Bakterielle Luziferasen sind in Anwesenheit von reduzier¬ tem Flavo ononukleotid {FMNH2 ) , Sauerstoff und langket- tiσen aliphatischen Aldehyden in der Lage, Biolumines- zenzliσht zu erzeugen:

Luziferase FMNH2 + 0 ₂ + Aldehyd > FMN + H20 + Säure + Licht

Invitro spricht die Luziferase auf Aldehyde mit Ketten¬ längen von 8 bis 18 Kohlenstoffatomen mit einem Maximum bei 14 Kohlenstoffatomen an. Die sehr effektive Umsetzung von chemischer Energie in Lichtenergie ermöglicht den Nachweis extrem niedriger Konzentrationen von beispiels¬ weise FMNHa oder Aldehyden. Auf diese Tatsache ist es zurückzuführen, daß sich bakterielle Luziferasen für ein attraktives Nachweisverfahren für die oben genannten und daran zu koppelnden Substanzen geeignet sind (beispiels¬ weise NAD über eine NADH-FMN-Oxidoreduktase) .

Eine Teilaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere w-(1,4-Chinonyl)-alkanale vorzusehen.

Dazu wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein w-(1,4-Chinonyl)-alkanal der allgemeinen Formel

vorgesehen, das in 3-, 5- und/oder 6-Stellung substitu-

iert sein kann, wobei n eine ganze Zahl von 7 bis 15 ist. Hinsichtlich der Substitution kann auf dem Stand der Technik verwiesen werden, beispielsweise Fieser et. al. , JACS., 64 (1942) 2060-2065.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung dieses Alkanals vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein 1,4-Chinon der allgemeinen Formel

das in 3-, 5- und/oder 6-Stellung substituiert sein kann, mit einer Carbonsäure der allgemeinen Formel

H0 ₂ C-(CH ₂ ) _n -X alkylier ,

(a) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 15 und X eine 0H- Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal oxydiert oder

(b) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 14 und X eine -CO∑H-Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal reduziert oder

(c) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 14 und X eine -Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal oxydiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein w-(l,4-Chinonyl) -alkanal der allgemeinen Formel

ERS

in der

Ri , R2 und R3 gleich oder verschieden sein können und jeweils ein asserstoffatom, ein Halogenatom (nämlich Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom), einen OH-, einen SH-, einen NH2-, einen Ci-3 -Alkoxy- oder einen Ci-3 - Alkylrest bedeuten, oder

R2 und R3 zusammen eine gesättigte oder ungesättigte C3-4-Kohlenwasserstoffkette bilden, die mit ein oder zwei Resten aus der durch Halogenatome (nämlich Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatome), OH-, SH-, NH2-, Ci-s- Alkoxy- oder Ci-3-Alkylreste gebildeten Gruppe substi¬ tuiert sein kann, und Ri die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt.

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Alkanals, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein 1,4-Chinol der allσemeinen Formel

in der

Ri , R2 und R3 die in Anspruch 2 angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit einer Carbonsäure der allgemeinen Formel

HOa C-(CH ₂ ) n -X alkyliert,

(a) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 15 und X eine OH- Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal oxydiert oder

(b) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 14 und X eine -Cθ2H-Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal reduziert oder

(c) in der n eine ganze Zahl von 7 bis 14 und X eine -CH=CH2 -Gruppe bedeutet, und das Reaktionsprodukt zum Alkanal oxydiert.

Der erste Syntheseschritt (a) besteht also in der Alkylierung der 1, 4-Chinone mit w-funktionalisierten Carbonsäuren. Andere Verfahren zur Alkylierung von Chinonen haben den Nachteil, daß zuerst instabile und damit reaktionsfähige Alkylierungssubstrate hergestellt werden müssen und die Ausbeuten bei langkettigen Derivaten sehr gering sind. Darüberhinaus macht die ter inale Funktionalität den Syntheseweg zusätzlich kompliziert. Mit der erfindungsgemäßen Synthese können diese Nachteile vermieden werden.

Grundlage für die erfolgreiche Alkylierung war die von Jacobsen und Torssell beschriebene homolytische Spaltung durch oxydierende Decarboxylierung; vgl. Liebigs Ann. Chem., 763 (1972) 135-147. Diese Autoren haben für kurzkettige Carbonsäuren eine Alkylierung von Chinonen zeigen können. Bei der Erfindung vorausgehenden Untersu¬ chungen stellte sich heraus, daß diese Reaktion mit einigen Modifikationen im Gegensatz zu den meisten

anderen Reaktionen auch für langkettige Carbonsäuren gute Ergebnisse liefert. Die leichte Zugänglichkeit der Substrate und die einfache experimentelle Ausführung der Reaktion sind bestechend. Die Ausbeuten bei langkettigen Aldehydderivaten fallen im Vergleich zu den kurzkettigen Derivaten keinesf lls so unbefriedigend aus, wie man es von anderen Synthesewegen her kennt. Es sind sowohl Hydroxycarbonsäuren als auch Dicarbonsäuren oder ungesättigte Carbonsäuren als Substrate einsetzbar.

Der zweite Syntheseschritt (b) , die Umwandlung der Alkylierungsprodukte in die entsprechenden Aldehyde, erfolgt auf unterschiedlichen Wegen.

So kann man eine Hydroxylfunktion bis zur Aldehydstufe mit Hilfe von Pyridiniu -chlorochromat oxydieren; vgl. Corey & Suggs , Tetrah. Lett. , 31 (1975) 2647-2650.

Eine Carboxylfunktion kann man durch Hydroborierung mit Borandimethylsulfid und anschließende Oxidation mit Pyridinium-chlorochromat in den Aldehyd überführen; vgl. Brown et. al. , Synthesis, (1979) 704-705, Thieme-Verlag.

Terminale Doppelbindungen kann man oxydativ über die Diolbildung mit Osmiumtetroxid und anschließende Perjodatspaltung in den Aldehyd umwandeln.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine w- Hydroxycarbonsäure mit n = 10 bis 15, eine Dicarbonsäure n = 7 bis 13 oder eine w-ungesättigte Carbonsäure mit n = 10 bis 14 verwenden.

Gemäß einer speziellen Ausfuhrungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens kann man homolytisch alkylieren, indem man mit Hilfe eines Persulfats oxydierend dicarboxyliert. Dazu kann man in Gegenwart eines Silberkatalysators arbeiten. Ferner kann man diese homolytische Alkylierung in einem Wasser-Acetonitril-Gemisch durchführen, beispielsweise bei einem Volumenverhältnis von etwa 1:1, vorzugsweise in der Wärme, beispielsweise bei der Siedetemperatur des Gemischs.

Schließlich betrifft die Erfindung gemäß einer Ausfüh¬ rungsform die Verwendung der erfindungsgemäßen Alkanale oder sonstiger w-(1,4-Chinonyl)-alkanale, beispielsweise die Verwendung der Alkanale des Stands der Technik, als Substrat für bakterielle Luziferasen. Die Verwendung kann in einem Biosensor erfolgen.

Nachstehend wird die Erfindung durch Figuren, allgemeine Arbeitsvorschriften und Beispiele näher erläutert. Es zeigen:

Abbildung 1: Aktivität der bakteriellen Luziferase aus Vibrio harveyi in Abhängigkeit von der Konzentration verschiedener Aldehyde. N-Decanal dient als Standardver¬ gleichsaldehyd.

BQ9A = 9-(1, 4-Benzochinon-2-yl) -nonanal

UQ9A = 9-(5, 6-Dimethoxy-3-methyl-l, 4-benzochinon-2-yl)- nonanal NQ9A = 9- (1,4-Naphthochinon-2-yl) -nonanal VitK3-9A = 9- (3-Methyl-l,4-naphthochinon-2-yl)-nonanal RLU/s = Relative Lichteinheiten/s Abbildung 2:

Substratspezifität der bakteriellen Luziferase aus Vibrio harveyi und Photobacterium fischeri bezüglich der Aldehytkettenlange für die 1,4-Naphthochinonderivate.

NQ9A = 9-(1,4-Naphthochinon-2-yl)-nonanal RLU/s = Relative Lichteinheiten/s

Allgemeine Arbeitsvorschriften

I. Zur Alkylierung von Chinonen

12 mmol Chinon werden mit 10 mmol Carbonsäure und 1,5 mmol AgNθ3 in 100 ml H2O/Acetonitril (1:1) unter Rückfluß (78 °C) gelöst. Zu der klaren Reaktionslösung werden innerhalb von 35 Minuten 12 mmol einer 1-molaren (NH )2S2Oβ -Lösung zugetropft. Nach weiteren 10 Minuten wird die Reaktion abgebrochen und die Lösung mehrfach mit Ether ausgeschüttelt. Die Ether-Acetonitril-Phase wird über MgS0 ₄ getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (in CH2CI2 gegebenenfalls mit 1 bis 4 % Methanol) getrennt, und man erhält das reine Alkylchinon.

II. Zur Umwandlung von einer Säure- in eine Aldehydfunk¬ tion

5 mmol Säure werden unter Stickstoffatmosphäre in ca. 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst, über ein Septu werden 5 mmol Di ethylsulfidboran (DMSB) (2 M in THF) aus einer Spritze unter Stickstoff bei Raumtempera¬ tur zuσetropft. Ist die erste Hälfte des DMSB zugegeben und die Wasserstoffentwicklung abgeklungen, wird die Lösung zum Sieden erhitzt. Der Rest des DMSB wird vorsichtig zugetropft und die Reaktion 1 Stunde unter leichtem Rückfluß gehalten. Anschließend wird Lösungsmit¬ tel und restliches DMSB unter Vakuum abgezogen und der Rückstand in ca. 10 ml wasserfreiem Dichlormethan aufgenommen. In einem zweiten Reaktionskolben werden 7,5

mmol Pyridinium-chlorochromat (PCC) in ca. 10 ml wasserfreiem Dichlormethan vorgelegt und die frisch hergestellte Alkylboranverbindung unter kräftigem Rühren dazugetropft. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde unter Rückfluß gekocht und dann mit 40 ml trockenem Diethyl- ether versetzt. Die Lösung wird von dem braunen Rückstand dekantiert und jener noch dreimal mit Diethylether nachgewaschen. Die vereinigten Lösungen werden über eine kurze Kieselgelsäule filtriert und das Filtrat vom Lösungsmittel befreit. Das Reaktionsprodukt wird säulen- oder dünnschichtchromatographisch getrennt.

III. Zur Oxidation einer Alkohol- zu einer Aldehydfunk¬ tion

4,3 mmol des Alkohols werden in 5 bis 10 ml trockenem CH∑ CI2 gelöst und zu 6,45 mmol Pyridinium-chlorochromat (PCC) in ca. 9 ml trockenem CH2 CI2 langsam zugetropft. Nach 2-stündiger Reaktion bei 30 °C werden 20 ml trockener Ether dazugegeben und die Lösung von dem braunen Rückstand abdekantiert. Der Rückstand wird noch dreimal mit je 10 ml Ether gewaschen und die vereinigten Lösungen über eine kurze Kieselgelsäule filtriert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abzogen und der Rückstand in CH2 CI2 aufgenommen.

Beispiel 1 Synthese von 15- (1 , 4-Naphthochinon-2-yl) -pentadecanal

2- (15-Hydroxy-pentadecyl) -1 , 4-naphthochinon Arbeitsvorschrift: I

Edukte: 1,58 g (10 mmol) Naphthochinon, 2,8 g (10,3 mmol) 16-Hydroxyhexadecansäure

Reinigung: saulenchromatographisch (150 g Kieselgel in

CH2CI2 1-4 % MeOH) , Kristalle aus CH2 Cl ₂

Ausbeute: 1 g (2,6 mmol, 38 %) , gelbe Kristalle

Schmp. : 93-95 °C

H-NMR (CDCI3 , 400 MHz) : 1.26 - 1.42 (m; 22H, IICH2 ) ,

1.53 - 1.61. (m; 4H, 14-CH ₂ , 2-H) , 2.56 (dt, Jι , ₂ =

7.7 Hz, Ji , chinon-H = 1.2 Hz; 2H, I-CH2 ) , 3.64 (t, Ji4 ,i3 = 6.6 Hz; 2H, 15-CH ₂ ) , 6.79 (t, J ₃ , 1 = 1.2 Hz; 1H, Chinon-H) , 7.73 (m; 2H, Aromaten-H) , 8.08 (m; 2H, Aromaten-H) . -

15-(1,4-Naphthochinon-2-yl)-pentadecanal

Arbeitsvorschrift: III, Reaktionstemp. 40 °C

Edukt: 780 mg (2 mmol) 2-(15-Hydroxy-pentadecyl) -1, - naphthochinon,

Reinigung: dünnschichtchromatographisch in Dichlormethan

Ausbeute: 535 mg (1,4 mmol, 70 %) , gelbe Kristalle

Schmp. : 65 °C

ⁱ -H-NMR (CDCls , 400 MHz) : 1.26 - 1.42 (m; 20H, IOCH2 ) ,

1.54 - 1.64 ( ; 4H, 3-CH2 , 14-CH ₂ ) ; 2.42 (dt, J ₂ ,3 = 7.3 Hz, Ji ,2 = 1.8 Hz; 2H, 2-CH2 ) , 2.57 (dt, J 13 , < 4 = 7.6 Hz, Ji5 ,ciinon-a = 1.2 Hz; 2H , 15-CH ₂ ) , 6.79 (t, Je.» inon-H ,13 = 1.2 Hz; 1H, Chinon-H), 7.73 (m; 2H, Aromaten-H) , 8.08 ( ; 2H, Aromaten-H) , 9.67 (t, Jι ,2 =

1.8 Hz; 1H, 1-CHO) .-

Beispiel 2

Synthese von 9-(1, 4-Benzochinon-2-yl) -nonanal

2- ( -Dec-9-enyl) -1 , 4-benzochinon

Arbeitsvorschrift: I

Edukte: 1,62 g (15 mmol) 1 , 4-Benzochinon, 1,82 g (10 mmol) 10-Undecensäure

Reinigung: saulenchromatographisch (400 g Kieselgel in

Cyclohexan/Ether (1:1))

Ausbeute: 690 mg (2,8 mmol, 28 %) , gelber Feststoff

Schmp.: 40 °C

ⁱ H- MR (CDCls , 400 MHz) : 1.29 - 1.35 (m; 10H, 5CH ₂ ) , 1.46 - 1.54 (m; 2H, CH ₂ ) , 2.03 ( ; 2H, 8-CH2 ) , 2.41 (dt, Ji ,2 = 7.7 Hz, Ji , chinon-H = 1.4 Hz; 2H, I-CH2 ) , 4.93 (dd, J ,ιocis = 10.3 Hz, Jgem = 2.0 Hz; 1H, 10b-CH2 ) , 4.99 (dd, Jg. iOtrans = 17.2 Hz , J g e m = 1.9 Hz ; 1H , 10a- CIΪ2 ) , 5.81 (ddt, Jθ. lOtrans = 16.9 HZ, J9 ,l0Cis =

10.1 Hz, Js . = 6.6 Hz; 1H, 9-CH ₂ ) , 6.56 (m; 1H, Chinon- H) , 6.71 (dd, J rtho = 10.2 Hz; Jmeta ^~ * 2.1 Hz; 1H, Chinon-H) , 6.75 (d, Jchinon-a = 10.2 Hz; 1H, Chinon-H) . -

9- (1,4-Benzochinon-2-yl) -nonanal

200 mg (0,81 mmol) Decenylbenzochinon werden in 50 ml Ether gelöst. Dazu kommen 140 mg (0,67 mmol) NaJθ4 in 10 ml Wasser und 3 Tropfen einer 2-proz. 0sθ4 -Lösung. Als Phasentransfervermittler wird eine Spatelspitze Adogen 464 dazugegeben. Die Reaktion erfolgt unter Stickstoff bei Raumtemperatur und kräftigem Rühren für 108 Stunden. Die Etherphase wird abgezogen und die wässrige Phase dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherphasen

werden über MgS0 ₄ getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Ausbeute: 50 mg (0,2 mmol, 25 %) , gelber Feststoff

ⁱ H-NMR (CDCla . 400 MHz) : 1.32 (m; 8H, 4CH ₂ ) , 1.46 - 1.54 (m; 2H, 8-CH2 ) , 1.61 - 1.66 ( ; 2H, 3-CH2 ) , 3.39 - 2.45 (m: 4H, 2-CH2 , 3-CH2 ) , 6.56 (m; 1H, Chinon-H) , 6.71 (dd, J rth = 10.0 Hz; Jmeta = 2.4 Hz; 1H, Chinon-H) , 6.76 (d, Jchinon-a = 10.2 Hz; 1H, Chinon-H) . 9.71 (t, Ji . z = 1.8 Hz; 1H, 1-CHO) .-

Beispiel 3 Synthese von 9-(5.6-Dimethoxy-3-methyl-l, 4-benzochinon-2- yl)-nonanal

9-(5,6-Dimethoxy-3-methyl-l,4-benzochinon-2-yl) -nonan- säure

Arbeitsvorschrift: I

Edukte: 1,82 g (10 mmol) 2,3-Methoxy-5-methyl-l , 4-benzo- chinon, 3,03 g (15 mmol) Decandisäure

Reinigung: saulenchromatographisch (350 g Kieselgel in

CH2CI2 2-5 % MeOH) , Kristalle aus CH2Cl ₂

Ausbeute: 840 mg (2,56 mmol, 26 %) , orange-rote Kristalle

ⁱ H-NMR (CDCls , 400 MHz) : 1.31 - 1.42 (m; 10H, 5CH ₂ ) , 1.60 - 1.65 ( ; 2H, 3-CH2 ) . 2.01 (s: 3H, CH ₃ ) , 2,35 (t. J2 ,3 = 7.5 Hz. 2H, 2-CH2 ) , 2.45 (m; 2H, 9-CH ₂ ) , 3.99 (2s; 6H, CHsO) .-

9-(5,6-Dimethoxy-3-methyl-l, 4-benzochinon-2-yl)-nonanal Arbeitsvorschrift: II

Edukt: 800 mg (2,36 mmol) 9- (5, 6-Dimethoxy-3-methyl-l, 4- benzochinon-2-yl) -nonansäure

Reinigung: dünnschichtchro atographisch in CH∑ CI2 1 %

MeOH

Ausbeute: 300 mg (0,93 mmol, 40 %) , oranges öl

^! H-N R (CDCI3 , 400 MHz) : 1.32 - 1.39 (m; 10H, 5CH ₂ ) , 1.59 - 1.65 (m; 2H . 3-CH ₂ ) ; 2.01 (s; 3H , CH3 ) , 2,44 (m; 4H, 9-H, 2-CH2 ) , 3.99 (2s; 6H, CH3O) , 9,76 (t, Jι , ₂ = 1.8 Hz, 1H, 1-CHO) .-

Beispiel 4

9-(3-Methyl-l , 4-naphthochinon-2-yl) -nonanal

9-(3-Methyl-l, 4-naphthochinon-2-yl)-nonansäure

Arbeitsvorschrift: I

Edukte: 5,16 g (20 mmol) 2-Methyl-l , 4-naphthochinon,

9,09 g (30 mmol) Decandisäure

Reinigung: saulenchromatographisch (470 g Kieselgel in

CH2CI2 2-4 % MeOH) , Kristalle aus CH2Cl ₂

Ausbeute: 5,14 g (15 mmol, 52 %) , hellgelbe Kristalle

^H-NMR (CDCI3 , 400 MHz) : 1.33 - 1.50 (m; 10H, 5CH ₂ ) ,

1.60 - 1.65 ( ; 2H, 3-CH ₂ ) . 2.19 (s; 3H, CHs ) , 2.35 (t,

Jz ,3 = 7.5 Hz, 2H, 2-CH2 ) , 2.62 (t, J β , 9 = 7.6 Hz ; 2H, 9-

CH2 ) , 7.68 ( ; 2H, Aromaten-H) , 8.08 (m; 2H, Aromaten- H) .-

9- (3-Methyl-l, 4-naphthochinon-2-yl) -nonanal

Arbeitsvorschrift: II

Edukt: 1.97 g (6 mmol) 9-(3-Methyl-l, 4-naphthochinon-2-

yl) -nonansäure

Reinigung: dünnschichtchromatographisch in CH2CI2 1 %

MeOH

Ausbeute: 1,07 g (3,4 mmol, 57 ) . hellgelber Feststoff

^! H-NMR (CDCI3 , 400 MHz) : 1.33 - 1.51 (m; 10H, 5CH ₂ ) , 1.59 - 1.65 (m; 2H, 3-CH2 ) , 2.19 (s; 3H, CHa ) , 2.42 (dt, J ₂ ,3 = 7.4 Hz, Ji .2 = 1.8 Hz; 2H, 2-CH2 ) , 2.62 (t, Je ,9 = 7.6 Hz; 2H, 9-CHz ) , 7.69 (m; 2H, Aromaten-H) , 8.06 (m; 2H, Aromaten-H) , 9.76 (t, Jι , ₂ = 1.8 Hz; 1H, 1-CHO).-

Beispiel 5 Die biologische Wirksamkeit der w-(l,4-Chinonyl)-alkanale kann mit verschiedenen bakteriellen Luziferasen überprüft werden. Hierzu wird zu 885 ul 50 mM Phosphatpuffer pH 7 0,2 % BSA 5 ul einer 50-proz. ethanolischen Lösung des Aldehydes und 10 ul einer Luziferaselδsung (0,5 mg Protein/ml) gegeben. Reaktionsstart erfolgt durch Injektion von 100 ul FMNH2 (50 uM) . Gemessen wird die Aktivität als emmitierte Lichtmenge innerhalb der ersten Sekunde nach Reaktionsstart mit einem Bioluminometer.