Nouvelles applications de la lactoferrine et compositions pharmaceutiques et nutraceutiques

L'invention concerne des compositions destinées à réguler le métabolisme du fer chez les patients atteints du syndrome des jambes sans repos et d'autres syndrome neurologique ou neuropsychiatriques liés à un déficit en fer, comme le syndrome de Gilles de la Tourette, le trouble du déficit de l'attention et la myoclonie nocturne. La présente invention concerne également de nouvelles applications et utilisations de la lactoferrine.

Font partie de la présente invention des compositions de lactoferrine utilisées comme complément alimentaire ou comme traitement contre le syndrome de Willis-Ekbom (syndrome des jambes sans repos) et autres affections neurologiques et neuropsychiatriques.

La lactoferrine, selon l'invention, concerne une protéine extraite et purifiée du lait de mammifère ou obtenue à partir de l'expression de cellules recombinantes telles que des cellules eucaryotes ou des bactéries exprimant le gène de la lactoferrine humaine, ovine, bovine ou de buffle de manière préférentielle ainsi que tout fragment de cette protéine purifiée ayant conservée ses propriétés chélatrices du fer et ses propriétés fonctionnelles de fixation sur ses récepteurs spécifiques cellulaires. La lactoferrine peut également être produite par des animaux transgéniques exprimant le gène codant pour cette protéine. La lactoferrine peut être composée d'un mélange de cette protéine provenant d'espèces différentes (humaine et animale ou animales seules) ou d'un mélange constitué de protéines extraites et purifiées du lait et de protéines recombinantes ou encore de fragments de celles-ci. Sont inclus comme « lactoferrine » dans la présente invention les fragments de cette protéine décrits au paragraphe 31 de la demande de brevet US2009/0156484 Al publiée le 18 juin 2009.

Le fer est essentiel au fonctionnement de nombreux mécanismes cellulaires au premier rang desquels la fixation de l'oxygène par l'hémoglobine et la myoglobine. Toutefois le caractère pro-inflammatoire du fer (via l'Interleukine-6 et/ou le déclenchement de la voie NF-κΒ - Int J Colorectal Dis. 2006 May;21(4):381-7. Epub 2005 Aug 23. Exacerbation of dextran sulfate sodium-induced colitis by dietary iron supplementation: rôle of NF-kappaB. Carrier JC, Aghdassi E, Jeejeebhoy K, Allard JP.), sa tendance à former des radicaux oxygène toxiques, voir à précipiter si sa concentration est localement trop élevée ont contraint les organismes supérieurs à mettre en place une ingénierie cellulaire et systémique chargée de veiller à la bonne économie du fer dans le corps. L'enjeu pour l'organisme est, en effet, de pourvoir aux besoins de l'ensemble des cellules en fer, tout en évitant une saturation en fer dans les différents compartiments liquidiens et tout particulièrement dans la circulation sanguine. Ceci implique d'une part la création d'entités chargées du transport du fer (ferritine/transferrine) et d'autre part la mise en place d'un système de stockage du fer dans des types cellulaires spécifiques, au premier rang desquels les hépatocytes, les entérocytes et les macrophages et chez la femme enceinte les syncitiotrophoblastes. Pour tous ces types cellulaires, la régulation est sous le contrôle de deux entités chimiques :

^• D'une part la ferroportine (protéine transmembranaire présente à la jonction sang/cellule) qui est la seule protéine connue capable d'exporter le fer du milieu intracellulaire vers le sang. Son rôle est déterminant pour assurer une mise à disposition du fer dans la circulation sanguine. Elle nécessite d'être associée à une ferroxydase pour pouvoir permettre l'exportation du fer vers le milieu extracellulaire, en même temps que son oxydation de Fe(II) en Fe(III).

^• D'autre part l'hepcidine (hormone peptidique circulante sécrété par les hépatocytes). L'hepcidine active, qui dérive d'un précurseur (la pro- hepcidine) de 84 acides-aminés ; contient 25 acides aminés.

L'hepcidine régule le stockage de du fer dans les cellules listées ci-dessus, pas son interaction avec la ferroportine. En effet l'hepcidine a la capacité de se lier à la ferroportine, d'induire sa phosphorylation, son internalisation et sa dégradation dans le lysosome. Or comme la ferroportine est la seule protéine connue capable d'exporter le fer des cellules des organes de réserves dans le sang, l'hepcidine (hormone circulante) a une fonction antagoniste de la ferroportine en entravant la libération du fer dans la circulation générale et son exportation vers d'autres cellules du corps (Annu Rev Nutr. 2006;26:323-42. Régulation of iron metabolism by hepcidin. Nemeth E, Ganz T). Schématiquement, lorsque le taux d'hepcidine est bas, le taux de ferroportine transmembranaire est élevé et le fer est exporté vers la circulation générale. Inversement, lorsque le taux d'hepcidine est élevé, le taux de ferroportine transmembranaire est bas, et le fer reste prisonnier dans le cytosol des cellules en général complexé à la ferritine intracellulaire (Hepcidin régulâtes cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, Vaughn MB, Donovan A, Ward DM, Ganz T, Kaplan J. Science. 2004 Dec 17;306(5704):2090-3 et Régulation of iron acquisition and iron distribution in mammals. Ganz T, Nemeth E.Biochim Biophys Acta. 2006 Jul;1763(7):690-9). Le syndrome des jambes sans repos est une maladie pour laquelle aucune anomalie physiopathologique n'est clairement identifiée. Cette maladie se manifeste par des « impatiences » dans les jambes principalement en fin de journée et au cours de la nuit, obligeant la personne atteinte à se lever et à marcher pour faire passer le trouble. Cette affection a un impact important sur la qualité du sommeil des patients et a des répercussions importantes sur leur mode de vie. Dans cette affection, la part respectivement imputable au système nerveux central et au système nerveux périphérique reste toujours sujette à discussion (The restless legs syndrome. Barrière G, Cazalets JR, Bioulac B, Tison F, Ghorayeb I. Prog Neurobiol. 2005 Oct;77(3):139-65).

Objectivement, aucune lésion de structure dopaminergique n'a été mise à jour dans le syndrome des jambes sans repos (en particulier, aucune étude anatomo-pathologique n'a pu mettre en évidence une perte neuronale ni au niveau de la substance noire ni au niveau de la région dopaminergique hypothalamique Ail) (Restless legs syndrome: revisiting the dopamine hypothesis from the spinal cord perspective. Clemens S, Rye D, Hochman S. Neurology. 2006 Jul ll;67(l):125-30). Pourtant, l'amélioration marquée des symptômes lors de l'administration d'agonistes dopaminergiques et inversement l'exacerbation des symptômes lors de la prise d'antagonistes dopaminergiques (neuroleptiques) soulignent l'importance du ou des systèmes dopaminergiques dans les manifestations cliniques de la maladie (Dopamine agonists for restless legs syndrome. Scholz H, Trenkwalder C, Kohnen R, Riemann D, Kriston L, Hornyak M. Cochrane Database Syst Rev. 2011 Mar 16;(3):CD006009).

L'approche thérapeutique classique (basée essentiellement sur des données obtenues cliniquement) consiste donc en l'administration de Levodopa ou d'agonistes de la dopamine (comme le ropinirole, le pramipexole, la rotigotine et la cabergoline) qui par une action non-spécifique sur les mouvements anormaux contribuent à la réduction des symptômes gênants (impatiences] et à un mieux-être du patient. Cette approche thérapeutique lourde induit un certain nombre d'effets secondaires et donne lieu au bout de quelques mois à des phénomènes de rebond, de tolérance voir d'augmentation du syndrome obligeant le patient à accroître les doses pour maintenir un bénéfice suffisant justifiant la poursuite d'un traitement par des agonistes dopaminergiques (Long-term treatment of restless legs syndrome with dopamine agonists. Ondo W, Romanyshyn J, Vuong KD, Lai D. Arch Neurol. 2004 Sep;61(9):1393-7 et Progressive development of augmentation during long-term treatment with levodopa in restless legs syndrome: results of a prospective multi-center study. Hogl B, Garcia-Borreguero D, Kohnen R, Ferini-Strambi L, Hadjigeorgiou G, Hornyak M, de Weerd A, Happe S, Stiasny-Kolster K, Gschliesser V, Egatz R, Frauscher B, Benes H, Trenkwalder C, Hening WA, Allen RP. J Neurol. 2010 Feb;257(2):230-7). En cas d'échec ou de contre-indication du traitement par des agonistes dopaminergiques, les alternatives sont essentiellement les benzodiazépines, certains antiépileptiques (comme la gabapentine), les dérivés codéinés, les dérivés morphiniques. Des combinaisons entre certain de ces produits et des agonistes dopaminergiques peuvent être parfois utilisées pour des cas particulièrement sévères (A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Dose-Response Study to Assess the Pharmacokinetics, Efficacy, and Safety of Gabapentin Enacarbil in Subjects With Restless Legs Syndrome. Lal R, Ellenbogen A, Chen D, Zomorodi K, Atluri H, Luo W, Tovera J, Hurt J, Bonzo D, Lassauzet ML, Vu A, Cundy KC. Clin Neuropharmacol. 2012 Jun 1).

A ce jour, il n'y a pas de réponse thérapeutique ciblée pour la prise en charge du syndrome des jambes sans repos. La réponse dopaminergique classique n'apporte qu'un soulagement phénotypique souvent temporaire et n'intervient que partiellement sur l'étiologie de la maladie. Il en va de même pour les autres approches thérapeutiques, qui anesthésient le patient plus qu'elles ne le soignent. En conséquence, la communauté des malades et des neurologues sont toujours à la recherche d'un remède efficace, sûr et bien toléré contre cette pathologie qui touche selon les estimations entre 0.01 et 18.3% de la population générale adulte (Epidemiology of restless legs syndrome in Turkish adults on the western Black Sea coast of Turkey: A door-to-door study in a rural area.Tasdemir M, Erdogan H, Boni UT, Dilaver E, Kumas A.Sleep Med. 2010 Jan;ll(l):82-6 et Restless legs syndrome: relationship between prevalence and latitude. Koo BB. Sleep Breath. 2011 Dec 31).

Il a été observé chez certains patients atteints du syndrome des jambes sans repos des anomalies dans la concentration en fer des liquides physiologiques (Dopamine and iron in the pathophysiology of restless legs syndrome (RLS).Allen R.Sleep Med. 2004 Jul;5(4):385-91). Cette anomalie martiale a été confirmée épidémiologiquement. En effet, il est reconnu depuis longtemps que le syndrome des jambes sans repos se déclenche préférentiellement chez les individus en situation de stress martial (ayant des taux de fer anormalement bas) comme les personnes donnant fréquemment leur sang, les femmes enceintes et les dialysés rénaux en phase terminale (A common sleep disorder in pregnancy: restless legs syndrome and its predictors. Balendran J, Champion D, Jaaniste T, Welsh A.Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2011 Jun;51(3):262-4 et Restless legs syndrome in dialysis patients: a comparison between hemodialysis and continuous ambulatory peritoneal dialysis. Merlino G, Lorenzut S, Romano G, Sommaro M, Fontana A, Montanaro D, Valente M, Gigli GL. Neurol Sci. 2012 jan 22). Inversement, le groupe ethnique où le syndrome des jambes sans repos est le plus rare est la population japonaise avec un taux de syndrome des jambes sans repos dix fois plus faible que la moyenne occidentale (0,46% pour les hommes âgés) (Prevalence of restless legs syndrome in a Japanese elderly population. Tsuboi Y, Imamura A, Sugimura M, Nakano S, Shirakawa S, Yamada T.

Parkinsonism Relat Disord. 2009 Sep;15(8):598-601). Ceci s'explique en partie du fait d'une alimentation très riche en fer (les algues consommés au japon sont les nutriments connus les plus riches en fer avec un taux allant jusqu'à 200mg de fer pour 100g). Pour autant le manque de fer chez les patients atteints du syndrome des jambes sans repos ne donne pas forcément lieu à une anémie caractérisée.

Cette anomalie du taux de fer a été retrouvée lors de biopsies réalisées sur des cerveaux de personnes atteintes du syndrome des jambes sans repos où ont été confirmés des taux de fer anormalement bas (MRI-determined régional brain iron concentrations in early- and late-onset restless legs syndrome. Earley CJ, B Barker P, Horskâ A, Allen RP. Sleep Med. 2006 Aug;7(5):458-61). Pour autant, le lien entre baisse du niveau de fer et syndrome des jambes sans repos n'est pas établi. Dans cet article, on suppose que la synthèse de dopamine défectueuse s'explique du fait que la tyrosine hydroxylase impliquée dans la synthèse de la dopamine a comme cofacteur le fer. Mais les résultats sur la tyrosine hydroxylase sont en contradiction avec les observations faites dans la maladie de Parkinson, où à l'inverse du syndrome des jambes sans repos, le niveau de fer intracérébral est supérieur à la normale (Potential sources of increased iron in the substantia nigra of parkinsonian patients. Gerlach M, Double KL, Youdim MB, Riederer P. J Neural Transm Suppl. 2006;(70):133-42. Review). En conséquence, aucun élément objectif de l'art antérieur ne permet de lier la concentration de fer disponible et de fer séquestré dans les cellules avec une maladie dopaminergique. Le fer circulant n'est pour autant pas un bon marqueur de la carence martiale car il est toujours maintenu, via un processus de régulation systémique, à une concentration inférieure à 10 ¹⁸ M dans les liquides physiologiques. Cette régulation imposée par la toxicité potentielle du fer à l'état d'ions Fe ³⁺ libre (Fe (III)) implique un certain nombre de protéines circulantes agissant comme agents chélateurs du fer. Les deux principales protéines intervenant dans ce processus sont d'une part la transferrine et d'autre part la ferritine, deux protéines sécrétées présentes dans le sérum et le liquide céphalo-rachidien. La transferrine a la capacité de fixer deux atomes de fer tandis que la ferritine a la capacité d'en fixer 4500. Ce déséquilibre dans les capacités de chélations de ces deux protéines se retrouvent dans la leurs concentrations respectives dans les liquides physiologiques (la concentration de transferrine sérique s'élève à 2,5g/L tandis que la concentration de la ferritine sérique est comprise entre 50 et 100μg/L chez l'adulte). L'affinité extrêmement élevée de la ferritine pour le fer en fait un bon marqueur physiologique reconnu de l'homéostasie du fer.

Ce rôle central de la ferritine comme marqueur du stockage de fer disponible a été confirmé dans le cas du syndrome des jambes sans repos par plusieurs études. Non seulement la concentration de la ferritine dans le liquide céphalo-rachidien est anormalement basse chez la majorité des patients atteints de syndrome des jambes sans repos (Ferritin subunits in CSF are decreased in restless legs syndrome. Clardy SL, Earley CJ, Allen RP, Beard JL, Connor JR. J Lab Clin Med), mais elle l'est également dans le sérum (The severity range of restless legs syndrome (RLS) and augmentation in a prospective patient cohort: association with ferritin levels. Frauscher B, Gschliesser V, Brandauer E, El-Demerdash E, Kaneider M, Rùcker L, Poewe W, Hôgl B. Sleep Med. 2009 Jun;10(6):611-5). Cette concordance entre les paramètres des deux liquides physiologiques est d'ailleurs confirmée par l'analyse du tissu endothélial de la barrière hémato-encéphalique. D'autres études ont montré que le taux de ferritine du liquide céphalo-rachidien était directement corrélé au taux de ferritine sérique. Cette importance du taux de ferritine sérique comme biomarqueur du syndrome des jambes sans repos a été confirmée dans les formes sévères du syndrome où il y a une corrélation linéaire négative entre l'intensité de la maladie et le niveau de ferritine sérique [Augmentation in restless legs syndrome is associated with low ferritin. Trenkwalder C, Hôgl B, Benes H, Kohnen R. Sleep Med. 2008 Jul;9(5):572-4). Cet indicateur est particulièrement intéressant lors des phénomènes d'aggravation du syndrome car dans ces cas-là, un effondrement du taux de ferritine sérique est observé.

D'autres maladies neurologiques présentent un déficit en fer sans qu'une solution nutraceutique ou pharmaceutique soit envisagée ou permette l'obtention d'un rééquilibrage biologique. En effet, de manière analogue au syndrome des jambes sans repos, d'autres affections neurologiques ou psychiatriques font apparaître des anomalies dans le métabolisme et du fer et plus particulièrement une baisse anormale du taux de ferritine. Il s'agit du déficit de l'attention (ADHD), de la myoclonie nocturne et du syndrome de Gilles de la Tourette. Les patients atteints de déficit de l'attention (ADHD) présentent une comorbidité fréquente avec le syndrome des jambes sans repos que ce soit dans les formes infantiles ou adultes. Chez l'enfant, certains pédopsychiatres vont même jusqu'à penser que l'ADHD est l'expression juvénile du syndrome des jambes sans repos. La similitude entre les deux maladies a été confirmé d'un point de vue physiopathologique avec dans les deux cas une anomalie du fer. En effet à l'instar du syndrome des jambes sans repos, les patients souffrant d'ADHD présentent des taux de fer et de ferritine statistiquement inférieurs à la normale. Toutefois, le lien entre taux de fer et ADHD n'a été démontré que pour les aspects cognitifs et ne concerne pas les aspects physiques de la maladie (Relation of ferritin levels with symptom ratings and cognitive performance in children with attention deficit-hyperactivity disorder. Oner 0, Alkar OY, Oner P. Pediatr Int. 2008 Feb;50(l):40-4). Cette déficience martiale a donné lieu à des essais cliniques, où était testée une supplémentation en fer chez les patients ADHD (Effects of iron supplementation on attention déficit hyperactivity disorder in children. Konofal E, Lecendreux M, Deron J, Marchand M, Cortese S, Zaïm M, Mouren MC, Arnulf I. Pediatr Neurol. 2008 Jan;38(l):20-6). L'autre argument en faveur d'une similitude entre les deux syndromes concerne les aspects familiaux et génétiques des deux maladies :

- le syndrome des jambes sans repos est plus fréquemment retrouvé chez les parents d'enfants atteints d'ADHD, que dans la population générale

Des études en biologie moléculaires ont confirmés les études épidémiologiques et ont fait état de plusieurs loci statistiquement retrouvés dans les deux pathologies. Tout particulièrement le locus BTBD9, qui non seulement serait commun à la RLS et à l'ADHD mais est lié au métabolisme du fer (Exploring the genetic link between RLS and ADHD. Schimmelmann BG, Friedel S, Nguyen TT, Sauer S, Ganz Vogel CI, Konrad K, Wilhelm C, Sinzig J, Renner TJ, Romanos M, Palmason H, Dempfle A, Walitza S, Freitag C, Meyer J, Linder M, Schàfer H, Warnke A, Lesch KP, Herpertz-Dahlman B, Hinney A, Hebebrand J. J Psychiatr Res. 2009 Jul;43(10):941-5).

La myoclonie ou syndrome de mouvement périodique des jambes (PLMD - Periodic Limb Movement disorder) nocturne ressemble beaucoup d'un point de vue symptomatologique au syndrome des jambes sans repos, à la différence près que ce syndrome n'intervient que pendant le sommeil, et qu'il n'est pas en soit douloureux ou gênant, mise à part le fait qu'il induit des réveils inopinés au cours de la nuit. On constate souvent qu'une myoclonie nocturne précède dans l'histoire des patients un diagnostic d'un syndrome des jambes sans repos et qu'il y a un lien statistique fort entre ces deux pathologies. Ce lien se retrouve à un niveau familial, où les enfants atteints de myoclonie nocturne ont souvent des parents atteints du syndrome des jambes sans repos (Pédiatrie restless legs syndrome and periodic limb movement disorder: parent-child pairs. Picchietti DL, Rajendran RR, Wilson MP, Picchietti MA. Sleep Med. 2009 Sep;10(8):925-31).

De la même manière que pour le syndrome des jambes sans repos, on constate fréquemment une anomalie dans le métabolisme du fer, avec un taux anormalement bas de ferritine (Iron deficiency and periodic leg movement disorder of sleep. Gozal D, Kheirandish-Gozal L. Sleep Med. 2009 Feb;10(2):265).

Le syndrome Gilles de la Tourette se caractérise par un certain nombre de tics, dont des mouvements faciaux, des clignements, des raclements gutturaux qui sont associés à l'expression orale involontaire d'obscénités (coprolalie).

Le rôle du fer, comme pour le syndrome des jambes sans repos et l'ADHD, a été souligné dans le cas du syndrome Gilles de la Tourette. On retrouve également un taux de fer et de ferritine intracrânien anormalement bas chez les patients atteints de ce syndrome (Ferritin levels and their association with régional brain volumes in Tourette's syndrome. Gorman DA, Zhu H, Anderson GM, Davies M, Peterson BS. Am J Psychiatry. 2006 Jul;163(7):1264-72). D'un point de vue de génétique, les anomalies constatées au niveau du locus BTBD9, dans les autres pathologies neurologiques liées à une anomalie du métabolisme du fer se retrouvent également dans le syndrome de Gilles de la Tourette (Attention-deficit/hyperactivity disorder, Tourette's syndrome, and restless legs syndrome: the iron hypothesis. Cortese S, Lecendreux M, Bernardina BD, Mouren MC, Sbarbati A, Konofal E. Med Hypothèses. 2008;70(6):1128-32).

En conséquence, pour ces maladies dans lequel les anomalies du métabolisme du fer sont impliquées, la mesure du taux de ferritine sérique est un marqueur quantitatif décrit dans la littérature de la pathologie et de son intensité. Agir sur le taux de ferritine sérique dans le but de l'augmenter constitue un bon moyen de normaliser l'homéostasie du fer chez les patients en vue de diminuer les symptômes gênants et d'améliorer leur qualité de vie. Dans l'art antérieur, la limite basse du taux, de ferritine sanguine est de 50 g/L, sa limite maximale est de 300μg/L (les hémochromatoses, pathologies où le taux de ferritine est en excès se situent à un niveau de ferritine sérique de 1000 g/L). La marge d'augmentation de la ferritine est donc importante et il est très improbable d'atteindre le maximum du taux sérique.

Le problème technique à résoudre consiste à apporter une nouvelle solution à la fourniture de fer dans les pathologies neurologiques et psychiatriques déficientes en fer. La définition de compositions, ayant la capacité de faire remonter le taux de fer et plus particulièrement le taux de ferritine chez les patients atteints du syndrome des jambes sans repos sans induire d'effets secondaires indésirables tout en stabilisant la concentration biologique vers la normalité, est l'objet de la présente invention ainsi que la nouvelle utilisation de la lactoferrine pour réduire les symptômes des maladies neurologiques telles que le syndrome des jambes sans repos ou psychiatriques telles que l'ADHD. Pour agir sur la ferritine plasmatique et pour compenser un déficit supposé en fer chez les patients atteints du syndrome des jambes sans repos, il a été proposé d'augmenter massivement l'apport en fer avec l'inconvénient de conduire à une séquestration du fer dans l'espace intra-cellulaire, que ce soit par une supplémentation per os ou par des injections intraveineuses (essentiellement iron sucrose, iron dextran). Ces approches ont donné lieu à plusieurs essais cliniques, dans lesquels les critères (objectifs et subjectifs) définis pour mesurer le bénéfice éventuel de ces approches thérapeutiques sont principalement :

• le taux de ferritine sérique

^• les mouvements périodiques des jambes durant le sommeil (periodic leg movement in sleep-PLMS)

^• durée du sommeil (total sleep time)

^• l'évolution de la douleur selon l'échelle internationale de sévérité du syndrome des jambes sans repos (International RLS severity rating scale - IRLS)

Les résultats de ces études font apparaître une réponse variable chez les patients recrutés. Avec un taux de répondeurs (amélioration partielle ou totale du syndrome) qui varient entre 20 et 60% selon l'âge, le sexe, l'état général des patients.

D'une manière générale, Les résultats, avec supplémentations orales ont été plutôt décevants, et n'ont pas aboutis à des recommandations thérapeutiques (Evaluation of oral iron treatment in pédiatrie restless legs syndrome (RLS). Mohri I, Kato-Nishimura K, agitani-Shimono K, Kimura-Ohba S, Ozono K, Tachibana N, Taniike M. Sleep Med. 2012 Apr;13(4):429-32). Les injections de fer intraveineux (qui sont plus difficiles à manipuler et plus contraignantes à long terme) n'ont pas donné les résultats attendus dans le cas de l'iron sucrose (A randomized, double-blind, placebo-controlled trial of intravenous iron sucrose in restless legs syndrome. Earley CJ, Horskâ A, Mohamed MA, Barker PB, Beard JL, Allen RP. Sleep Med. 2009 Feb;10(2):206-ll) et de l'iron dextran (The treatment of restless legs syndrome with intravenous iron dextran. Earley CJ, Heckler D, Allen KP. Sieep Med. 2Û04 May;5(3):231-5). L'utilisation de ces approches basées sur une adjonction massive de fer peut se révéler dangereuse en raison de l'accumulation de fer dans les cellules notamment les cellules nerveuses. Il faut également noter que dans un certain nombre de cas, l'apport massif en fer a donné lieu à des allergies.

Ces phénomènes d'apports massifs en fer sont à mettre en parallèle avec le fait que la supplémentation-err fer comporte un certain nombre de risques et d'effets secondaires indésirables qui peuvent parfois être dangereux tels que :

• la prolifération microbienne

· l'inflammation (Iron overload impairs pro-inflammatory cytokine responses by Kupfferreils. Olynyk JK, Clarke SL. J Gastroenterol Hepatol. 2001 Apr;16(4):438- 44]

• les cancers

• les hépatites

· les problèmes digestifs

(diarrhées/nausées/vomissements/ballonnements/constipat ion induite par la faible biodisponibilité du fer inorganique et la nécessité d'administrer des doses massives). (Effect of oral iron therapy on the upper gastrointestinal tract. A prospective évaluation. Laine LA, Bentley E, Chandrasoma P. Dig Dis Sci. 1988 Feb;33(2):172-7)

D'ailleurs l'AFFSAPS a émis des recommandations négatives sur la supplémentation en fer, qu'il fallait réserver à des situations particulières (Article du Monde du vendredi 30 septembre 2011 - Les 56 médicaments particulièrement surveillés - pl2, Paul Benkimoun)). En conclusion, les essais cliniques, dont les résultats sont disponibles, font apparaître que la supplémentation massive en fer ne constitue pas une solution satisfaisante dans le cadre d'une prise en charge à long terme des patients atteints du syndrome des jambes sans repos.

Ainsi dans le cas du syndrome des jambes sans repos, une supplémentation massive en fer va obliger l'organisme à mettre en place une réponse immédiate pour éviter un excès de fer, dans la circulation sanguine. Le fer en excès va induire l'augmentation d'interi uki-nes circulantes pro- inflammatoires, comme l'interleukine-6. Cette dernière favorise la transcription du gène de l'hepcidine dans le hépatocytes, par l'intermédiairette-la fixaliun de STAT3 ^~ sui la éque ce promotrice du gène.

Ceci va induire dans un premier temps une brusque montée du taux d'hepcidine sanguin qui va aboutir à l'élimination de la ferroportine de la surface des cellules. Cette disparition de la ferroportine transmembranaire va avoir pour effet de séquestrer le fer dans les compartiments intracellulaire. Cette baisse du fer disponible va induire des déficits en fer et une baisse de la ferritine dans les autres compartiments liquidiens et tout particulièrement dans le liquide céphalo-rachidien. Ce résultat n'est pas très étonnant lorsqu'on sait que si le fer est quantitativement le métal le plus imfwrftarrt dans†e corp humain {environ 5g de fer chez un homme adulte de 70 Kg), l'apport quotidien de fer dans le cadre d'une alimentation normale est suffisant pour compenser les pertes en fer qui s'élèvent en moyenne à un millième de la masse totale du fer présent dans le corps (entre 5 et 10 mg environ). Ceci s'explique par la capacité de l'organisme à recycler le fer hèmique (hémoglobine principalement) lors de la destruction des hématies (hémolyse normale). Seules des situations très particulières comme la grossesse justifie une augmentation des apports quotidiens en fer chez l'individu adulte.

Le faible taux de fer circulant chez l'adulte et l'enfant, n'est donc pas forcément dû à un manque quantitatif de fer dans l'organisme mais plutôt à sa séquestration dans les cellules de la muqueuse intestinale et dans les macrophages par le jeu du système hepcidine-ferroportine. (Hepcidin and iron homeostasis. Ganz T, Nemeth E. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan 26 et The molecular mechanism of hepcidin-mediated ferroportin down-regulation. De Domenico I, Ward DM, Langelier C, Vaughn MB, Nemeth E, Sundquist WI, Ganz T, Musci G, Kaplan J. Mol Biol Cell. 2007 Jul;18(7):2569-78). L'apport direct et massif en fer n'est donc pas la réponse appropriée pour résoudre le problème technique évoqué plus haut.

D'autres solutions ont été proposées dans l'art antérieur, telles celles d'utiliser des transferrines sanguines. Les transferrines sanguines constituent une famille de protéines globulaires, conservées au cours de l'évolution, qui interviennent dans la mise à disposition du fer. Elles pourraient avoir une action (positive ou négative) sur le taux de ferritine sérique, et intervenir sur les transfer ines pourrait être un moyen de faire remonter le taux de ferritine.

La famille des transferriije est constituée de quatre protéines : - la transferrine sartguihe (ou serôtransferrine)

- la lactoferrine naturelle (sanguine)

- l'ovotransferrinet

- la melanotransferrine

Pour les transferrines sanguines, les résultats répertoriés dans la littérature donnent à penser qu'il n'y a pas de lien évident entre ces deux paramètres, même dans des situations pathologiques [64].

Cette décorrélation est confirmée par les différences de variations de ces deux paramètres au cours du cycle circadien. Alors que la ferritine est le paramètre protéique sanguin le plus stable avec des variations au cours de la journée considérées comme non-significatives, le taux de transferrine peut varier au cours d'une même journée de 70%. (Diurnal variation of hematology parameters in healthy young maies: the Bispebjerg study of diurnal variations. Sennels HP, J0rgensen HL, Hansen AL, Goetze JP, Fahrenkrug J. Scand J Clin Lab Invest. 2011 Nov;71(7):532-41 et Diurnal variation of sérum iron, iron-binding capacity, transferrin saturation, and ferritin levels. Dale }C, Burritt MF, Zinsmeister AR. Am J Clin Pathol. 2002 May;117(5):802-8). Vouloir agir sur le taux de ferritine sérique via la transferrine sérique ne constitue donc pas une bonne approche et pourraient induire des désordres biochimiques.

On peut donc conclure à l'indépendance entre le taux de ferritine sérique et les taux sériques de l'ensemble des transferrines. Agir sur les transferrines sériques n'apporte pas une réponse satisfaisante au problème technique.

La lactoferrine sanguine est présentes également principalement au niveau tissulaire et à des concentrations très basses dans la circulation sanguine. Elle ne peut avoir d'action directe sur la ferritine (Diurnal variation of sérum iron, iron-binding capacity, transferrin saturation, and ferritin levels. Dale JC, Burritt MF, Zinsmeister AR. Am J Clin Pathol. 2002 May;117(5):802-8) et n'a jamais été citée pour être une molécule thérapeutique ou nutraceutique dans la maladie des jambes sans repos et les autres maladies neurologiques liées à un déficit en fer.

L'ovotransferrine est une protéine existant dans le blanc d'œuf et absente chez l'homme (Iron binding proteins and influx of iron across the duodenal brush border. Evidence for spécifie lactotransferrin receptors in the human intestine. Cox TM, Mazurier J, Spik G, Montreuil j, Peters TJ.Biochim Biophys Acta. 1979 Nov 15;588(l):120-8).

La mélanotransferrine, protéine principalement cellulaire ou tissulaire, est catabolisée très rapidement par le foie dans sa forme sérique, ce qui l'empêche d'atteindre le cerveau (The transferrin homologue, melanotransferrin (p97), is rapidly catabolized by the liver of the rat and does not effectively donate iron to the brain. Richardson DR, Morgan EH. Biochim Biophys Acta. 2004 Oct 14;1690(2):124-33).

Certaines caractéristiques biochimiques de la lactoferrine, indépendantes de sa présence dans le sang et de son éventuelle activité de transporteur de médicaments, ont conduit de manière surprenante malgré l'absence de lien dans la littérature scientifique à envisager dans la présente invention une nouvelle utilisation de la lactoferrine bovine pour le traitement du syndrome des jambes sans repos et les autres pathologies neurologiques dans lesquelles un taux de ferritine circulant dans le sang anormalement bas a été relevé.

La lactoferrine bovine et humaine sanguine et non sanguine est une glycoprotéine globulaire cationique de la famille des transferrine qui a une masse moléculaire de 80 Kilo Daltons. Son affinité pour le fer est 300 fois supérieure à celle de la transferrine sérique. Elle est présente chez tous les mammifères avec une grande stabilité au cours de l'évolution (Bioinformatics analysis of lactoferrin gene for several species. Kang JF, Li XL, Zhou RY, Li LH, Feng FJ, Guo XL. Biochem Genêt. 2008 Jun;46(5-6):312-22). Elle est produite par toutes les cellules muqueuses dans différents liquides biologiques et a la capacité [comme la transferrine) de se lier à deux atomes de fer (on parle d'holo- lactoferrine dans sa forme chelatée et d'apo-lactoferrine dans sa forme non-chélatée). Elle participe au niveau des tissus au maintien d'une concentration correcte en fer et prévient l'inflammation. Le lait des mammifères est le liquide biologique dans lequel son taux est le plus élevé. Dans le lait humain, la concentration de lactoferrine est de l,5g/L

Le type de lactoferrine utilisable est soit la lactoferrine bovine qui est biologiquement active chez l'homme (dans l'hypothèse où le mode d'extraction/purification n'est pas dénaturant) soit la lactoferrine humaine recombinante dès lors qu'elle se présente sous une forme biologiquement active (correctement glycosylée). (Bovine lactoferrin can be taken up by the human intestinal lactoferrin receptor and exert bioactivities. Lônnerdal B, Jiang R, Du X. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011 Dec;53(6):606-14).

A l'inverse de la plupart des protéines, la lactoferrine humaine te bovine est une des rares protéines biologiquement actives qui a conservé ses propriétés thérapeutiques lorsqu'elle est administrée par voie orale. Elle a la particularité de résister à la digestion et de conserver son activité biologique dans le tube digestif chez l'adulte et l'enfant (Lactoferrin, a bird's eye view. Vogel HJ. Biochem Cell Biol. 2012 Jun;90(3):233-44 et Lactoferrin - 50 years on. Brock JH. Biochem Cell Biol. 2012 Jun;90(3):245-51).

Il existe des récepteurs spécifiques à la lactoferrine sur les villosités des cellules de la muqueuse duodénale chez l'homme, qui permettent l'incorporation cellulaire de la lactoferrine. La spécificité de ces récepteurs est telle que les autres membres de la famille des transferrines (ovotransferrines, transferrines) pourtant structurellement très proche ne se fixent pas sur ce récepteur de la lactoferrine bovine ou humaine et ne sont donc pas absorbés.

Ainsi il a été démontré chez le porc que la lactoferrine bovine, qui est naturellement active jusqu'à son arrivée dans l'intestin grêle, était transportée par transcytose de la lumière du tube digestif vers les cellules endothéliales au niveau des villosités; et des cellules endothéliales vers la circulation sanguine par le système lymphatique vers la veine porte (Persorption of bovine lactoferrin from the intestinal lumen into the systemic circulation via the portai vein and the mesenteric lymphatics in growing pigs. Kitagawa H, Yoshizawa Y, Yokoyama T, Takeuchi T, Talukder MJ, Shimizu H, Ando K, Harada E. J Vet Med Sci. 2003 May;65(5):567-72). Dans le cadre de la présente invention, la lactoferrine administrée per os est choisie, en raison de l'étiologie martiale des pathologies neurologiques inventoriées (syndrome des jambes sans repos, ADHD, myoclonie nocturne, syndrome de Gilles de la Tourette) pour sa capacité à normaliser la concentration circulante de fer par une action tissulaire au niveau des cellules du tube digestif.

Des études cliniques ont été menées pour comparer les effets d'une supplémentation en fer versus un apport de lactoferrine par voie orale, sur les différentes protéines impliquées dans le métabolisme du fer (en particulier la ferritine) (Lactoferrin efficacy versus ferrous sulfate in curing iron disorders in pregnant and non-pregnant women. Paesano R, Berlutti F, Pietropaoli M, Goolsbee W, Pacifici E, Valenti P. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010 Apr-Jun;23(2):577-87). Les résultats ont été obtenus cliniquement avec une supplémentation orale de type sulfate ferreux versus lactoferrine saturée à 20%.

Rien dans ces travaux antérieurs ne permet d'envisager que la lactoferrine humaine ou bovine administrée per os peut être aussi utilisée pour traiter des maladies de types neurologiques ou pour compenser un déséquilibre nutritionnel chez ces patients. La lactoferrine per os peut être utilisé comme agent thérapeutique systémique pour agir sur la remontée de taux de ferritine chez les patients atteints du syndrome des jambes sans repos, en ayant l'avantage de ne pas perturber l'homéostasie systémique du fer et d'éviter tout risque inflammatoire ou effet secondaire indésirable.

Même s'ils ont en commun un taux anormalement bas de ferritine, les sujets concernés par l'invention (maladies des jambes sans repos et autres troubles neurologiques ou neuropsychiatriques) sont dans des situations pathologiques très différentes et présentent des symptômes qui n'ont rien de commun avec les patients décrits dans les articles (Lactoferrin efficacy versus ferrous sulfate in curing iron deficiency and iron deficiency anémia in pregnant women. Paesano R, Berlutti F, Pietropaoli M, Pantanella F, Pacifici E, Goolsbee W, Valenti P. Biometals. 2010 Jun;23(3):411-7 et Lactoferrin efficacy versus ferrous sulfate in curing iron disorders in pregnant and non-pregnant women. Paesano R, Berlutti F, Pietropaoli M, Goolsbee W, Pacifici E, Valenti P. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010 Apr-Jun;23(2):577-87) (anémie de la femme enceinte ou en âge de procréer). Les résultats décrits dans les deux articles cités ci-dessus (2010 Paesano et al. suppra) ne permettent pas de transférer la solution du choix thérapeutique d'administrer de la lactoferrine notamment par voie orale pour palier et compenser les symptômes associés aux maladies neurologiques (Syndrome des jambes sans repos, myoclonie nocturne, syndrome de Gilles de la Tourette) et neuropsychiatriques (ADHD) correspondantes. Ces maladies n'ont aucun rapport avec la situation d'une grossesse non-pathologique, cas des exemples dont les résultats ont été publiés. Il s'agit donc d'un domaine technique très distinct de celui de la présente invention.

Dans la présente invention, la lactoferrine humaine ou bovine (molécules naturelles extraites ou obtenues par expression dans des systèmes de recombinaisons génétiques conservant les glycosylations naturelles de la molécule obtenue) a été sélectionnée parmi les protéines appartenant à la famille des transferrines comme principe actif d'une composition pharmaceutique et/ou de compléments alimentaires ou nutraceutiques pour réguler et apporter une concentration sérique en fer adaptée et suffisante aux patients présentant un déficit en fer ou une séquestration en fer dans les tissus liés à un traitement non-spécifique.

Pour éviter les inconvénients liés à une supplémentation massive en fer et faire remonter le taux de ferritine sans induire le déclenchement d'une réponse pro- inflammatoire et une séquestration intracellulaire du fer, la lactoferrine (bovine ou humaine) répond aux caractéristiques d'une molécule utile pour réguler, par voie orale le taux de fer dans les tissus et dans le sang.

La présente invention consiste donc en des compositions contenant comme principe actif de la lactoferrine, principe actif seul, principal ou en association avec d'autres principes actifs, pour être utilisée dans une préparation :

- une préparation pharmaceutique

- un complément alimentaire

- ou comme un composant nutraceutique dans un produit agro-alimentaire.

Cette composition selon l'invention a pour objet de moduler le métabolisme martial en vue de normaliser le fer et les paramètres protéiques associés afin de limiter voir supprimer les causes et les "symptômes du syndrome des jambes sans repos et d'autres maladies neurologiques ou neuropsychiatriques liés à un déficit en fer, comme le syndrome de Gilles de Fa Tourette, le trouble du déficit de l'attention et la myoclonie nocturne. ¾

Pour les maladies neurologiques, seules celles qui ne sont pas neurodégénératives, sont concernées par un traitement pharmaceutique consistant en une composition constituée en totalité ou en partie par de la lactoferrine pure ou purifiée ou par une complémentation alimentaire nutraceutique constituée en totalité ou en partie au moins par de la lactoferrine selon la présente invention. La proportion de lactoferrine associée à d'autres composants ou produits actifs est comprise entre 10% à 90 % en poids total sec ou en volume total en cas de forme liquide de la composition considérée.

Dans le cadre de cette invention, ce n'est pas la capacité de la lactoferrine d'amener du fer via la barrière hemato-encéphalique au liquide céphalo-rachidien, c'est sa capacité à apporter du fer aux protéines sanguines et tout particulièrement à la ferritine, qui permettra d'améliorer la symptomatologie des patients et le taux de fer disponible et utile biologiquement pour le corps humain.

La présente invention concerne une composition pharmaceutique pour traiter des maladies neurologiques non dégénératives sélectionnées parmi : le syndrome des jambes sans repos, le déficit de l'attention, la myoclonie nocturne et le syndrome de Gilles de la Tourette et associées à un déficit en fer, caractérisée en ce qu'elle comprend de la lactoferrine.

Elle concerne également une composition pharmaceutique pour traiter des maladies psychiatriques associées à un déficit en fer, caractérisées en ce qu'elle comprend de la lactoferrine.

La présente invention comprend la lactoferrine purifiée pour traiter des déficits nutritionnels chez des patients atteints de maladies neurologiques . . on dégénératives o - de maladies psychiatriques et pour traiter des symptômes de râaladies neurologiques non dégénératives ou de maladies psychiatriques.

La présente invention concerne des compléments alimentaires ou une composition nutraceutique caractérisés en ce qu'ils comprennent de la lactoferrine pour traiter les syndromes des jambes sans repos, du déficit de l'attention, de la rhyoclonie nocturne et du syndrome de Gilles de la Tourette et pour traiter les déficits en fer chez les patients atteints des mêmes syndromes. L'invention concerne une composition combinée pour utilisation quotidienne ou sous forme retard pour traiter un déficit en fer chez l'adulte et l'enfant ou une pathologie associée- à une anémie caractérisée en ce qu'elle comprend un composé actif de la lactoferrine administrée par voie orale, associée à des composés permettant l'utilisation par voie orale du dit composé actif.

L'invention dan s» ses variantes comprend une composition pharmaceutique caractérisée en ce que la concentration en lactoferrine est comprise entre 10 et

90 pour cent de préférence entre 25 et 45% en poids sec de la dite composition.

L'invention concerne une composition pharmaceutique pour traiter des maladies psychiatriques ou des maladies neurologiques non dégénératives caractérisée en ce qu'elle contient au moins l'un des composés choisis parmi un excipient et/ou un liant et/ou un antiagglomérant et/ou l'un au moins des composés suivants : sels ferreux ou ferriques, acide sialique et oméga-3.

La présente invention concerne une nouvelle utilisation de la lactoferrine pour la fabrication d'une composition pharmaceutique active pour traiter des maladies neurologiques non dégénératives ou psychiatriques ou pour la fabrication d'une composition vétérinaire.

L'invention concerne des compositions vétérinaires contenant au moins l'un des composés choisis parmi un excipient et/ou un liant et/ou un antiagglomérant et/ou l'un au moins des composés suivants : sels ferreux ou ferriques, acide sialique et oméga-3 et comprenant également de la lactoferrine pour le traitement de déficit en fer chez les animaux. L'invention concerne un procédé de préparation de compléments alimentaires ou de composition nutraceutique consistant à ajouter à un aliment de la lactoferrine bovine ou extraite du lait ou de ses dérivés ou de la lactoferrine humaine.

Afin d'illustrer les effets obtenus ih vivo chez des patients ayant signé un formulaire de consentement éclairé conformément aux dispositions légales, les compositions selon .Invention contenant de la lactoferrine ont été administrés comme compléments alimentaires dans le cadre d'une étude clinique. Dans l'Etude, les compositions nutraçeutiques contenaient comme principe actif de la lactoferrine purifiée.

L' Etude clinique a été menée pendant 3 mois pour évaluer in vivo l'intérêt de la lactoferrine chez des patients atteints du syndrome des jambes sans repos connu également sous le sigle RLS. Elle a été effectuée sur deux sites : à Strasbourg et au

CHRU de Lille.

Objectifs de l'étude

L'objectif principal est de comparer la situation des patients atteints du syndrome des jambes sans repos avec carence martiale modérée préexistante à l'étude clinique (avant traitement à la lactoferrine bovine) avec l'effet éventuel observé sur l'évolution de cette carence en fer après traitement par la lactoferrine bovine. L'objet de l'étude est également de mesurer les bénéfices obtenus sur la carence en fer des patients par la mesure d'un biomarqueur impliqué dans le métabolisme du fer (taux de ferritine circulante). L'objectif secondaire est de comparer la symptomatologie des mêmes patients atteints du syndrome des jambes sans repos avec l'effet éventuel observé sur l'évolution de cette symptomatologie après traitement par la lactoferrine bovine

La recherche consiste donc à étudier les bénéfices éventuels sur les symptômes du syndrome des jambes sans repos et sur l'anémie des patients de la prise de lactoferrine dans des doses standards de 200mg par jour.

Objectif principal de l'Etude: amélioration du taux de ferritine circulante

Au cours de l'étude clinique, l'objectif principal a été de mesurer l'évolution du taux de ferritine sanguin des patients inclus dans l'étude.

Objectif secondaire : amélioration significative du score RLS Pour mesurer la gravité du syndrome, il a été établi à un niveau international, un questionnaire standardisé et mondialement reconnu (IRLS International Restléss ^" Legs Syndrome Rating Scàle rédigé par l'International Restless Legs Syndrom Study Group, en français : Questionnaire de sévérité du syndrome des Jambes sans repos) pour évaluer et quantifier la gêne occasionnée par la maladie. Ce questionnaire comprend 1Θ questions, qui évaluent le degré d'incorrfort causé par là maladie. Le patient est invité à répondre à chacune des questions en donnant une notre comprise entre 0 et 4 (la note 0 correspondant à l'absence de trouble et la note 4 à un ^" â-ou^ë¾le-sévéfité maximale). A l'issue des questionnaires, les 10 valeurs obtenues sont sommées et aboutissent à l'élaboration d'un score final (compris entré 0" et 40) qui permet d'évaluer le degré de sévérité du syndrome (appréciant notamment, la fréquence des crises, leur durée, leur conséquence sur la qualité du sommeil ainsi que leur impact sur l'humeur et la vie sociale (tes patients) :

^• Score compris entre 0 et 10 : syndrome des jambes sans repos léger

^• Score compris entre 11 et 20 : syndrome des jambes sans repos modéré

^• Score compris entre 21 et 30 : syndrome des jambes sans repos sévère

^• Score compris entre 31 et 40 : syndrome des jambes sans repos très sévère.

Au cours dè ët dè clïnfque, Objectif secondaire a été de faire remplir par les patients recrutés dans l'essai le questionnaire avant et après traitement, afin d'évaluer l'impact de la prise de lactoferrine en terme de bénéfice et de confort de vie pour le patient.

Description de la population étudiée

La population étudiée concerne les patients atteints du syndrome des jambes sans repos, dont le trouble a été clairement diagnostiqué. La maladie apparaissant à des âges très divers et existant chez les deux sexes, il n'y a pas eu, dès lors que la personne est majeure, de critères d'élimination en fonction de l'âge ou du sexe des patients.

Pour s'assurer une meilleure appréciation intrinsèque du traitement, ont été inclus des patients atteints du syndrome des jambes sans repos à l'exclusion d'autre trouble du sommeil associé (apnée du sommeil, par exemple), sauf si ces troubles sont traités et stabilisés (par un médicament ou un dispositif médical) depuis une période d'au moins trois mois, avant le recrutement dans l'étude.

Par ailleurs, ont été également exclues d'emblée de l'étude les personnes présentant des comorbidités majeures (troubles cardiaques, rénaux, hépatique etc.).

Le fait d'avoir déjà été traité pour le syndrome des jambes sans repos par un produit autre que la lactoferrine ne constituait pas un obstacle à l'inclusion, dès lors que le traitement était soit arrêté depuis une période d'au moins un mois, soit stabilisé depuis une période d'au moins deux mois, et qu'il ne donnerait pas lieu à des modifications au cours de l'essai.

Critères d'inclusion

Les critères d'inclusion des patients étaient les suivants :

• Personne diagnostiquée pour le Syndrome des jambes sans repos

• Carence martiale modérée : Taux de ferritine sérique < 90ng/l (inférieur ou égal à 90 ng/1) en absence de syndrome inflammatoire

• Personne majeure, libre de son consentement

• Absence de traitement du syndrome des jambes sans repos depuis un mois ou traitement stable depuis au moins 2 mois, non modifié au cours de l'essai

• Intensité du syndrome de modéré à très sévère IRLS > 15

• CRP et Vitesse de sédimentation normales

• Affiliation à un régime de sécurité sociale

Critères de non-inclusion

Les critères de non-inclusion étaient les suivants :

• Femme enceinte

• Allergie connue aux produits laitiers*

^• Comorbidité avec un trouble affectant le sommeil non stabilisé par un traitement depuis au moins 2 mois

· Comorbidité majeure

• Niveau de ferritine sérique >90ng/l

• Participation concomitante à un autre essai clinique

^• Modification du traitement de fond contre le Syndrome des jambes sans repos dans les 2 derniers mois avant l'inclusion ou au cours de l'essai

· Patients bénéficiant déjà d'un traitement contenant du fer (période de wash- out d'un mois préalable à l'inclusion)

^• Capacité linguistique et cognitive suffisante pour remplir le questionnaire

^• Etre sous sauvegarde de justice ou tutelle * Bien qu'elles existent, les allergies à la lactoferrine sont rares, et en général inconnues du patient. Les allergies les plus fréquents aux produits laitiers concernent le lactose ou les grosses protéines du lait (caséine, albumine). En ce qui concerne l'essai, on optera, par sécurité, pour une exclusion systématique des personnes présentant une allergie quelconque aux produits laitiers.

Critères d'évaluation

Critère principal

Le critère d'évaluation principal est l'augmentation significative de la ferritinémie. Traditionnellement, le taux de ferritine sanguine est considéré comme normal pour des valeurs comprises entre 50 et 300ng/l. Ces valeurs ont été calculées sur la base de paramètres hématologiques. Les valeurs de la ferritinémie normale donnent lieu à de plus en plus de discussions au sein des la communauté des neurologues spécialistes du syndrome des jambes sans repos. Et, Il apparaît, dans le cadre de cette pathologie, que la limite basse du taux est probablement insuffisante et que la normalité se situerait (selon les groupes ethniques] plutôt entre 75 et 300 ng/1. (Racial différences in restless legs symptoms and sérum ferritin in an incident dialysis patient cohort. Int Urol Nephrol. 2012 Dec;44(6):1825-31. Kutner NG, Zhang R, Huang Y, Bliwise DLJ.

Par ailleurs, les patients atteints du syndrome des jambes sans repos et présentant une carence en fer modérée, peuvent avoir des taux de ferritine sanguine très variable entre 10 et 90 ng/1.

En conséquence, le paramètre statistique choisi pour estimer l'impact du traitement sur le taux de ferritine a été la mesure d'une remontée du taux de ferritine en calculant la différence entre la valeur du taux de ferritine avant l'administration de lactoferrine et après l'étude. Cette remontée est considérée comme significative, dès lors que l'augmentation du taux est supérieure ou égale à 20ng/l.

Critère secondaire

Le critère secondaire est constitué par l'amélioration de la symptomatologie : score obtenu au questionnaire de sévérité du syndrome des jambes sans repos avant inclusion ( ₀ ) et à l'issue du traitement (T ₃ ).

Déroulement de la recherche

Dans le cadre de cette recherche, 24 patients majeurs ont été recrutés pour une période de 3 mois, au cours de laquelle ils ont pris, en aveugle, deux fois par jours, avant le repas de midi et du soir, lOOmg de lactoferrine bovine.

Modèle statistique

Description des méthodes statistiques prévues

Le protocole d'études statistiques sera établi comme suit :

• Analyse unique, pas d'analyse intermédiaire

^• Les sujets sont appariés, pour chaque sujet, on comparera la mesure avant (à To) avec la mesure après (à T ₃ ].

^• L'essai est multicentrique (2 centres), les analyses seront donc ajustées sur le centre.

^• 1 seul critère principal : réponse à la ferritine, un biomarqueur sanguin. Il s'agit d'une donnée quantitative continue.

^• Critères secondaires n'influant pas le calcul du nombre de sujets nécessaires : score simplifié résultant du questionnaire IRLS.

^• Analyse descriptive des données et analyse des données manquantes

^• Analyse de variance du critère principal ajustée sur le centre

^• Analyse de variance du critère secondaire ajustée sur le centre • Les tests sont tous effectués de manière bilatérale.

• Test de significativité réalisé pour un risque alpha de 5%

Nombre prévu de personnes à inclure dans la recherche, avec sa justification statistique Le nombre prévu de personnes dans la recherche est justifié par les données suivantes :

• Mesures étudiées :

o Différence entre la valeur à T ₀ et à T ₃ (3 mois) du biomarqueur sanguin

(notée Delta (To, T ₃ )

o Critère secondaire n'influant pas le calcul du nombre de sujets nécessaires : score résultant du questionnaire IRLS

• Test de comparaison bilatéral :

o Hypothèse nulle : La moyenne du Delta (To, T ₃ ) est nulle. Aucun effet du traitement.

o Hypothèse alternative : La moyenne du Delta (To, T ₃ ) est non nulle. Le traitement a un effet positif ou négatif,

o Risque alpha =5%

o Puissance = 90%

o Ecart minimum à détecter entre To et T ₃ = 20

o Ecart-type de la différence entre To et T ₃ =25

o Nombre de sujets nécessaires = 17

^• degré de signification statistique prévu ;

o Risque alpha = 5%, il y a un critère principal et aucune analyse intermédiaire.

Le recrutement est majoré de 41% pour tenir compte de l'éventuelle perte de puissance due aux données manquantes.

Choix des personnes incluses dans les analyses.

Tous les patients recrutés qui répondent aux critères d'inclusion et qui ne présentent aucune violation au protocole ont été inclus dans l'analyse. L'analyse a été conduite en intention de traiter.

Résultat de l'étude

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 :

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 :

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 :

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 :

Tableau 1 : Récapitulatif des données obtenues patient par patient

Matériels et Méthodes

Les données ont été fournies à partir d'un fichier au format tableur. Tout le traitement des données a été réalisé avec le logiciel R.

Le patient LIL56 a été sorti de l'étude pour non-respect des critères d'inclusions. Ainsi, l'étude statistique ne porte que sur 23 sujets, 13 provenant de Strasbourg (identifiant débutant par STR) et 10 provenant de Lille (identifiant débutant par LIL). Le patient STR62 présentant à T3 un taux de Ferritine <5 a été gardé dans l'étude avec un taux fixé arbitrairement à 5.

Les tests statistiques réalisés dans la partie analyse descriptive des données et visant à comparer les centres sont le test de Student pour les variables quantitatives et le test de Khi-2 ou le test de Fisher (si le test du Khi-2 n'est pas applicable) pour les variables qualitatives.

Distribution de l'âge des sujets dans les deux centres

L'âge présente une forte dispersion des valeurs avec un minimum à 20 ans et un maximum à 80 ans et un écart-type de près de 18 ans. 50% des sujets ont plus de 60 ans et 25% ont plus de 68,5 ans. L'âge moyen de l'échantillon est 57 ans (56.78).

Au vu des indicateurs statistiques, il semblerait que l'échantillon provenant de Strasbourg soit plus jeune (moyenne, médiane et quartiles 25% et 75% plus faibles que ceux de Lille), toutefois le test statistique ne conclut pas à une différence significative entre les 2 centres (probabilité du test de Student = 0.33> 5%). Les dispersions sont très proches (écarts-types = 17.91 et 17.39). Conclusion

Les échantillons recrutés dans les 2 centres sont tout à fait comparables au moment du recrutement. Le Tableau 2 présente un résumé de l'analyse descriptive de chaque variable. Par ailleurs, l'ordre d'inclusion ne semble pas avoir créé de biais dans les données.

Les données semblent donc tout à fait correctes pour procéder à l'analyse de l'essai clinique.

Global Lille Strasbourg P*

Age. Moyenne (Min-Max) " 56.8 (20-80) 61 (20-80) 53.5 (20-80) 0.33

Sexe H/F, N (%) 6/17 (26.1/73.9) 1/0 ( 10/90) 5/8 (38.5/61.5) o. is

Trait, de fond Oui/Non, {%) 16/7 (69.6/30.4) 8/2 (80/20) 8/5 (61.5/38.5) 0.41

Score RLS à TO. 28.5 (17-38) 28.2 (17-35) 28.7 (20-38) 0.86

Ferritine à TO, Moyenne (Min-Max) 36.5 (7-8S) 41 ( 16-88) 33.1 (7-69) 0.36

Tableau 2 : Résumé de l'analyse descriptive des variables à To *p est la probabilité du test de comparaison dans les deux centres

Analyse de l'essai clinique

2 critères sont éttKrrés ^~ :"fe-scoreda questionnaire RLS et le taux de Ferritine

Score du questionnaire RLS

La figure n°l et le tableau n°3 représentent la distribution de l'évolution du score du questionnaire RLS entre T ₀ et T ₃ (delta correspondant au score à T ₃ - score à To). La distribution est tracée par centre et tous centres confondus.

La Figure 1 représente des boîtes à moustaches comparatives de l'évolution du score au questionnaire RLS

- Les lignes A, C, E représentent les valeurs maximales de l'échantillon

Les lignes B, D, F représentent les valeurs minimales de l'échantillon - Les lignes G, H, 1 représentent la médiane des données (la valeur qui partage l'échantillon en deux groupes d'effectifs égaux)

- Les extrémités des boîtes Ql représentent le premier quartile

Les extrémités des boîtes Q3 représentent le troisième quartile Min Q. 25% 1 Médiane Moyenne Q, 75% îVlàx Ecart- type N

Lille -17.00 -1 1.50 -5.00 -5.00 2.00 5.00 7.86 10

Strasbourg -15-00 -8.00 -3.00 -3.85 -1.00 8.00 5.74 13

Strasbourg + Lille -17.00 -8.50 -3.00 -4.35 -0.50 8.00 6.60 23

Tableau 3 : Indicateurs statistiques de l'évolution du score au questionnaire RLS (Delta =

T3-T0)

Globalement, le score diminue entre T0 et T3 puisque sur l'échantillon global, 75% des sujets ont un delta négatif, correspondant à un effet positif (c'est-à-dire une amélioration moyenne à forte) du traitement par la lactoferrine. En moyenne, le score diminue de 4.35 points sur l'échantillon global. L'effet est plus fort pour Lille avec une réduction de 5 points du score contre seulement 3.85 pour Strasbourg. Les écarts-types sont non négligeables car tous supérieurs aux moyennes observées (en valeur absolue). Il y a donc une disparité importante de l'évolution du score entre les sujets, la disparité est plus importante dans le centre de Lille.

Résultats du modèle : Après avoir défini la meilleure configuration de l'effet aléatoire, on teste les effets fixes (effet centre, effet sexe, effet traitement de fond, effet traitement testé). De l'ensemble de ces résultats, on en déduit que :

- L'effet centre n'est pas significatif (p=0.7218). On le garde tout de même dans le modèle comme facteur d'ajustement.

- Les effets sexe et prise d'un traitement de fond n'ont pas d'effet significatif (respectivement, p = 1 et p= 0.434).

On ne les inclut pas dans le modèle testant l'effet traitement.

- L'effet du traitement avec la lactoferrine est très significatif (p=0.003302), il fait réduire de manière significative le score.

On procède alors au test de Student car les données suivent une loi normale. La probabilité du test confirme que le delta moyen est significativement différent de 0 (probabilité du test = 0.004563 < 5%). Les résultats convergent donc bien avec ceux de la modélisation.

Conclusion : Il y a un effet significatif du traitement en termes d'amélioration de la symptomatologie des patients. En moyenne, le gain en score est de 4.35 points.

Taux de ferritine La figure 2 et le tableau 4 représentent l'évolution du taux de Ferritine entre T0 et T3 (taux à T3 - taux à TO). La Figure 2 représente des boîtes à moustache comparatives de l'évolution du taux de ferritine

Min Q, 25% Médiane Moyenne Q. 75% Max Ecart-type N

Lille -23.00 -4.75 -1.50 Î .90 14.00 22,00 14.25 10

Strasbourg -14.00 -6.00 -2.00 -0.23 6.00 24.00 10.30 13

Strasbourg -Lille -23.00 -6.00 -2.00 0.70 7.00 24.00 1 1.92 23

Tableau 4 : Indicateurs statistiques de l'évolution du taux de ferritine (Delta = T3-T0) On observe une très grande dispersion dans les résultats. On observe un minimum à -23 et un maximum à 24, soit une étendue de 47. Les écarts-types sont tous très nettement supérieurs aux moyennes. Il y a donc une très grande variabilité entre les sujets. La variabilité est plus importante dans l'échantillon provenant de Lille. Les médianes par centre et tous centres confondus sont très proches entre elles ainsi que de la valeur 0. La moyenne du delta de Lille est la plus élevée à 1.9.

Résultats du modèle : Après avoir défini la meilleure configuration de l'effet aléatoire, on teste les effets fixes (effet centre, effet sexe, effet traitement de fond encours stabilisé, effet traitement testé). De l'ensemble de ces résultats, on en déduit que :

De l'ensemble de ces résultats, on en déduit que :

- L'effet sexe est significatif (p=0.008148). Les femmes ont un taux de Ferritine globalement plus faibles que les hommes. On inclut donc cet effet dans le modèle qui teste l'effet traitement.

- L'effet centre est significatif dans le modèle incluant l'effet sexe (p=0.01572). Les sujets de Strasbourg ont tendance à avoir un taux plus faible.

- L'effet traitement de fond (oui/non) est en limite de significativité (p=0.06224). La prise d'un traitement de fond peut avoir tendance à augmenter le taux de Ferritine. Cet effet est inclus dans le modèle qui teste l'effet traitement.

- L'effet traitement par la lactoferrine n'est pas significatif (p=0.6821) sur le taux de ferritine.

La modélisation ayant montré un effet significatif du centre et du sexe, il n'est pas recommandé de procéder à une analyse simple qui n'en tiendrait pas compte (du type test de Student).

Conclusion : Le traitement par la lactoferrine n'a pas d'effet significatif sur le taux de Ferritine.

Conclusion générale Le traitement a un effet significatif sur l'évolution en 3 mois du score au questionnaire RLS. En moyenne, le score est réduit de 4.35 points. On observe une forte disparité des évolutions des scores

entre les sujets (25% des sujets ont une amélioration du score de 8.5 points alors que 25% des sujets ont un score qui n'a quasiment pas changé ou a augmenté (delta > -0.5]).

En revanche, l'analyse statistique ne permet pas de conclure à un effet significatif du traitement sur le taux de Ferritine.

L'apport de lactoferrine aux patients inclus dans l'étude clinique montre statistiquement une amélioration de la symptomatologie dans 75% des cas avec une dose de 200mg par jour.

Une posologie préférée comprise entre 200 et 800mg/jour de lactoferrine est recommandée chez les patients pour moduler les effets de sévérité du RLS et en fonction de la durée de ce traitement.

On constate que le taux de ferritine, en tant que tel, qui est connu pour être un marqueur de l'anémie lorsqu'il est faible, ne peut être considéré comme un marqueur fiable (causal) du RLS.

L'apport de fer par la lactoferrine n'a pas montré d'effet significatif et ne doit pas être considéré comme le seul produit actif de traitement de l'anémie chez des patients atteints de maladies neurologiques non-neurodégénératives.

A. EXEMPLES

Exemple n°l: composition pharmaceutique

La composition de lactoferrine à administrer par voie orale comprend :

- Le principe actif qui est la lactoferrine lyophilisée (ou fragments de lactoferrine ayant conservés leurs propriétés thérapeutiques) extraite du lait bovin ou Lactoferrine humaine recombinante purifiée (25 à 45% du poids sec) avec un niveau de saturation en fer compris entre 0 et 90%, de préférence entre 0 et 50% et de manière optionnelle au moins l'un des éléments suivants : un excipient, un liant et un anti-agglomérant. Sont ajoutés éventuellement un colorant et un support de délivrance tel que gélule ou cachet. De manière optionnelle, ces compositions peuvent également contenir les éléments suivants : sels ferreux ou ferriques, dont la concentration représente un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, ainsi qu'éventuellement de l'acide sialique dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, des acides gras polyinsaturés par exemple des omega-3 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, et des omega-6 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition.

A titre d'exemple, une présentation pharmaceutique selon l'invention comprendra dans un support de type gélule, de la lactoferrine lyophilisée (lOOmg) et de l'amidon tel que l'amidon de maïs (450mg). A titre d'exemple, cette composition est utilisée, à un dosage quotidien du principe actif compris entre 100 et 400 mg/jour pour un sujet de 70Kg en une ou plusieurs prises :

- Comme traitement thérapeutique dans le syndrome des jambes sans repos (maladie de Willis-Ekbom), le syndrome de Gilles de la Tourette, le trouble du déficit de l'attention (ADHD) et la myoclonie nocturne.

- Comme complément alimentaires dans le syndrome des jambes sans repos (maladie de Willis-Ekbom), le syndrome de Gilles de la Tourette, le trouble du déficit de l'attention (ADHD) et la myoclonie nocturne.

Dans le cadre d'une utilisation thérapeutique la composition doit être administrée en tenant compte des éléments suivants :

^• La posologie appropriée est selon l'âge et le profil du patient comprise entre 50 et 400mg/ jour, idéalement en deux prises

^• La durée du traitement s'étend sur une période minimum d'un mois sans limite de durée

· Il n'y a pas d'interactions connus de la lactoferrine avec d'autres composés. La lactoferrine peut donc être utilisée seule ou en accompagnement d'un autres traitement. • La lactoferrine est administrée par voie orale deux fois par jours avant les repas (la lactoferrine est dégradée par un excès d'acidité dans l'estomac).

• La réalisation facultative d'un test diagnostic préalable pour évaluer le taux de ferritine sérique

· La vigilance s'impose pour les personnes allergiques aux produits laitiers, même si l'allergie la plus fréquente concerne le lactose

Exemple n°2: Composition nutraceutique Une composition nutraceutique contenant de la lactoferrine extraite du lait de vache ou du petit lait, est constituée par de :

- La lactoferrine, selon l'invention, (ou des fragments de lactoferrine ayant conservés leurs propriétés thérapeutiques) est à un niveau de saturation en fer compris entre 0 et 90%, de préférence entre 0 et 50% représentant entre 0,1 et 10g pour 100 kcal. De manière optionnelle la lactoferrine est associée aux éléments suivants : sels ferreux ou ferriques, dont la concentration représente un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, ainsi qu'éventuellement de l'acide sialique dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, des acides gras polyinsaturés tels que des omega-3 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, et des omega-6 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition. La composition peut également à titre de variante ne contenir que de la lactoferrine purifiée selon l'invention.

- La dite composition nutraceutique peut entrer dans la fabrication d'un aliment, d'un aliment pour les animaux tels que le bétail, aliments pour les animaux de compagnie, d'une formulation nutritionnelle, d'une boisson, d'un additif alimentaire pour l'adulte ou l'enfant

- Cette composition peut être par ailleurs une source de protéines, de lipides, de glucides.

- Cette composition contient de la lactoferrine sous forme sèche, telle qu'un lyophilisât, qui est une forme stabilisée. Cette composition est utilisée quotidiennement :

- Comme supplément dans l'alimentation pour améliorer les symptômes des patients atteints du syndrome des jambes sans repos (maladie de Willis-Ekbom), du syndrome de Gilles de la Tourette, du trouble du déficit de l'attention (ADHD) et de la myoclonie nocturne.

A titre indicatif, la composition comprend pour 100ml de boisson lactée 0,2g de lactoferrine bovine purifiée. Les laits stérilisées par Ultra Haute Température (UHT) (supérieurs à 70°c) sont appauvris ou dépourvus en lactoferrine. L'ajout de lactoferrine humaine recombinante purifiée ou bovine ou extraite stérilement à ces laits produits commercialement, permet de compenser le taux résiduel très réduit de lactoferrine et de constituer une composition nutraceutique utile pour les personnes adultes et enfants ayant un déficit en fer. Cette composition comprend par litre de lait UHT 10 à 100 mg de lactoferrine pour 100ml de lait.

Exemple n°3: Complément alimentaire

Une composition comestible à base de lactoferrine extraite du lait de vache ou du petit lait utilisé comme complément alimentaire contient :

La lactoferrine (ou des fragments de lactoferrine ayant conservés leurs propriétés thérapeutiques) à un niveau de saturation en fer compris entre 0 et 90%, de préférence entre 0 et 50% représente entre 0,1 et 25g pour lOOkcal, et de manière optionnelle les éléments suivants : sels ferreux ou ferriques, dont la concentration représente un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, ainsi qu'éventuellement de l'acide sialique dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, des omega-3 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition, et des omega-6 dans un rapport compris entre 0,1% et 10% du poids total de la composition.

- La dite composition peut entrer dans la fabrication d'un aliment à usage humain ou d'un aliment pour animaux (tels que le bétail, les chevaux, les animaux de compagnie comme les chats ou les chiens], d'une boisson, d'un additif alimentaire ou dans une formulation nutritionnelle. - Eventuellement un diluant ou solvant tel que liquide (eau ou lait par exemple aromatisée ou non) permettant la mise en suspension ou la réalisation d'une solution de lactoferrine ou contenant de la lactoferrine.

La dite composition peut être par ailleurs une source de protéines, lipides, glucides, qui auront été sélectionnées selon les besoins.

- La lactoferrine peut être ajoutée sous forme de poudre, de lyophilisât, de solution.

Cette composition peut être utilisée quotidiennement ou sous forme retard de manière hebdomadaire par exemple:

- comme complément alimentaire pour améliorer les symptômes des patients atteints du syndrome des jambes sans repos (maladie de Willis-Ekbom), du syndrome de Gilles de la Tourette, du trouble du déficit de l'attention (ADHD) et de la myoclonie nocturne et autres pathologies neurologiques et psychiatriques. Une liste de références bibliographiques est incluse afin d'illustrer l'art antérieur existant avant la conception et la réalisation de la présente invention sans pour autant en limiter les variantes.

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