UN PROCEDIMIENTO BIOTECNOLÓGICO

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la obtención de determinados oligosacáridos presentes en la leche materna, concretamente la lacto-N-neotetraosa y la lacto-N- tetraosa, mediante un proceso biotecnológico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los oligosacáridos son carbohidratos de cadena corta (grado de polimerización de 2 a 7) que se encuentran de forma natural en frutas, verduras, leche humana y miel. Son considerados importantes debido a sus propiedades biológicas y fisiológicas, como ingredientes funcionales y particularmente por su actividad prebiótica.

Los oligosacáridos presentes en la leche humana cumplen un papel biológico importante ya que probablemente están relacionados con la prevención de infecciones en los recién nacidos al evitar la adhesión de ciertos patógenos (virus y bacterias) al epitelio intestinal, disparar el sistema inmune localmente y actuar como prebióticos. La leche materna contiene más de 130 oligosacáridos distintos, que constituyen el tercer componente de ésta. Su concentración total disminuye a medida que avanza el curso de la lactancia, de modo que al año contiene menos de la mitad que en las primeras semanas de vida. Existen diferencias cuantitativas y cualitativas entre los oligosacáridos detectados en la leche de los distintos mamíferos. Los monómeros mayoritarios de los oligosacáridos de la leche humana son D-glucosa, D-galactosa, N- acetil glucosamina, L-fucosa y N-acetil neuramínico. Todos ellos sufren modificaciones por la adición de grupos de L-fucosa y/o ácido siálico, generando los llamados oligosacáridos neutros o ácidos, respectivamente, de los que se han descrito entre 150 y 200. Su concentración en la leche decrece a medida que avanza la lactación pero en los primeros meses parecen tener un papel fisiológico relevante.

Los oligosacáridos neutros más importantes se forman a partir de la lactosa por medio de glucosiltransferasas (GT), de modo que los que se forman mayoritariamente en la leche humana son Lacto-N-triosa y Lacto-N-tetraosa y los distintos isómeros de la Lacto-N-fucopentaosa. La fracción de oligosacáridos no digerida en la leche materna estimula el crecimiento de bifidobacterias en el colon, y esta flora podría tener efectos beneficiosos de protección frente a infecciones entéricas. Así, los oligosacáridos son un componente principal del sistema inmunológico innato por el cual la madre protege a su hijo de patógenos (entéricos o de otra localización) durante la lactancia.

Es destacable que ninguno de estos productos se encuentra en la leche de cabra, oveja o vaca. Además, estas moléculas no están presentes en las leches artificiales, por lo que su adición a las mismas tiene evidente interés social y económico. En este sentido existirían cuatro posibilidades para su producción y posterior utilización, i) La primera sería su purificación a partir de la leche humana. Esta alternativa resulta inabordable dada la carencia de materia prima.

ii) La segunda sería la síntesis química. Aunque es posible, su coste es alto y su eficacia baja.

iii) La tercera alternativa se basa en el uso de enzimas para producir distintos oligosacáridos a partir de lactosa. Esta estrategia se basa en el uso de distintas glicosidasas o glicosiltransferasas provenientes de diversos orígenes (microorganismos o mamíferos). Es preferible el uso de glicosiltransferasas dada su mayor eficacia pero, dado que muchas de ellas provienen de mamíferos, su costo es muy elevado. Por ello se trabaja en la expresión de los genes que codifican alguno de estos enzimas en distintos microorganismos (Escherichia coli, Pichia pastorís y Saccharomyces cerevisia ) con el fin de sobreproducirlos, aunque nunca se ha dado el salto al escalado semi-industrial.

iv) Finalmente, la última estrategia pasa por construir mediante técnicas de ingeniería genética, micoorganismos capaces de generar los oligosacáridos. En este sentido se han logrado los primeros avances expresando tres genes de Neissería meningitiditis que codifican una N-acetil glucosamino transferasa, una galactosil transferasa y una sialil transferasa, en una cepa de E.coli en la que la expresión del gen que codifica el transportador de lactosa puede inducirse por glicerol. Aunque este abordaje ha tenido éxito, la comercialización del producto obtenido para la alimentación infantil parece compleja al utilizarse bacterias patógenas como donadoras y receptoras de genes y generar ingredientes obtenidos a partir de organismos genéticamente modificados que requerirían un etiquetado específico. También se han logrado construir diferentes bacterias transgénicas que, al crecer en un termentador y permeabilizarse, son capaces de producir cada una de ellas diferentes actividades enzimáticas y precursores implicados en la síntesis de los oligosacáridos de interés. Dicho abordaje implica cuatro microorganismos distintos dificultando su posible aplicación industrial. Respecto al estado de la técnica descrito en documentos de patente existen algunos procesos precedentes, como por ejemplo, el JP 1 1253191 A que proporciona un método para sintetizar enzimáticamente lacto-N-tetraosa, adecuada para utilizarse en alimentos y medicamentos, en cualquier cantidad. El método comprende la reacción de UDP-GIcNac sobre la lactosa en presencia de beta-1 ,3-N- acetilglucosaminil transferasa para sintetizar lacto-N-triosa seguido de la unión con galactosa en presencia de beta-galactosidasa, obteniéndose así la lacto-N-tetraosa. El documento US 2007/0275881 A1 se refiere a composiciones farmacéuticas y su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Las composiciones contienen péptidos unidos a oligosacáridos de interés, tales como, Lacto-N-tetraosa y Lacto-N- neotetraosa. Se describe la obtención de estos oligosacáridos en levaduras en presencia de las correspondientes glicosiltranferasas.

La invención del documento US 7,521 ,212 B1 se refiere a la producción de oligopolisacáridos a través de un proceso microbiológico, en el cual, por ejemplo, se obtiene lactosa-N-neotetraosa, en presencia de lactosa y GIcNAc y las enzimas beta- 1 -3-Nacetilglucosaminiltransferasa y beta-1 -4-galactosiltransferasa. Se describe también la obtención del producto intermedio Lacto-N-triosa. El documento US 6,204,431 B1 se refiere a métodos para producir mamíferos no humanos transgénicos capaces de producir ciertos oligosacáridos en la leche. A los efectos de la invención descrita en el citado documento se seleccionan las secuencias genéticas de enzimas, tales como beta-acetilglucosaminiltransferasa a partir de especies eucariotas o procariotas y se insertan en el pronúcleo del embrión que dará lugar al animal transgénico.

El documento ES 2 162 619 T3 describe un aparato y un método para la obtención de composiciones de oligosacáridos en tres pasos, utilizando glucosaminiltransferasas y galactosiltransferasas de origen humano y el documento US 5,879,912 describe un método para sintetizar oligosacáridos, polisacáridos, glicolípidos y glicoproteínas. Se describe le síntesis de lacto-N-neotetraosa en presencia de dos cultivos celulares que proveen las dos enzimas con actividad glicosiltransferasa para formar el enlace beta- Gal 1 -4 GIcNAc y beta-GIcNAc 1 -3 en presencia de UPD-GIcNAc y lactosa. OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al desarrollo de un método de producción biotecnológico de determinados oligosacáridos presentes en leche materna, concretamente la producción de los oligosacáridos lacto-N-neotetraosa y lacto-N- tetraosa a partir de lacto-N-triosa obtenida de sobrenadantes de cultivo enriquecidos en las enzimas adecuadas para generarlos a partir de sus precursores: lactosa y N- acetil-glucosamina. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Formación enzimática de los oligosacáridos: lacto-N-triosa, lacto-N- neotetraosa y lacto-N-tetraosa.

Figura 2: Ensayo en placa de detección de actividad N-acetil-glucosaminidasa. (Ej.3) Figura 3: Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en la actividad de la enzima nag A de A.niger recuperada del caldo de cultivo de la cepa recombinante de S.cerevisiae. (Ej. 4)

Figura 4: Determinación de actividad beta-galactosidasa en caldo de cultivo (A) o suspensión celular (B) de recombinantes de S. cerevisiae o P.pastoris para la enzima lacZ de S. thermophilus. (E . 5)

Figura 5: Localización subcelular de lacZ de S. thermophilus sobreexpresado en S. cerevisiae. (Ej. 6)

Figura 6: Ensayo en placa de detección de actividad beta-galactosidasa en transformantes de E.coli para el gen lacZde S. thermophilus (Ej. 7)

Figura 7: Proceso de obtención de lacto-N-triosa en caldo de cultivo. (Ej. 8)

Figura 8: Influencia de la concentración de sustratos en la producción de lacto-N-triosa in vivo en caldo de cultivo. (Ej. 9)

Figura 9: Proceso de obtención de lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa en dos etapas secuenciales. (Ej. 10) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los oligosacáridos a obtener en la presente invención son los tetrasacáridos lacto-N- neotetraosa y lacto-N-tetraosa. Estos tetrasacáridos se encuentran presentes en la leche materna, y están formados por una unidad de lactosa, a la que se adiciona N- acetilglucosamina (enlace beta 1 -3), lo que genera lacto-N-triosa. A partir de Lacto-N- triosa, y en presencia de beta-galactosiltransferasa puede obtenerse Lacto-N- neotetraosa (enlace beta 1 -4) y Lacto - N-tetraosa (enlace beta 1 -3). Los tetrasacáridos se producen por tanto por medio de dos actividades secuenciales, una beta -(1 ,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa, y después una actividad beta-(1 ,3) ó beta- (1 ,4) galactosiltransferasa.

El procedimiento sigue el esquema simplificado de las reacciones enzimáticas de transglicosilación necesarias para la síntesis de los oligosacáridos de interés, es decir, la lacto-N-neotetraosa y lacto-N-tetraosa, así como la lacto-N-triosa como intermediaria. (Figura 1 ).

Las enzimas necesarias para producir los oligosacáridos lacto-N-triosa, lacto-N- tetraosa y lacto-N-neotetraosa son producidas y secretadas al caldo de cultivo por levaduras de la especie S. cerevisiae modificadas genéticamente. Para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumo humano, se deben de cumplir una serie de requisitos legales, que se centran en que tal microorganismo debe figurar en la llamada lista "GRAS" (generally aknowledged as secur ), es decir, que cumpla ciertos requisitos de seguridad. Existen unos 50 microorganismos GRAS aprobados para la industria alimentaria. En la presente invención, el origen de los genes codificantes de ambas actividades enzimáticas se fija en microorganismos GRAS para evitar problemas de rechazo. Los genes seleccionados son: nagA de Aspergillus niger, y lacZde Streptococcus thermophilus.

La actividad enzimática necesaria para la primera etapa del proceso se ha demostrado presente en suero bovino, calostro, y las enzimas codificadas por los genes nagA de los hongos Aspergillus oryzae y Aspergillus nidulans (dos enzimas con actividad N- acetil-glucosaminidasa).

Por similitud con las especies en las que se han identificado genes codificantes de glucosaminiltransferasas (Matsuo 2003), disponibilidad pública de su secuencia y estatus GRAS, se selecciona como origen de esta actividad enzimática a utilizar en el proceso objeto de la invención, el hongo A. niger. Conviene señalar que aunque esta actividad se ha detectado en la especie A. niger, el gen correspondiente no ha sido identificado en su secuencia genómica. Por ello, a los efectos de la presente invención, ha sido necesario identificar previamente el gen ortólogo al gen nagA de A. nidulans en A. niger. La secuencia nucleotídica del gen nagA de A.niger se muestra en SEQ ID NO:1 .

La segunda etapa se lleva a cabo por una enzima galactosiltransferasa. Esta actividad se ha demostrado en algunas beta-galactosidasas de origen bacteriano y fúngico (A. oryzae, Bifidobacterium bifidum, Bacillus circulans).

En este caso se ha seleccionado como origen de la actividad galactosiltransferasa a utilizar en el proceso objeto de la invención el gen codificante de la enzima beta- galactosidasa (lacZ) de la bacteria S. thermophilus, puesto que dicho gen codifica esta actividad en otras bacterias lácticas, y es sabido que S. thermophilus es capaz de catalizar reacciones de transglicosilación al actuar sobre la lactosa (Smart 1991 , Reuter et al 1999). El gen lacZ se encuentra identificado en la secuencia genómica de S. thermophilus y se ilustra en la SEQ ID NO:2.

Por otra parte, para conseguir que las enzimas clonadas sean secretadas al caldo de cultivo por S. cerevisiae, es necesario fusionarlas a un péptido-señal de secreción. Los tres péptidos-señal de secreción más ampliamente estudiados para S. cerevisiae son el del factor oc (Brake eí a/.1989), SEQ ID NO:3, el de la invertasa SUC2 (Perlman et al. 1982), SEQ ID NO:4, y el de la fosfatasa ácida PH05 (Arima et al. 1983), SEQ ID NO:5.

Así, los genes que codifican las enzimas nagA y lacZ pueden expresarse en el transformante de S.cerevisiae, que se puede obtener insertando el ADN de la presente invención en dos vectores e introduciendo los mismos en un hospedador. Los primeros métodos de transformación de S.cerevisiae implicaban la eliminación de la pared celular para producir esferoplastos que pudieran incorporar ADN tras tratamiento de los mismos con calcio y polietilenglicol (Hinnen et al. 1978). Los transformantes se plaqueaban en medio selectivo isotónico para la regeneración de la pared celular. Posteriormente se desarrolló un método más práctico en el que las células intactas se hacen competentes por tratamiento con iones de litio (Ito eí al. 1983). Este método se utiliza actualmente a pesar del hecho de que tiene una menor eficiencia que el anterior; sin embargo, una modificación que utiliza DMSO permite un incremento de hasta 25 veces de la frecuencia de transformación. Más recientemente, se viene utilizando un tercer método, electroporación, obteniéndose eficiencias muy elevadas (Meilhoc et al. 1990).

Los vectores a usar para este propósito pueden ser cualquiera de los capaces de expresar los genes que codifican las enzimas en hospedadores apropiados. Como ejemplo de dichos vectores, pueden mencionarse: vectores plasmídico, bacteriófago o cósmido. Generalmente dichos vectores comprenderán un factor regulador tal como un promotor; a corta distancia del promotor deben tener una región que al transcribirse suministre el sitio de entrada al ribosoma; y finalmente deben contener un origen de replicación que permita su multiplicación dentro del huésped. Además, los vectores seleccionados para cada proteína cuentan con genes marcadores de selección diferentes con el fin de rescatar diferentes auxotrofías, lo cual permite la introducción simultánea de ambos vectores en un mismo hospedador y selección en un único paso. Los marcadores de selección más ampliamente utilizados para S.cerevisiae son LEU2, TRP1 , URA3 y HIS3, utilizados en las correspondientes cepas mutantes que son auxótrofas para leucina, triptófano, uracilo e histidina, respectivamente (Beggs 1978; Rose et al. 1984; Struhl et al. 1980; Tschumper et al. 1980). Tales cepas auxótrofas están disponibles y su selección requiere el uso de medio mínimo de crecimiento en ausencia del nutriente relevante. Como fuentes de obtención de dichas cepas podemos mencionar las siguientes colecciones de cultivos tipo: Yeast Genetics Stock Culture Center of the American Type Culture Collection (k ü > :£w w w _; a ice _; 0£ ^ ; EUROSCARF

(httfi:ff s^.m^^ Research Genetics National Collection of Yeast

Cultures Centraalbureau voor

Schimmelcultures ( i > ^ _{. ;} c^ y Culture Collection of Saccharomyces cerevisiae (http://www.natur.cuni.ez/fccm/federacs.htm#dgub.).

Como hospedador en el que tiene que introducirse un vector de expresión que contiene el ADN de la invención pueden mencionarse: levaduras, bacterias y cultivos celulares de insecto, mamífero, etc. Se contempla como preferente la utilización de la levadura S. cerevisiae, pero también se propone Schizosaccharomyces pombe, P. pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, S. thermophilus, etc.

Para comprobar la expresión del gen nagA en el hospedador es posible ensayar la actividad hidrolítica N-acetilglucosaminidasa de la enzima expresada en los transformantes obtenidos, mediante ensayo en placa o en medio líquido, utilizando los sustratos sintéticos metilumbelilferil (MU)-N-acetilglucosamina ó p-nitrofenil (PNP)-N- acetilglucosamina, respectivamente (Borooah et al. 1961 ). En el caso de ensayo en placa se detecta cualitativamente, mediante análisis de fluorescencia bajo luz UV, la formación de metilumbeliferona como consecuencia de la actividad hidrolítica N-acetil- glucosaminidasa. La metilumbeliferona es un compuesto fluorogénico, fluorescente al iluminarse con una lámpara de luz UV de 366 nm. El ensayo en líquido permite la cuantificación de la actividad analizando la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la actividad hidrolítica N- acetil-glucosaminidasa.

De la misma manera, para comprobar la expresión del gen lacZ es posible ensayar la actividad hidrolítica beta-galactosidasa de la enzima expresada en los transformantes obtenidos, mediante ensayo en placa o en medio líquido, con los sustratos sintéticos metilumbelilferil (MU)-galactósido o p-nitrofenil (PNP)-galactopiranósido, respectivamente. (Maruhn 1976). En el caso de ensayo en placa se detecta cualitativamente mediante análisis de fluorescencia bajo luz UV la formación de metilumbeliferona como consecuencia de la actividad hidrolítica beta-galactosidasa. La metilumbeliferona es un compuesto fluorogénico, fluorescente al iluminarse con una lámpara de luz UV de 366 nm. El ensayo en líquido permite la cuantificación de la actividad analizando la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la actividad hidrolítica beta-galactosidasa.

El ensayo en placa permite una rápida selección de aquellos clones con mayor expresión de los genes. Mientras que el ensayo en medio líquido permite la cuantificación de la actividad, así como de su secreción, puesto que se analiza de manera independiente la actividad en el caldo de cultivo y en las células aisladas.

Una vez comprobada la actividad de las enzimas recombinantes seleccionadas es posible llegar a expresar éstas simultáneamente en una misma cepa utilizando plásmidos que rescaten distintas auxotrofías. Como plásmidos a utilizar pueden ser los pertenecientes a la colección descrita en Mumberg et al. (1995), compuesta por series de vectores de expresión con combinaciones de cuatro promotores, dos orígenes de replicación y cuatro marcadores diferentes. Utilizando estos vectores es posible controlar la expresión génica a diferentes niveles, controlando el nivel de transcripción así como el número de copia del gen recombinante. Una vez seleccionados los transformantes con mayor actividad de cada enzima o con actividades simultáneas en una misma cepa, es posible hacer crecer éstos a alta densidad obteniendo caldos de cultivo con actividades enzimáticas elevadas o grandes cantidades de células con actividad intracelular en el caso de que la enzima no se secrete. Estos caldos de cultivo o extractos celulares se pueden utilizar directamente como lecho de reacción in vivo para la obtención de los oligosacáridos de interés a partir de sus precursores lactosa y N-acetil-glucosamina, sin necesidad de llevar a cabo una purificación de las proteínas correspondientes. Alternativamente pueden purificarse las enzimas para su utilización en la obtención de los oligosacáridos de interés.

Así el proceso final de obtención de los oligosacáridos de interés constará de dos fases, una primera que durará de 70 a 74 horas a 43-47 ⁵ C, preferiblemente, 72 horas a 45 ⁵ C, en la cual se generará lacto-N-triosa a partir de sus precursores lactosa y N- acetil-glucosamina utilizando la actividad nagA de caldos de cultivo o extractos celulares (en caso de que la proteína se secrete o no, respectivamente) o proteína purificada. Finalizada esta fase es posible purificar la lacto-N-triosa o continuar el proceso con una segunda fase para generar lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa. Esta segunda fase durará 36 horas a 45 ⁵ C en la cual se generará lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa a partir de lacto-N-triosa y galactosa, presentes en el caldo de reacción resultante de la primera fase, utilizando la actividad lacZ de un caldo de cultivo o extracto celular, según se secrete o no la enzima recombinante, o en su caso, proteína purificada.

En una realización preferente de la invención, se ha llevado a cabo el procedimiento microbiológico para la obtención de lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa, de forma que la lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa se obtienen in vivo en un rango de 1 a 100 gramos por litro de caldo de reacción en dos etapas secuenciales a partir de caldo de cultivo enriquecido en actividad nagA y extracto celular con actividad lacZ provenientes de una única cepa que expresa y secreta nagA y que expresa y no secreta lacZ.

A los efectos de la presente invención, se contempla también la posibilidad de llevar a cabo la reacción utilizando la actividad de las dos enzimas simultáneamente presentes en un mismo caldo de cultivo o en un mismo extracto celular con actividad lacZ provenientes de una única cepa que expresa y secreta nagA y lacZ. Finalmente, los oligosacáridos obtenidos de acuerdo a la presente invención son extraídos y purificados del medio de reacción a través de técnicas habituales conocidas del estado de la técnica. Como técnica de preferencia para la purificación de los oligosacáridos se utiliza la separación cromatográfica en carbón activado (Whistler et al. 1950).

Una vez purificados, estos oligosacáridos pueden ser incorporados como ingredientes alimenticios en productos alimenticios para su consumo.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Secuencia de nucleótidos del gen nagA de A. niger. (Fiq.2)

Se identifica el gen codificante de la actividad N-acetil-glucosaminidasa en A. niger por homología con el gen nagA de A.nidulans. La secuencia de dicho gen de referencia está disponible y anotada en las bases de datos ( úffi J á^ db=protein&id=10039359). La proteína resultante de su expresión corresponde con la SEQ ID NO:6

Al comparar la secuencia de aminoácidos anterior con el genoma disponible de A. niger en las bases de datos

aparecen al menos 2 posibles genes ortólogos a nagA de A. nidulans. De entre los dos, se decide clonar el gen cuya secuencia es SEQ ID NO:1 , por su mayor homología y descripción en las bases de datos como gen codificante de una actividad putativa N- acetil-glucosaminidasa. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos codificadas por ambos genes muestra una homología del 71 .3%. El clonaje se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico de A. niger, siguiendo el método y materiales descrito en Mullís eí a/ (1986).

Ejemplo 2: Secuencia de nucleótidos del gen lacZde S. thermophilus.

La secuencia del gen lacZ codificante de la enzima β-galactosidasa de S. thermophilus está identificada y disponible en las bases de datos y corresponde con SEQ ID NO:2. La proteína está descrita como un tetrámero de 124 kDa aproximadamente. Se clonó el gen lacZ mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico de S. thermophilus, siguiendo el método y materiales descrito en Mullís et al (1986).

Ejemplo 3: Determinación de la actividad N-acetil-qlucosaminidasa en placa del gen nag A de A. niger sobreexpresado en S. cerevisiae.

Se crecen los transformantes generados con el plásmido p415GPD-nagA-LEU2 en la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) sobre medio rico YPD, formulado con 10 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 20 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono, solidificado con agar al 2% (Pronadisa).

Sobre la placa se vierte una solución licuada del sustrato metilumbeliferil (MU)-N- acetil-glucosamina a una concentración de 1 mM en tampón citrato 45 mM con 1 % de agarosa a pH 4,8, se incuba a 50 ⁵ C durante 30 minutos protegida de la luz y se observa bajo luz UV. La actividad N-acetil-glucosaminidasa provoca la formación de metilumberilferona, que es un compuesto fluorogénico, fluorescente al iluminarse con una lámpara de luz UV de 366 nm.

Como se muestra en la Figura 2, se observa un halo fluorescente alrededor de aquellos clones capaces de secretar la enzima nagA (A) frente a cepas control que no expresan nagA (B). Ejemplo 4: Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en la actividad la enzima nag A de A.niger recuperada del caldo de cultivo de la cepa recombinante de S. cerevisiae.

Con el fin de optimizar la expresión del gen nagA en S. cerevisiae, se estudió si la composición del medio y/o la temperatura de crecimiento pueden influenciar en la expresión y/o secreción de la enzima.

Para ello se utilizó una cepa recombinante generada mediante transformación de la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) con el plásmido p415GPD-nagA-LEU2. Los transformantes se seleccionaron en medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck), uracilo (Calbiochem) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales. En primer lugar se cultivaron las células en paralelo en medio mínimo selectivo y en medio rico. Como medio mínimo se utilizó medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck), uracilo (Calbiochem) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales; como medio rico se utilizó YPD formulado con 10 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 20 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono.

El caldo de cultivo resultante del crecimiento de la cepa en ambos medios se ensayó para la actividad N-acetil-glucosaminidasa en medio líquido utilizando p-nitrofenil (PNP)-N-acetil-glucosamina como sustrato de la reacción. Para ello se utilizó una alícuota de cada caldo de cultivo y se diluyó en tampón citrato/fosfato 0,09 M a pH 4,8 en presencia del sustrato, incubando a 30 ⁵ C durante 30 minutos. La actividad hidrolítica N-acetil-glucosaminidasa se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la misma.

Como se observa en la Figura 3, la actividad es casi tres veces superior en el sobrenadante de cultivo cuando se crece la cepa en medio rico que en medio mínimo selectivo, poniendo de manifiesto una influencia del medio de cultivo en la expresión y/o secreción de la enzima nagA.

En cuanto a la temperatura de crecimiento, el transformante seleccionado se creció en medio rico YPD formulado con 10 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 20 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono, en paralelo a 3 temperaturas diferentes: 28, 30 y 32 ⁵ C. El caldo de cultivo se analizó en cuanto a su actividad hidrolítica N-acetil- glucosaminidasa en medio líquido. Para ello se utilizó una alícuota del caldo de cultivo y se diluyó en tampón citrato/fosfato 0,09 M a pH 4,8 en presencia del sustrato p- nitrofenil (PNP)-N-acetil-glucosamina, incubando a 30 ⁵ C durante 30 minutos. La actividad hidrolítica N-acetil-glucosaminidasa se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la misma. Como se muestra en la Figura 3 la actividad que se recupera en el sobrenadante de cultivo se ve incrementada a medida que disminuye la temperatura de crecimiento, llegando a ser un 50% superior cuando se disminuye la temperatura de crecimiento de 32 a 28 ⁵ C. Por tanto, se establece una temperatura de crecimiento óptima para la expresión y secreción de nagA de entre 26 y 30 ⁵ C.

Como se muestra en la Figura 4 se recupera hasta 3 veces más actividad N-acetil- glucosaminidasa en el caldo de cultivo cuando se crece el transformante nagA en medio rico y más de 4 veces más actividad cuando además se disminuye la temperatura de crecimiento a 28 ⁵ C. Ejemplo 5: Determinación de actividad β-qalactosidasa del gen lacZ de S.thermophilus sobreexpresado en las levaduras S. cerevisiae v P. Pastorís

Se generaron cepas recombinantes de S.cerevisiae y P. pastorís, por transformación de la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) con el plásmido p416GPD-lacZ-URA3 y de la cepa haploide silvestre X-33 con el plásmido pPICzaB-lacZ, respectivamente. Los transformantes de S.cerevisiae se seleccionaron en medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck), leucina (Merck) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales. Los transformantes de P.pastoris se seleccionaron en medio YPDS formulado con 10 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 20 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa), 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono, 1 M de sorbitol (Applichem VWR) y 100 μg/ml de Zeocina (Invivogen).

Se llevó a cabo un crecimiento en los medios indicados y se determinó la actividad hidrolítica beta-galactosidasa en los caldos de cultivo así como en una suspensión celular. Para ello se diluyó la cantidad indicada de caldo o de suspensión celular en tampón fosfato 100 mM a pH 7 en presencia del sustrato p-nitrofenil (PNP)- galactopiranósido, incubando a 55 ⁵ C durante 30 minutos. La actividad hidrolítica beta- galactosidasa se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la misma.

Como se muestra en la Figura 4, no se detecta actividad beta-galactosidasa en los sobrenadantes de cultivo ni en el caso del recombinante de P. pastorís ni en el de S. cerevisiae (A). Los niveles de actividad en las suspensiones celulares son similares en los dos organismos (B).

Ejemplo 6: Localización subcelular de lacZ en recombinantes de lacZ de S.thermophilus en S. cerevisiae

Se generó la cepa recombinante de S.cerevisiae mediante transformación de la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) con el plásmido p416GPD-lacZ-URA3 y selección en medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck), leucina (Merck) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales.

El recombinante se creció en medio rico YPD formulado con 10 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 20 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono a 28 ⁵ C. Se separaron tres muestras con el mismo número de células: se preparó una suspensión de células enteras con una de ellas para analizar la actividad en la pared celular; se prepararon protoplastos con otra de las muestras mediante tratamiento de las células con 3 mg/ml de zimoliasa 20T (Seikagaku) durante 15 minutos a 37 ⁵ C, para evaluar la actividad lacZ en la membrana plasmática; y finalmente, se lisó mecánicamente la tercera muestra y se preparó un extracto celular en el que evaluar la actividad lacZ citoplásmica. Las tres muestras se prepararon en el mismo volumen.

Con una porción de cada una de las muestras se llevó a cabo un ensayo de determinación de actividad hidrolítica beta-galactosidasa en medio líquido, diluyendo cada muestra en tampón fosfato 100 mM a pH 7 en presencia del sustrato p-nitrofenil (PNP)-galactopiranósido e incubando a 55 ⁵ C durante 30 minutos. La actividad hidrolítica beta-galactosidasa se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la misma.

Como se observa en la Figura 5 se recupera 3 veces más actividad en el lisado celular que en la pared celular. La actividad en la membrana celular determinada a partir de los protoplastos preparados es muy pequeña. Por tanto, la actividad lacZ en este recombinante se encuentra principalmente en el citoplasma celular y una pequeña porción se encuentra retenida en la pared celular. Ejemplo 7: Determinación de la actividad beta-qalactosidasa en placa del gen lacZde S. thermophilus sobreexpresado en E. coli.

Se genera un transformante de E. coli para el gen lacZ de S.thermophilus mediante transformación de la cepa DH5oc (fhuA2 (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 V80 A(lacZ)M15 gyrA96 recA 1 relA 1 endA 1 thi-1 hsdR17 ) con el plásmido p416GPD-lacZ URA3 y selección en medio LB formulado con 5 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 10 g/l de triptona (Scharlau Chemie S.A.), 10 g/l de cloruro sódico (NaCI) y ampicilina (Calbiochem) a una concentración de 100 mg/l.

Sobre la placa se vierte una solución licuada del sustrato metilumbelilferil (MU)- galactopiranosido a una concentración de 1 mM en tampón fosfato 100 mM con 1 % de agarosa a pH 6, se incuba a 50 ⁵ C durante 30 minutos protegida de la luz y se observa bajo luz UV. La actividad beta-galactosidasa provoca la formación de metilumbelilferona, que es un compuesto fluorogénico, fluorescente al iluminarse con una lámpara de luz UV de 366 nm.

Como se muestra en la Figura 6 se observa un halo fluorescente alrededor de aquellos clones capaces de secretar la enzima lacZ (A) frente a cepas control que no expresan lacZ (B).

Ejemplo 8: Obtención de lacto-N-triosa in vivo a partir de caldo de cultivo enriquecido en actividad naq A y de sus precursores: lactosa y N-acetil-qlucosamina.

Para llevar a cabo la reacción de obtención de lacto-N-triosa se utilizó una cepa recombinante generada mediante transformación de la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) con el plásmido p415GPD-nagA-LEU2. Los transformantes se seleccionaron en medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck), uracilo (Calbiochem) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales.

El transformante seleccionado se creció hasta OD 40 en lote en medio 4xYPD formulado con 40 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 80 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 80 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono a 28 ⁵ C hasta saturación.

Se comprobó la presencia de la enzima nag A en el sobrenadante de cultivo, mediante determinación de la actividad hidrolítica N-acetil-glucosaminidasa en una alícuota del caldo de cultivo diluida en tampón citrato/fosfato 0,09M a pH 4,8 en presencia del sustrato, incubando a 30 ⁵ C durante 30 minutos. La actividad hidrolítica N-acetil- glucosaminidasa se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 405 nm debida a la liberación de p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, como consecuencia de la misma.

Posteriormente, como se esquematiza en la Figura 7 se adicionó directamente al medio de cultivo lactosa y N-acetil-glucosamina a alta concentración (330 g/l y 100 g/l respectivamente) y se incubó a 45 ⁵ C durante 72 horas. Una fracción del sobrenadante se filtró y se analizó mediante HPLC la presencia de lacto-N-triosa en el mismo. Ejemplo 9: Influencia de la concentración de sustratos en la producción de lacto-N- triosa in vivo en caldo de cultivo.

Con el fin de optimizar el proceso de producción de lacto-N-triosa in vivo, se llevó a cabo ensayos como los descritos anteriormente con cantidades decrecientes de los sustratos lactosa y N-acetil-glucosamina. Se utilizó como referencia la reacción llevada a cabo con 416 g/l de lactosa y 125 g/l de N-acetil-glucosamina y en paralelo se llevaron a cabo reacciones con el 50%, 33%, 25%, 10% y 1 % de sustratos.

Como se observa en la Figura 8, el rendimiento de la reacción disminuye a medida que disminuye la concentración de sustratos en el medio. Sin embargo esta tendencia no es proporcional, perdiéndose únicamente un 7% de producto para una disminución de hasta el 50% en la concentración de sustratos y un 33% con una disminución de hasta el 99%.

Ejemplo 10: Obtención de lacto-N-tetraosa v lacto-N-neotetraosa in vivo en dos etapas secuenciales a partir de caldo de cultivo enriquecido en actividad naqA y extracto celular con actividad lacZ provenientes de una única cepa que expresa y secreta naqA y que expresa y no secreta lacZ

Se transformó la cepa haploide BY4741 (MATa HIS3D1 LEU2D0 MET15D0 URA3D0) con los plásmidos p415GPD-nagA-LEU2 y p416GPD-lacZ-URA4 simultáneamente. Los transformantes se seleccionaron en medio sintético SD basado en 6,7 g/l de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco) y suplementado con 20 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono y 200 mg/l de histidina (Merck) y metionina (Fluka) como requerimientos nutricionales. La cepa obtenida, recombinante para las dos enzimas, secreta únicamente la proteína nagA. Esto permite separar las dos actividades en un mismo cultivo, la actividad nagA se enriquece en el caldo de cultivo y la actividad lacZ en el interior celular.

Como se muestra en la Figura 9, se crece la cepa a alta densidad en medio 4xYPD formulado con 40 g/l de extracto de levadura (Scharlau Chemie S.A.), 80 g/l de peptona bacteriológica (Pronadisa) y 80 g/l de glucosa (Panreac Química S.A.U.) como fuente de carbono a 28 ⁵ C hasta saturación. Entonces se separaron las células del sobrenadante de cultivo. A este último se le adicionó lactosa y N-acetil- glucosamina a una concentración de 330 g/L y 100 g/L, respectivamente y se incubó a 45 ⁵ C durante 72 horas. Posteriormente, las células se lisaron y se preparó un extracto celular que se adicionó a la reacción incubándose durante 36 horas más a la misma temperatura. Una fracción del caldo de reacción se filtró y se analizó mediante HPLC la presencia de lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa en el mismo. La cantidad de lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa se determinó en 3,5 gramos por litro de caldo de reacción.

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