Область техники

Данное изобретение относится к новому цинковому комплексу гамма-L- глутамилгистамина, восстанавливающему барьерные функции эпителиальной ткани и подавляющему аберрантную активность клеток иммунной системы. Настоящее изобретение также относится получению и применению указанного цинкового комплекса для терапии атопического дерматита и других заболеваний, ассоциированных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и развитием аберрантного воспалительного ответа.

Уровень техники

Эпителиальный барьер играет важнейшую роль в организме человека и животных. Эпителиальный барьер предотвращает проникновение различных субстанций, аллергенов и бактерий во внутреннюю среду организма. Нарушение барьерных функций эпителиальной ткани вносит существенный вклад в патогенез целого ряда заболеваний, таких как: воспалительные заболевания полости рта (стоматит, гингивит, фарингит т.д.), заболевания желудочно-кишечного тракта (колиты, энтериты, кишечная аутоинтоксикация, синдром раздраженного кишечника, синдром нарушенного всасывания, рецидивирующая диарея и др.), аллергические заболевания (аллергический ринит, бронхиальная астма, атопический дерматит и др.) [Recent Pat Antiinfect Drug Discov. 2015; 10(2):84-97; Current Pediatrics. 2013; 12 (2): 12-19; Bulletin of Siberian Medicine. 2017; 16 (2) 32- 46]. Учитывая ключевую роль барьерных функций эпителиальной ткани в развитии воспалительных и аллергических заболеваний, стратегия, направленная на восстановления барьерных функций эпителиальной ткани, является первой линией терапии многих патологических состояний человека. В частности, ведущее значение в терапии атопического дерматита занимает наружная терапия, целью которой является восстановление поврежденного эпителия, улучшение барьерных функций кожи, гидратация кожных покровов, а также профилактика и устранение вторичного инфицирования [Pediatrics. 2014 Dec;l34(6):el735-44]

Цинк является одним из ключевых микроэлементов, обеспечивающих сохранение барьерных функций кожи, а его противовоспалительные, антиоксидантные и антибактериальные свойства делают его одним из самых применяемых микроэлементов в дерматологии [FEMS Microbiol Lett. 2008 Feb; 279(1):71-76]. Цинк является неотъемлемым компонентом матриксных металлопротеиназ, контролирующих ремоделирование эпителия и играет ключевую роль в росте эпителиальных клеток, заживлении ран и сохранении барьерных функций кожи [Front Biosci (Landmark Ed). 2017 Mar 1; 22: 1469-1492]. В недавних исследованиях было показано, что выраженность симптомов атопического дерматита отрицательно коррелирует с концентрацией цинка в эритроцитах пациентов [Postepy Dermatol Alergol. 2016 Oct; 33(5):349-352]. Более того, использование соединений цинка приводит к снижению выраженности симптоматики атопического дерматита в доклинических и клинических исследованиях [Biol Trace Elem Res. 2017 Sep;l79(l): 110-116; Clin Cosmet Investig Dermatol. 2013 May 6;6: 115-21; Acta Derm Venereol. 2014 Sep;94(5):558-62] В моделях атопического дерматита на животных было показано, что применение соединений цинка восстанавливает толщину эпителиальных тканей и снижает выраженность локального воспаления кожных покровов [Dermatol Ther. 2018 Jul 17:е12659].

Необходимо отметить, что нарушение барьерных функций эпителиальной ткани во многих случаях ассоциировано с развитием аберрантного воспалительного ответа, который, в свою очередь, индуцирует дальнейшее разрушение клеток и деградацию барьерных функций эпителия. Так, например, у пациентов с атопическим дерматитом нарушение барьерных функций кожи приводит к ее колонизации условно-патогенными бактериями, в том числе S. Aureus [Br J Dermatol. 1998 Dec; 139 Suppl 53:13-6]. Бактериальное обсеменение кожи условно-патогенными микроорганизмами, приводит к развитию избыточной воспалительной реакции и аберрантного хемотаксиса клеток иммунной системы (преимущественно лимфоцитов, эозинофилов, дендритных и тучных клеток), продуцирующих провоспалительные цитокины. Провоспалительные цитокины и активные формы кислорода, секретируемые клетками иммунной системы, индуцируют дальнейшую деградацию барьерных функций кожи и образование самоподдерживающейся положительной обратной связи, обеспечивающей переход заболевания в хроническую фазу [J. Clin. Diagn. Res. 2013 Dec; 7(12):2683-2685]. Таким образом, подавление аберрантной активности клеток иммунной системы за счет ингибирования их хемотаксиса, может быть крайне востребовано для терапии атопического дерматита, а также других заболеваний человека и животных.

Хемокины семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), являются мощными факторами хемотаксиса моноцитов, макрофагов, эозинофилов, Т- лимфоцитов и дендритных клеток в организме млекопитающих [Biochem. J. 2012 Mar 1; 442(2):403-12; Postepy Dermatol. Alergol. 2014 Мау;31(2):84-91]. Члены семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), фракталкин, а также ряд других гормонов и секретируемых белков, содержат остаток пироглутаминовой кислоты (рЕ), роль которого заключается в защите от деградации аминопептидазами [Chem Immunol. 1999;72:42-56; Biochemistry. 1999 Oct 5;38(40): 13013-25]. Пироглутаминирование N-концевого остатка катализируется ферментом глутаминилциклазой (QPCT или QC) [J Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):49773-9; J Mol Biol. 2008 Jun 20;379(5):966-80]. В ходе экспериментальных исследований было показано, что ингибирование глутаминилциклазы приводит к резкому снижению хемоаттракторной активности непироглутаминированных форм хемокинов CCL2, CCL7, CCL8 и CCL13 [Biochem. J. (2012) 442, 403-412) и фракталкина (Biosci Rep. 2017 Aug 23;37(4)]. Таким образом, пироглутаминирование хемокинов семейства CCL, является необходимым этапом ССЕ-опосредованного хемотаксиса клеток иммунной системы, а стратегия, направленная на ингибирование глутаминилциклазы, является возможной стратегией модулирования аберрантного воспалительного ответа и снижения активности клеток иммунной системы.

К настоящему времени в литературе не описаны цинковые комплексы ингибиторов глутаминилциклазы, а также их получение и терапевтическое применение. В то же время, известны ингибиторы глутаминилциклазы, включающие сульфолипиды [WO 2017/046256, опубл. 23.03.2017, HOCHSCHULE ANHALT, DE], производные флаваноидов [Bioorg Med Chem. 2016 May 15;24(10):2280-6], производные, пиридина [US 2015/0291632, опубл. 15.10.2015, Dow AgroSciences LLC, US] и некоторые малые молекулы, описанные в недавних работах [J. Med. Chem. 2017 Mar 23; 60(6):2573-2590; WO 2014/193974, US 2015/0291557]. Также ингибиторы глутаминилциклазы описаны в публикациях компании Probiodrug Aktiengesellschaft [J. Biol. Chem. 2003 Dec l2;278(50):49773- 9]. В данной работе описаны ингибиторы глутаминилциклазы на основе производных имидазола. Однако в работах компании Probiodrug Aktiengesellschaft не описаны цинковые комплексы ингибиторов глутаминилциклазы, а в структурах соединений, опубликованных компанией Probiodrug Aktiengesellschaft, имидазол содержит алифатический заместитель по одному из атомов азота. Введение алифатического заместителя снижает метаболическую стабильность соединений. Кроме того, введение алифатического заместителя увеличивает гидрофобность соединений и повышает системную биодоступность соединений, что по-видимому, излишне для терапии атопического дерматита и других заболеваний, ассоциированных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани.

На сегодняшний день не известно ни одного лекарственного средства на основе цинкового комплекса ингибитора глутаминилциклазы, который бы применяли в терапии атопического дерматита или других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и/или аберрантной активностью клеток иммунной системы, поэтому сохраняется потребность в создании и внедрении для терапевтического применения новых эффективных лекарственных средств на основе цинковых комплексов ингибиторов глутаминилциклазы.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного химического соединения, обладающего эффективностью в восстановлении барьерных функций эпителиальной ткани и ингибировании фермента глутаминилциклазы в терапии атопического дерматита или других заболеваний связанных с нарушением барьерных функций эпителия и аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка нового лекарственного средства, эффективного для лечения заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности атопического дерматита, а также прочих заболеваний.

Техническим результатом данного изобретения является предоставление нового химического соединения, эффективного для лечения атопического дерматита, а также других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и/или аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Указанный технический результат достигается путем предоставления соединения цинкового комплекса гамма-Е-глутамилгистамина (соотношение металл: л иганд=1 : 1).

Основываясь на проведенных исследованиях, которые подробно описаны в настоящем описании, Заявитель предполагает, что структуру полученного комплекса можно описать следующей структурной формулой:

Указанный цинковый комплекс (Соединение 1) или его гидрат, сольват, или фармацевтически приемлемая соль, является эффективным для лечения атопического дерматита, а также других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является применения полученного цинкового комплекса гамма-Е-глутамилгистамина (Соединения 1) или его гидрата/сольвата для предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а также других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является применение нового цинкового комплекса гамма-Е-глутамилгистамина или его б гидрата, сольвата, или фармацевтически приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы.

Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции для предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а также других заболеваний связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы и характеризующиеся тем, что они содержат эффективное количество соединения по изобретению и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах воплощениях изобретения вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

Изобретение также включает способ предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а также других расстройств связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы в организме, включающий введение в указанный организм фармацевтической композиции по изобретению. В частных случаях воплощения изобретения организм представляет собой человека или животного.

Цинковые комплексы гамма- -глутамил гистамина не описаны в уровне техники, однако известен псевдопептид гамма- -глутамил гистамина, который был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -рр. 1461-1463; J. Neurochemistry. -1977. - vol. 29. -рр. 633-638.]. Получение самого гамма-Ь-глутамил гистамина описано в патенте на изобретение RU2141968, опубл. 27.11.1999. Использование крема на основе гамма-Ь-глутамил гистамина описано в патенте на изобретение RU 2233152, опубл. 27.07.2004.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. ИК-спектр образца псевдопептида гамма-Ь-глутамил гистамина (лиганда)

Фиг. 2. ИК-спектр образца продукта, полученного в результате смешивания раствора хлорида цинка и гамма-Ь-глутамил гистамина по примеру 1.

Фиг. 3. ИК-спектр образца цинкового комплекса гамма-L- глутамилгистамина по примеру 2.

Фиг. 4. ИК-спектр образца цинкового комплекса гамма-L- глутамилгистамина по примеру 3, Синтез «А»

Фиг. 5. ИК-спектр образца цинкового комплекса гамма-L- глутамилгистамина по примеру 3, Синтез «В»

Фиг. 6. Спектр ядерного магнитного резонанса 1Н образца цинкового комплекса гамма-Ь-глутамилгистамина по примеру 2

Фиг. 7. Фармакологическое действие крема, содержащего Соединение 1 (0.01%) на поражение кожи в модели атопического дерматита у мышей по данным гистологического анализа.

Фиг. 8. Гистологические срезы кожи пораженного уха мышей в модели атопического дерматита.

Подробное раскрытие изобретения

Как указано выше, цинковый комплекс гамма-L- глутамилгистамина не был ранее описан в литературе, однако известен псевдопептид гамма -L- глутамилгистамин, который был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -рр. 1461-1463; J. Neurochemistry. -1977. -vol. 29. -рр. 633-638]. Получение гамма-L- глутамилгистамина также описано в патенте на изобретение RU 2141968. В указанных работах описан гамма-L- глутамил гистамин, который представляет собой псевдопептид, обладающий антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, противовоспалительным, антиметастатическим, адаптогенным действием, а также обладает способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты, предупреждать проявления сахарного диабета, ожирения, ишемической болезни, стрессовых состояний, гепатита, цирроза, токсических поражений печени, алкоголизма, радиационных поражений, геронтологических изменений.

В то же время в указанных работах не приведены какие-либо данные о цинковых комплексах гамма-L- глутамил гистамина, методах их получения и исследования их биологической активности. При этом, необходимо отметить, что цинковый комплекс гамма-L- глутамил гистамина не может быть получен путем простого смешения солей цинка и гамма- -глутамил гистамина, поскольку в данных условиях образуется смесь солей цинка и свободного гамма-L- глутамилгистамина.

Заявитель в ходе создания настоящего изобретения разработал способ получения устойчивого цинкового комплекса гамма- -глутамил гистамина с соотношением металл/лиганд 1/1. (Соединения 1).

В ходе исследований специфической фармакологической активности полученного заявителем цинкового комплекса гамма- -глутамил гистамина (Соединения 1) в модели атопического дерматита было показано, что Соединение 1 обладает существенно большей терапевтической активностью, в сравнении со свободным лигандом гамма-Ь-глутамил гистамина. Нанесение на кожу соединения I (крем 0,01 мас.%) снижало до уровня интактных животных приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) в эпидермис и дерму кожи, а также уменыналадругие микроскопические проявления атопического дерматита. Таким образом, показано, что Соединение 1 влияет на хемотаксис клеток иммунной системы. Снижение притока клеток иммунной системы может применяться в терапии целого ряда заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Исследования Заявителя показали, что наблюдаемый терапевтический эффект Соединения 1 связан со способностью данного соединения ингибировать активность глутаминилциклазы.

Таким образом, Соединение 1 (цинковый комплекс гамма-L- глутамил гистамина с соотношением металл/лиганд 1/1) является новым химическим соединением, применимым для терапии атопического дерматита и других заболеваний, обусловленных нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Термины и определения

Термин «Соединение I» относится к цинковому комплексу гамма-L- глутамилгистамина в соотношении метал: лиганд 1 : 1.

В частности, данный комплекс может быть представлен структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью.

Термин «С», когда он используется со ссылкой на температуру, означает стоградусную шкалу или температурную шкалу Цельсия.

Термин «1С ₅ о» означает концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование фермента.

Термин «сольват» используется для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по изобретению и одну или более молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола. Термин «гидрат» используется, когда указанным растворителем является вода.

Термин «аберрантная активность» клеток иммунной системы в настоящем документе означает активность, существенно отличающуюся от базового уровня активности клеток иммунной системы в организме при отсутствии патологии. Аберрантная активность может быть вызвана избыточным притоком клеток иммунной системы к органу или ткани, нарушением процессов, приводящих к активации клеток иммунной системы, дерегулированием процессов связанных с гибелью клеток иммунной системы, а также другими факторами.

Термин «вспомогательное вещество» означает любое фармацевтически приемлемое вещество неорганического или органического происхождения, входящее в состав лекарственного препарата или используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств.

Термин «глутаминилциклаза» означает фермент аминоацилтрансферазу, участвующую в преобразовании N-концевого глутамина в пироглутамин в различных пептидных субстратах. Образование N-концевого пироглутамата защищает биологически активные пептиды, гормоны и хемокины (например, тиреотропин-высвобождающий гормон, b-хемокиновый лиганд -2) от деградации экзопептидазами и в некоторых случаях может увеличивать аффинность лигандов к их рецепторам.

Термин «хемотаксис» означает направленное движение клеток в ответ на химический раздражитель. В основе хемотаксиса лежит способность клетки отвечать на градиент концентрации хемотаксического медиатора. Хемотаксис является тем процессом, благодаря которому клетки иммунной системы покидают сосудистое русло и мигрируют в поврежденную ткань. Ведущую роль в хемотаксисе играют хемотаксические вещества (хемоаттрактанты. Одним из наиболее мощных хемоаттрактантов для моноцитов и макрофагов является хемокин CCL2.

Термины «лечение», «терапия» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) снижение, б) блокирование (приостановку) течения заболевания, в) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания, г) реверсирование заболевания или состояния, к которому данный термин применяется, или одного или более симптомов данного заболевания или состояния.

Термин «профилактика», «предотвращение» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у млекопитающих, предпочтительно у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Соединение I, являющееся предметом данного изобретения, перспективно для лечения заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности заболеваний, связанных с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы, предпочтительно терапии атопического дерматита. В некоторых частных вариантах соединение по изобретению может быть использовано для лечения других заболеваний, обусловленных нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.

Способ терапевтического применения соединения

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Соединение по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая соединение, может быть введено в организм пациента в любом количестве и любым путем введения (предпочтителен топический путь введения), эффективным для лечения или профилактики заболевания.

После смешения лекарственного препарата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных местно и т.п.

Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема вещества (например, 1-30 дней).

В том случае, когда соединение по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, дозу каждого из компонентов комбинированной терапии вводят в течение требуемого периода лечения. Активные ингредиенты, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединение по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с соединением, составляющем суть данного изобретения, и которые не влияют на фармакологическую активность этого соединения, и являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Изобретение относится также к способу получения цинкового комплекса гамма- -глутамил гистамина, включающему перемешивание смеси ацетата цинка и гамма- -глутамил гистамина в полярном растворителе, предпочтительно в полярном растворителе, выделение осадка продукта и сушку полученного продукта, который представляет собой цинковый комплекс гамма-L- глутамилгистамина с соотношением металл/лиганд 1/1. Предпочтительными растворителями являются метанол или вода, или их комбинации. В рамках способа предпочтительно используют водный ацетат цинка, в частности, двуводный ацетат цинка. Перемешивание смеси осуществляют при температуре от 15 до 50 градусов Цельсия, предпочтительно от 15 до 40 градусов Цельсия, в случае использования метанола в качестве растворителя и при температуре от 15 до 90 градусов Цельсия при использовании воды в качестве растворителя.

Соединение по изобретению может быть использовано в качестве фармацевтически приемлемой соли.В частности, могут быть получены хорошо известные специалисту в данной области аддитивные соли органических и неорганических кислот, например, хлоргидрат или ацетат.. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению, содержат соединение данного изобретения совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые известные специалисту в данной области растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, скользящие материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Приемлемые материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, моно- и олигосахаридами, а также их производными; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые скользящие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определенного пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм местно.

Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.

Для обеспечения топического введения могут использоваться известные специалисту формы, такие как мази, крема и суспензии, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутил енгликоль .

Примеры фармацевтических композиций Вещество, описанные в данном изобретении, может быть использовано для профилактики и/или лечения болезней человека, или животных в виде следующих составов:

Мазь мл

Активный ингредиент 40 мг

Этанол 300 мкл

Вода 300 мкл

1 -додецилазациклогептанон 50 мкл

Пропиленгликоль до 1 мл

Крем I мас.%

Активный ингредиент 0,005-0,5

Масляный компонент 10,0-15,0

Стеарин косметический 2, 0-3,0

Эмульгатор 1, 0-3,0

Эмульсионный воск 1,0-3, 0

Триэтаноламин 0,1 -0,6

Витамин А 0,003-0,05

Глицерин дистиллированный 2, 0-3,0

Антиоксидант 0,05-0,075

Консервант 0,15-0,25

Масло чайного дерева 0,3 -0,5

Вода очищенная питьевая до 100%

Крем II мас.%

Активный ингредиент 0,01

Масло растительное 15,0

Стеарин косметический 0,75

Эмульгатор ПГ -3 2,25

Эмульсионный воск 2,25

Триэтаноламин 0, 1

Витамин А 0,028

Сорбитол 2, 0-3, 0

Витамин Е 1,5 Мономульс 90-018 0,75

Нипазол 0,2

Нипагин 0,3

Масло чайного дерева 0,3 -0,5 Вода очищенная питьевая до 100%

Крем III мас.%

Активный ингредиент 0, 1 Масло растительное 15,0

Стеарин косметический 0,75 Эмульгатор ПГ-3 2,25

Эмульсионный воск 2,25

Триэтаноламин 0, 1

Витамин А 0,028

Сорбитол 2, 0-3, 0

Витамин Е 1,5

Мономульс 90-018 0,75

Нипазол 0,2

Нипагин 0,3

Масло чайного дерева 0,3 -0,5 Вода очищенная питьевая до 100%

Крем IV мас.%

Активный ингредиент 0,3 Масло растительное 15,0

Стеарин косметический 0,75 Эмульгатор ПГ -3 2,25

Эмульсионный воск 2,25

Триэтаноламин 0, 1

Витамин А 0,028

Сорбитол 2, 0-3, 0

Витамин Е 1,5

Мономульс 90-018 0,75

Нипазол 0,2 Нипагин 0,3

Масло чайного дерева 0,3 -0,5

Вода очищенная питьевая до 100%

В случае использования крема, предпочтительным масляным компонентом является масло растительное, минеральное или их смесь. Растительным маслом может быть оливковое, подсолнечное масло или их смесь. Минеральным маслом может быть вазелиновое масло. В качестве эмульгатора могут использоваться полиэфиры ненасыщенных жирных кислот с глицерином (эмульгатор ПГ-3). Витамин А может присутствовать в виде ретинола пальмитата. Предпочтительным антиоксидантом является токоферола ацетат, а консервантом - по меньшей мере один низший алкиловый эфир параоксибензойной кислоты, например метиловый или пропиловый эфиры.

Данные составы могут быть приготовлены в соответствии со стандартными фармацевтическими методиками.

Применение Соединения I в комбинированной терапии

Несмотря на то, что Соединение I по данному изобретению может вводиться в качестве индивидуального активного ингредиента, его также можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими агентами, в частности, другой агент может представлять собой антибиотик, Н11ВС (нестероидное противовоспалительное средство) или другое противовоспалительное средство, глюкокортикостероид, ингибитор кальциневрина, антигистаминный препарат, мембраностабилизирующий препарат, иммуннотропное средство и т.д. При совместном приеме терапевтические агенты могут представлять собой разные лекарственные формы, которые вводятся одновременно или последовательно в разное время, либо терапевтические агенты могут быть объединены в одну лекарственную форму.

Фраза «комбинированная терапия» в отношении соединения данного изобретения в сочетании с другими фармацевтическими агентами, означает одновременный или последовательный прием всех агентов, который так или иначе обеспечит благоприятное воздействие сочетания лекарств. Совместное введение подразумевает, в частности, совместную доставку, например, в одной мазе, креме, таблетке, капсуле, инъекции или в другой форме, имеющий фиксированное соотношение активных веществ, также как и одновременную доставку в нескольких, отдельных лекарственных формах для каждого соединения соответственно.

Таким образом, введение соединения по данному изобретению может быть осуществлено в сочетании с дополнительными методами лечения, известными специалистам в области профилактики и лечения соответствующих заболеваний, включающими применение антибактериальных, цитостатических и цитотоксических препаратов, препаратов для подавления симптомов или побочных эффектов одного из лекарственных средств.

Если лекарственная форма представляет собой дозированную форму, такая комбинация использует соединение данного изобретения в приемлемом дозовом диапазоне. Соединение I по данному изобретению также может быть введено в организм пациента последовательно с другими агентами, в том случае, когда комбинация этих препаратов невозможна. Изобретение не ограничено последовательностью введения; соединение данного изобретения может быть введено в организм пациента совместно, до или после введения другого препарата.

Примеры осушествления изобретения

Элементный анализ образцов

Исследования элементного состава образцов были проведены с использованием Элементного анализатора multi ЕА 5000, Analytik Jena. Для проведения анализа, навеску образца массой около 20 мг (точная навеска) помещали в ячейку автосамплера. После заполнения прибора инертным газом (гелием) вводили 10 см ³ кислорода, очищенного от азота, углерода и влаги и сжигали исследуемый образец при температуре -1000 °С. Для удаления избытка кислорода, продукты сгорания пропускали над металлической медью при температуре 750 °С. Далее смесь газов (С0 ₂ , N ₂ и Н ₂ 0) пропускали через адсорбционную ловушку для сбора влаги и определения количества водорода. Затем смесь азота и оксида углерода подавалась в газохроматографическую колонку и разделялась на компоненты, которые потоком газа-носителя переносились на хемилюминесцентный детектор CLD (для анализа содержания азота, в газовой смеси) и ИК детектор NDIR (для анализа содержания оксида углерода в газовой смеси). Расчет содержания каждого из определяемых элементов в исследуемом образце проводился с помощью автономного программного обеспечения multiWin.

ИК спектры регистрировали на ИК спектрометре IFS-l l3v Bruker в интервале 4000...400 см ¹ с разрешением 1 см ¹ . Для приготовления образцов цинковый комплекс гамма- -глутамил гистамина растирали с КВг (5мг вещества на 100мг КВг), прессовали в таблетки и использовали для записи спектра.

Пример 1 (не по изобретению). Смешивание хлорида цинка с гамма-L- глутамилгистамином

Данный пример доказывает, что цинковый комплекс гамма -L- глутамилгистамина не может быть получен путем простого смешения солей цинка и гамма- -глутамил гистамина, поскольку в данных условиях образуется смесь солей цинка и свободного гамма- -глутамил гистамина. Так, например, при смешении водного раствора хлорида цинка с гамма- -глутамил гистамином в соотношении 1 :2 и высаживанием образовавшегося продукта добавлением водного аммиака (до слабощелочной реакции среды) приводит к образованию белого кристаллического вещества. Данные элементного анализа (см. Таблицу 1), хоть и близки к расчетным значениям для комплексного соединения, однако не могут рассматриваться в качестве свидетельства образования комплексов. Заниженное содержание углерода и азота в образцах свидетельствует о вероятном образовании гидроксида цинка, который частично теряет воду в процессе проведения анализа, что и приводит к заниженным значениям прочих элементов. Повторный элементный анализ комплексов после дополнительной промывки холодной водой приводит к еще большему завышению количества водорода в образцах.

Таблица 1 - Данные элементного анализа образца выделенного из реакции хлорида цинка с гамма- -глутамил гнетам ином

С Н N

Найдено (до обработки водой) 40.12 5.81 18.61 Найдено (после обработки водой) 39.62 5.99 18.03 Вычислено 44.17 5.56 20.60

Далее, согласно данным ИК-спектроскопии, ИК-спектры исходного гамма- L-глутамилгистамина и продукта смешивания совпадают (см. Фиг. 1 и 2). Отсутствие сдвигов и совпадение относительной интенсивности полос поглощения С=0, -ОН и -NH групп свидетельствует о том, что при смешивании хлорида цинка и гамма- -глутамил гистамина был выделен исходный гамма-L- глутамилгистамин, а цинк выделяется в форме неорганического соединения.

Пример 2. Получение цинкового комплекса по изобретению (Метод

JV»1)

Заявителем в ходе дальнейших исследований была разработана методика получения цинкового комплекса гамма- -глутамил гистамина, включающая использование водного ацетата цинка.

2,20 г (0,01 моль) Zh(0H ₃ 000) ₂ *2H ₂ 0 растворяют в 20 мл метанола и приливают по каплям, при интенсивном перемешивании к раствору 2,40 г (0,01 моль) гамма- -глутамил гистамина и 1,08 г (0,02 моль) свежеприготовленного метилата натрия в 50 мл метанола при комнатной температуре. После того, как приблизительно половина объема раствора ацетата цинка добавлена, наблюдают образование белого осадка. После прибавления всего раствора ацетата цинка перемешивание продолжают около 4 часов, продукт отфильтровывают, промывают водой (4x10 мл) и сушат в вакууме при 65°С до постоянной массы. Выход 2.67 г (88%).

Были выполнены 2 повторения данной методики осуществления способа и из каждого повторения получили образец для элементного анализа. Согласно анализу данных элементного анализа указанных двух образцов, в результате осуществления способа образуется цинковый комплекс гамма-L- глутамилгистамина с мольным соотношением гамма- -глутамил гистамин/цинк - 1/1 (см. Таблицу 2)

Таблица 2 - Данные элементного анализа образца, выделенного из реакционной смеси ацетата цинка с гамма- -глутамил гистамином

Также дляля подтверждения состава комплекса и полученного соотношения металл/лиганд проводили комплексонометрическое титрование цинка. Для определения содержания цинка осуществляли минерализацию продукта: навеску продукта массой ~70мг нагревали с пятикратным количеством концентрированной серной кислоты до полного обугливания образца. Затем к остатку добавляли— 1,5 мл 30 об.% перекиси водорода и кипятили в течение ~10 минут. Остаток переносили в коническую колбу объемом 25 мл добавляли ~10 мл аммиачной буферной смеси (рН=10) и небольшое количество сухого индикатора эриохрома черного Т. Содержимое колбы тщательно перемешивали до полного растворения индикатора и образования раствора малинового цвета. Пробу титровали 0,02 М раствором ЭДТА до перехода малиновой окраски через фиолетовую в ярко-синюю. В результате было показано, что содержание цинка в полученном продукте составляет 21,5%, что согласуется с теоретически рассчитанным значением (21,1%), соответствующем цинковому комплексу, имеющему соотношение металл:лиганд 1 : 1.

В ИК-спектре продукта (см. Фиг. 3) наблюдается две сильных полосы карбонильной группы: 1616 см ¹ и 1646 см ¹ . При этом, структура и частоты поглощения существенно отличаются от таковых в спектре свободного гамма-L- глутамилгистамина (см. фиг. 1), за счет координации с цинком полоса карбоксильной группы смещается в сторону более высоких частот. Также в ИК- спектре продукта возникает интенсивная полоса поглощения при 3276 см ¹ , отсутствующая в спектре гамма- -глутамил гистамина. Ее можно отнести к колебаниям N-H связи в амидном фрагменте, либо N-H связи системы имидазола. Кроме того, в ИК-спектрах продукта, по сравнению со спектром гамма-L- глутамилгистамина, имеются множественные изменения в областях «отпечатков пальцев» и колебаний С-Н связей, указывающие на отсутствие свободного гамма- L-глутамилгистамина в образце.

Полученный продукт нерастворим в растворителях, используемых для регистрации спектров ЯМР.

В качестве примера, на фиг.6 приведен ЯМР-спектр в D ₂ 0, зарегистрированный на приборе Bruker DRX500, 13400, с рабочей частотой 500,13 МГц.

Он в основном содержит остаточный сигнал недейтерированного растворителя, и малоинтенсивные сигналы, соответствующие исходному гамма- L-глутамилгистамину.

Это свидетельствует не только об отсутствии примесей, но и о незначительной диссоциации полученного продукта в водных суспензиях.

Пример 3. Получение цинкового комплекса по изобретению (Метод

JV»2)

Задачей настоящей модификации способа по изобретению является улучшение фильтруемости получаемого продукта, а также обеспечение максимально однородного распределения гидроксида цинка в реакционной смеси.

Проблема однородности распределения чрезвычайно важна для масштабируемости методики, т.к. образование цинкового комплекса гамма-L- глутамилгистамина на поверхности гидроксида цинка препятствует прохождению реакции. Для решения указанной проблемы предложено получение гидроксида цинка in situ путем одновременного прибавления растворов гидроксида натрия и ацетата цинка.

Синтез «А»: К нагретой до 70°С суспензии 12,0 г (0,05 моль) гамма-L- глутамилгистамина в 150 мл воды прибавляли по каплям, одновременно из двух воронок 50 мл 2М водного раствора гидроксида натрия и раствор 11,0 (0,05 моль) дигидрата ацетата цинка в 80 мл воды. Реакционную смесь перемешивали 4 часа при 70°С, охлаждали до комнатной температуры и оставляли на ночь. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой 3x50 мл и сушили в вакууме при 45-50°С до постоянной массы. Выход составил 21,5 г (71% продукта).

Полученный по данной методике полиаморфный комплекс легче отделяется в виде фильтрата , по сравнению с комплексом по примеру 2, полученным в метаноле с использованием метилата натрия.

Данная методика была воспроизведена с увеличенной загрузкой Согласно синтезу «В».

Синтез «В»: К нагретой до 70°С суспензии 24,0 г (0,1 моль) гамма-L- глутамилгистамина в 300 мл воды прибавляли по каплям, одновременно из двух воронок 100 мл 2М водного раствора гидроксида натрия и раствор 22,0 (0,1 моль) дигидрата ацетата цинка в 120 мл воды. Реакционную смесь перемешивали 4 часа при 70°С, охлаждали до комнатной температуры и оставляют на ночь. Осадок отфильтровывают, промывали на фильтре водой 4x50 мл и сушили в вакууме при 45-50°С до постоянной массы 44,1 г (71% продукта).

Были выполнены 2 повторения данной методики осуществления способа и из каждого повторения получили образец для элементного анализа. Согласно анализу данных элементного анализа указанных двух образцов,, в результате реакции образуется цинковый комплекс гамма- -глутамил гистамина с мольным соотношением гамма- -глутамил гистамин/цинк - 1/1 (см. Таблицу 3).

Таблица 3— Результаты элементного анализа цинкового комплекса гамма-

L-глутамилгистамина (Метод N°2)

ИК-спектр полученного продукта (см. Фиг. 4 и 5), аналогичен спектру цинкового комплекса гамма- -глутамил гистамина синтерированного по Методу N°l и данные спектры не имеют существенных отличий в области отпечатков пальцев.

Для подтверждения состава комплекса и полученного соотношения металл/лиганд было проведено комплексонометрическое титрование цинка (см. Таблицу 4). В результате было показано, что содержание цинка в продукте полученном по методу N°2 составляет ~22,0%, что согласуется с теоретически рассчитанным значением (21,1%) соответствующем цинковому комплексу, имеющему соотношение металл: лиганд 1 : 1.

Таблица 4— Результаты комплексонометрического титрования цинкового комплекса гамма-Ь-глутамилгистамина

Характеристика биологической активности комплекса соединения 1 по изобретению

Биологическая активность Соединения 1, являющегося предметом настоящего изобретения, была изучена в различных in vitro и in vivo экспериментах. В частности, при изучении активности Соединения 1 в in vivo модели атопического дерматита было показано ингибирующее действие Соединения 1 на хемотаксис клеток иммунной системы. Исследования биологической активности Соединения 1 in vitro , позволили установить, что Соединение 1 является ингибитором фермента глутаминилциклазы и, таким образом, действие Соединения 1 на хемотаксис клеток иммунной системы может быть опосредованно ингибированием активности глутаминилциклазы.

Пример 4. Исследование влияния Соединения 1 на ферментативную активность глутаминилциклазы человека in vitro.

В ходе исследований влияния Соединения 1, являющегося предметом настоящего изобретения, на ферментативную активность глутаминилциклазы in vitro впервые было обнаружено прямое ингибирующее действие Соединения 1 на рекомбинантную внутриклеточную глутаминилциклазу человека.

Активность глутаминилциклазы при различных концентрациях Соединения 1 изучалась при 25°С с использованием флуоресцентного субстрата L-глутаминил 2-нафтиламида (Gln-bNA) [Anal Biochem. 2002 Apr 1;303(1):49-56]. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 50 мкМоль флуорогенного субстрата; ~0,2 единицы пироглутаминиламинопептидазы человека (1 единица определяется как количество, гидролизующее 1 микромоль pGlu-bNA в минуту), и аликвоту рекомбинантной внутриклеточной глутаминилциклазы человека (gQC) в 50 микромоль трисаминометан-НС1 и 5% глицерине, pH 8,0. Реакцию инициировали добавлением к реакционной смеси аликвоты глутаминилциклазы, инкубированной с Соединением 1 в течение 5 минут.

Дальнейшее протекание реакции отслеживали спектрофотометрически (длина волны возбуждения и эмиссии составляли 320 и 410 нм). Ферментативную активность определяли по количеству выделившегося 2-нафтиламида (bNA), рассчитанному по калибровочной кривой. Значения 1С ₅ о рассчитывали с помощью нелинейной регрессии кривой "концентрация ингибитора"-"ферментативная активность".

В результате эксперимента было установлено, что Соединение 1 ингибирует активность глутаминилциклазы с 1С50=26 мкМ.

Пример 5. Исследование активности Соединения 1 на модели атопического дерматита у мышей Методика эксперимента. Исследование активности Соединения 1 на модели атопического дерматита было проведено с помощью стандартной методики [Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article Ш 545497, 9 pages]. В экспериментальную группу были отобраны животные без признаков отклонений внешнего вида, таким образом, чтобы индивидуальное значение массы отклонялось от среднего значения в пределах пола не более чем на ±20%.

На 0 и 12 сутки эксперимента мышам-самцам линии balb/c на предварительно выбритые участки спины наносили 100 мкл 2% раствора 1-хлор- 2, 4-динитробензола (ДНХБ) в этаноле с целью сенсибилизации организма. На 17 сутки на правое «опытное» ухо животным наносили 20 мкл 2% спиртового раствора ДНХБ дважды с интервалом 1 час. Крем Соединения 1 с содержанием действующего вещества 0,01 мас.% наносили накожно, на правое "опытное" ухо, дважды: через 1 и через 13 ч после последнего нанесения ДНХБ на ухо. В качестве препаратов сравнения использовали метилпреднизолона ацепонат (0,1% мазь для наружного применения), пиритион цинка (0,2% крем для наружного применения), пимекролимус (1% крем для наружного применения) и крем для наружного применения с содержанием гамма-Е-глутамилгистамина 0,01%. На 18 сутки проводили эвтаназию животных и гистологический анализ пораженного уха. Г истологические срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку микроскопических изменений проявлений дерматита проводили по следующей шкале:

1) Акантоз - утолщение эпидермиса и эпителия с удлинением межсосочковых отростков:

0 баллов - отсутствие патологии;

0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;

1 балл - умеренно выраженная патология;

2 балла - выраженная патология.

2) Гипер кератоз - это патологическое состояние кожи невоспалительного характера, характеризующееся значительным утолщением рогового слоя или задержкой его нормального отторжения:

0 баллов - отсутствие патологии; 0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;

1 балл - наличие указанной патологии.

3) Пустулы (гнойнички) - полостные островоспалительные элементы с гнойным содержимым:

0,5 балла - единичные проявления патологии;

1 балл - слабо выраженная патология;

2 балла - умеренно выраженная патология;

3 балла - сильно выраженная патология;

4 балла - тотальная патология.

4) Киста - структура округлой или овальной формы, выстланных изнутри ороговевающим плоским эпителием и заполненных слоистыми роговыми массами возникают при гиперплазии эпителия (акантоза):

0 баллов - отсутствие патологии;

0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;

1 балл - наличие указанной патологии.

5) Воспаление:

0 баллов - отсутствие патологии;

0,5 балла - единичные проявления патологии;

1 балл - слабо выраженная патологии;

2 балла - умеренно выраженная патология;

3 балла - сильно выраженная патология;

4 балла - тотальная патология.

6) Отек:

0 баллов - отсутствие патологии;

0,5 балла - единичные проявления патологии;

1 балл - слабо выраженная патологии;

2 балла - умеренно выраженная патология;

3 балла - сильно выраженная патология;

4 балла - тотальная патология.

Полученные данные были проверены с использованием теста Граббса на наличие в выборке наибольшего или наименьшего аномального наблюдения (выброса). Значения, определенные как «вылетающие» в данном тесте, не использовались для дальнейшего анализа. Для всех данных применялась описательная статистика: подсчитаны среднее значение (М) и стандартная ошибка среднего (m). С помощью критерия Колмогорова-Смирнова была проверена нормальность распределения полученных в ходе эксперимента значений. В случае нормального распределения для оценки межгрупповых различий использовался критерий Стьюдента (t-тест). В случае отличного от нормального распределения для сравнения нескольких групп использовался критерий Краскела-Уоллиса (с постанализом Данна). Статистический анализ проводился с использованием программы GraphPad Prism. 5.0. Различия определялись при 5% уровне достоверности.

Результаты проведенных экспериментов приведены на Фигурах 7 и 8. Как видно из приведенных на фиг.7 данных, исследовано фармакологическое действие крема, содержащего Соединение 1(0,01 мас.%) на поражение кожи в модели атопического дерматита у мышей по данным гистологического анализа: а) акантоз (баллы), б) гиперкератоз (баллы), в) пустулы (баллы), г) кисты (баллы), д) воспаление (баллы), е) отек (баллы). Эксперименты проведены в соответствии с: Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article Ш 545497, 9 pages. Примечание: *- достоверность различия (P < 0,05) с интактной группой, & - достоверность различия (Р < 0,05) с контролем.

На фиг.8 изображены гистологические срезы кожи пораженного уха мышей в модели атопического дерматита, окрашенные гематоксилин-эозином, с увеличением х20.

А - Группа интактных животных; В - Контроль патологии; С - Адвантан (Метилпреднизолона ацепонат, мазь 0.1%); D - Пимекролимус (Элидел 1% крем); Е - Крем Соединение I 0,01%. 1- эпидермис; 2 - дерма; 3 -воспалительный инфильтрат. Эксперименты проведены в соответствии с: Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article Ш 545497, 9 pages.

При этом нанесение на кожу Соединения 1 (крем 0,01 мас.%) снижало до уровня интактных животных приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) в эпидермис и дерму кожи, а также другие микроскопические проявления атопического дерматита. Важно отметить, что по выраженности действия Соединение 1 (цинковый комплекс гамма-L- глутамилгистамина) существенно превосходил действие лиганда гамма-L- глутамилгистамина. Таким образом, терапевтическая активность Соединения 1 не может быть объяснена активностью гамма-Ь-глутамил гистамина. По выраженности действия крем Соединения 1 превосходил препараты сравнения метилпреднизолона ацепонат, пиритион цинка и пимекролимус. Полученные результаты позволяют заключить, что соединение 1 оказывает улучшенное терапевтическое действие при атопическом дерматите.

Выводы

Таким образом проведенные исследования показали, что Соединение 1 обладает эффективностью в ингибировании фермента глутаминилциклазы. На модели атопического дерматита показано, что Соединение 1 ингибирует приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) in vivo , а также подавляет другие микроскопические проявления атопического дерматита.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.