通路调控细胞周期， 为了进一歩确定乙酰乙酸与 IGF1或者 MSTN是否共同通过 ERK通 路来调节细胞增殖， 我们用 ERK通路的抑制剂 PD98059对细胞周期 进行干扰。流式分析结果显示， 相比于对照组， PD98059只能部分抑 制细胞周期进程（图 7C)。此结果建议，乙酰乙酸与 IGF1或者 MSTN 可以共同通过 ERK通路来调节 C ₂ C ₁₂ 细胞增殖。

6. 乙酰乙酸可以显著减弱 CTX对骨骼肌组织造成的损伤 为了检测乙酰乙酸在动物体内的生物学功能， 我们利用注射 CTX 的骨骼肌损伤模型进行研究。 将 CTX、 不同剂量的乙酰乙酸单独或 者联合注射 8周龄的 C57BL/6小鼠腓肠肌， 注射 4天后取组织样本 进行组织学以及分子生物学检测。 组织切片染色以及 Western Blot结 果均显示， 单独注射 CTX可以造成骨骼肌组织大面积损伤， 镜下观 察到大量免疫细胞浸润 （图 8A)， Western Blot结果显示肌肉卫星细 胞活化 Marker表达升高。 单独注射乙酰乙酸对骨骼肌组织几乎没有 损伤 （图 8B)。 CTX与乙酰乙酸同时注射相比于 CTX单独注射组对 骨骼肌的损伤明显减弱， 肌肉卫星细胞活化 Marker表达也明显下降 (图 8A,8B)。 以上结果显示， 乙酰乙酸可以明显减弱 CTX对骨骼肌 组织造成的损伤。 参考文献

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