本发明涉及一种 Chi 92蛋白的新用途以及表达 Chi92蛋白的菌株。

背景技术

几丁质（Chi t in)又称甲壳素、 甲壳质， 其基本组成单位是乙酰氨基葡 萄糖。 乙酰氨基葡萄糖为一种直链聚合物， 其结构类似于纤维素， 只是 C2 羟基被 N-乙酰氨基所取代。 几丁质的主要来源是海洋甲壳类动物， 如虾、 蟹等， 是海洋环境最重要的营养源和能源， 同时又是我国近海域主要的有 机污染源之一。 几丁质广泛的分布在自然界中， 是世界上含量仅次于纤维 素的生物高聚物， 每年生物合成量达 100亿吨。 由于几丁质的分子量大、 结构紧密、 不容于水和普通溶剂， 故其应用受到很大的限制， 所以在生产 上需要将几丁质降解为水溶性好的几丁寡糖等 甲壳低聚糖。

几丁质酶（ EC. 3. 2. 14)是一类特异性水解几丁质的蛋白， 能水解几丁 质的 β -1， 4糖苷键，产生几丁质寡聚糖如 Glc (NAG) ₂ 、Glc (NAG) ₃ 、Glc (NAG) ₄ 、 Gl _C (NAG) ^n Glc (NAG) ₆ ， 最终分解为 N-乙酰氨基葡萄糖 （GlcNAc ) 。

发明公开

本发明的目的是提供一种 Chi92蛋白的新用途以及表达 Chi92蛋白的 菌株。

本发明提供的巴氏毕赤酵母 i Pichia pastor is) pPIC9/Chi92， 已于

2013年 5月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 (简称 CGMCC , 地址为： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏号为 CGMCC No. 7634。

本发明还保护巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92 在生产 Chi92 蛋白中的应 用； 所述 Chi92蛋白为如下 （a ) 或 （b ) ： ( a ) 由序列表中序列 1所示 的氨基酸序列组成的蛋白质； （b ) 将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加且具有几丁质酶 活性的由序列 1衍生的蛋白质。 应用所述巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92生产 所述 Chi92蛋白的方法如下： 将所述菌株接种至 MY液体培养基， 30°C、 250-280rpm振荡培养 48h， 每 12h补加甲醇， 使培养体系中的甲醇浓度达 到 0.5% (体积比） ， 离心收集上清液。 所述方法还可包括如下步骤： 将所 述上清液采用 lOkDa膜包进行浓缩， 然后进行透析， 最后冷冻干燥， 得到 干粉。

本发明还保护所述巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92的发酵产物。 所述发酵 产物的制备方法如下： 将所述菌株接种至 BMMY 液体培养基， 30°C、 250-280rpm振荡培养 48h， 每 12h补加甲醇， 使培养体系中的甲醇浓度达 到 0.5% (体积比） ， 离心收集上清液。 所述方法还可包括如下步骤： 将所 述上清液采用 lOkDa膜包进行浓缩， 然后进行透析， 最后冷冻干燥， 得到 干粉。

本发明还保护所述发酵产物在制备几丁质酶中 的应用。 所述应用中， 反应的条件为： 30°C-45°C (如 30- 40°C或 40- 45°C) ， pH6- 9 (如 pH6- 7、 pH7- 8、 pH8- 9) 。

本发明还保护所述发酵产物作为几丁质酶的应 用。 所述应用中， 反应 的条件为： 30°C-45°C (如 30- 40°C或 40- 45°C)， pH6- 9 (如 pH6- 7、 pH7- 8、 pH8- 9) 。

本发明还保护所述发酵产物在降解几丁质类底 物中的应用； 所述几丁 质类底物为胶体几丁质、 β-葡聚糖、 羧甲基纤维素、 壳聚糖、 虾壳粉、 蟹壳粉、 几丁质、 乙二醇几丁质和热灭活酵母菌粉中的至少一种 。 所述应 用中， 反应的条件为： 30°C-45°C (如 30-4CTC或 40-45°C) ， pH6-9 (如 pH6-7、 pH7-8、 pH8-9) 。 所述热灭活酵母菌粉具体可为将毕赤酵母 GS115 菌体冷冻干燥得到的菌粉进行热灭活得到的产 物。 所述热灭活的条件具体 可为 80°C处理 30min。

本发明还保护所述 Chi92蛋白在制备几丁质酶中的应用。所述应用� ��， 反应的条件为： 30°C-45°C (如 30- 40°C或 40- 45°C) ， pH6- 9 (如 pH6- 7、 pH7- 8、 pH8- 9) 。

本发明还保护所述 Chi92蛋白作为几丁质酶的应用。 所述应用中， 反 应的条件为： 30°C- 45°C (如 30- 40°C或 40- 45°C)，pH6- 9(如 pH6- 7、pH7- 8、 pH8-9) 。

本发明还保护所述 Chi92蛋白在降解几丁质类底物中的应用； 所述几 丁质类底物为胶体几丁质、 β-葡聚糖、 羧甲基纤维素、 壳聚糖、 虾壳粉、 蟹壳粉、 几丁质、 乙二醇几丁质和热灭活酵母菌粉中的至少一种 。 所述应 用中， 反应的条件为： 30°C -45 °C (如 30-4CTC或 40-45 °C ) ， pH6-9 (如 pH6-7、 pH7-8、 pH8-9 ) 。 所述热灭活酵母菌粉具体可为将毕赤酵母 GS115 菌体冷冻干燥得到的菌粉进行热灭活得到的产 物。 所述热灭活的条件具体 可为 80°C处理 30min。

本发明还保护所述 Chi92蛋白作为饲料添加剂的应用。 所述饲料添加 剂具体可为鱼类饲料添加剂， 如罗非鱼饲料添加剂。

本发明还保护所述 Chi92蛋白在制备饲料中的应用。 所述饲料具体可 为鱼类饲料， 如罗非鱼饲料。

本发明还保护一种饲料添加剂， 其活性成分为所述 Chi92蛋白。 所述 饲料添加剂具体可为鱼类饲料添加剂， 如罗非鱼饲料添加剂。

附图说明

图 1为标准曲线以及标准曲线方程。

图 2为 SDS- PAGE电泳图。

图 3为薄层层析的结果。

图 4为 ESI-MS分析的结果。

图 5为最适 pH的结果。

图 6为 pH稳定性的结果。

图 7为最适温度的结果。

图 8为温度稳定性的结果。

图 9为底物特异性的结果。

图 10为三种几丁质酶降解酵母细胞壁产生还原糖� ��结果。

图 11为 Chi92蛋白降解酵母细胞壁产生还原糖中葡萄糖� ��量的结果。 图 12为 Chi92蛋白降解酵母细胞壁产物的扫描电镜结果� ��

实施发明的最佳方式

以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施 例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试 验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施 例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。酶活力单位定义： 每小时分解胶体几丁质释放出 Ι μ ηιοΐ /L GlcNAc所需的酶量定义为一个酶 活力单位（1U)。比活力单位定义：每毫克酶蛋 白所含的酶活力单位（U/mg)。 Chi92蛋白如序列表的序列 1所示， 其编码基因如序列表的序列 2所示。

气单胞菌 iAeromoi s sp. ) B565, 已于 2010年 12月 03日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC, 地址为： 北 京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏号为 CGMCC No.4403。

毕赤酵母表达载体 pPIC9: Invitrogen 公司。 毕赤酵母 Pichia pastor is) GS115.- Invitrogen公司。几丁质： Sigma公司，货号为 C9752。 羧甲基纤维素： 北京鼎国生物技术公司， 货号为 DH053。 大麦 β-葡聚糖： 北京拜耳迪生物公司。 壳聚糖 （粉末） ： sigma公司， 货号为 417963。 乙 二醇几丁质（粉末）： sigma公司，货号为 G7753。N-乙酰氨基葡萄糖： Sigmah 公司，货号 N8759。胰蛋白酶（Trypsin)、 -糜蛋白酶（ a -Chymotrypsin)、 胃蛋白酶均购自 Sigma (USA) ₀

MD 固体培养基的溶剂为水， 含有如下溶质： YNB 13.4g/L、 葡萄糖 20g/L、 生物素 4X10— ⁴ g/L、 琼脂粉 20g/L。

BMGY液体培养基的溶剂为水， 含有如下溶质： 酵母提取物 10g/L、 蛋 白胨 20g/L、 酵母氮源（YNB) 13.4g/L、 生物素 4 X 10— ⁴ g/L、 甘油 10mL/L。

BMMY液体培养基的溶剂为水， 含有如下溶质： 酵母提取物 10g/L、 蛋 白胨 20g/L、 酵母氮源（YNB) 13.4g/L、 生物素 4 X 10— ⁴ g/L、 甲醇 5mL/L。 实施例 1、 工程菌的构建和保藏

一、 重组质粒的构建

1、 提取气单胞菌 B565的基因组 DNA。

2、 以步骤 1提取的基因组 DNA为模板， 用 F1和 R1组成的引物对进 行 PCR扩增， 得到 PCR扩增产物。

F1: 5' -GGAGAATTCGCGGCGCCCGGCAAGCC-3 ' ；

R1: 5' - GGAGCGGCCGCTTATTTACAACTGGCGGCTCCCACATCCTG- 3' 。

3、 用限制性内切酶 EcoRI和 Notl双酶切步骤 2的 PCR扩增产物， 回 收酶切产物。

4、 用限制性内切酶 EcoRI和 Notl双酶切毕赤酵母表达载体 pPIC9， 回收约 9.3kb的载体骨架。 5、 将步骤 3 的酶切产物和步骤 4 的载体骨架连接， 得到重组质粒。 根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下 ：在毕赤酵母表达载体 PPIC9 的 EcoRI 和 Notl 酶切位点之间插入了序列表的序列 2 自 5 ' 末端第 70-2595位核苷酸所示的双链匪分子。

二、 重组菌的构建

1、 将步骤一构建的重组质粒导入毕赤酵母 GS115的感受态细胞， 然 后涂布 MD 固体培养基平板， 用灭过菌的牙签挑取单菌落， 按照编号接种 到新的 MD固体培养基平板。 共得到 96个单克隆。

2、按编号挑取单克隆接种于 3mL BMGY液体培养基， 30°C、 250-280rpm 振荡培养 2-3天， 然后 4500rpm离心 5mi n， 取沉淀 （尽量将上清除尽） ； 向沉淀中加入 lmL BMMY液体培养基， 30°C、 250-280rpm振荡培养 48h， 离心收集上清液。

三、 对照菌的构建

1、 用毕赤酵母表达载体 PPIC9 代替重组质粒进行步骤二的 1， 得到 30个单克隆。

2、 同步骤二的 2。

四、 检测上清液的几丁质酶酶活

1、 1%胶体几丁质的制备

在 4°C下， 取 10g几丁质放入研钵中， 加丙酮 40mL研磨 10min， 边研 磨边缓缓加入冷浓 HC1 400mL， 充分研磨， 使呈糊状， 然后 4 °C放置 24h， 之后用玻璃棉过滤， 收集滤液； 将滤液缓缓加入到盛有 2000ml 50% (体积 分数） 乙醇水溶液的烧杯中， 边加边剧烈搅拌， 然后静置， 待胶态几丁质 析出后去除清液， 收集胶体几丁质； 用蒸馏水冲洗胶体几丁质至 PH7. 0 , 以蒸馏水定容至 1000ml , 冷藏备用。

2、 绘制标准曲线

用 pH7. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将 N-乙酰氨基葡萄 糖配成不同浓度的溶液， 将 0. 5mL各个溶液 （N-乙酰氨基葡萄糖的含量分 另 lj为 5. 5 μ ηιο1、 7. 1 μ mol , 8. 3 μ mol , 10. 0 μ mol , 12. 5 μ mol或 16. 7 μ mol ) 分别与 lmL DNS溶液混合后沸水浴 5min显色， 然后用蒸馏水补齐至 2. 5mL， 冷却至室温后在 540nm测定 0D值， 绘制标准曲线， 标准曲线以及 标准曲线方程见图 1 (后续实施例中的标准曲线均指本标准曲线） 。

3、 分别检测步骤二得到的各个上清液、 步骤三得到的各个上清液的 几丁质酶酶活

(1) 取 4支试管， 分别加入 0.25mL待测溶液和 0.25mL 1%胶体几丁 质， 其中三支试管于 40°C水浴 lh， 另外一支于 4°C放置， 作为对照；

(2)取完成步骤（1) 的试管， 每管加入 lmLDNS溶液， 沸水浴 5min， 然后用蒸馏水补齐至 2.5ml， 离心取上清液， 在 540nm测定 0D值， 对照标 准曲线方程并计算酶活。

步骤二得到的 96个单克隆中， 24个单克隆得到的上清液具有几丁质 酶酶活， 依次为 7.584、 8.873、 9.609、 16.788、 32.251、 32.803、 33.907、 33.907、 34.460、 35.288、 37.497、 37.681、 37.865、 37.957、 38.509、 38.601、 38.693、 38.970、 39.154、 39.890、 41.087、 41.179、 41· 731和 66.398U/ml。 将几丁质酶酶活最高的上清液对应的菌株作为 工程菌， 命名 为巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92。

步骤三得到的 30个单克隆中， 上清液的几丁质酶酶活均为 0U/mL。 五、 工程菌的保藏

巴氏毕赤酵母 iPichia pastor is pPIC9/Chi92， 已于 2013年 5月 23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普� ��微生物中心（简称 CGMCC, 地址为： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏号为 CGMCCNo.7634。 实施例 2、 Chi92蛋白的制备、 纯化以及酶活测定

一、 Chi92蛋白的制备及纯化

1、 将巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92接种于装有 200mL BMGY液体培养基 的 lOOOmL三角瓶， 30°C、 250-280rpm振荡培养 2天， 4500rpm离心 5min， 取沉淀（尽量将上清除尽）； 向沉淀中加入 lOOmLBMMY液体培养基， 30°C、 250-280rpm振荡培养 48h， 每 12h补加甲醇， 使培养体系中的甲醇浓度达 到 0.5% (体积比） ， 离心收集上清液。

2、 在 0°C下， 将步骤 1得到的上清液采用 lOkDa膜包进行浓缩， 然后 以去离子水作为透析液进行透析， 最后冷冻干燥， 得到干粉。

3、 取步骤 2得到的干粉， 溶于去离子水后进行 SDS-PAGE, 见图 2， 显示分子量约为 92kDa的单一条带， 与预测分子量相近。 切取目标条带， 送天津生物芯片技术有限公司进行二级质谱鉴 定， 鉴定结果表明该目标条 带为 Chi92蛋白。

二、 Chi92蛋白作为几丁质酶的比活， Km, Vmax

1、 将 50mg步骤一的 2得到的干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

3、 1%虾壳粉的制备

同实施例 5的步骤一的 4。

4、 1%大麦 β -葡聚糖的制备

同实施例 5的步骤一的 2。

5、 通过考马斯亮蓝法检测步骤 1得到的待测溶液中的蛋白含量。

6、 检测步骤 1得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施例 1 的 步骤四的 3。 待测溶液的几丁质酶酶活为 69. 423U/mL， Chi92蛋白的比活 力为 809· 207U/mg _o

7、测定 Chi92蛋白的一级反应时间为 60min， 分别采用不同浓度的不 同底物 （底物分别为： 胶体几丁质、 虾壳粉或大麦 β -葡聚糖； 每种底物 的浓度分别为： 1%、 0. 8%、 0. 7%、 0. 6%、 0. 4%、 0. 3%或 0. 1%) ， 其它同实 施例 1 的步骤四的 3， 计算相应的反应速度， 利用米氏方程双倒数法求得 Km值及 Vmax。按双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）将米� �方程改写为： 计算 v、 [S]二者的倒数， 以 1/ν对 1/ [S]作图， 绘出直线， 求得 Km 值及 Vmax。 结果见表 1。

表 1 Chi92蛋白的动力学参数

、 TLC (薄层层析法） 检测 Chi92蛋白降解胶体几丁质的产物 1、 将 50mg步骤一的 2得到的干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

3、 将 500μ1步骤 1得到的待测溶液与 500μ1步骤 2得到的 1%胶体几 丁质混合并 40°C静置反应 lh，然后 10CTC煮沸 10min，12000rpm离心 lOmin 并取上清，即为实验组反应产物。将 500μ1步骤 1得到的待测溶液与 500μ1 步骤 2得到的 1%胶体几丁质混合后 10CTC煮沸 10min，然后 12000rpm离心 lOmin并取上清， 即为对照组反应产物。

DGX9053-B-2 鼓风干燥烘箱 （上海福玛） ； P-1 型展层缸（双槽）（100 mm*200 mm) 。 GF254硅胶板（100 mm*200 mm)。 展开剂： 正丁醇： 异丙醇： 乙酸： 水 =7 : 5 : 2 : 4 (体积比） 。 显色剂： 苯胺 4ml， 二苯胺 4g， 85%磷酸 30ml， 丙酮 200ml。 105 °C烘箱干燥 5min显色。

结果见图 3。 Chi92蛋白降解胶体几丁质的产物是几丁二糖，� ��样孔 1、 2、 3、 4、 5、 6分别为 Glc (NAG) ₆ 、 Glc (NAG) ₅ 、 Glc (NAG) ₄ 、 Glc (NAG) ₃ , Glc (NAG) ₂ 和 Glc (NAG)的标准品， 7为实验组反应产物， 8为对照组反应产物， 9为 Glc (NAG) 、 Glc (NAG) ₅ , Glc (NAG) ₄ 、 Glc (NAG) ₃ , Glc (NAG) ₂ 禾卩 Glc (NAG)的标 准品的混合物。 结果表明： Chi92蛋白降解胶体几丁质的产物为几丁二糖。

四、 ESI-MS检测几丁质酶 Chi92降解胶体几丁质的产物

处理方法同步骤三。

将 800μ1 反应产物与 1/3 体积的阴阳树脂粒子涡旋混匀， 室温静置 30min， 取上清 500μ1 即为脱盐反应产物。 脱盐反应产物送到中科院化学 研究所进行 ESI-MS分析， 结果见图 4。 Ν-乙酰 -D-氨基葡萄糖和几丁二糖 的理论分子量分别为 221. 21和 424. 4。 由于在 ESI-MS过程中采用氯仿作 为电喷雾试剂，在糖的结构中引入 C1—离子，与几丁寡糖中的 0H—形成氢键， 利于结合柱子， 产生峰图。 所以在图中显示的峰图为加 C1—分子量。 N-乙 酰 -D-氨基葡萄糖和几丁二糖的加 C1—分子量分别为 256. 21和 459. 4，与峰 图结果一致。在 ESI-MS过程中， 加入 C1—有 2种形式， 分别是 ³⁵ C1—和 ³⁷ Cl—， 理论上加 ³⁵ C1—的峰高为加 ³⁷ C1—的峰高的 3倍。 峰图中 255. 9与 459. 2峰后 面 2个质荷比的位置分别有一个峰高度为其 1/3的峰， 进一步证明此峰图 为加 CI—峰图。由图中峰高度可以看出几丁二糖的� ��度明显高于 N-乙酰 -D- 氨基葡萄糖。由于 ESI-MS的检测分辨率约为 lng，TLC检测分辨率约为 5ng， 因此在 TLC方法中没有检测到浓度较低的 N-乙酰 -D-氨基葡萄糖。 实施例 3、 Chi92蛋白作为几丁质酶的酶学性质

将实施例 2的步骤一的 2得到的干粉作为待测干粉（主要组分为 Chi92 蛋白） ， 进行本实施例的实验。

一、 最适 pH

1、 1%胶体几丁质的制备

在 4°C下， 取 10g几丁质放入研钵中， 加丙酮 40mL研磨 10min， 边研 磨边缓缓加入冷浓 HCl 400mL， 充分研磨， 使呈糊状， 然后 4°C放置 24h， 之后用玻璃棉过滤， 收集滤液； 将滤液缓缓加入到盛有 2000ml 50% (体积 分数） 乙醇水溶液的烧杯中， 边加边剧烈搅拌， 然后静置， 待胶态几丁质 析出后去除清液， 收集胶体几丁质； 用缓冲液冲洗胶体几丁质， 以相同的 缓冲液定容至 1000ml , 冷藏备用。

分别采用以下缓冲液： PH3. 0-8. 0的 0. 2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓 冲液、 pH8. 0-9. 0的 0. 2mol/L Tri s- HCl缓冲液和 pH9. 0-11. 0的 0. 2mol/L 甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液。

2、 将 50mg待测干粉溶于 10ml缓冲液 （与步骤 1中相同的缓冲液） ， 得到待测溶液。

3、 检测步骤 2得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施例 1 的 步骤四的 3。

采用 PH8. 0的 Tri s-HCl缓冲液时， Chi92蛋白的酶活最高， 待测溶液 的酶活为 67. 640U/ml。计算采用其它缓冲液时待测溶液与最� �酶活相比的 相对酶活， 见图 5。 pH6. 0-9. 0时， Chi92蛋白保持 80 %以上的相对酶活。

二、 pH稳定性

1、 用缓冲液溶解待测干粉 （每 5mg干粉溶于 lml缓冲液） ， 4°C静置 2h 后作为待测溶液。 分别采用以下缓冲液： pH3. 0-8. 0的 0. 2mmol/L柠檬酸-磷 酸氢二钠缓冲液和 PH9. 0-12. 0的 0. 2mol/L甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液。

2、 1%胶体几丁质的制备 同实施例 1的步骤四的 1。

3、 检测步骤 1得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施例 1 的 步骤四的 3。

相对酶活结果见图 6。 Chi92蛋白在 pH范围为 4. 0-9. 0间都很稳定， 保持 70%以上的酶活。

三、 最适温度

1、 将 50mg待测干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠 -柠檬 酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

3、 检测步骤 1 得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法参见实施例 1 的步骤四的 3 (差异仅在于采用不同的反应温度） 。

采用 40°C的反应温度时， Chi92蛋白的酶活最高， 待测溶液的酶活为 86. 861U/ml。 计算采用其它反应温度时待测溶液与最高酶活 相比的相对酶 活， 见图 7。 在 30°C -45 °C时， Chi92蛋白保持 60 %以上的相对酶活。

四、 温度稳定性

1、 将 50mg待测干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠 -柠檬 酸缓冲液， 在不同温度 （40°C或 50°C ) 下分别保温 20、 40、 60、 80、 100 或 120分钟后作为待测溶液。

2、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

3、 检测步骤 1得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施例 1 的 步骤四的 3。

相对酶活结果见图 8。 40°C下处理 60min后， Chi92蛋白仍然保留 80% 以上的相对酶活， 温度稳定性较好。 实施例 4、 金属离子及化学试剂对 Chi92蛋白作为几丁质酶酶活的影 响

将实施例 2的步骤一的 2得到的干粉作为待测干粉（主要组分为 Chi92 蛋白） ， 进行本实施例的实验。 1、 将 50mg待测干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠 -柠檬 酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

3、 在步骤 2制备的 1%胶体几丁质中加入化合物， 使化合物的浓度为 lmmol/L 或 5mmol/L。 分别采用以下化合物： KC1 (提供 K ⁺ ) 、 NaCl (提供 Na ⁺ )、 CaCl ₂ (提供 Ca ²⁺ )、 LiCl (提供 Li ⁺ )、 CoCl ₂ (提供 Co ²⁺ )、 CrCl ₃ (提 供 Cr ³⁺ )、 NiCl ₂ (提供 Ni ²⁺ )、 CuCl ₂ (提供 Cu ²⁺ )、 MgCl ₂ (提供 Mg ²⁺ )、 FeCl ₃ (提 供 Fe ³⁺ )、 MnCl ₂ (提供 Mn ²⁺ )、 PbCl (提供 Pb ⁺ ) 、 ZnCl ₂ (提供 Zn ²⁺ )、 AgN0 ₃ (提 供 Ag ⁺ )、 EDTA, SDS和 β -巯基乙醇。

3、 将步骤 2得到的每种不同体系进行如下检测：

( 1 ) 取 4支试管， 分别加入 0. 25mL待测溶液和 0. 25mL步骤 2得到 的体系， 其中三支试管于 40°C水浴 lh， 另外一支于 4°C放置， 作为对照；

( 2 )取完成步骤（1 ) 的试管， 每管加入 lmL DNS溶液， 沸水浴 5min， 然后用蒸馏水补齐至 2. 5ml， 离心取上清液， 在 540nm测定 0D值， 对照标 准曲线方程并计算酶活。

4、 CK组： 检测步骤 1得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施 例 1的步骤四的 3。

将各组处理中待测溶液的几丁质酶酶活与 CK 组待测溶液的几丁质酶 酶活的比值作为相对酶活， 结果见表 2。 Mn ²⁺ 离子对 Chi92蛋白的酶活有一 定的促进作用， Cr ³⁺ 、 Cu ²⁺ 等对 Chi92蛋白的酶活有一定的抑制作用， 高浓 度 （5mM) 的 EDTA (螯合剂） 几乎完全抑制 Chi92蛋白的酶活， 但低浓度 ( ImM) 时， 对 Chi92蛋白的酶活基本没有影响。

表 2 化学试剂及金属离子对 Chi92蛋白的几丁质酶活力的影响

Na ⁺ 98. 6 ± 0. 6

ΝΓ 81. 5 ± 1. 4 80. 5 ± 1. 9

Cu ²⁺ 33. 9 ± 1. 2 35. 7 ± 6. 8

Mg ²⁺ 82. 7 ± 0. 7

Fe ³⁺ 23. 0 ± 0. 6 20. 0 ± 6. 1

Mn ²⁺

Pb ²⁺ 69. 4 ± 2. 6 65. 3 ± 4. 4

Ag ⁺ 91. 0 ± 2. 0 115. 2 + 4. 3

EDTA 100. 1 ± 1. 0 11. 8 ± 1. 2

SDS 73. 7 ± 1. 5 87. 3 ± 3. 5 巯基乙醇 o

实施例 5、 Chi92蛋白作为几丁质酶的底物特异性

+1

一、 底物的制备 1+

o

1、 1%胶体几丁质的制备 o 同实施例 1的步骤四的 1。

2、 1%大麦 β -葡聚糖的制备

lg大麦 β -葡聚糖溶于 100ml蒸馏水中， 10CTC水浴 3min， 静置至室 温， 5000rpm离心 5min， 去除沉淀， 上清的浑浊物即为 1 o o o%大麦 β -葡聚糖， 4°C保存。 o o

+1 +1 +1 +1

3、 1%羧甲基纤维素

lg羧甲基纤维素缓慢加入到 100ml蒸馏水中，边加边使用磁力搅拌器 搅拌， 得到均一的浑浊物， 即为 1%羧甲基纤维素， 4°C保存。

4、 虾壳粉和蟹壳粉的制备

取虾壳或蟹壳， 洗净， 干燥后打为粉末， 过 100目筛， 取粉末， 然后 用 5% HC1水溶液浸泡粉末 2h以去 Ca ²⁺ ，水洗至中性，干燥；然后用 10% Na0H 水溶液浸泡粉末， 沸水浴 2h 以去蛋白， 水洗至中性， 干燥； 得到的粉末 即为虾壳粉或蟹壳粉。

二、 Chi92蛋白作为几丁质酶的底物（一些 β -1, 4-糖苷键连接的多糖） 特异性

1、 将 50mg 实施例 2 的步骤一的 2 得到的干粉溶于 10ml pH6. 0、

0. lmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 用步骤一制备得到的各种底物、 几丁质、 羧甲基纤维素、 壳聚糖、 乙二醇几丁质或大麦 β -葡聚糖代替 1%胶体几丁质， 方法参见实施例 1的 步骤四的 3。

结果见表 3。 结果表明， Chi92蛋白对 1%胶体几丁质、 1%大麦 β -葡 聚糖、 1%羧甲基纤维素有不同程度的降解能力， 而与羧甲基纤维素粉末、 壳聚糖粉末、 虾壳粉末、 几丁质粉末、 大麦 β -葡聚糖粉末以及乙二醇几 丁质粉有微弱的降解能力， 但与蟹壳粉反应后没有检测到还原糖的产生。

Chi92蛋白对不同底物的降解能力

实施例 6、 蛋白酶及罗非鱼肠液对 Chi92蛋白几丁质酶酶活的影响 将实施例 2的步骤一的 2得到的干粉作为待测干粉（主要组分为 Chi92 蛋白） ， 进行本实施例的实验。

1、配制如下各种蛋白酶溶液：将胰蛋白酶溶� � pH7. 0, 0. lmol/L Tris-HCl 缓冲液； 将 α -糜蛋白酶溶于 pH7. 0、 0. lmol/L Tris-HCl缓冲液； 将胃蛋白 酶溶于 pH2. 0、 0. lmol/L Tris-HCl缓冲液。

2、 制备罗非鱼肠液

取购自超市的罗非鱼， 解剖， 使用 PBS缓冲液（NaCl 8 g/L、 KCl 0. 2 g/L、

Na ₂ HP0 ₄ 1. 44 g/L、 KH ₂ P0 ₄ 0. 24 g/L， 溶剂为蒸馏水， pH 7. 2 ) 冲洗肠道， 收 集冲洗液 （含有溶于 PBS缓冲液的肠道内容物）， 即为罗非鱼肠液。 使用时， 采用 PBS缓冲液将罗非鱼肠液稀释至目标浓度 （浓度以蛋白浓度计）。

3、 将 50mg待测干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠 -柠檬 酸缓冲液， 得到待测溶液。 4、 1%胶体几丁质的制备

同实施例 1的步骤四的 1。

5、 在步骤 4制备的 1%胶体几丁质中加入蛋白酶溶液或罗非鱼肠液� ��

6、 酶活检测

( 1 ) 取 12支试管， 分别加入 0. 25mL待测溶液和 0. 25mL步骤 5得到 的溶液（蛋白酶或罗非鱼肠液中的蛋白质与 Chi92蛋白的质量比为 1 : 10 )， 试管 1-3 于 4CTC水浴 0min，试管 4于 4°C放置 Omin (对照）， 试管 5-7于 4CTC水浴 30min，试管 8于 4°C放置 30min (对照），试管 9-11 于 4CTC水浴 60min,试管 12于 4°C放置 60min (对照）。

( 2 )取完成步骤（1 ) 的试管， 每管加入 lmL DNS溶液， 沸水浴 5min， 然后用蒸馏水补齐至 2. 5ml， 离心取上清液， 在 540nm测定 0D值， 对照标 准曲线方程并计算酶活。

7、 CK组： 检测步骤 3得到的待测溶液的几丁质酶酶活， 方法同实施 例 1的步骤四的 3。

将各组处理中待测溶液的几丁质酶酶活与 CK 组待测溶液的几丁质酶 酶活的比值作为相对酶活， 结果见图 9。 胃蛋白酶和胰蛋白酶对 Chi92蛋 白的酶活基本没有影响， α -糜蛋白酶和罗非鱼肠液作用 60min 后 Chi92 蛋白还能保持 40%以上的相对酶活， 表明 Chi92蛋白可以作为养殖业中的 饲料添加剂， 降解饲料中的几丁质类物质 （如虾壳粉、 酵母菌粉等， 虾壳 粉和酵母菌粉均为鱼类饲料中的常见成分） ， 降低动物饲料的成本。 实施例 7、 Chi92蛋白作为几丁质酶降解酵母细胞壁的能力

1、 将 50mg 实施例 2 的步骤一的 2 得到的干粉溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、 ChiCD3蛋白干粉的制备方法： 取专利 "几丁质酶 ChiCD3及其编码 基因和应用" （申请号为 201110092079. 1 ) 中的实施例 2的步骤一的 2的

( 2 ) 中制备得到的 ChiCD3蛋白液， 冷冻干燥， 得到 ChiCD3蛋白干粉。 ChiCD3蛋白干粉， 溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲 液， 得到待测溶液。

3、 C6137蛋白为购买于 Sigma公司的几丁质酶蛋白。 C6137蛋白溶于 10ml pH6. 0、 0. lmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

4、 酵母菌粉的制备： 将毕赤酵母 的单菌落接种于 20mL YPD液 体培养基， 30°C、 ISOrpm振荡培养 48h， 然后以 0. 1% (体积比） 接种量转 接入装有 200mL YPD液体培养基的 1L三角瓶中， 30°C、 ISOrpm 振荡培养 2d， 取整个培养体系， 10°C、 12000rpm离心 10min， 收集菌体沉淀， 用 PBS 缓冲液冲洗 2次，然后真空冷冻干燥机中干燥，获得的粉� �即为酵母菌粉。 将酵母菌粉于 80°C烘箱处理 30min后即为热灭活酵母菌粉。 将 lg酵母菌 粉溶于 lOOmL蒸馏水， 得到 1%酵母菌粉溶液。 将 lg热灭活酵母菌粉溶于 lOOmL蒸馏水， 得到 1%热灭活酵母菌粉溶液。

5、 几丁质酶降解酵母菌粉的几丁质酶活性的测定

分别将步骤 1制备的待测溶液、 步骤 2制备的待测溶液和步骤 3制备 的待测溶液进行如下测定：

( 1 ) 取 12支试管， 分别加入 0. 25mL待测溶液和 0. 25mL 1%热灭活酵 母菌粉溶液，试管 1-3 于 4CTC水浴 Oh，试管 4于 4°C放置 Oh (对照）， 试管 5-7于 4CTC水浴 1. 5h，试管 8于 4°C放置 1. 5h (对照），试管 9-11 于 4CTC水 浴 3h，试管 12于 4°C放置 3h (对照）；

( 2 )取完成步骤（1 ) 的试管， 每管加入 lmL DNS溶液， 沸水浴 5min， 然后用蒸馏水补齐至 2. 5ml， 离心取上清液， 在 540nm测定 0D值， 对照标 准曲线方程得到还原糖浓度。

还原糖含量浓度见图 10。 反应 1. 5h和 3h后， Chi92蛋白组的还原糖 含量高于 C6137蛋白组和 ChiCD3蛋白组， 即 Chi92蛋白具有降解酵母细 胞干粉的能力， 且能力高于 C6137蛋白和 ChiCD3蛋白。

用 1%酵母菌粉溶液代替 1%热灭活酵母菌粉溶液进行上述步骤， Chi92 蛋白、 C6137蛋白和 ChiCD3蛋白均没有降解酵母细胞干粉的能力。

6、 Chi92蛋白降解热灭活酵母菌粉的能力

( 1 )取 18支试管，分别加入 0. 25mL步骤 1制备的待测溶液和 0. 25mLl% 热灭活酵母菌粉溶液， 试管 1-3和试管 10-12于 4CTC水浴 0h，试管 4-6和 试管 13-15于 40°C水浴 1. 5h，试管 7-9和试管 16-18 于 40°C水浴 3h;

( 2 ) 取完成步骤 （1 ) 的试管 1-9， 每个试管加入 lmL DNS溶液， 沸 水浴 5min， 然后用蒸馏水补齐至 2. 5ml， 离心取上清液， 在 540nm测定 0D 值， 对照标准曲线方程得到还原糖浓度。

( 3 ) 取完成步骤 （1 ) 的试管 10-18， lOOOOrpm离心 10min， 取上清， 用葡萄糖检测试剂盒 （北京利文生物技术有限公司， 产品标准编号： YZB/ 京 0748-2009 ) 检测葡萄糖浓度。

非葡萄糖的还原糖的浓度 =还原糖浓度-葡萄糖浓度。

结果见图 11。 反应 1. 5h和 3h时， 葡萄糖的产量分别约占总还原糖产 量的 18% 和 25% 。非葡萄糖的还原糖的产量极显著的高于葡萄 糖的产量。

7、 Chi92蛋白作为几丁质酶降解热灭活酵母菌粉降� ��产物的制备和表 征

取 500 μ L 实施例 7的步骤 1 的 Chi92蛋白溶液和 500 μ L 1%热灭活 酵母菌粉溶液， 混合， 4CTC水浴孵育 0h、 1. 5h或 3h， 然后沸水浴 10min， 冷却至室温后 lOOOOrpm离心 10min，收集沉淀，在真空冷冻干燥机中干燥， 收集干粉， 进行扫描电镜分析。

结果见图 12， A、 B、 C分别为水浴孵育 0h、 1. 5h和 3h后得到的干粉； 1和 2分别为放大 3000倍和 8000倍， 箭头指向的是细胞壁出现的小孔。 Oh的热灭活酵母菌粉， 少数细胞表面存在孔状。 水浴孵育 1. 5h后， 细胞 壁表面小孔的数量增加。 水浴孵育 3h 后， 细胞壁表面小孔的数量和深度 均明显增加。

结果表明， Chi92 蛋白可以作为养殖业中的饲料添加剂， 降解饲料中 的酵母菌粉等（酵母菌粉为鱼类饲料中的常见 成分）， 降低动物饲料成本。 工业应用

本发明提供的巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92， 具有高效生产 Chi92蛋白 的能力。 巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92的发酵产物 （Chi92蛋白） ， 具有几 丁质酶活性， 其比活力为 809. 207U/mg， 对胶体几丁质的 ^值和 L值分 别为 3. 967mg/mL禾卩 161(^mol/ (mg · h)。 所述发酵产物 （Chi92蛋白） 作 为几丁质酶具有如下优点： 最适反应温度为 40°C， 并且在 30-45°C间保持 60. 0%以上的活性； 具有良好的热稳定性， 40°C处理 60min后， Chi92蛋白 仍然保留 80%以上的相对酶活； 最适反应 pH为 8. 0， 在 pH6-9范围内酶活 性可以维持在 80%以上； 具有良好的 pH稳定性； 具有较高的比活力。 本发 明对现代几丁质产业发展具有重要意义。