Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft raf Nukleinsäuren, welche auf den Nuclear faktor KB (NFKB) wirken, Substanzen zur Inhibierung dieser Wechselwirkung, Screening Verfahren zur Bestimmung solcher Substanzen sowie mit solchen Substanzen hergestellte pharmazeutische Präparate.

Hintergrund der Erfindung Das raf Protein in seinen verschiedenen Isoformen spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der Pro- liferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen. raf ist eine Effektorkinase von ras und ein wichtiges Glied in der mitogenen cytoplasmischen Protein Kinase (MAPK) Signalisierungkaskade (siehe Daum, 0., Eisenmann-Tappe, I., Fries, H.-W., Troppmair, J. & Rapp, U. R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19,474-479).

Die meisten Effekte werden mediiert durch direkte Pho- phorylierung von MEK (mitogen activated and extracel- lular stimuli regulated kinase kinase), eine Kinase mit zweifacher Spezifität, welche ihrerseits die ERK Proteine (extracellular stimuli regulated kinase) phosphoryliert und aktiviert.

Die Familie der NF-kB/Rel Transkriptionsfaktoren besteht bei Säugetieren aus 5 Mitgliedern (RelA, RelB,

c-Rel, plO5/NF-KB1 und plOO/NF-KB2), welche an DNA als homo-oder heterodimere Komplexe binden (Baldwin, A.

S. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14,649-681 ; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcription Fac- tors in Eukarotes, eds. Papavassiliou, A. G.

(R. G. Landes Company, Austin, Texas), pp. 153-188.).

Mittels knock out Experimenten ist die Rolle der NF-KB Familie für bestimmte zelluläre Funktionen, wie Pro- liferation, Zytokin Expression, Differenzierung oder Schutz vor Apoptose, gezeigt worden (Attar, R. M., Caamano, J., Carrasco, D., Iotsova, V., Ishikawa, H., Ryseck, R.-P., Weih, F. & Bravo, R. (1997) Sem. Cancer Biol. 8,93-101 ; Guttridge, D. C., Albanese, C., Reuther, J. Y., Pestell, R. G. & Baldwin, A. S., Jr.

(1999) Mol Cell Biol 19,5785-99 ; Hinz, M., Krappmann, D., Eichten, A., Heder, A., Scheidereit, C. & Strauss, M. (1999) Mol Cell Biol 19,2690-8 ; Karin, M. (1999) J Biol Chem 274, 27339-27342 ; Zandi, E. & Karin, M.

(1999) Mol Cell Biol 19,4547-51). Weiterhin liegen fundierte Belege für eine Rolle der NF-KB Transkrip- tionsfaktoren in verschiedenen pathophysiologischen Prozessen, einschließlich Krebs, vor (Foo, S. Y. & Nolan, G. P. (1999) Trends Genet 15,229-35). Die Bindung eines der drei Inhibitorproteine IKBa, IKBp oder IxBe hieran ist verantwortlich für die Sequestri- erung des NF-KB/IKB Komplexes in dem Zytoplasma (Whiteside, S. T. & Israel, A. (1997) Sem. Cancer Biol.

8,75-82). Eine große Vielfalt von Stoffen triggern Signaltransdukti-onskaskaden, welche zur Phospho- rylierung spezifischer Serin Reste in den NH2-terminalen Domänen der IKB Proteinen führen. Die phosphorylierten IKB Moleküle werden danach poly-

ubiquitiniert und abgebaut über den Proteasom-Komplex.

Dies resultiert in der Freisetzung von NF-KB, welches in den Kern wandern kann. Durch NF-KB regulierte Tar- getgene spielen wichtige Rollen in Immun-, inflammato- rischen und Stressreaktionen, in der Zelladhäsion sowie dem Schutz gegen Apoptose (Baeuerle, P. A. & Renkel, T. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12,141-179 ; Siebenlist, U., Franzoso, G. & Brown, K. (1994) Annu.

Rev. Cell. Biol. 10,405-455). Der Status der Zelldif- ferenzierung und das spezifische Signal verantwortlich für die Zellaktivierung bestimmen, welches Set von Targetgenen durch die Induktion mittels NF-KB zur Transkription kommt.

IKB Abbau und folglich NF-KB Aktivierung kann in vielen Zelltypen durch multiple verschiedene Stimuli induziert werden. Daher müssen mehrere parallele Transduktionspfade existieren, welche alle letzt- endlich zur IxB-Kinase Aktivierung und zum IKB Abbau führen. Zu den am besten bekannten Signalisierungs- pfaden gehören jene für für den inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNFa) und Interleukin 1 (IL1) (Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A. V.

& Wallach, D. (1997) Nature 385,540-544). Die Bindung von Liganden an Rezeptoren führen in beiden Fällen zur Einschaltung von TRAF Proteinen (TRAF2 und TRAF6 für TNF-RI/TNF-RII und IL1R) (Takeuchi, M., Rothe, M. & Goeddel, D. V. (1996) J Biol Chem 271,19935-4214 ; Cao, Z., Xiong, 3., Takeuchi, M., Kurama, T. & Goed- del, D. V. (1996) Nature 383,443-6). Es konnte gezeigt werden, daß zwei Membran Scuttle Kinasen, nämlich MEKK1 und NIK (NF-KB inducing kinase) in der

Übertragung des Signals auf den IkB-kinase Komplex involviert sind. TRAF Proteine wechselwirken mit NIK direkt und es erscheint plausible, daß sie NIK ak- tivieren (Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A.

V. & Wallach, D. (1997) Nature 385,540-544). Weitere wichtige, in diesen Signaltransduktionsprozessen in- volvierte Proteine sind RIP und IRAK für TNFa und IL1 (Lee, S. Y., Reichlin, A., Santana, A., Sokol, K. A., Nussenzweig, M. C. & Choi, Y. (1997) Immunity 7, 703-713 ; Yeh, W.-C., Shahinian, A., Speiser, D., Kraunus, 3., Billia, F., Wakeham, A., de la Pompa, J.

L., Ferrick, D., Hum, B., Iscove, N., Ohashi, P., Rothe, M., Goeddel, D. & Mak, T. W. (1997) Immunity 7,715-725 ; Kelliher, M. A., Grimm, S., Ishida, Y., Kuo, F., Stanger, B. Z. & Leder, P. (1998) Immunity 8, 297-303 ; Kanakaraj, P., Schafer, P. H., Cavender, D., Wu, Y., Ngo, K., Grealish, P. F., Wadsworth, S. A., Peterson, P. A., Stierkierka, J. J., Harris, C. A. & Fung-Leung, W.-P. (1998) J. Exp. Med. 187,2073-2079).

Das Verständnis des Mechanismus der induzierbaren IKB Phosphorylierung wurde erheblich verbessert durch die Identifizierung und Klonierung von zwei verwandten zytokininduzierbaren Kinasen, nämlich IKK-1 und IKK-2 (DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E. & Karin, M. (1997) Nature 388,548-554 ; Renier, C., Song, H. Y., Gao, X., Goeddel, D. V., Cao, Z. & Rothe, M. (1997) Cell 90,373-383 ; Zandi, E., Rothwarf, D. M., Deihase, M., Hayakawa, M. & Karin, M. (1997) Cell 91,243-252 ; Mercurlo, F., Zhu, H., Murray, B. W., Shevchenko, A., Bennett, B. L., Li, J. W., Young, D. B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. & Rao, A. (1997) Science 278,860-866 ; Woronicz, J.

D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M. & Goeddel, D. V.

(1997) Science 278,866-869). Diese sind Teil eines großen 700-9OOkD großen Multisubunit IKB-Kinase Kom- plexes, welcher verantwortlich für die Phospho- rylierung der IKB Proteine ist. Es konnte gezeigt werden, daß ein gereinigter 700kD IKB-Kinase Komplex in vitro entweder durch Ubiquitinierung oder durch Phosphorylierung aktiviert wird (Chen, Z. J., Parent, L. & Maniatis, T. (1996) Cell 84,853-862 ; Lee, F. S., Hagler, 3., Chen, Z. J. & Maniatis, T. (1997) Cell 88, 213-222). IKK-1 und IKK-2 wurden unabhängig vone- inander identifiziert durch biochemische Reinigung der aktiven Kinase und durch ein Hefe Two Hybrid Screening mit NIK als Köder (IKK-1). IKK-1 und IKK-2 phospho- rylieren IKB Proteine direkt und zeigen eine höhere Affinität für mit NF-KB komplexiertes IKB (Zandi, E., Chen, Y. & Karin, M. (1998) Science 281,360-363).

Zwei weitere Komponenten des hochmolekulargewichtigen IKB-kinase Komplexes konnten bislang identifiziert werden : ein NEMO (NF-KB essential modulator)/IKKy genanntes Protein, welches für die Assoziation bzw. die Funktion des Komplexes wichtig erscheint (Yamaoka, S., Courtois, 0., Bessia, C., Whiteside, S. T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H. E., Kay, R. J. & Israel, A.

(1998) Cell 93, 1231-1240 ; Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G. & Karin, M. (1998) Nature 395,297-300), sowie IKAP, welches als Scaffold Protein für NIK, IKK-1 und IKK-2 wirkt (Cohen, L., Henzel, W. J. & Baeuerle, P. A. (1998) Nature 395,292-6). Kinasen, von welchen bekannt ist, daß sie in der Lage sind, Teile des IKB-Kinase Komplexes in vivo und/oder in vitro zu phosphorylieren sind NIK und MEKK1 (Ling, L.,

Zhaodan, C. & Goeddel, D. V. (1998) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 95, 3792-3797 ; Nakano, H., Shindo, M., Sakon, S., Nishinaka, S., Mihara, M., Yagita, H. & Okumara, K. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3537-3542).

Die Rolle von raf bei der Aktivierung von NF-KB is hingegen weniger klar. In Verfolg von Untersuchungen, welche demonstrierten, daß NF-KB gesteuerte Genkon- strukte auf raf reagieren (Bruder, J. T., Heidecker, 0., Tan, T.-H., Weske, J. C., Derse, D. & Rapp, U. R.

(1993) Nucl. Acids Res. 21,5229-5234 ; Finco, T. S. & Baldwin, A. S. (1993) J. Biol. Chem 268,17676-17679), wurde in verschiedenen Publikationen eine direkte Wechselwirkung mit bzw. Phosphorylierung von IxBa durch raf-1 Kinase vermutet (Li, S. & Sedivy, L. M.

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,9247-9251 ; Hafner, S., Adler, H. S., Mischak, H., Janosch, P., Heidecker, 0., Wolfman, A., Pippig, S., Lohse, M., Uefflng, M. & Koich, W. (1994) Mol Cell Biol 14, 6696-703 ; Li, S., Janosch, P., Tanji, M., Rosenfeld, G. C., Waymire, J. C., Mischak, H., Koich, W. & Sedivy, J. M. (1995) EMBO J. 14,685-96). Andere Pub- likationen haben dagegen Hinweise geliefert, daß raf Aktivierung als solche möglicherweise nicht für eine NF-KB Induktion ausreicht, und daß raf Kinase IKB nicht direkt phosphoryliert (Belka, C., Wiegmann, K., Adam, D., Holland, R., Neuloh, M., Herrmann, F., Kronke, M. & Brach, M. A. (1995) EMBO J 14,1156-1165 ; Janosch, P., Schellerer, M., Seitz, T., Reim, P., Eul- itz, M., Brielrneier, M., Kölch W., Sedivy, J. M. & Mischak, H. (1996) J Biol. Chem. 271,13868-13874). Es wurde gezeigt, daß raf NF-KB in embryonalen

Nierenzellen (HEK 293) durch Induktion von Signalis- ierungspfaden aktiviert, welche gleichfalls in der Aktivierung von Streß Kinasen resultieren (Troppmair, 3., Hartkamp, J. & Rapp, U. R. (1998) Oncogene 17, 685-90). Dieser Mechanismus is abhängig von einer autokrine loop aufgrund der Expression von heparin binding epidermal growth factor (hbEGF) (McCarthy, S.

A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A. & McMahon, M. (1995) Genes Dev 9,1953-64 ; Kerkhoff, E.

& Rapp, U. R. (1997) Mol Cell Biol 17,2576-86). Dies steht für eine verzögerte Form der NF-KB Aktivierung, welche scheinbar auf eine nur geringe Anzahl von Zelltypen beschränkt ist (Heidecker, 0., Cleveland, J.

L., Beck, T., Huleihel, M., Kölch, W., Storm, S. M. & Rapp, U. R. (1989) in Genes and signal transduction in multistage carcinogenesis, eds. Colburn, N. H. (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 339-374).

Technisches Problem Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einen Ansatz zur Hemmung der NF-KB Aktivierung zu fin- den, und daran anschließend Wirkstoffe zu finden, welche eine NF-KB Aktivierung wirksam zu unterdrücken vermögen und folglich eine Proliferation von Tumorzel- len zu unterbinden.

Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnisse Es wurde die Rolle der NF-KB Aktivierung in der raf- vermittelten Zelltransformation untersucht sowie der Mechanismus, mittels welchem PMA und raf NF-KB

Aktivität induzieren. Es wurde gefunden, daß Hemmung der NF-KB Aktivierung die raf Transformation blocki- ert. Die NF-KB Aktivierung durch raf und PMA hängt sehr kritisch von dem IKB Kinase Komplex ab, insbeson- dere IKK-2. raf phosphoryliert die IKB Kinase Proteine nicht direkt. Vielmehr geschieht dies über die mem- brane shuttle kinase MEKK1. raf abhängige Aktivierung wird blockiert durch eine dominant negative Form von MEKK1.

In diesen Zusammenhängen ist auch wesentlich, daß ver- schiedene Inhibitoren der klassischen mitogenen cyto- plasmalen Kinase Kaskade dagegen nicht die NF-KB Aktivierung durch raf und PMA blockieren. Hieraus folgt, daß die NF-KB Aktivierung mittels raf unab- hängig von der klassischen Kaskade in einer separaten Reaktionskaskade erfolgt und insofern ein unabhängiger Pfad zur Transformation bzw. Induktion der Prolifera- tion in Tumorgewebe existiert.

MEKK1 ist daher ein neues Target für die Inhibierung der raf induzierten Transformation. raf ist ein neues Tool zur Untersuchung der Transformation über NF-KB sowie zur Findung von Inhibitoren der NF-KB vorgeschalteten Reaktionskaskade.

Beschreibung der Erfindung Die Erfindung lehrt zunächst eine Nukleinsäure codier- end für zumindest eine raf Teilsequenz, wobei die Teilsequenz eine MEKK1 Bindungsstelle enthält, oder codierend für zumindest eine eine Bindungsstelle für

raf enthaltende Teilsequenz von MEKK1, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hy- bridisierende Nukleinsäure. Der Begriff der Nuklein- säure umfaßt DNA, RNA und PNA. Der in den Patentansprüchen verwendete Begriff der raf Teilse- quenz bezieht sich auf Protein bzw. dessen Aminosäure- sequenz. Die raf Teilsequenz enthält vorzugsweise die enzymatisch aktive Domäne von raf Protein. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nuk- leinsäuren sowie einzelsträngige Nukleinsäuren und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren.

Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die Bindungsstelle des Proteins für MEKK1, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstli- che Mutationen sein. Ebenfalls umfaßt sind Derivate, i. e. in Resten synthetisch veränderte Nukleinsäuren, deren Funktionalität, bezogen auf die Bindungsstelle für MEKK1, unberührt, vielleicht sogar verstärkt, ist.

Wesentlich ist, daß jedenfalls ein Fragment mit der Bindungsstelle für MEKK1 vorhanden ist. Mit er- findungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nuklein- säuren sind solche bezeichnet, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringenz tritt typischer- weise in einem Temperaturbereich von 5°C bis 25°C un- terhalb der Aufschmelztemperatur bei der Hybridisierung ein. Unter stringenten Bedingungen wird eine Hybridisierung bei zumindest 95% Sequenziden- tität, vorzugsweise 98% Sequenzidentität, verstanden.

Hinsichtlich der diesen Definitionen zugrundeliegenden Hybridisierungsmethode wird auf die Literaturstelle

Sambrook, J. M. ; Fritsch, E. F ; Manaitis, T ; Molecular Cloning. A laboratory manual ; Cold Spring Harbor Labo- ratory Press (1989), sowie ergänzend auf Southern, E. M. ; Detektion of specific sequences among DNA frag- ments separated by gel electrophoresis ; J. Mol. Biol.

98,503 (1975) verwiesen.

Mittels solcher Nukleinsäuren kann nach Inhibitoren der gefundenen Signalisierungskaskade gesucht werden.

Insbesondere kann nach Substanzen gesucht werden, welche die MEKK1 Bindungsstelle der Nukleinsäure blockieren. Auch kann nach Substanzen gesucht werden, welche die natürlichen Nukleinsäuren mimikrieren, i. e. an MEKK1 binden, dieses jedoch für dessen Folgereak- tionen blockieren. Die Nukleinsäuren sind daher als screening tool brauchbar sowie zur Suche nach geeigneten Mimikrie-Substanzen für die natürlichen Nukleinsäuren.

Bevorzugterweise ist eine erfindungsgemäße Nuklein- säure eine cDNA.

Die Erfindung lehrt weiterhin einen isolierten rekom- binanten Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nuk- leinsäure bzw. ein Expressionsplasmid mir dieser Nukleinsäure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fu- sion gag mit beispielsweise raf oder raf Fragment).

Eine konstitutiv aktive Variante kann auch durch Fu- sion mit der carboxylterminalen Domäne von ras an die Kinase Domäne von raf geschaffen werden. Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transformante

bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsäure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach übli- chen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.

Der Erfindungskomplex umfaßt auch Stoffe zur Hemmung der Wirkung von MEKK1. Dies kann sein eine antisense Nukleinsäure oder ein Ribozym bindend an eine er- findungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere RNA. Hier- durch wird die Bildung des durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure codierten Proteins gehemmt. Dies kann aber auch sein eine Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure cod- iertes Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) deaktiviertes MEKK1 (beispielsweise dominant negativ), b) inaktive Proteine oder Peptide (inaktive MEKK1 Analoge, i. e. Proteine, die die MEKK1 Bindungsstelle an raf aufweisen, jedoch MEKK1-inaktiv sind), c) Aptamere. Durch diese Substanzen wird das durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure codierte Pro- tein selbst gehemmt. Bei den Aptameren empfiehlt es sich, diese gegen nukleinsäurespaltende Enzyme zu sta- bilisieren. Im Falle der Proteine bzw. Peptide handelt es sich um"geschneiderte", für die MEKK1 Bindungsstelle des durch die erfindungsgemäße Nuklein- säure codierten Proteins hochspezifische synthetische Moleküle. Schließlich gehört zum Erfindungskomplex auch eine Substanz mit einer Bindungsstelle für die Bindungsstelle von MEKK1 an eine durch eine er- findungsgemäße Nukleinsäure codiertes Protein oder Peptid, insbesondere kinase-inaktive Analoge/Homologe von raf. Analoge sind Proteine, die die Bindungsstelle des raf für MEKK1 aufweisen, jedoch kinase-inaktiv

sind. Mit einer solchen Substanz wird das MEKK1 für eine Bindung an raf blockiert. Ein Beispiel hierfür ist eine kinaseinaktive Variante von raf, insbesondere raf-BxB-CX 375W.

Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Blockierung der Bindung von raf an MEKK1 sowie deren Verwendung zur Herstel- lung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.

Die Erfindung lehrt desweiteren die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines hierdurch codierten Proteins oder Peptids oder einer für zumind- est eine eine Bindungsstelle bzw. Bindungsregion an raf enthaltende Teilsequenz von MEKK1 Protein codier- enden Nukleinsäure oder eines oder mehrer durch eine solche Nukleinsäure codierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer Sub- stanz, welche die Bindung von raf an MEKK1 blockiert.

Dabei ist die Vorgehensweise wie folgt. Ein Protein oder Peptid enthaltend die oder bestehend aus der Bindungsregion von raf oder von MEKK1 für die Bindung raf/MEKK1 (Bestimmung siehe unten) wird hergestellt.

Einer Lösung enthaltend dieses Protein oder Peptid wird ein prospektiver Inhibitor zugegeben und die Bindung untersucht. Bindende prospektive Inhibitoren werden selektiert, nicht bindende verworfen. Es kann auch mit einer Mischung prospektiver Inhibitoren gear- beitet werden, wobei dann sich eine Deconvolution (Testung von einzelnen Inhibitoren der Mischung oder von Untergruppen der Mischung der Inhibitoren) empfe- hlen wird, wenn für eine Mischung Bindung festgestellt

worden ist. Im Falle eines identifizierten Inhibitors wird es zweckmäßig sein, in vitro oder in vivo die Inhibitorwirkung durch kompetitive Bindung zu veri- fizieren bzw. nachzuselektieren. Kompetitive Bindung meint, daß der prospektive Inhibitor die Anzahl der Bindungsereignisse raf/MEKK1 in einem Versuch reduz- iert gegenüber der Anzahl der Bindungsereignisse ohne den prospektiven Inhibitor oder mit einer Placebosub- stanz.

Die erfindungsgemäßen Substanzen lassen sich in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tier- ischen Körpers mit Tumorzellen verwenden, in dem dem Körper ein pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 9 verabreicht wird, oder wobei eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 7 mittels gentherapeutischer Meth- oden in den Tumorzellen zur Expression gebracht wird.

Die exakte raf-seitige Bindungsstelle für MEKK1 läßt sich unschwer bestimmen bzw. einkreisen, indem gezielt mit unterschiedlichen (hinsichtlich der Lage und der Größe von Teilsequenzen) raf Fragmenten die Bindungsfähigkeit von MEKK1 untersucht wird. Frag- mente, die keine Bindung zeigen, enthalten die Bindungsstelle nicht ; Fragmente, die Bindung zeigen umfassen dagegen die Bindungsstelle. Die MEKK1-seitige Bindungsstelle für raf läßt sich analog durch Einsatz unterschiedlicher Teilsequenzen von MEKK1 und Bindung- sassay gegenüber raf ermitteln. Es kann sich empfe- hlen, in ersterem Falle mit vollständigem raf Protein und in letzterem Falle mit vollständigem MEKK1 Protein zu arbeiten. Wenn jedoch von einem Bindungspartner bereits die Bindungsregion bekannt ist, so kann auch

in dem Bindungsassay zur Suche der Bindungsregion des anderen Bindungspartners lediglich mit der Bindungsre- gion des einen Bindungspartners gearbeitet werden.

Entsprechend den vorstehenden Ausführungen umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung der Bindungsregionen von raf und/oder MEKK1 des Bindung- spaares raf/MEKK1.

Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung einer Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nuk- leinsäure oder einer mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierenden Nuklein- säure in einem screening Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung des von der Nukleinsäure codierten Proteins oder Peptids mit der der Aktivierung von NF-KB vorgeschalteten Signalisierungskaskade sowie die Verwendung einer Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nukleinsäure oder einer mit einer sol- chen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybrid- isierenden Nukleinsäure oder von solchen Nukleinsäuren codierten Proteinen oder Peptiden, insbesondere auch von Proteinen oder Peptiden, die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Indentifizierung von Bindungsregionen erhaltene Teilsequenzen enthalten, vorzugsweise hieraus bestehen, in einem screening Ver- fahren zur Ermittelung von Inhibitoren der Transforma- tion von Zellen durch raf vermittelte Aktivierung von NF-KB.

Die Erläuterung für eine Anspruchskategorie gelten entsprechend auch für andere Anspruchskategorien.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausfürhungsbeispiel darstellenden Figuren und Experi- menten näher erläutert. Es zeigen : Fig. la-d : Ergebnisse, welche die Blockierung der raf und PMA vermittelten NF-KB Aktivierung durch dominant negatives IKK-2 belegen, Fig. 2a-c : Stimulation der IKK-2 Kinase Aktivität durch raf, Fig. 3a-d : Ergebnisse, welche zeigen, daß der MEK In- hibitor PD98059 nicht die raf und PMA ver- mittelte NF-KB Aktivierung beeinflußt, Fig. 4a-d : Ergebnisse entsprechend Fig. 3 für dominant negatives MEK, Fig. 5a-b : Ergebnisse, welche zeigen, daß unterschied- lich Reaktionspfade von raf gesteuert werden, Fig. 6 : Ergebnisse, die zeigen, daß raf und PMA NF-KB in HeLa Zellen unabhängig von der MAPK Kaskade induzieren, Fig. 7a-c : Ergebnisse, die zeigen, daß raf in vitro IKK Aktivität induziert, jedoch nicht di- rekt die IKK Proteine phosphoryliert,

Fig. 8a-c : Ergebnisse, die die Wechselwirkung raf mit MEKK1 belegen, Fig. 9 : Verschiedene synergistische Pfade der raf induzierten Zelltransformation.

Fig. 10 : Sequenz von humanem c-raf 1 Fig. 11 : Sequenz von humanem MEKK1 1 : Materialien und Methoden 1.1 Plasmide und Antikörper Das v-raf Expressionsplasmid ist beschrieben worden in der Literaturstelle Troppmair, J., Potter, M., Wax, J. S. & Rapp, U. R. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 9941-5. Die Konstruktion von Hemagglutininn (HA-) tagged wild type raf BxB, BxB-CX und kinase-inaktivem BxB-CX, welches in der Position 375 eine Substitution von K durch W trägt, ist in der Literaturstelle Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C.

& Rapp, U. R. (1998) J. Virol. 72,2788-2794, beschrieben. raf BxB ist eine in frame Deletion der Aminosäuren 22-303 aus humanem c-raf-1, CX ist die C-terminale targeting Domäne von Ki-ras. VSV tagged IKK-2 und VSV tagged kinase-inaktives IKK-2 ist beschrieben worden in der Literaturstelle Yamaoka, S.,

Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S. T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H. E., Kay, R. J. & Israel, A. (1998) Cell 93,1231-1240. Dominant negatives MEK-1 (MEK-S217A) wurde erhalten von S. Cowley (Cowley, S., Paterson, H., Kemp, P. & Marschall, C. J. (1994) Cell 77,841-852, und kinase inaktives MEK1 (MEK-K97M) wurde von N. Ahn (Mansour, S. 3., Matten, W. T., Hermann, A. S., Candia, J. M., Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, G. F. & Alin, N. G. (1994) Science 265, 966-970) zur Verfügung gestellt. Alle inserts wurden in die mutiple Klonierungsstelle von pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert. HA-BxB-DD wurde durch site-gerichtete Mutagenese unter Verwendung des quick change mutagenesis kits (Stratagene) aus KRSPA-HA-BxB (Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, U. R. (1998) J. Virol. 72, 2788-2794) generiert. Das Insert wurde in pcDNA3 (Invitrogen) mittels der HindIII und XbaI Sites subkloniert. pGEX-IKB (1-72) wild type und pGEX-IKB (1-72) AA (mit S nach A Substitutionen an den Positionen 32 und 36) sind in der Literaturstelle Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S. T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H. E., Kay, R. J. & Israel, A. (1998) Cell 93,1231-1240, beschrieben.

Die Luciferase Reporter Plasmide (3xKB. luc, 4x17. TATA, HSV-tk-luc sowie der Gal-Elk Expressionsvektor wurden in den folgenden Literaturstellen beschrieben : Kirillov, A., Kistler, B., Mostoslavsky, R., Cedar, H., Wirth, T. & Bergman, Y. (1996) Nature Genetics 13, 435-441 ; Annweiler, A., Zwilling, S. & Wirth, T.

(1994) Nucl. Acids Res. 22,4250-4258 ; sowie Janknecht, R., Ernst, W. H., Pingoud, V. & Nordheim, A. (1993) EMBO J. 12,5097-104).

Monoklonale anti-HA Antikörper (Klon 12CA5) wurden mittels Standardprozeduren von Zellkulturüberständen mittels einer HiTrap protein G sepharose Säule (Pharmacia) aufgereinigt. Anti VSV Antikörper (Klon P5D4) wurden von Sigma gekauft und Antiseren gegen IKK-1, IKK-2 und ERK-2 wurden von Santa Cruz erhalten.

1.2 Focus assay 1 x 105 NIH/3T3 Zellen wurden in eine 30 mm Schale gesät und am folgenden Tag mittels Lipofectamine (Gibco BRL) mit 250 ng des v-raf Plasmids EHneo zusammen mit den beschriebenen Expressionskonstrukten für wild type oder dominant negativen Formen von IKK-1 und IKK-2 transfiziert. Nach weiteren 48 Stunden wurden die Zellen trypsinisiert und auf eine 10 cm Schale umgesiedelt. Im Mittel war der focus yield 650 Foci je ug EHneo DNA.

1.3 Zellkulturen und Transfektionsexperimente Jurkat T-Zellen und Hela Zellen wurden in DMEM/Glutamax (Gibco BRL), welches mit 10% fetal bovine serum, 50 uM ß-Mercaptoethanol und Antibiotika supplementiert war, gezogen. Das gleiche Medium, jedoch ohne ß-Mercaptoethanol, wurde für die NIH/3T3 Zellen verwendet. Für transiente Transfektionen wurden 3 pg des KB-abhangigen Luciferase Reporters (3xKB. luc) oder 4 ug an 4x17. TATA Reporter zusammen mit 1 ug RSV-Lac-Z verwendet. Die Gesamtmenge an DNA betrug

25-30 ug und wurde aufgefüllt mit Expressionsvektoren.

Typischerweise wurden 10 ig des betreffenden Expressionsvektors und/or leeren Expressionsvektors eingesetzt. Jurkat T Zellen, S107 Zellen und Hela Zellen (1-2x107) wurden zweimal in PBS gewaschen, schließlich in 200 ul oder 500 ul PBS resuspendiert und dann in Kuvetten (BioRad, 4mm Durchmesser) transferiert. Dann wurde das DNA-mix zugegeben, mit der Zellsuspension gemischt und die Mischung wurde einer Elektroporation unter Verwendung eines BioRad gene pulsers bei 960 uF und 220V (Jurkat), 230V (S107) oder 250V (Hela) unterworfen. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Zellen auf Eis gesetzt (5 min.) und anschließend für 5 min. bei 20°C inkubiert, gefolgt von dem Einbringen auf Medium (1/3 konditioniert, 2/3 frisch). Die Proben wurden in Aliquoten geteilt und 16 Stunden nach der Transfektion gemäß der beschreibungen zu den Figuren behandelt. Die Zellen wurden 6 Stunden später geerntet. Die Luciferase Aktivitäten wurden bestimmt und ß-Galactosidase Niveaus wurden zur Normalisierung bezüglich unterschiedlicher Transfektioneffektivitäten verwendet.

1.4 Präparation und Analyse von Proteinextrakten Die Präparationsbedingungen von Ganzzellen Extrakten mittels der freeze-thaw Methode sowie die Bedingungen für die Durchführung von EMSA unter Verwendung von radiomarkierten Proben enthalten die Ig-K-enhancer consensus NF-KB Bindungsstelle sind beschrieben in der Literaturstelle Lernbecher, T., Muller, U. & Wirth, T.

(1993) Nature 365, 767-770. Die Qualität der Extrakte wurde mittels paralleler EMSA Experimente mit einer die Octl (und Oct2) Transkriptionsfaktoren detektierenden Octamer Probe verifiziert. Für Western Immunoblots wurden 50 bis 100 ug Proteinextrakt auf 12,5% SDS Polyacrylamidgelen separiert. Nach Übertragung auf PVDF Membrane wurde die Proteine mittels der angegebenen Antikörper detektiert und blots wurden unter verwendung des ECL Systems (Amersham) entwickelt.

1.5 Zellysis und Immunopräzipitation Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion in PBS bei 0°C gewaschen. Für die IKK Aktivitätsassays wurden die Zellen in NP-40 Lysispuffer (enthaltend 25 mM Tris-HCl (ph 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM Na-Pyrophosphat, 25 mM Na-Glycerophosphat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 0,5% Nonidet P-40,1 mM PMSF, 1 mM NaVO4, 5 mM Benzamidin, 5 ug/ml Aprotinin, sowie 5 ug/ml Leupeptin) lysiert. Lysate wurden durch Zentrifugieren bei 14000 g für 30 min. geklärt und auf Proteingehalt normalisiert. Die Immunopräzipitation wurde für 2 Stunden bei 4°C auf einer rocking plattform unter Verwendung von entweder an protein G sepharose präadsorbierten anti-VSV Antikörpern (für transfektierte Zellen) oder an protein A beads präadsorbiertem IKK-2 Antiserum (zur Präzipitation engenen IKK) durchgeführt. Für das ERK Aktivitätsassay wurden Zellen in RIPA Puffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM

NaCl, 0, 1% SDS, 0,5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40,10% Glycerol, 2 mM EDTA, pH 8,0, supplementiert mit 1mM Na-Orthovanadat, 1 mM PMSF, 5 mM Benzamidin, 5 ug/ml Aprotinin, sowie 5 ug/ml Leupeptin) lysiert gefolgt von einer Klärung bei 40000g für 30 min. Lysate wurden auf Proteingehalt normalisiert und für 2 Stunden bei 4°C mit an protein A agarose (Boehringer Mannheim) präadsorbierten 8 ug anti-HA Antikörper (für transfektierte Zellen) oder anti-ERK-2 Antiserum (für endogenes ERK2) inkubiert.

1.6 Immun Komplex Kinase assays Zur Bestimmung der IKK Aktivität wurden Immuno- präzipitate zweimal in NP-40 Lysispuffer gewaschen und einmal mit Kinasepuffer enthaltend 20mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 25 mM Na-Glycerophosphat, 10 mM MgCl2. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 30 pl Kinasepuffer für 20 min. bei 30°C und unter ständigem Rühren in der Gegenwart von 1 mM DTT, lOuCi [Y32P] ATP (spezifische Aktivität : 3000Ci/mmol), 50uM kaltem ATP und 600 ng gereinigtem GST-IKBa (wild type) oder GST-IKBaAA durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und fünfminütiges Kochen beendet. Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Aktivität wurde mittels Autoradiographie bestimmt und mit einem BAS 2000 BioImaging Analyser (Fuji) quantifiziert. Immunpräzipitierte Proteine wurden mittels western blot unter Verwendung von anti-VSV

oder anti-IKK-2 Antikörpern und anschließender standard enhanced Chemiluminescenz (Amersham) analysiert. Die Aktivität von ERK-2 wurde unter Verwendung von myelin basic protein als Substrat (Gibco BRL) bestimmt gemäß der Literaturstelle Hoffmeyer, A., Avots, A., Flory, E., Weber, C. K., Serfling E. & Rapp, U. R. (1998) J Biol Chem273, 10112-9.

1.7 Präparation der rekombinaten IKKß Kinase Domäne aus E. coli Die pGEX-GST-IKKß Kinase Domäne wurde erhalten durch subklonierung des N-terminalen Fragments (Aminosäuren 1-291) von VSV-IKK in pGEX-2T (Pharmacia) unter Verwendung der endogenen BamHl sites. E. coli bl21 wurden mit dem Plasmid transformiert und die Proteinexpression wurde durch Zugabe von Isopropyl- ß-D-thiogalactosid für 4 Stunden bei 30°C induziert.

Das bakterielle Pellet wurde schallbehandelt in PBS enthaltend 1% Triton X-100. GST Fusionsprotein wurde mittels glutathion sepharose beads (Pharmacia) präzipitiert. Das IKKß Protein wurde nach Eluierung von den beads weiter aufgereinigt mittels Chromatographie durch eine mon Q column (Pharmacia).

Die Reinheit des eluierten Proteins war besser als 90%, wie durch SDS-PAGE und subsequentem Coomassie Färben des Gels belegt.

1.8 Aufreinigung von aktivem c-raf aus Sf9 Zellen Sf9 Insektenzellen wurden mit einer MOI (multiplicity of infection) von 5 mit einem GST-rafA1302YY340-341DD (GST-BxB-DD, von Dr. P. Cohen, Dundee, zur Verfügung gestellt) exprimierenden Baculovirus infiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion geerntet und in RIPA Puffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0, 1% SDS, 0,5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40,10% Glycerol, 2 mM EDTA, pH 8,0, supplementiert mit 1mM Na-Orthovanadat, 1 mM PMSF, 5 mM Benzamidin, 5 ug/ml Aprotinin, sowie 5 ug/ml Leupeptin) lysiert. Alle darauf folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.

GST-BxB-DD wurde mittels Gluthation beads präzipitiert. Die beads wurden zweimal mit RIPA Puffer, wie vorstehend, gewashen und einmal für 5 min. in Ripa Puffer mit zusätzlich 500mM LiCl. Nach der Eluierung wurde das Fusionsprotein in 20 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10% Glycerol und 1 mM DTT dialysiert. Die Reinheit von GST-BxB-YY340-341DD war ca. 70% gemäß SDS-PAGE und Coomassie Färbung. Die Aktivität des Fusionsproteins wurde getestet in einem in vitro kinase assay unter Verwendung von rekombinantem kinaseinaktivem MEK als Substrat gemäß der folgenden Literaturstellen : Baldwin, A. S. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14,649-681 ; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcription Factors in Eukarotes, eds. Papavassiliou, A. G. (R. G. Landes Company, Austin, Texas), pp. 153-188.

1.9 raf Aktivitätsassay mit gereinigter IKK Kinase Domäne HA tagged raf Proteine wurden aus transfizierten Jurkatzellen gemäß der Literaturstelle Baldwin, A. S.

(1996) Annu. Rev. Immunol. 14,649-681, immuno- gereinigt. 500 ng gereinigter GST-IKKß Kinase Domäne wurden mit den angegebenen raf Proteinen oder gereinigtem GST-BxB-DD aus Sf9 Zellen in Kinasepuffer (25 mM HEPES, pH 7,5,150 mM NaCl, 25 mM ß-Glycerophosphat, 10 mg MgCl2, lOOug ATP, 1 mM DTT) in der Gegenwart von 10 uCi [y32P] ATP für 20 min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und anschließendem Kochen gestoppt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Kinase Reaktionen mit rekombinatntem MEK als Substrat wurden durchgeführt wie in folgenden Literaturstellen beschrieben : Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C.

& Rapp, U. R. (1998) J. Virol. 72,2788-2794 ; Daub, M., Jockel, 3., Quack, T., Weber, C. K., Schmitz, F., Rapp, U. R., Wittinghofer, A. & Block, C. (1998) Mol Cell Biol 18,6698-710.

1.10 IKK Aktivitätsassay in Rohzellen-Lysaten Jurkat Zellen wurden in hypotonischem Puffer (siehe : Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Nucl. Acids Res. 11,1475-1489) inkubiert und lysiert im Wege der mehrfachen Passage durch eine 21 gauge Nadel. Lysate wurden mittels Zentrifugation geklärt und auf Proteingehalt normalisiert. Für jedes assay

wurden 1 mg Lysatprotein mit 10 ug gereinigtem GST-BxB-DD aus Sf9 Zellen inkubiert. Thermisch deaktiviertes GST-BxB-DD (90°C für 10 min.) wurde als Kontrolle verwendet. Die Inkubation wurde bei 20°C für 20 min. und unter ständigem Rühren in der Gegenwart von 10 uM ATP durchgeführt. Die Bestimmung der Aktivität wurde gemäß 1.6 durchgeführt. Immunoprä- zipitiertes IKK wurde mittels Western blotting und anschließendem Probing mit Antiseren gegen IKKa und IKKß (Santa Cruz) quantifiziert (IKKa und IKKß entspricht IKK-1 und IKK-2).

1.11 In vitro IKK Aktivitätsassay Rekombinates IKKa oder IKKß (zur Verfügung gestellt von Dr. J. Li : Li, J., Peet, G. W., Pullen, S. S., Schembri-King, 3., Warren, T. C., Marcu, K. B., Kehry, M. R., Barton, R. & Jakes, S. (1998) J Biol Chem 273, 30736-41) wurde mit gereinigtem GST-BxB-DD in Kinasepuffer (25 mM HEPES, pH 7,5,150 mM NaCl, 25 mM ß-Glycerophosphat, 10 mg MgCl2, lOO, ug ATP, 1 mM DTT) inkubiert. Pro assay wurden 800 ng rekombinates IKBa zugegeben und die Reaktion wurde bei 30°C für 20 min. in der Gegenwart von 50 uM ATP und 10 uCi (712p ATP durchgeführt. Thermisch deaktiviertes (siehe 1.10) GST-BxB-DD wurde als Kontrolle verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und Kochen bei 95°C für 4 min. beendet. Die Proteine wurden mittels SDS PAGE getrennt. Gleichmäßige Beladung wurde mittels Coomassie Färbung geprüft. Die Gele wurden getrocknet

und phosphorylierte Proteine wurden durch Autoradiographie visualisiert.

2. Experiment zur Blockierung der v-raf Transformation von Fibroblasten durch Inhibierung der NF-KB Induktion.

NIH/3T3 Fibroblasten wurden mit dem v-raf Expressionsplasmid EHneo (250 ng) zusammen mit einem 4-fachen Überschuß (1 ug) der wild type und kinaseinaktiven Formen von IKK-2 transfiziert. Foci oder morphologisch transformierte Zellen wurden 14 Tage nach der Transfektion gezählt. Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich war die v-raf induzierte Transformation nicht beeinflußt durch die Expression von wild type Kinase. Dagegen reduzierte kinaseinaktives IKK-2 die Focus Ausbeute dramatisch.

Es ist bekannt, daß kinaseinaktives IKK-2 als ein dominant negativer Regulator der Induktion von NF-KB durch TNFa und andere Stimuli funktioniert. Dies in Verbindung mit den gezeigten Ergebnissen belegt, daß NF-KB Induktion für eine v-raf vermittelte Transformation erforderlich ist.

Tabelle 1 Focus Ausbeute (%) v-raf + Vektor 100 v-raf + IKK-2 (WT) 111 + 28 v-raf + IKK-2 (KD) 13 + 11

3. Experimente, welche belegen, daß IKB-Kinase in die raf vermittelte NF-KB Induktion involviert ist Um den Beitrag des IKK-Komplexes zur PMA-und raf-induzierten NF-KB Aktivität zu untersuchen, wurde der Effekt von kinaseinaktivem IKK-2 in Jurkat T Zellen untersucht. Jurkat T Zellen wurden cotransfiziert mit einem KB abhängigen Reporter (3xKB. luc) und entweder einem Expressionsvektor für dominant negatives IKK-2 (dn-IKK-2) oder dem leeren Expressionsvektor pcDNA3.16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 20 ng/ul PMA oder 80ng/ul TNFa für 6 Stunden stimuliert. Die Luciferaseaktivität für nichtinduzierte Zellen, welche mit pcDNA3 cotransfiziert wurden, wurde auf 1 gesetzt und alle anderen Aktivitäten sind hierauf normiert.

Die Ergebnisse sind im einzelnen in der Fig. la dargestellt. Hieraus entnimmt man, daß der Reporter atwa 15-fach bei Behandlung mit PMA und etwa 25-fach mit TNFa aktiviert wurde. Cotransfektion des dn-IKK-2 Expressionsvektors blockierte die Aktivierung nicht nur im Falle von TNFa, sondern auch im Falle von PMA.

Als nächstes wurde der Effekt der dn-IKK-2 Expression auf constitutiv aktive Varianten der raf Protein Kinase untersucht. Dies wurde erhalten durch Fusion der ras carboxyterminalen Domäne an die Kinase Domäne von raf, was in Targeting von raf auf die Zellmembran resultiert (raf-BxB-CX). Alternativ wurde ein raf Protein mit zwei phosphomimetischen Aminosäuren benutzt (YY340-341DD), welche Tyrosin Phophorylierung mimikrieren. Tyrosin Phosphorylierung von raf an diesen Stellen ist in der Aktivierung von raf in

T-Zellen involviert. Jurkat T-Zellen wurden mit einer der vorstehenden Varianten, 3xKB. luc und ggf. dn-IKK-2 cotransfiziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. lb dargestellt. Transfektion dieser raf Proteine induzierte NF-KB abhängige Transcription auf einem vergleichbaren Niveau wie PMA Behandlung. Diese Aktivität nahm zu bei PMA Behandlung der raf trans- fizierten Zellen. Bei cotransfektion von dn-IKK-2 waren allerdings alle Aktivitäten praktisch vollstandig unterdrückt. Hieraus folgt, daß IKK-2 und vermutlich der IKK-Komplex ein kritisches Element in der PMA-und raf-induzierten NF-KB Aktivität sind.

Die Figur lc zeigt Aktivitäten in Jurkat Zellen, welche cotransfiziert sind mit dem Reporter HSV-tk. luc und Expressionsvektoren für entweder wild type IKK-2 oder dn-IKK-2. Auf 100 gesetzte Bezugsgröße ist das Expressionsniveau bei Cotransfektion des Reporters (lOug) mit pcDNA3. Die Figur lc belegt, daß die zuvor gezeigten Effekte von IKK-2 und dn-IKK-2 Cotransfektionen spezifisch für den NF-kB abhängigen Reporter sind, da ein constitutiver Promotor (Herpes Virus Thymidin Kinase Promotor) nicht berührt war.

In den der Figur ld zugrundeliegenden Versuchen wurden Jurkat Zellen mit dem KB-abhängigen Reporter und aktivem raf transfiziert. 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Suramin (1,5 mM f. c.) behandelt. Eine Stunde später wurden PMA oder TNFa zugegeben, wie ersichtlich und die Zellen wurden weitere 6 Stunden danach geerntet. Suramin ist eine heterozyklische polyanionische Verbindung, welche in Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen an der Zelloberfläche

eingreift. Die Figur ld zeigt, daß TNFa vermittelte NF-KB Aktivität durch Behandlung mit Suramin reduziert wird, wie erwartet. Im Gegensatz hierzu wurde weder PMA-noch raf-induzierte NF-KB Aktivität berührt. Dies legt nahe, daß eine autocrine loop nicht involviert ist.

4. Experimente, die belegen, daß PMA und raf IKB Kinase Aktivität stimulieren.

Die Figur 2a zeigt Ergebnisse, welche mit Jurkat Zellen erhalten wurden, die mit 3xkB. luc and aktivem raf (raf-BxB-CX) und7oder wild type IKK-2 cotrans- fiziert wurden. Stimulation erfolgte mit PMA, wie angegeben. Die Ergebnisse zeigt, daß Uberexpression von wild type IKK-2 als solches die NF-KB abhängige Transkription signifikant stimuliert. Cotransfektion des constitutiv aktiven raf Konstrukts mit wild type IKK-2 führt zu einer zusätzlichen Erhöhung der Reportergen Aktivität. Entsprechendes wurde bei PMA Behandlung gefunden.

In der Fig. 2b ist gezeigt, daß IKK-2 Vberexpression in constitutiver Phosphorylierung von IKBa resultiert.

Das obere Panel zeigt ein Autoradiogram eines Immun Komplex Assays unter Verwendung von GST-IKBa (AA1-72) (GST = Glutathion-S-Transferase) als Substrat. Zellen wurden wie in Fig. 2a transfiziert. VSV-IKK-2 wurde immunopräzipitiert und entweder mit wild type (wt) oder mutiertem IxBa (AA), worin Serin an den Positionen 32 und 36 durch Alanin substituiert ist, inkubiert.

Die Zahlen darunter zeigen die relative

IKBa-spezifische Kinaseaktivität. Die background Phosphorylierung in pcDNA3 transfizierten Zellen wurde zu 1 gesetzt. Das untere Panel zeigt Western blot Analysen des immunopräzipitierten IKK-2. Die Spezifität der gefundenen Phosphorylierung ist durch die Abwesenheit einer Phosphorylierung im Falle des mutanten Substrats belegt.

Die Figur 2c belegt, daß die IKK-2 Aktivität in Extrakten von Zellen, welche mit einem aktiven raf Kinase Konstrukt cotransfiziert wurden, erhöht ist. In dem oberen Panel ist ein Immun Komplex Assay mit immunopräzipitiertem VSV-IKK-2 und IKBa als Substrat gezeigt. Der Stern zeigt autophosphoryliertes IKK-2 Protein. Die Zahlen unter dem Panel geben die relativen Kinaseaktivitäten an. Das untere Panel zeigt einen Western Immunoblot für präzipitiertes IKK-2 als Kontrolle. Die Größen der Protein Marker sind an der Seite angegeben. Nicht gezeigt ist, daß mutantes IKBa Protein nicht berührt war, was die Spezifität der Phosphorylierung belegt. Das mutante raf Konstrukt (im Bereich der ATP Bindungsstelle mutiert) ergibt ein kinaseinaktives Protein, welches eine IKBa-spezifische Kinaseaktivität von IKK-2 nicht stimuliert. Dieses mutante Protein stimuliert auch nicht KB-abhängige Reportergenaktivität (nicht dargestellt).

5. Ergebnisse, welche belegen, daß die mitogene cytoplasmische Kinase Kaskade nicht essentiell für die NF-KB Induktion durch PMA und raf ist.

Die mitogene Signalisierung via raf ist bereits ausführlich untersucht worden. raf wird aktiviert über multiple extrazelluläre Signale, i. e. über ras durch Liganden, welche an Tyrosin Kinase Rezeptoren binden.

Der wesentliche nachgeschaltete Effektor ist MEK, welches die ERK Kinasen phosphoryliert und aktiviert.

Es ist bekannt, daß ein Inhibitor niedrigen Molekulargewichts, PD98059, MEK Aktivierung in vielen Systemen blockiert (Dudley, D. T., Pang, L., Decker, S. J., Bridges, A. J. & Saltiel, A. R. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92,7686-9).

Die Ergebnisse der Fig. 3 zeigen, daß PD98059 dagegen nicht in die raf oder PMA vermittelte NF-KB Aktivierung eingreift, woraus zu schließen ist, daß die mitogene cytoplasmische Kinase Kaskade bei der NF-KB Aktivierung nicht involviert ist.

Fig. 3a zeigt EMSA Versuche mit Ganzzellextrakten (5ug) aus Jurkat Zellen mit Behandlungen, wie angegeben, sowie eine KB-spezifische probe. PD98059 (PD) wurde 2 STunden vor der PMA oder TNFa Stimulierung zugegeben. Die Positionen der induzierten NF-KB Komplexe sowie der nichtspezifischen Komplexe (Stern) sind gekennzeichnet. Nur der relevante Teil des Autoradiogramms ist gezeigt. Unbehandelte Jurkat Zellen zeigen sehr niedrige Levels nuklearer NF-KB Bindungsaktivität, welche mit PMA Induktion sehr stark induziert werden konnte. Im Gegensatz zu den bereits nach 10 min. durch TNFa induzierten NF-KB Komplexen, war PMA Induktion leicht verzögert und maximal nach ca. 30 min. nach Behandlung. PD98059 Zugabe führte zu

keiner Verringerung der TNFa oder PMA induzierten NF-kB DNA Bindung.

Fig. 3b zeigt Ergebnisse einer transienten Transfektion von Jurkat Zellen mit 3xKB. luc. Die Zellen wurden mit dem aktiven raf Expressionsvektor BxB-CX cotransfiziert und wie angegeben mit PMA und PD98059 behandelt. PD98059 wurde 4 STunden nach Transfektion zugegeben, PMA wurde weitere 12 Stunden später für 6 Stunden zugegeben. Man erkennt, daß PD98059 die PMA-oder raf-stimulierte KB-abhängige Reporter Aktivität nicht reduziert. Eine geringfügige Stimulation der KB-abhängigen Transkription ist zu erkennen.

Die Fig. 3c zeigt, daß PMA-und TNFa-stimulierte Aktivität des IKK Komplexes durch PD98059 nicht berührt wird. Endogene IKK Aktivität wurde zeitabhängig in Verfolg der STimulation von Jurkat Zellen bestimmt. Die Panels zeigen Autoradiogramme eines Immun Komplex Assays unter Verwendung von IxBa als Substrat nach 10,30 und 60 min. und in der Gegenwart oder Abwesenheit der angegebenen Stoffe.

Maximale Phosphorylierung wurde nach 10 min. mit TNFa und nach 30 min. mit PMA beobachtet. Die Zahlenwerte geben die relativen IKBa-spezifischen Kinase Aktivitäten an. Die Aktivität in Extrakten aus unbehandelten Zellen wurde zu 1 gesetzt. Hinsichtlich der induzierten IKK-2 Aktivitäten ist kein signifikanter Effekt durch PD98059 auf die Induktion durch TNFa oder PMA zu beobachten.

Der Figur 3d ist zu entnehmen, daß demgegenüber (und erwartungsgemäß) Die PMA Stimulation von endogenem ERK-2 durch PD98059 unterdrückt wird. Jurkat Zellen wurden mit den angegebenen Stoffen für 30 min. stimuliert. Die Aktivität von endogenem ERK wurde in einem Immun Komplex Assay unter Verwendung von myelin basic protein (MBP) als Substrat bestimmt. Das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm der MBP Phosphorylierung, das untere ein Western blot des immunpräzipitierten ERK-2. Das mobility shift für phosphoryliertes ERK-2 ist aufgrund des kurzen Polyacrylamid Gels nicht detektierbar. MBP-spezifische Kiase Aktivitäten sind durch die Zahlenwerte angegeben.

Zur Bestätigung der Erkenntnisse aus den Ergebnissen der Fig. 3 wurde der Effekt von dominant negativem MEK untersucht. Für Fig. 4a wurden Jurkat Zellen transient transfiziert mit 3xkB. luc und Expressionsvektoren für raf (BxB-CX, wild type IKK-2 und zwei dominant negativen Varianten von MEK (MEK-S217A und MEK-K97M, jeweils 15ug). Keines der beiden MEK Mutanten reduzierte die raf-induzierte Transaktivierung des NF-KB-abhangigen Reporters. Für Fig. 4b wurden Jurkat Zellen mit den angegebenen Plasmiden transfiziert wie zu 4a beschrieben. Das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm eines Immun Komplex Assays der IKK-2 Aktivität unter Verwendung von IKBa als Substrat. Eine langsamer wandernde Bande (Stern) ist vermutlich Autophosphorylierung von immunpräzipitiertem IKK-2.

Die Zahlenwerte geben die relative IKK-2 Kinase Aktivität an. Das untere Panel zeigt einen Western blot des immunpräzipitierten IKK-2. Wie bereits zuvor,

erkennt man, daß IKK-2 Expression allein in einer meßbaren, für IKBa spezifische in vitro Kinase Aktivität resultiert. Cotransfektion von mutantem MEK berührt diese konstitutive Aktivität nicht. Dies belegt, daß MEK nicht für die raf vermittelte NF-KB Aktivierung erforderlich ist. Die Figuren 4c und 4d belegen auch, daß dieses Ergebnis nicht auf mangelnder Funktion der MEK Mutanten als dominant negativ beruht.

Für Fig. 4c wurde ein GAL4 Reporter (4x17. TATA) mit dem Expressionsvektor für das GAL-ERK Fusionsprotein cotransfiziert und raf BxB-CX sowie die genannten MEK Mutanten (jeweils 15ug) wurden eingeschlossen. Für Fig. 4d wurden Jurkat Zellen entweder mit pcDNA3 oder einem Expressionsvektor für HA-tagged ERK-2 zusammen mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. ERK-2 wurde unter Verwendung des tag-spezifischen Antikörpers immunpräzipitiert und das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm eines Immun Komplex Assays mit MBP als Substrat. Die Zahlenwerte geben die relativen Aktivitäten an. Das untere Panel zeigt einen Western blot des immunpräzipitierten ERK-2. Man erkennt, daß das verwendete dn-MEK erwartungsgemäß die raf-induzerte GAL-ELK Transkriptionsaktivität blockiert und daß die ERK-2 Aktivierung durch raf BxB-CX unterdrückt wird.

Eine weitere Stützung der vorstehenden Ergebnisse wurde durch die der Fig. 5 zugrundeliegenden Versuche erhalten. Für Fig. 5a wurden S107 Zellen mit dem GAL4-abhängigen Reporter zusammen mit GAL-ELK oder 3xKB. luc, wie angegeben, transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit raf BxB-CX cotransfiziert oder mit PMA stimuliert. Fig. 5b zeigt ein Cotransfektions-

experiment mit GAL-ELK und dem GAL4 Reporter in Jurkat Zellen zusammen mit Expressionsvektoren für raf BxB-CX und wild type IKK-2 und dn-IKK-2, wie angegeben. S107 ist eine mutantePlasmacytoma Zellinie, welchen die Fähigkeit zur Aktivierung von NF-KB auf verschiedene Stimuli fehlt und dieser Defekt ist dem IKK Komplex vorgeschaltet. Der Fig. Sa entnimmt man, daß weder PMA noch raf den KB-abhängigen Reporter in diesen Zellen aktivieren. Dagegen zeigten die gleichen Stimuli eine hohe Aktivität in dem GAL-ELK Reportersystem. Dies belegt, daß eine intakte MAP-Kinase Kaskade nicht für eine NF-KB Aktivierung ausreicht. Die Fig. 5b belegt letztendlich, daß die raf-MEK-ERK und raf-IKK pathways unabhängig voneinander sind. Weder stimuliert wild type IKK-2 GAL-ELK Aktivität, noch reduziert dn-IKK-2 raf stimulierte GAL-ELK Aktivität bei Cotransfektion in Jurkat Zellen.

Schließlich wurde untersucht, ob die beobachteten Effekte nur auf Jurkat Zellen beschränkt sind. Die Figur 6 zeigt Versuchsergebnisse in HeLa Zellen. Diese wurden transient transfiziert mit 3xkB. luc und Expressionsvektoren für raf-BxB-CX, dn-IKK-2 und dn-MEK (S217A), wie angegeben. PMA Iduktion wurde wie zuvor angegeben durchgeführt. Die Ergebnisse an den HeLa Zellen stehen in voller Übereinstimmung mit jenen an Jurkat Zellen.

6. Experimente, welche belegen, daß die Stimulation von IKB Kinase durch raf indirekt ist und MEKK1 involviert.

Die folgenden Experimente dienten der Untersuchung der Frage, ob die Stimulation der IKK Kinase Aktivität durch raf direkt oder indirekt ist.

Zunächst wurde untersucht, ob auch rekombinates raf eine in vitro Stimulation von IKK Aktivität hervorruft. In Fig. 7a wurden cytosole Extrakte aus unbehandelten oder PMA-induzierten (30 min.) Jurkat Zellen mit aktivem (+) oder hitzedeaktiviertem (-) rekombinantem raf-BxB-DD Protein in Anwesenheit von unmarkiertem ATP inkubiert. Der endogene IKK Komplex wurde mit entweder IKK-1 oder IKK-2 erkennenden Antikörpern immunpräzipitiert und in einem in vitro Kinase Assay mit GST-IKBa getestet (oberes Panel). Das untere Panel zeigt einen Kontroll-Immunblot der Immunpräzipitate mit einer Mischung aus IKK-1 und IKK-2 erkennenden Antikörpern. In allen Fällen wurde eine Stimulation von IKK Aktivitäten durch aktives rekombinantes raf Protein festgestellt. Da IKK-2 stets mit dem IKK-1 Antikörper präzipitierte, und umgekehrt, dürfte die bestimmte Aktivität von dem heterodimeren IKK-1/IKK-2 Komplex herrühren.

In der Fig. 7b ist ein in vitro Kinase Assay mit rekombinatem GST, GST-MEK und die activation loop entahltendem GST-IKK-2 (1-291) als Substrat wiedergegeben. Jurkat Zellen wurden mit HA-tagged raf-BxB-CX, einem HA-tagged kinaseinaktiven Mutant hiervon, oder pcDNA3 transfiziert. Extrakte wurden immunpräzipitiert mit HA-spezifischen Antikörpern und in einem Immun Komplex Assay mit den angegebenen Substraten getestet. Zusätzlich wurden Substrat- proteine auch mit 5 ug rekombinantem raf-BxB-DD,

gereinigt aus Baculovirus-infizierten Sf9 Zellen umgesetzt. MEK wurde erwartungsgemäß durch raf phosphoryliert, hingegen konnte keine Phosphorylierung des GST-IKK-2 Fusionsproteins festgestellt werden. Das Gleiche wurde für rekombinates raf (rBxB-DD) oder immunpräzipitiertes raf (BxB-CX aus transfizierten Jurkat Zellen gefunden. Bei Benutzung von Vollängen rekombinantem IKK-1 und IKK-2 in einem coupled kinase assay mit IkBa als Substrat wurde entsprechenderweise keine Stimulation oder zusätzliche Phosphorylierung von IKK Proteinen in vitro und in Gegenwart von raf beobachtet, wozu auf die Fig. 7c verwiesen wird.

Hierin wurden 500 ng rekombinantes und gereinigtes IKK-1,50 ng rekombinantes und gereinigtes IKK-2 und 5 ug rekombinates raf-BxB-DD, wie angegeben, eingesetzt.

Die Positionen des phosphorylierten IKBa und des autophosphorylierten IKK Proteins sind markiert.

Die Beobachtung aus diesen Experimenten, daß raf IKK Aktivität in Rohlysaten induziert, nicht jedoch die Aktivitäten der gereinigten IKK Proteine berührt, zeigt an, daß keine direkte Bindung von raf an NF-KB erfolgt, sondern daß ein Intermediat involviert ist.

In der Fig. 8 sind Ergebnisse mit den als Intermediate in Frage kommenden Substanzen MEKK1 und NIK dargestellt. In der Fig. 8a sind Ergebnisse einer Cotransfektion von 3xKB. luc mit entweder 5 ug oder 2 ug MEKK1 Expressionsvektor und absteigenden Mengen (10,7,5 pg) an raf-BxB-CX dargestellt. Die Aktivität des Reporters in Cotransfektion mit pcDNA3 wurde zu 1 gesetzt. Man erkennt, daß raf auf synergistische Weise MEKK1 vermittelte Aktivität bei allen getesteten Konzentrationen steigert. Dagegen konnte kein Effekt

durch raf in Cotransfektionen mit verschiedenen Mengen an NIK Expressionsvektor gefunden werden (Daten nicht gezeigt). Die Fig. 8b zeigt, daß die Synergie zwischen raf und MEKK1 auch im Falle von raf-BxB-CX, raf-BxB-DD und interessanterweise auch von raf-BxB, welches als solches keinerlei NF-KB induzierende Aktivität in T-Zellen zeigt, gefunden wurde (Fig. 8b : 5 ug MEKK1 und/oder jeweils 10 pg der raf Varianten). Der kinaseinaktive Mutant raf-BxB-CX375W zeigte keine Wirkung auf MEKK1 und wechselwirkte auch nicht mit der MEKK1 vermittelten NF-KB Aktivierung, was zeigt, daß MEKK1 in diesem pathway raf nachgeschaltet ist. In der Fig. 8c wurden schließlich die Effekte dominant negativer Varianten von MEKK1 und NIK (jeweils 10 ug, 10 pg raf-BxB-CX, 3xKB. luc) getestet. Man erkennt, daß mit dnMEKKl eine Inhibierung der raf-induzierten KB-abhängigen Reporteraktivitat erfolgt.

In der Figur 9 ist schließlich in schematischer Weise dargestellt, daß entsprechend der vorgestellten Untersuchungen zwei raf-induzierte pathways für die Zelltransformation existieren.