【기술분야】 . 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】 염증성 질환이란 여러 외부 자극 혹은 내부 요인으로 인해 인체 여러 장기나 조직에 염증성 면역세포의 침윤과 더불어 부종, 발적 및 동통이 나타나고 조직학적 변화를 보이는 상태를 말한다. 이러한 염증은 손상조직과 이동하는 세포 ( 용 061 1 )로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자들은 염증 과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만， 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.

이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치료제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며， 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환 예방 또는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

활성산소를 제거할 뿐만 아니라 다른 항산화 효소가 작용할 수 있도록 하여 세포를 보호하는 기능을 가지는 S0D( super oxide di smutase)는 구리와 아연 원자를 가지고 있는 Cu/Zn S0DCS0D 1)， 망간 원자를 가지고 있는 Mn-S0D(S0D 2) 및 세포 표면 또는 세포 외액에 존재하는 EC-SOD(extracel lular superoxide dismutase)로 구분된다. 그 중 EC-S0D 단백질인 S0D3(superoxide di smutase 3， extracel lular)는 세포 외부로 분비되며 인간의 정상형 (wi ld-type , WT) S0D3 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank database의 NP_003093.2 등의 accession number로 공지되어 있다. 또한 인간의 S0D3 단백질을 암호화하는 mRNA의 염기서열은 ■_003102.2 등의 accession number로 공지되어 있다.

종전 요(©3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해서 공지된바 있다 (한국공개특허 10-2017- 0032872 참고) . 하지만 줄기세포를 이용한 치료제는 생명윤리 문제뿐만 아니라 분화조절의 어려움， 변이발생， 암세포화 등 부작용 발생의 위험성에 대한 이론적 우려가 꾸준히 제기되고 있어 임상시험 적용 및 제품 상용화에 많은 어려움을 가지고 있다. 이러한 부작용은 투여 즉시 발생하기보다는 수개월 내지 수년에 걸쳐 발생할 가능성이 있으므로， 장기간에 걸쳐 부작용 발생 여부를 확인해야 한다. 더군다나 줄기세포들을 채취한 후 많은 조작과정을 수행하게 되는데, 그 과정에서 세포의 특성이 변할 수도 있고， 박테리아나 바이러스 등 질병을 유발하는 병원체에 감염될 수도 있다. 특히 줄기세포의 경우, 살아있는 유기체이기 때문에 관리는 더욱더 어렵다.

실제 임상 또는 제품화를 위해서는 효능이 우선시 되어야 하고， 효능이 동등한 경우에는 시술의 용이성， 가격 등이 경쟁력이 있어야 한다. 하지만 줄기세포를 이용한 치료제는 개인별 맞춤 시술이어야 하므로 고비용일 수밖에 없다. 또한 상기와 같은 장기간에 걸친 부작용 발생 가능성 추적과 원료 관리의 어려움은 제품 가격 상승의 요인이 된다. 따라서 줄기세포를 이용한 치료제의 장점을 그대로 보유할 뿐만 아니라， 부작용의 위험이 적으며 쉬운 보관을 통해 가격이 저감된 치료제의 개발이 필요하다.

【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 이에， 본 발명자들은 부작용은 현저히 낮으면서 염증성 질환에 있어 뛰어난 치료 효과를 갖는 치료제에 대하여 연구하던 중, 요(©3가 과발현된 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피를 가진 개체에 투여시 면역조절과 항산화 효과 등의 기능이 현저하게 향상되어 아토피가치료되는 것을 발견하여 본 발명을완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3( super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 개선용 화장료조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용 화장료조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3( super oxi'de di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용화장료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 엤예를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합발현 벡터로줄기세포를 형질감염 시키는 단계; 및 상기 형질감염된 줄기세포를 원심분리하여 세포외 소낭을 추출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아토피 예방또는 치료용 약학조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide dismutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포유래 세포외 소낭의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 아토피 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로포함하는 아토피 피부염 예방또는치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 ,

S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 ,

S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로포함하는 아토피 피부염 예방또는 개선용 화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxi de di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 엤此를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 줄기세포를 형질감염 시키는 단계; 미 상기 형질감염된 줄기세포를 원심분리하여 세포외 소낭을 추출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는， 아토피 예방또는 치료용 약학조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 줄기세포유래 세포외 소낭의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을특징으로 하는 아토피 질환의 치료 방법을 제공한다.

이하본 발명을상세히 설명한다.

본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(31¾)610 6 51111 336 3, 엤예)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자는 종전 S0D3를 과발현하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과를 확인한 바 있다 (한국공개특허 10-2017-0032872 참고). 그러나 줄기세포 기반의 치료제는 상기에 기재한 바와 같이 고가의 가격， 장기간의 부작용 발생 가능성 추적과 원료 관리의 어려움으로 인해 임상 시험뿐만 아니라 제품의 상용화에 많은 어려움이 있다. 따라서 본 발명자는 줄기세포를 이용한 치료제의 장점을 그대로 보유한 치료제에 대해 연구하던 중， S0D3 과발현 세포 유래 세포외 소낭 (extracel lular vesicle, EV)가 S0D3 과발현 줄기세포의 장점을 그대로 보유한 것을 확인하였다. 본 발명에서 사용된 “세포외 소낭” 은 세포가 세포외 환경에 다양한 막 (membrane) 유형의 소포체를 방줄하는데, 통상 이러한 방줄 소포체들을 의미한다. 세포외 소낭은 세포막 유래 소포체, 엑토좀 (ectosomes) , 쉐딩 소포체 (shedding vesicles) , 마이크로파티클 (microparticles) , 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다. 본 발명에서는 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 세포외 소낭은 S0D3를 과발현하는 줄기세포 유래로， 상기 S0D3는 단백질로 발현될 수 있고， 상기 S0D3 단백질은 음이온의 부동 변화 (dismutation) 반응을 촉매하고， 세포 외부로 분비되어 세포외 기질 (extracel lular matrix)에 존재하며， 항혈관신생， 항화학주성, 항암활성 등의 효과를 나타낸다.

본 발명에서 S0D3는 인간 및 마우스를 포함하는 포유동물， 바람직하게는 인간으로부터 유래한 단백질을 의미하며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 인간의 정상형 S0D3 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 재조합 S0D3 단백질 (209E-SOD3)의 아미노산서열을포함하는 것일 수 있다. 상기 인간의 정상형 S0D3는 N-말단 부위의 개시 메치오닌 아미노산을 포함하여 18번째의 알라닌까지는 시그날 펩타이드로 되어 있으며, 활성화된 S0D3는 상기 시그날 펩타이드가 제거된 222개의 아미노산으로 구성된다. S0D3의 C-말단 영역 (아미노산 잔기 210번〜 215번)에는 헤파린 결합 도메인 (hepar in binding domain)을 가지고 있다 ^' . 시그널 펩타이드를 포함하는 240개의 아미노산으로 이루어진 전체 길이의 인간 S0D3의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 표시된 바와같다.

또한본 발명에서의 S0D3는 전체 길이의 인간 S0D3 중 N-말단부위의 시그날 펩티드 및 C-말단 부위의 헤파린 결합 도메인이 포함된 13개의 아미노산 (아미노산 잔기 210번〜 222번)이 제거된 209개의 아미노산으로 이루어진 것일 수도 있다. 상기 시그널 펩타이드와 헤파린 결합 도메인이 제거된 S0D3 단백질은 본 발명에서 209E- S0D3 또는 209E로 지칭할 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 209E-S0D3는 항- S0D3 항체와도 결합할 수 있으며， 정상형 S0D3와 동일한 효소 활성 및 R0S 제거 활성을 갖는 것으로 확인된 바 있다 (대한민국공개특허 제 10-2008-0108876호) .

본 발명에서의 S0D3는 정상형 S0D3 또는 209E-S0D3 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 기능적 동등물 ( funct ional equivalent ) , 기능적 유도체 (funct ional der ivat ive) 및 상기 S0D3 단백질의 단편이 모두 포함된다. 실질적으로 동등한 생리 활성이란 정상형 S0D3와 동등한 수준의 효소 활성 및/또는 세포외 분비 특성과 세포내 투과성을 갖는 것을 의미하며, S0D3와 동등한 효소 활성으로 인하여 줄기세포， 바람직하게는 중간엽 줄기세포에서 과발현되었을 때 줄기세포의 면역 및 염증 조절능력을 향상시키게 된다. 상기 줄기세포의 면역 및 염증조절능력이란구체적으로는 염증으로 인한 면역 세포의 침윤 억제， 전염증성 T 세포의 증식과 분화 및 전염증성 매개체/사이토카인의 발현의 억제， 염증조절능을 갖는 Treg 세포의 증식과 분화 및 Treg 관련 사이토카인의 발현 증가, NFkB 신호전달계의 인산화 억제 등을 의미하며， 본 명세서에서 서술한 본 발명의 S0D3를 과발현하는줄기세포가갖는특성에서 기재한바와같다.

상기 엤此의 기능적 동등물은 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상， 바람직하게는 80% 이상， 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (homology)을 갖는 폴리펠티드일 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물은 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산 (Gly, Ala, Pro) , 소수성 아미노산 (lie, Leu, Val) , 방향족 아미노산 (Phe, Tyr , Trp) , 산성 아미노산 (Asp, Glu) , 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gin, Asn) 및 황 함유 아미노산 (Cys， Met) . 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 S0D3 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 S0D3의 아미노산 서열의 양 말단또는서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 예를 들어 209E-S0D3과 같이 S0D3의 효소 활성에는 영향을 주지 않으면서 S0D3 전체 길이의 일부분이 제거된 펩티드일 수 있으며， S0D3 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 SNP(smal 1 nucleotide polymorphism) 등 S0D3의 다형성 (polymorphism) 단백질일 수도 있다.

본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명의 S0D3 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 여기 한정되는 것은 아니지만， 본 발명의 S0D3 단백질의 안정성， 세포내 투과성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한구조 변경이 이에 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 세포외 소낭은 此를 과발현하는 줄기세포 유래로, 상기 줄기세포는 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)”는 뼈 (bone), 연골 (carti lage) , 지방조직 (fat tissue) , 힘줄 (건)， 신경조직 (nerve tissue) , 섬유아세포 (fibroblast) 및 근육세포 (muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포 (multipotent progenitor)를 말한다. 본 발명에서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은상태, 즉줄기세포 상태로 조성물 중에 포함된다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며 바람직하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈， 태반， 골수， 지방조직, 근육， 양수 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대혈 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며， 가장 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 제대혈 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 분화 능력 및 증식 능력이 뛰어난특징을지닌다.

본 발명에서 사용된 용어 제대혈은 포유동물의 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 말한다. 상기 제대혈은 출산시 공여자의 제대정맥으로부터 용이하게 채취할 수 있다. 보다 구체적으로， 정상질식분만의 경우에는 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있다. 또는 제왕절개의 경우에는 출산 후 태반 역시 자궁밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.

본 명세서에서, 태반에서 채취된 줄기세포는 "태반 줄기세포'’라는 용어로 기재될 수 있고, 이는 형상, 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포로서 조직 배양 기질 (t issue culture substrate) , 예를 들어 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴 피복 조직 배양판에 부착하는 것을 말한다. 그러나본 명세서에서 "태반줄기세포"라는 용어는 영양막 세포 (trophoblast )를 가리키는 것은 아니다. 세포는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나, 예를 들어 적어도 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력 등을 갖추고 있으면 줄기세포이다.

태반 또는 제대혈로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 어떤 분리방법에 의해서도 분리될 수 있다. 예를 들면, 밀도차를 이용한 분리법 (density gradient fract ionat ion) , 면역선택 ( immunose lect ion) 및 감별 부착 분리법 (di f ferent ial adhesion separat ion) 등이 있다. 제대혈으로부터 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하는 방법은 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할수 있다.

상기에서 분리된 중간엽 줄기세포의 배양은 당업계에 공지된 세포 배양용 배지에서 수행할 수 있으며, 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나， DMEM 배지, McCoys 5A 배지, Eagle ' s basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지， Ham' s F-12 배지， Iscove’s modi f ied Dulbecco’s 배지, Liebovi tz ' L-15 배지, RPMI 1640 배지 KSB-3 basal media등이 있다. 또한, 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있는데, 우태아혈청, 말 또는 인간 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용할 수 있다.

분리 또는 배양된 줄기세포는 사용 전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호 아근 )!!) 처리한 후 냉동 보관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 엤, 글리세롤， 폴리비닐피롤리돈， 폴리에틸렌 글리콜， 알부민, 덱스트관， 수크로스， 에틸렌 글리콜， 卜에리스리톨, I) -리비톨, I)-만니톨 , I) -솔비톨， 卜이노시톨, I)-락토스 또는 콜린 클로라이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 엤此를 과발현하는 줄기세포는 此를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조 ^’ 합 발현 벡터를 줄기세포에 형질도입시켜 수득한 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 ⁿ 발현 (expression) "은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하며, “과발현 (overexpression) "은 정상적인 상태 또는 일반적인 상태보다 특정 유전자의 발현의 수준이 과도하게 증가한 것을 의미한다. 본 발명에서 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 구체적으로는 S0D3 단백질의 발현 수준이 증가하여 S0D3 단백질의 활성이 증가되어 있는 줄기세포이다. 본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드 (1)01 1111(：1601；1(16) " 또는 핵산은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드山 ) 또는 리보뉴클레오티드 ( 시를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도포함된다.

줄기세포에서 S0D3를 과발현시키는 가장 일반적인 방법은 S0D3 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 줄기세포에 인위적으로 또는 실험적으로 도입하여 S0D3 유전자의 복제개수 (copy number)를 증가시키는 것이다. 원래의 세포가 가지고 있던 것이 아닌 외인성 (exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내부로 주입하는 것을 형질감염 (transfect ion) , 그리고 이로 인하여 세포의 유전적 형질이 변화되는 현상을 형질전환 (transformat ion)이라고 한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터를 통하여 세포 내부로 주입되는 과정을 형질도입 (transduct ion)이라고 부른다. 본 명세서에서는 용어 ‘형질전환’ ,

‘형질감염’ 그리고 ‘형질도입’ 이 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입되어 정상형과 다른 유전적 형질을 갖게 된 것 또는 그러한 과정을 일컫는 것으로서 유사한의미로사용된다.

본 발명에서 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 포유류에서 유래한 S0D3 유전자일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 인간의 정상형 S0D3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 209E-S0D3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 就 ⁾ D3는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있다. 또한 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는 서열번호 7로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는서열번호 8로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있다.

또한 상기 此를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간의 엤此의 염기서열, 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 표시되는 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 인간 엤 를 암호화하는 2020/085533 1»（：1^1{2018/012712

12 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 비교 대상이 되는 임의의 다른 염기서열을 최대한 대응되도록 정렬하고， 당해 기술분야에서 통상적으로 이용되는 분석 방법과 알고리즘을 이용하여 서열을 비교 분석하는 경우， 최소 70% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 3孤3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열에 의해 암호화되는 단백질은 8003 단백질， 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 기능적 동등물일 수 있다. 5003 단백질의 기능적 동등물에 대하여서는 본 명세서에서 앞서 서술한 바와 같다.

본 명세서에서 ’’재조합 발현 벡터’’란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산 ( 시을 발현할 수 있는 벡터로서， 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된 (애 크비 "이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 쇼를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 ( £1111 101131 1 止^용6)되어 있는 것을 말한다. 즉, 단백질 또는 핵산 서열이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 例쇼를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을사용한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터， 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 바이러스에서 유래한 벡터를 사용할 수 있다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 081^322 , _? 8모325 , 1)1018 및 1)1019 , _? £1-225(+) ) , 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (1)仰110 및 ?5) 및 효모 유래 플라스미드竹묘1)13 , ^2^ 및 ¥0?50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며， 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfect ion) , 미세주사， 형질도입 (transduct ion) , 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 ( l iposome-mediated transfect ion) , DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfect ion) , 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfect ion) , 전기천공법 (electroporat ion) , 유전자 종 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을유입시키기 위한공지의 방법에 의해 줄기세포 내로도입할수 있다.

본 발명에 따른 003를 과발현하는 줄기세포는 3(X ⁾ 3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 바람직하게는 전기천공법 또는 바이러스로 매개되는 형질도입 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 주입하여 형질전환한 것일 수 있다.

또한 본 발명의 줄기세포는 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 다음의 단계를 거쳐 제조될 수 있다: (a) 셔틀벡터， S0D3를 암호화하는 핵산 및/또는 단백질 형질도입 도메인이 작동가능하게 연결된 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 S0D3 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 S0D3발현 재조합바이러스로 중간엽 줄기세포를 감염시키는 단계.

본 발명의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터， 아데노바이러스 벡터， 아데노연관바이러스 ( \0 벡터, 벡시니아바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

따라서 본 발명은 (©3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로줄기세포를 형질감염 시키는 단계; 및 상기 형질감염된 줄기세포를 원심분리하여 세포외 소낭을 추출하는 단계;를 포함하는 것을특징으로 하는， 아토피 예방또는 치료용 약학조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 8003 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며， 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 ’약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 , 통상적으로 위장 장애 , 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분， 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러， 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다 . 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸-또는 프로필 과라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제 , 습윤제 , 감미제 , 향미제 , 유화제， 현믿 i제 등을 주가로 포함할 수 있다 . 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington’ s Pharmaceut ical Sciences , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995) .

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내， 경막내， 심장내, 경피, 피하， 복강내， 비강내, 장관， 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 보다 바람직하게는 피하에 주입되는 것이나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. - 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제， 캡슐제， 액제， 겔제， 시럽제, 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈， 솔비톨， 만니톨， 자일리톨， 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와옥수수 전분, 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈， 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 · 셀룰로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피롤리돈등과 같은충전제가포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은항응집제， 윤활제 , 습윤제 , 향료, 유화제 및 방부제 등을추가로포함할수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제， 외용연고제， 오일제, 보습제, 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington’s Pharmaceut ical Science , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mul t iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 lkg 당 약 0.01 _// g 내지 10,000mg， 가장 바람직하게는 0.1/ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법， 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중， 건강 상태， 성별， 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한유효투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피성 피부염을 유도한 동물 모델에 처리하고 병변의 변화를 육안으로 평가한 결과 S0D3과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 처리하였을 때 가장증상이 개선된 것을 확인하였다（실시예 2-1， 도 3 참조）.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 본 발명에 따른 5003 과발현 줄기세포 유래 세포의 소낭을 아토피성 피부염을 유도한 동물 모델에 처리하고 병변의 중증도를 조직염색을 통해 평가한 결과， 외피（印 하미 ） 두께와 림프구 침윤 정도가 감소된 것을 확인하였다. 또한 아토피성 피부염의 만성화에 핵심적인 역할을 하는 비만세포의 침윤 또한 억제하는 것을 확인할수 있었다（실시예 2-2, 도 4내지 도 7참조）.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포의 소낭이 TNF-a, IL-1 |3 , IL-6과 같은 전염증성 사이토카인을 방출하는 면역세포에 미치는 영향을 확인한 결과， 본 발명에 따른 세포외 소낭의 처리에 의해 면역 세포인 말초혈액 단핵세포（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）의 증식을 억제하는 것을 확인할수 있었다（실시예 3, 도 8 및 도 9참조）.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭이 헬퍼 T세포（helper T cell） 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, Thl의 분화가 억제된 반면, Th2의 분화에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다（실시예 4-1, 도 W및 도 11참조）.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭이 전체적인 면역 반응과 타면역세포의 과도한활성화 억제에 핵심 역할을 하는 조절 T세포（regulatory T cell, Treg） 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 본 발명의 세포외 소낭은 뛰어난 Treg유도 능력이 있음을 확인하였다（실시예 4-2, 도 12참조）.

상기 실시예의 결과를 통해, 본 발명에 따른 8003 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭은 전염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포의 증식 억제, Treg 유도 효과를통해 아토피 피부염 치료효과를보이는 것을 확인하였다. 특히， 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭은 비만세포의 병변부위 침윤을 억제하며， 헬퍼 T 세포의 분화에 있어서 Thl의 분화는 억제하지만 Th2의 분화에는 영향을 미치지 않는유의미한결과를보였다. 아토피성 피부염은 대부분 묘와 연관된 면역기전에 의해 발병되는데， T 세포 이상에 의한 면역반응이 관여한다는 보고가 많으며， 헬퍼 T세포 (helper T cel l )의 역할이 중요하다고 알려져 있다. 헬퍼 T세포에는 헬퍼 T1 형 (Thl) 세포와 헬퍼 T2형 (Th2) 세포가 포함된다. Thl 세포가 분비하는 사이토카인은 세포매개형 면역반응에 관여하며， 아토피성 피부염의 경우 Thl 세포가 분비하는 인터페론- Y ( IFN- Y )과 같은 Thl 사이토카인의 분비가 감소하는 것으로 알려져 있다. 초기에 Th2 면역반응에 의하여 개시되어 점차 만성적인 Thl 면역반응으로 전환된다고 알려져 있다 (Am J Cl in Dermatol 5； 281-294, 2004 및 Nature 413:531-534, 2001 참고) .

따라서 이상의 세포 실험과 동물 실험 결과는 본 발명에 따른 8003 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭이 뛰어난 아토피 치료 효과를 보일뿐만 아니라, 만성적인 아토피 피부염의 치료 효과를 갖는 안전하고 효과적인 의약 후보 물질로 사용될 수 있음을 시사한다.

본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 개선용 화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 ,

S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 ,

S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭으로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용화장료조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물을 제조하기 위한 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭에 대하여서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 화장료 조성물은 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물 (화장수, 크림， 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일) , 색조 화장품 조성물 (화운데이션， 립스틱， 마스카라， 메이크업 베이스)， 두발 제품 조성물 (샴푸, 린스， 헤어컨디셔너， 헤어젤) 및 비누등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제， 피부 침투 증강제， 착색제， 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한， 향료， 색소, 살균제, 산화방지제， 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며， 물성개선을 목적으로 점증제， 무기염류， 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면， 본 발명의 화장료조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형 (0/W)의 크림베이스에 S0D3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료， 킬레이트제, 색소， 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄， 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 _. 있다. 본 발명의 화장료조성물에 함유되는 S0D3 과발현 줄기세포유래 세포외 소낭의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001 중량% 미만에서는 목적하는 아토피 피부염 치료 효과를 기대할 수 없고， 10 중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을수 있다.

본 발명은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3, S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭의 용도를 제공한다.

본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 아토피 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 ‘유효량’ 이란 개체에게 투여하였을 때， 아토피 피부염 질환의 개선， 치료， 예방， 검출， 진단 또는 아토피 피부염 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 ‘개체’ 란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는상기 효과가필요한환자 ) 일 수 있다. 본 발명의 상기 ‘치료’ 는 아토피 피부염 질환 또는 아토피 피부염 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 아토피 피부염 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 아토피 피부염 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 을 포함하는 (compr i sing)’ 이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’ 과동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 로 구성되는 (consi st ing of )’ 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는 (essent i al ly consi st ing of )’ 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을포함하는 것을 의미한다.

【발명의 효과】 따라서, 본 발명은 으孤3 과발현 줄기세포 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 전염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포의 증식 억제， 竹6용유도 효과를 통해 아토피 피부염 치료 효과를 보이며， 비만 세포의 병변부위 침윤 억제 및 ¾1 분화 억제 효과를 보여 아토피 피부염의 만성화 예방또는 만성화된 아토피 피부염 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 【도면의 간단한설명】 도 1은 엤的를 과발현시킨 제대혈 줄기세포의 3003 단백질 발현량을 확인한 결과이다 7 : 세포 계대를 7번 넘겨 배양한 세포, 11192/197/218 : 공여자에 따른 세포 번호) . 과발현시킨 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭의 엤況 단백질 발현량을 확인한 결과이다.

도 3 중 (크)는 아토피 피부염 동물 모델을 제조 순서에서, 8003 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭의 투여 날짜를 설정한 것이고， ( 는 상기 세포외 소낭의 투여에 의한 아토피성 피부염의 병변 변화를 확인한 결과이다.

도 4는 S0D3 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피 동물 모델에 투여한 후 병변의 중증도를 조직 염색을 통해 확인한 결과로, 외피 (epidermi s)의 두께를 확인한 결과이다.

도 5는 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피 동물 모델에 투여한 후 병변의 중증도를 조직 염색을 통해 확인한 결과로, 림프구의 확인한 결과이다.

도 6은 3抑3 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피 동물 모델에 투여한 후 조직 염색 결과를 수치화한 그래프로， 도 6 중 (3)는 외피의 두께를 확인한 결과를 수치화한 결과이고, ( 는 림프구의 침윤을 수치화한 결과이다.

도 7은 S0D3 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 아토피 동물 모델에 투여한 후 아토피성 피부염의 만성화에 핵심적인 역할을 하는 비만세포의 병변부위 침윤 정도를 톨루이딘 블루 (Toluidine blue) 염색을 통해 확인한 결과이다. 도 8 및 도 9는 엤예 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 정상 혈액에서 분리한 ?8¾犯에 처리한후, 요 (:의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

도 10 및 도 11은 S0D3 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 PBMC에 서 분리한 미접촉 T 세포 (naive T cel l )에 처리한 후， 헬퍼 T세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과이다. .

도 12는 8003 과발현 제대혈 줄기세포 유래 세포외 소낭을 미접촉 I 세포에 처리한후, ^분화에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

MSC의 배양 및 동정 인간의 제대혈에서 유래한 중간엽 줄기세포 (hUCB-MSC)는 제공자의 동의하에 인간 탯줄의 혈액 샘플로부터 수집하였다. 탯줄 혈액 샘플은 채취 후 항응고제로 작용하는 구연산 인산 포도당을 포함하는 혈액수집팩에 보관하였다. 실험을 위한 처리는 24시간 이내에 실시하였다. F i co 1 1 -Paque PLUS 농도 구배 (Amersham Biosciences)하에 원심분리하여 단핵 세포 분획을 분리하였다. HBSSCei l Biotech Services)로 세척하고， 저혈당 Dulbecco의 변형된 Eagle 배양액 (DMEM, Invitrogen Corp) , 20%우태아 혈청 (Gibco-BRL) , 2mM L_글루타민, ImM 피루브산 나트륨 및 1%의 항생제/항진균제 (Li fe Technologies)로 재현탁하였다. 항생제/항진균제는 100U/ml 페니실린, 100 u g/ml 스트렙토마이신, 25 y g/ml의 암포테리신표를 포함한다. 7일 후， 부착되지 않은 세포는 제거하고， 부착된 세포를 두 가지 배양액을 일주일마다 바꿔가며 배양하였다. 세포는 5% C02 , 37 ^° C의 습윤 조건에서 배양하였다. 융합성 세포의 약 60%를 0.1%트림신- EDTA로 분리하였고, 배양플레이트에 옮겨 담았다. hUCB-MSC의 면역표현형을 분석하여 MSC와 관련된 항원 양성 마커의 존재와 조혈 계통 마커의 부재를 유동세포 분석법 (Epi cs XL, Beckman Coul ter)으로 조사하였다. 양성 마커로는 CD90(Thy-l) , CD10 endogl in) 및 SH3(CD73)가 있으며， 조혈계통 마커로는 CD34, CD45 및 CD31과 같은 내피 세포 마커가 있다. 세포는 HLA cl ass I에는 양성이었지만, HLA-m에는 음성이었다. 각각의 형광표지 단일클론 항체는 Beet on Dickinson에서 구입하였다 (결과도시하지 않음) . 이를 통해 P7 U192, P7 U197, P7 U218의 3 가지 세포주를 수득하였다 (P7: 세포 계대를 7번 넘겨 배양한세포， U192/197/218： 공여자에 다른 세포 번호) .

S0D3형질전환 상기를 통해 준비한 hUCB-MSC에 전기천공법을 이용하여 S0D3를 형질전환시켰다. S0D3 형질도입을 위한 바이러스 발현 벡터 및 형질도입 조건은 렌티바이러스를 바이러스 발현 벡터로 사용하였다는 점 외에 종전 기술인 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 특허와 동일하게 수행하였다 (한국공개특허 10-2017-0032872의 실험방법 참고) .

S0D3과발현 제대혈 줄기세포유래 세포외 소낭수득 상기 S0D3 과발현 hUCB-MSC에서 초원심분리법을 통해 세포외 소낭을 수득하였다. 이때 S0D3가 과발현되지 않은 hUCB-MSC에서 세포외 소낭을 추출하여 대조군으로사용하였다. 세포 배양액으로부터 세포외 소낭의 분리를 위해 각각 3X106 개의 S0D3 과발현 hUCB-MSC와 대조군 hUCB-MSC를 150X25mm 배양 접시에 깔고 세포외 소낭이 포함되지 않은 fetal bovine serum (Thermo Fi sher Scient i f ic , Inc . Wal tham, MA, USA)를 2% 함유한 배양액 25ml과 함께 배양하였다. 3일 후 배양액을 튜브에 모으고 OPTIMA MAX-XP/MLA-55 rotor (Beckman) 장비를 사용하여 다음 순서를 따라 초원심 분리를 진행하였다. 먼저 30½의 속도로 5분동안 원심분리한 후， 상층액을 수거하여 3,000 ₈ 의 속도로 45분동안 원심분리하였다. 그 후 상층액을 수거하여 10,00始의 속도로 30분동안 원심분리하였으며 이의 상층액을 수거하여 100,00 의 속도로 70분동안 원심분리하였다. 마지막으로 상층액을 제거후 펠렛을 표요에 부유시킨 후 100,00 의 속도로 70분 동안 원심분리하였다. 그 후 펠렛을 녹여 세포외 소낭 수득하였다.

S0D3과발현 유무 확인

S0D3 유전자로 형질전환된 hUCB-MSC및 이로부터 수득한 세포외 소낭의 S0D3 과발현 유무를 S0D3 단백질 발현을 분석하여 확인하였다. hUCB-MSC 및 세포외 소낭으로부터 단백질을 추출하였다. 그 다음 12% SDS-PAGE 젤에서 분리한 후, nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories Inc.)으로 이동시키고， 상기 membrane을 5% 탈지 분유로 blocking한 후, 1:1000으로 희석된 1차 항체 및 2차 항체와 각각 반응시켰다. 항체와 반응시킨 membranes를 PBST 용액으로 씻은 후, Enhancecd Chemi -Luminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific, Inc . Waltham, MA, USA)에 반응시키고， X-ray film에 노출시켜 단백질 밴드를분석하였다. 상기 방법에서 사용한항체는 다음과 같다.

1차항체: anti_S0D3 (Abeam, Cambridge, United Kingdom)

2차 항체: ant i -rabbit IgG (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA,

USA)

S0D3 과발현 hUCB-MSC 유래 세포외 소낭의 경우 1차 항체로 엑소좀 (exosome)에 대한 항체인 ant i -CD9 , ant i -CD63 , ant i ^~ CD81, anti- HSP70( System Bioscience, Palo Alto, CA, USA)를추가하였다.

아토피 동물모델 제조 및 세포외 소낭투여 아토피 동물모델은 본 분야의 공지된 방법으로 제조하였다. 실험에 사용한 마우스는 8주차의 C57BL/6 마우스 (mouse)로， 특정 병원균이 없는 상태에서 표준 마우스사료와물로사육하였으며， 보건복지부의 지침에 따른 가톨릭 대학교 가톨릭 윤리위원회의 규정에 따라다루었다. 먼저 마우스 동물 모델의 피부의 털을 제거한 후， 3일간 1% 2,4 - ^11^；1 0(：11101 0561 6116(0 8)를 도포하였다 ］! )11) . 그 후 6일차 마우스 동물 모델의 피부에 0 .2% 例期를 반복 도포하여 제조하였다 (0131比明6) . 상기 0^8 도포 과정 중 (사육 7일차) 상기에서 제조한, 4 X 유래의 세포외 소낭을 병변 부위 피하로 단회 주사하였고， 일주일 후 아토피 피부염의 병변을 육안으로 평가하였다. 그 결과 抑3를 과발현시킨 11況841엤 유래의 세포외 소낭을 투여하였을 때 가장 증상이 개선된 것을 확인하였다.

마우스 모델의 조직학적 평가와 형광조직염색 此를 과발현시킨 유래의 세포외 소낭을 투여한 마우스로부터 등 피부 조직을 수득하고, 4% 파라포름알데하이드어시에 고정한 후, 파라핀에 내장하였다 . 피부 샘플은 회전식 마이크로톰此 03)을 이용하여 조직 절편을 준비하였다. 이후 자일렌 )을 이용하여 탈지하고， 농도구배 알코올로 탈수하였다. 상기 전처리한 조직 절편은 헤마톡실린과 에오신대湖 염색)으로 염색하였다. 더불어 비만세포의 침윤 정도를 톨루이 염색을 통해 확인하였다. 마우스 피부 조직의 파라핀 섹션 절편을 0. 1% 톨루이딘 블루 염색 용액 ( 1%의 톨루이딘 블루 용액을 1% (：1 용액에 10배 희석하여 준비)에 2-3분간 담궜다. 이후 증류수로 3회 세척하고 95%와 100% 알코올에 차례대로 담궈서 탈수시킨 뒤 자일텐으로 탈지하고 말려서 염색을 완료하였다. 염색된 조직은 현미경을 통해 톨루이딘 블루로 염색된 비만세포의 과립상을 관찰하고 계수하였다.

유세포 분석 (Flow cytometry)

S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC 유래의 세포외 소낭이 면역세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 먼저 정상 혈액에서 분리한 말초혈액 단핵세포 (PBMC)을 CFSE(Carboxyf luoresce in succ inimi dyl ester )로 표지하였다. 그 후 증식을 촉진하는 미토겐 (mi togen)인 콘카나발린 ACConcanaval in A) (G， n=2) 또는 T 림프구 증식을 특징적으로 촉진할 수 있는 CD3/28 (H， n=4)을 처리 (day 0)하여 5일 후 (day 5) 유세포 분석기로 증식 정도를 측정하였다. 이때 hUCB-MSC유래 세포외 소낭을 T 림프구 증식을 촉진하는 인자들과 함께 처치함으로써 (day 0) 그렇지 않은 그룹에 비해 증식 양상이 어떻게 변화하는지 비교하였다. 더불어 유세포 분석을 통해 S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC 유래의 세포외 소낭이 헬퍼 T세포의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 정상 PBMC에서 naive T cel l (ThO)을 분리한 뒤 5일간의 ant i_IL4+IFNr 혹은 ant i_IFNr+IL4를 처리하여 각각 Thl과 Th2로의 분화를 유도하였다. 이때 일부 그룹을 정해 S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC 유래의 세포외 소낭을 분화를 유도하는 시점에 함께 처치하여 분화된 세포 비율을 분석하였다. 분화된 헬퍼 T 세포의 마커로 Thl 세포는 Interferon-r 항체 (e-bioscience, Wal tham, MA, USA)를 사용하였고 Th2 세포는 Inter leukin-4항체 (e-bioscience, Waltham, MA, USA)를사용하였다. 또한 S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC 유래의 세포외 소낭이 용의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 Naive T cel l에 hUCB-MSC 유래의 세포외 소낭을 처치하고 5일 후 Treg 마커인 FoxP3 (e-bioscience , Waltham, MA, USA) 발현을 확인하였다.

실시예 1： S0D3과발현 여부확인

S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC의 S0D3 단백질 발현을 확인한 결과도 1과 같이 , S0D3 발현이 크게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 더불어 도 2와 같이 S0D3를 과발현시킨 hUCB-MSC 유래 세포외 소낭의 경우， S0D3가 과발현되기 전에는 엑소좀 마커의 발현이 높았으나， S0D3 형질도입 후 S0D3 단백질이 다량포함되어 있는 것을 확인할수 있었다.

실시예 2： 아토피 치료 효과확인

2-1. 8(形3를 과발현시킨 유래 세포외 소낭의 아토피 치료 효과 확인 도 3 중 (幻와 같이 아토피 동물 모델을 확립하고 此를 과발현시킨 111£ 엤 유래 세포외 소낭을 투여한 후 아토피 치료 효과를 확인하였다. 그 결과 도 3 중 )와 같이 엤此를 과발현시킨 1x1X3-10:( 1925 묘 , 19花 표재)를 투여하였을 때 증상이 개선되는 것을 확인하였다. 2020/085533 1»（：1^1{2018/012712

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2-2. 8(形3를 과발현시킨 유래 세포외 소낭 투여에 따른 병변의 중증도 변화 확인 아토피 동물 모델에 확립하고 엤此를 과발현시킨 11況84!엤 유래 세포외 소낭을 투여한 후 병변의 중증도를 조직염색으로 평가하였다. 그 결과 도 4 및 도 6 중 (3)와 같이， 외피의 두께가 엤此를 과발현시킨 유래 세포외 소낭 투여에 의해 감소하는 경향을 보임을 확인하였다. 더불어 도 5 및 도 6 중 )도 마찬가지로 림프구의 침윤 정도도 孤3를 과발현시킨 11況8-1\1 유래 세포외 소낭 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 특히 아토피 피부염의 만성화에 핵심적인 역할을 하는 비만세포의 침윤 정도를 평가한 도 7도 마찬가지로 세포외 소낭 투여에 의해 감소된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 此를 과발현시킨 느況요 엤 유래 세포외 소낭은 아토피 피부염의 만성화 억제에도 뛰어난 효과를 보임을 알수 있었다.

실시예 3： 면역세포 증식 억제 효과 확인 더불어 본 발명에 따른 쌨예를 과발현시킨 유래 세포외 소낭의 -1 ， -6과 같은 전염증성 사이토카인을 방출하는 면역세포인 증식 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이， 03를 과발현시킨 11狀8-¾1洗 유래 세포외 소낭을 투여하였을 때 표祀의 증식이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4： I세포 분화 억제 효과 확인 4-1. 헬퍼 1세포분화에 미치는 영향 확인 아토피성 피부염은 대부분 연관된 면역기전에 의해 발병되는데, I 세포 이상에 의한 면역반응이 관여한다는 보고가 많으며， 헬퍼 세포 (¾ 061 1 )의 역할이 중요하다고 알려져 있으므로， 본 발명에 따른 엤此를 과발현시킨 유래 세포외 소낭의 I세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이， 엤此를 과발현시킨 111«¾-1\1就 유래 세포외 소낭의 투여는 !¾1의 분화를 감소시킨 것을 확인하였다. 반면 도 11과 같이， ¾2 세포로의 분화에는 유의적인 영향을 끼치지 않은 것을 알수 있었다. 2020/085533 1»（：1^1{2018/012712

27 따라서 본 발명에 따른 此를 과발현시킨 유래 세포외 소낭은 아토피 피부염의 만성화 예방 또는 만성화된 아토피 피부염의 치료 효과를 갖는 것을 확인하였다.

4-2. 조절 I세포 분화에 미치는 영향 확인 더불어 전체적인 면역 반응과 타면역세포의 과도한 활성화 억제에 중요한 역할을 하는 조절 I세포奸 요）의 분화에 요（犯3를 과발현시킨 !遇-!\1엤 유래 세포외 소낭이 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이， 脚 3를 과발현시킨 느況표생앴 유래 세포외 소낭은 뛰어난 요 유도 효과를 가지는 것을 확인하였다.

이 연구는 한국 정부가 후원하는 의 바이오 & 의료 기술 개발 프로그램인 ¥311）（ 則 ^' -2016 3쇼986903020）의 지원을 받았다.

【산업상 이용가능성】 이상 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 조성물 및 이를 활용한 방법은 전염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포의 증식 억제， 근요 유도 효과를 통해 아토피 피부염 치료 효과를 보이며， 비만 세포의 병변부위 침윤 억제 및 ¾1 분화 억제 효과를 보여 아토피 피부염의 만성화 예방 또는 만성화된 아토피 피부염을 치료에 유용하게 이용될 수 있다.