SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la obtención de productos bioactivos a partir de materias primas vegetales, concretamente de extractos de cacao. Dichos productos poseen uno o más biopéptidos que poseen actividad inhibidora de la enzima prolil endopeptidasa (PEP) in vitro y/o capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa in vivo, pudiendo utilizarse en la industria alimentaria, dietética y farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud se puede considerar una continuación de la solicitud de patente PCT/ES2008/000540, de los mismos autores de la presente invención, en la que se describen productos bioactivos obtenidos por hidrólisis enzimática, que comprenden uno o más de una serie de ocho péptidos que se han aislado y caracterizado en la misma por sus secuencia. Siendo las secuencias de éstos 8 péptidos: SDNEWAWMF (SEQ.ID. No. 29), LSDNEWAWMF (SEQ. ID. No. 30), SDNEWAWMFK (SEQ. ID. No. 31), LSDNEWAWMFK (SEQ. ID. No. 32), RRSDLDNGTPVIF (SEQ. ID. No. 33), DNYDNSAGKWWVT (SEQ. ID. No. 34), TSTVWRLDNYDNSA (SEQ. ID. No. 35) y DNYDNSAGKWWVTTD (SEQ. ID. No. 36).

Las proteínas presentes en los alimentos son precursoras de una gran cantidad de péptidos con algún tipo de actividad biológica especial, con propiedades útiles sobre diferentes procesos del organismo. Debido al gran interés por el desarrollo de productos naturales que aporten algún tipo de efecto beneficioso "extra" para la salud de la persona que los consuma, resultaría ser una buena oportunidad para desarrollar nuevos productos o ingredientes funcionales tomando como punto de partida diferentes materias primas vegetales. La posibilidad de originar estos péptidos es un .campo de investigación puntero en la industria de nutraceúticos, ya que permite originar nuevas aplicaciones en alimentos funcionales, dar valor añadido de subproductos y componentes alimentarios, mejorar las propiedades nutritivas de alimentos convencionales y desarrollar nuevos suplementos dietéticos o incluso nuevos medicamentos.

Algunos subproductos de la Industria Agroalimentaria tienen un contenido elevado en proteínas y péptidos bioactivos que aportan un valor añadido al mismo. Existen diversos mecanismos para favorecer el incremento de péptidos enriqueciendo considerablemente una matriz asignándole unas características determinadas, como por ejemplo, antihipertensiva, antihiperglucémica, antineurodegenerativa, anticariogénica incluso antihiperlipidémica. Con la utilización de enzimas proteolíticas se pueden hidrolizar las proteínas por puntos específicos, capaces de originar un amplio espectro de péptidos en los hidrolizados obtenidos con múltiples efectos fisiológicos.

Como antecedentes del estado de la técnica se puede considerar, entre otros documentos, la solicitud de patente WO91/19800 A1 , la cual se refiere a proteínas y ácidos nucléicos derivados del cacao. Concretamente, se reivindican fragmentos de la proteína albúmina (21 kDa), de la semilla del cacao, como precursores del aroma del cacao. La funcionalidad que la presente solicitud de patente le atribuye al péptido de 205 aminoácidos, o a fragmentos del mismo, es la de ser precursores del sabor del cacao.

En el documento de patente europea EP1298210 A1 se describen péptidos derivados de las proteínas vicilina y albúmina derivadas del grano de cacao como precursores del sabor del chocolate. Los autores del mencionado documento atribuyen a los péptidos, de 2 a 30 aminoácidos, preferentemente de 2 a 5 aminoácidos, la funcionalidad de ser precursores del sabor del chocolate. Así mismo, los autores también reivindican el uso de éstos péptidos para la elaboración de helados, bebidas, lácteos, productos cosméticos, comida para animales y productos farmacéuticos.

La solicitud de patente W096/38472 A1 reivindica como péptidos precursores del sabor del cacao péptidos con la secuencia aminoacídica Lys-Ala-Pro-Leu-Ser-Pro- Gly-Asp-Val-Phe-Val y fragmentos de 2 a 1 1 aminoácidos contenidos en dicha secuencia. La secuencia reivindicada y sus fragmentos, tienen atribuida la funcionalidad de ser precursores del sabor del cacao.

La solicitud de patente WO02/42327 A2 se refiere a como se aisla, purifica e identifica la proteína de albúmina 2S como una proteína precursora del sabor del cacao. En concreto, la solicitud describe el uso de dicho polipéptido o fragmentos del mismo para la producción de sabor de cacao/chocolate. El documento de patente JP2008019228 describe una composición de aminoácidos derivados de extractos de cacao a los que se les ha extraído previamente los polifenoles con propiedades inhibitorias de la angiotensina - 1 (ACE), así como alimentos y comidas que contienen dicha composición. En el documento no se describe la secuencia de los péptidos o aminoácidos que comprenden dicho extracto, ni el proceso de aislamiento y/o purificación que se lleva a cabo.

La actividad prolil-endopeptidasa (PEP), está relacionada con la pérdida de memoria y los procesos de aprendizaje ya que degrada neuropéptidos implicados en estos procesos, ricos en prolina tales como la vasopresina y la sustancia P. Algunos estudios también señalan que esta enzima podría estar relacionada con la enfermedad de Alzheimer. Hasta la fecha diversos autores como Kim et al., ("Prolyl Endopeptidase Inhibitors from Green Tea"; Arch Pharm Res, 24 (4):292-296 2001 ) y Tezuka et al., ("Screening of crude drug extracts for prolyl endopeptidase inhibitory activity"; Phytomedicine, 6(3): 197-203 1999), afirman que los polifenoles de ciertos extractos vegetales producen la inhibición de la prolil endopeptidasa. También el documento de patente US 2007/01 16779 describe el uso de granos de cacao como fuente de polifenoles, como uno de los elementos de composiciones farmacéuticas y como inhibidor de ciertas enzimas implicadas en enfermedades neurodegenerativas como es el caso del Alzheimer o Parkinson. Otros autores, como Maruyama et al., ("Prolyl Endopeptidase Inhibitory Activity of

Peptides in the Repeated Sequence of various Proline-Rich proteins"; Journal of Fermentation and Bioengineering, 74:145-148 1992) y Asano et al., ("Inhibition of prolyl endopeptidase by synthetic peptide fragments of human P-casein";Agric.Biol.Chem, 55(3):825-828 1991 ) que defienden que algunos fragmentos peptídicos inhiben la acción de la PEP, pero nadie hasta la fecha ha relacionado los péptidos del cacao como metabolitos inhibidores de dicha enzima.

Por lo tanto, debido a la demanda cada vez mayor de nuevos ingredientes y compuestos con este tipo de actividad inhibitoria, dadas las características tan saludables del cacao, se consideró la posibilidad de encontrar péptidos bioactivos a partir de sus extractos que tuvieran actividad inhibitoria de PEP, y se encontraron ocho péptidos que no solo poseen actividad inhibitoria de PEP in vitro, sino que dichos péptidos bioactivos muestran capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa in vivo según pruebas con C. elegans, lo que dio lugar a la solicitud de patente PCT/ES/000540. Continuando con la investigación, sorprendentemente se han encontrado nuevos productos bioactivos que comprenden 28 nuevos péptidos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona productos bioactivos a partir de extractos de cacao ricos en nuevos péptidos bioactivos con actividad inhibidora in vitro de la enzima PEP y/o con capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa in vivo.

En concreto la invención se basa en la obtención a partir del cacao, de fracciones peptídicas de purificación inhibidoras de la enzima PEP y/o con capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa con el objetivo de poder ser utilizados como ingredientes para su incorporación en alimentos funcionales.

Los péptidos bioactivos se puedén producir por hidrólisis de una o más proteínas o péptidos presentes en los extractos de cacao obtenidos. Para dicho fin se utilizan enzimas y condiciones de hidrólisis que permitan obtener los biopéptidos deseados.

Para estudiar estas inhibiciones se pueden utilizar diferentes metodologías. Los ensayos in vitro, se basan en la determinación de la actividad enzimática de la enzima PEP en presencia del inhibidor a ensayar, es decir en esta invención, las fracciones de cacao ricos en péptidos.

Los péptidos bioactivos o los hidrolizados que los contienen pueden incorporarse a alimentos funcionales. Las fracciones, una vez concentradas, se pueden utilizar no solo en la industria alimentaria y de los productos dietéticos sino también en la industria farmacéutica mediante la fabricación de medicamentos que con la cantidad adecuada de dichos péptidos pueden utilizarse en el tratamiento y prevención de enfermedades, tales como el control de la presión arterial, concretamente de la hipertensión y también de tipo degenerativo como el Alzheimer, Parkinson, etc. También se pueden utilizar como antioxidantes. Así, la invención encuentra nuevas aplicaciones del cacao, contribuyendo a su revalorización desde el punto de vista de la salud.

Igualmente, una vez secuenciados e identificados los 28 péptidos que pueden contener los productos bioactivos, objeto de la invención, se pueden obtener a partir de cualquier material de partido o sustrato que los contenga. Además, los nuevos péptidos bioactivos identificados en los hidrolizados pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por métodos recombinantes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cromatograma de interacción hidrofóbica. Observando la curva a 214nm, podemos concluir que toda la proteína está recogida en las fracciones 3 y 4.

Figura 2. Cromatograma de fase inversa de la fracción 3 procedente de una cromatografía de interacción hidrofóbica. Observando la curva a 214nm, podemos concluir que toda la proteína está recogida entre las fracciones 7 y 11.

Figura 3. Cromatograma de fase inversa de la fracción 4 procedente de una cromatografía de interacción hidrofóbica. Observando la curva a 214nm, podemos concluir que toda la proteína está recogida entre las fracciones 7 y 1 1. Figura 4. Ensayo de la capacidad protectora frente a la acumulación del péptido β- amiloide en C. elegans CL4176 con las fracciones F8 (31.3 μg proteína/ml), F9 (18.1 μg proteína/ml) y F10 (9.9 μg proteína/ml). ZPP (0.1 mM) y Vitamina C (0.1 pg/ml) se usaron como controles positivos. A partir de esta figura se puede concluir que las fracciones F8, F9 y F10 confieren protección frente a la acumulación del pétido B-amieloide, siendo las fracciones F9 y F10 las que mayor protección presentan.

Figura 5. Efecto de los extractos peptídicos F8 (31.3 μg proteína/ml), F9 (18.1 μg proteína/ml) y F10 (9.9 μg proteína/ml) sobre la supervivencia en la cepa de C. elegans CL2070. ZPP (0.1 mM) y Vitamina C (0.1 pg/ml) se usaron como controles positivos. Las barras indican las desviaciones estándar. La figura muestra como los gusanos tratados con los extractos peptídicos de las fracciones F8, F9 y F10 ven aumentada su supervivencia frente en condiciones de estrés oxidativo.

Figura 6. Efecto de los extractos peptídicos F8 (31.3 μg proteína/ml), F9 (18.1 μg proteína/ml) y F10 (9.9 μg proteína/ml) en la supervivencia de los gusanos de la cepa de C. elegans CL2070. ZPP (0.1 mM) y Vitamina C (0.1 Mg/ml) se usaron como controles positivos. Esta figura muestra como la curva de supervivencia de los gusanos tratados con los extractos peptídicos de las fracciones F8, F9 y F10 se ve aumentada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de obtención de productos , bioactivos, concretamente procedentes de fracciones de cacao ricos en nuevos péptidos con actividad inhibitoria de PEP in vitro y/o capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa in vivo. En concreto la invención se basa en la obtención de diferentes fracciones peptídicas a partir de la hidrólisis enzimática de un subproducto del cacao (barquillo) para obtener péptidos bioactivos, con el objetivo de poder utilizarlos como ingredientes para su incorporación en alimentos funcionales En otro aspecto, la invención se relaciona con la purificación de los péptidos del extracto de cacao obtenido. Dependiendo de los péptidos presentes en el extracto se lleva a cabo diferentes estrategias de purificación, por ejemplo, la concentración por intercambio catiónico o interacción hidrofóbica, y separación, por ejemplo por fase inversa o filtración en gel. La presente invención proporciona 28 nuevos péptidos bioactivos, a partir de extractos de cacao. Dichos péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de aminoácidos denominadas: SEQ. ID. N°. 1 , SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N°. 9, SEQ. ID. N°. 10, SEQ. ID. N°. 1 1 , SEQ. ID. N° 12, SEQ. ID. N°. 13, SEQ. ID. N°. 14, SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 16, SEQ. ID. N° 17, SEQ. ID. N°. 18, SEQ. ID. N°. 19, SEQ. ID. N°. 20, SEQ. ID. N°. 21 , SEQ. ID. N° 22, SEQ. ID. N°. 23, SEQ. ID. N°. 24, SEQ. ID. N°. 25, SEQ. ID. N°. 26, SEQ. ID. N° 27 y SEQ. ID. N° 28, los cuales poseen actividad inhibitoria de la enzima PEP in vitro y/o capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa in vivo. Además, la invención proporciona la utilización de dichos péptidos bioactivos como ingredientes funcionales para diferentes alimentos, considerando como alimentos cualquier composición destinada a la alimentación, independientemente de que esté en forma líquida o sólida.

El material de partida de la presente invención sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese uno o más de los péptido bioactivos descritos en la presente invención. En una realización particular dicha materia prima es vegetal, concretamente el material de partida es el cacao. Theobroma cacao es el nombre científico que recibe el árbol del cacao o cacaotero. Cacao viene del maya (Ka'kaw) y Theobroma en griego significa "alimento de los dioses". Más concretamente es un subproducto del cacao denominado barquillo, que es un cacao con cascarilla parcialmente desgrasado mediante prensado físico, con una proporción de grasa que puede oscilar entre el 5% y el 15%, preferiblemente el 10%, expresado en porcentaje de peso. Dicho material de partida se disuelve en agua en una proporción que puede variar entre el 5% y 20%, preferiblemente el 10%. Una vez que el barquillo se ha disuelto en el agua se trata a diferentes temperaturas, por ejemplo entre 40°C y 60°C, preferiblemente 50°C, durante diferentes tiempos, por ejemplo entre 1 y 24 horas, preferiblemente 1 , 6 , 18 ó 24 horas, con una o más enzimas hidrolíticas a diferentes concentraciones. Puede emplearse cualquier enzima capaz de proporcionar los péptidos de interés. Concretamente las enzimas usadas podrían ser tanto enzimas con actividad celulasa como es el caso de la enzima Termamyl, como enzimas con actividad proteasa, como son las enzimas Alcalase, Neutrase, Ultraflo o Flavourzyme. Se puede utilizar una sola enzima o combinaciones de dos o más enzimas, siempre que produzcan uno o más biopéptidos con las características deseadas. Las concentraciones de enzima usadas oscilarán entre los 0,10 y 10 μΙ/L, y entre 0,5 y 2 μΙ_ de enzima por g de materia prima. Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, presión, concentración de enzima/s, tiempo de la reacción, etc se optimizan dependiendo de la o las enzimas utilizadas. Para la obtención del extracto, una vez terminada la reacción de hidrólisis, se inactiva la/s enzima/s, se realiza una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos y se recoge el sobrenadante que contiene los péptidos bioactivos, objeto de la presente invención, de donde se procede a su separación en fracciones y subfracciones para poder aislarlos y purificarlos. Por lo tanto, otro aspecto adicional de la invención se refiere a la purificación e identificación de los péptidos bioactivos obtenidos a partir de los extractos de cacao. Dado que los péptidos presentes en el extracto son de distinta longitud de aminoácidos y considerando que los péptidos bioactivos de interés tienen entre 5 y 20 aminoácidos se pueden llevar a cabo diferentes estrategias de purificación, tanto para eliminar los péptidos no deseados como para aislar y concentrar los péptidos que forman el objeto de la invención. Por ejemplo a partir de los hidrolizados, se pueden obtener fracciones de distinto peso molecular mediante ultrafiltración, pudiendo aislarse posteriormente subfracciones activas mediante concentración de intercambio iónico o de interacción hidrofóbica o cromatografía de alta eficacia en fase inversa o filtración en gel. Las ventajas de la presente invención no solo vienen dadas por los nuevos péptidos denominados anteriormente como SEQ. ID. N°. 1 , SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N°. 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N°. 1 1 , SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13, SEQ. ID. N°. 14, SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 16, SEQ. ID. N°. 17, SEQ. ID. N°. 18, SEQ. ID. N°. 19, SEQ. ID. N°. 20, SEQ. ID. N°. 21 , SEQ. ID. N°. 22, SEQ. ID. N°. 23, SEQ. ID. N° 24, SEQ. ID. N° 25, SEQ. ID. N° 26, SEQ. ID. N°. 27 y SEQ. ID. N°. 28, sino por la materia prima utilizada de donde dichos péptidos se pueden obtener o estar presentes inicialmente, por los hidrolizados completos y por todas las fracciones obtenidas a partir del cacao inicial que posean propiedades bioactivas, mostrando simultáneamente actividad inhibidora de la enzima PEP, y/o también capacidad antioxidante y/o antineurodegenerativa. Tanto los péptidos como las fracciones que los contienen podrán incorporarse a alimentos funcionales así como formar parte de compuestos farmacéuticos o dietéticos, y ser empleados para ayudar en el tratamiento y prevención de diferentes enfermedades, especialmente la enfermedad cardiovascular y la degeneración cerebral.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Obtención del extracto de cacao rico en péptidos bioactivos.

Para llevar a cabo el proceso se utilizó cacao de la variedad Forastero, procedente de la Costa de Marfil.

El proceso de obtención del barquillo se realizó con semillas frescas de cacao obtenidas a partir de mazorcas de cacao según el proceso descrito en el documento de patente ES 2 286 947 A1 y PCT/ES2008/000540, de los mismos autores de la presente invención. El producto obtenido después del desgrasado por prensado se denomina barquillo si proviene de granos con cascarilla, como en el caso de la presente invención. Para ello, se disolvieron 100g del barquillo, que había sido desgrasado por prensado en un extractor mecánico continuo, y poseía un contenido residual de grasa de 10%, en 1 L de agua destilada a un proporción 1 :10 (p:v) con una combinación de las enzimas Termamyl y Alcalase, a una concentración de 1 μΙ/g de cada una de ellas y se mantuvo con agitación durante 1 hora a una temperatura de 50°C . Pasado este tiempo, se inactivaron las enzimas a 100°C y se realizó una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos recuperándose aproximadamente 850ml del sobrenadante rico en péptidos. Con este sobrenadante se llevó a cabo la purificación de los péptidos bioactivos así como el ensayo de inhibición de la enzima PEP. Ejemplo 2: Purificación de los péptidos del extracto de cacao. El sobrenadante conteniendo los péptidos y obtenido tras la centrifugación fue sometido a dos etapas de purificación.

La primera etapa del proceso consistió en someter la muestra a una fase de concentración mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), en un sistema cromatográfico ÁKTA Explorer (GE Healthcare, Amersham Biosciences AB). Para ello se utilizó la columna HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub) y para la consecuente elución se utilizó el tampón de equilibrado (100 mM fosfato sódico, 1 ,5 M (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , pH =7) con un gradiente de 1 ,5 a O de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ . Dicha elución se monitorizó a 214 nm y se evaluó in vitro en cada una de las fracciones de 10 mi obtenidas, la actividad inhibitoria de PEP. Aquellas fracciones que poseían actividad se sometieron a una etapa de purificación mediante una primera ultrafiltración, empleando filtros de 10 kDa (Amicon Ultra, Millipore), y una posterior cromatografía de fase inversa (RPC) de la fracción inferior a 10 kDa, empleando la columna RESOURCE RPC 3 mi (Amersham Biosciences) en un sistema cromatográfico ÁKTA Explorer (Amersham Biosciences) y utilizando un gradiente de elución amplio con los eluyentes 0,1 % TFA en agua miliQ (A) y 0,1 % TFA en acetonitrilo (B). La muestra se monitorizó a 214 nm y se evaluó de nuevo in vitro, en cada una de las fracciones obtenidas, en este caso de 2 mi, la actividad inhibitoria de PEP, tras eliminar los disolventes empleados en el proceso.

Ejemplo 3. Evaluación in vitro de la actividad inhibitoria de la enzima PEP. A.- Medida de la actividad inhibitoria de la PEP.

La medida de actividad prolil-endopeptidasa se realizó siguiendo el método descrito por Yoshimoto (Yoshimoto, T. and Tsuru, D. 1978. Agr. Biol. Chem., 42, 2417; Yoshimoto, T., Walter, R. and Tsuru, D. 1980. J. Biol. Chem., 255, 4786), que se basa en el empleo del sustrato Z-Gly-Pro-p-nitroanilina, a partir del cual se libera p-nitroanilina, por la acción de la enzima PEP, cuantificable mediante espectrofotometría por lectura de la absorbancia a 410 nm.

La actividad inhibidora de PEP se determinó añadiendo a la mezcla de reacción la muestra a ensayar. Como control, se determinó la inhibición del barquillo inicial sin tratamiento enzimático, así como tras la hidrólisis de las proteínas con las enzimas comerciales y las fracciones de purificación por cromatografía de interacción hidrofóbica (Figura 1). Se separaron distintas fracciones por el método de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En la Tabla 1 se muestra el porcentaje de inhibición de PEP de las muestras de barquillo y de las distintas fracciones.

La Tabla 1 contiene los resultados de inhibición de la enzima PEP de todas las muestras a lo largo de esta primera etapa de purificación.

Tabla 1. Porcentaje de inhibición de PEP de las muestras de barquillo así como de las fracciones de interacción hidrofóbica.

Muestra Inhibición PEP

Barquillo sin tratar 22,81 ± 6,45

Barquillo Alcalase+Termamyl 42,81 ± 2,98

Barquillo filtrado (150 mi) 27,02 ± 1 ,49

No retenido HIC 14,39 ± 1 ,49

F2 HIC 3,86 ± 1 ,47

F3 HIC 18,95 ± 8,93

F4 HIC 35,44 ± 17,37

F5 HIC 1 ,40 ± 0,98

F6 HIC 1 ,40 ± 0,91

F7 HIC 0 ,0 ± 0,0

Las fracciones 3 y 4 obtenidas tras la purificación por cromatografía de interacción hidrofóbica fueron seleccionadas como aquellas con mayor capacidad inhibitoria de la enzima PEP por lo que fueron sometidas a una cromatografía por fase inversa (Figuras 2 y 3).

La Tabla 2 y 3 contienen los resultados de inhibición de PEP por las fracciones obtenidas por cromatografía de fase inversa provenientes de las fracciones 3 y 4 de interacción hidrofóbica respectivamente así como el contenido en proteína presente en cada una de ellas.

Tabla 2. Porcentaje de inhibición de PEP y cantidad de proteína de las fracciones de fase inversa provenientes de la fracción 3 de interacción hidrofóbica. Muestras Cantidad proteína (mg) % Inhibición PEP

F6 RPC. (F3 HIC) 0,041168081 10,18 ± 0,85

F7 RPC. (F3 HIC) 0,520117841 14,37 ± 3,39

F8 RPC. (F3 HIC) 5,329239984 24,55 ± 2,54

F9 RPC. (F3 HIC) 2,5620785 22,16 ± 0,85

F10 RPC. (F3 HIC) 1 ,131518808 19,16 ± 0,00

F11 RPC (F3 HIC) 0,470186129 8,38 ± 3,39

F12 RPC. (F3 HIC) 0,143528 10,78 ± 3,39

F13 RPC. (F3 HIC) 0,058311881 6,59 ± 7,62

F20 RPC. (F3 HIC) 0,039742304 8,38 ± 5,08

Tabla 3. Porcentaje de inhibición de PEP y cantidad de proteína de las fracciones de fase inversa provenientes de la fracción 4 de interacción hidrofóbica.

Muestra Cantidad proteína (mg) % Inhibición PEP

F6 RFC. (F4 HIC) 0,013445155 11 ,65 ± 5,11

F7 RFC. (F4 HIC) 0,393839581 20,48 ± 0,57

F8 RPC. (F4 HIC) 6,269268373 34,54 ± 2,27

F9 RPC. (F4 HIC) 3,61016316 38,96 ± 1 ,70

F10 RPC. (F4 HIC) 1 ,97302672 26,51 ± 3,41

F11 RPC. (F4 HIC) 0,889492386 22,49 ± 1 ,14

F12 RPC. (F4 HIC) 0,299741375 19,28 ± 0,00

F13 RPC. (F4 HIC) 0,100727615 13,25 ± 3,98

Dado que las fracciones 8, 9 y 10 de fase inversa provenientes de la fracción 4 de interacción hidrofóbica presentaron el mayor valor de inhibición de PEP, se seleccionaron las mismas para la identificación de los péptidos presentes en ellas. Estos se analizaron por espectrometría de masas MS/MS y se identificaron 28 nuevos péptidos, cuyas secuencias se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Secuencias de los 28 péptidos identificados de las fracciones 8, 9 y 10 de cromatografía de fase inversa, provenientes de la fracción 4 de cromatografía de interacción hídrofóbica (los péptidos 8 y 12 se identificaron tanto en la fracción 9 como en la 10).

MW (Da) Secuencia péptido

SEQ.ID. N°. 01 1067,37 GVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 02 1173,45 ALPVNSPGKYE

Fracción 8 Fl (F4HIC) SEQ.ID. N°. 03 1283,41 TDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 04 1292,45 LSQSPVYSNQNG

SEQ.ID. N°. 05 1483,69 VTTDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 06 1017,33 SDDDGQIRL

SEQ.ID. N°. 07 1053,31 NYDNSAGKW

SEQ.ID. N°. 08 1168,41 DNYDNSAGKW

Fracción 9 Fl (F4HIC) SEQ.ID. N°. 09 1283,53 TDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 10 1437,47 RLDNYDNSAGKW

SEQ.ID. N°. 1 1 1483,67 VTTDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 12 1857,83 ANSPVLDTDGDELQTGVQ

SEQ.ID. N°. 13 777,27 GHAVTFF

SEQ.ID. N°. 14 904,31 FASKDQPL

SEQ.ID. N° 15 954,31 TFGEFQQV

SEQ.ID. N°. 16 968,43 VAPAGHAVTF

SEQ.ID. N°. 17 1029,35 KAPLSPGDVF

SEQ.ID. N°. 18 1053,35 NYDNSAGKW

SEQ.ID. N°. 08 1168,35 DNYDNSAGKW

SEQ.ID. N°. 19 1239,53 APLSPGDVFVAPA

SEQ.ID. N°. 20 1256,59 QVKAPLSPGDVF

Fracción 10 Fl (F4HIC)

SEQ.ID. N° 21 1283,57 TDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N°. 22 1367,73 «APLSPGDVFVAPA

SEQ.ID. N° 23 1384,61 QQVKAPLSPGDVF

SEQ.ID. N°. 24 1594,93 QVKAPLSPGDVFVAPA

SEQ.ID. N° 25 1629,81 SQSPVYSNQNGRFF

SEQ.ID. N° 26 1669,41 WVTTDGVKGEPGPNTL

SEQ.ID. N° 27 1758,79 SQSPVYSNQNGRFFE

SEQ.ID. N° 12 1857,83 ANSPVLDTDGDELQTGVQ

SEQ.ID. N° 28 2020,93 ANSPVLDTDGDELQTGVQY Ejemplo 3. Evaluación in vivo de las fracciones de fase inversa.

A. Evaluación de la capacidad antineurodegenerativa de las fracciones en C. elegans.

El objetivo de este estudio consistió en evaluar in vivo la funcionalidad de las fracciones de fase inversa que han dado un resultado positivo en la inhibición in vitro de prolil- endopeptidasa. Para ello se utilizó el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Dicha funcionalidad está relacionada con la protección que puedan conferir dichos extractos en el desarrollo de enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer. Para evaluar esta capacidad se seleccionaron las fracciones 8, 9 y 10 de cromatografía de fase inversa provenientes de la fracción 4 de cromatografía de interacción hidrofóbica y se llevó a cabo un ensayo de la determinación de parálisis corporal utilizando la cepa transgénica de C. elegans CL4176. Esta cepa sé caracteriza por expresar el péptido β-amiloide humano (Ab1 -42) tras una inducción por temperatura.

Datos previos en la bibliografía indican que la formación de las placas de péptido β- amiloide está precedida por estrés oxidativo (Drake et al, "Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer ^' s disease amyloid beta-peptide (1 -42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model" Neurobiol Aging 2003, 24(3):415-20). Por tanto, resulta interesante evaluar si la acción producida por la acción de alguna molécula o compuesto da lugar a una mayor resistencia frente a la acumulación en el depósito fibrilar de péptidos Αβ en las neuronas. En estos gusanos transgénicos la expresión de dicho péptido produce una parálisis corporal que puede ser evaluada tras la adición de la molécula o compuesto de interés.

Para llevar a cabo el experimento, se obtuvieron gusanos de la cepa CL4176 de edad sincronizada mediante cultivo en placas de NG a 16°C. Los huevos se recogieron en placas de NG que contenían 100 μΙ_ de cada fracción peptídica (F8, F9 y F10). Como control positivo se utilizó Z-prolil prolinal (100 μΙ_ de un stock de 10mM en superficie de la placa) con una concentración final de 0.1 mM; y vitamina C (25 ul de un stock de 0.04 mg/ml) con una concentración final de 0.1 [iglm\. Como control negativo se utilizó NG y NG sin inducir (los gusanos se incubaron a 16°C durante todo el experimento). Se analizaron 100 gusanos/condición. Tras 1 día de incubación (aproximadamente a las 23 horas de vida del gusano), se aumentó la temperatura de 16°C a 25°C para inducir la expresión de péptido Ab. A las 24 horas tras la inducción la temperatura se cambió a 20°C y se mantuvo durante el resto del ensayo. Tras la inducción, se analizó el número de gusanos paralizados en cada condición ensayada hasta que el porcentaje de gusanos paralizados fue del 100%.

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos tras la realización del ensayo de parálisis corporal en la cepa de C. elegans CL4176. En ella se puede observar que las fracciones estudiadas (F8, F9 y F10) confieren protección frente a la acumulación del péptido β- amiloide respecto al control NG inducido, siendo las fracciones F9 y F10 las que presentan una mayor protección, mostrando un comportamiento similar entre ellas. Se observa que los gusanos a los cuales no se les ha realizado la inducción del péptido β- amiloide no sufren parálisis. B. Evaluación de la capacidad antioxidante de las fracciones en C.elegans.

Para llevar a cabo el experimento, se obtuvieron gusanos de la cepa CL2070 de edad sincronizada mediante cultivo en placas de NG a 20°C. Los huevos se recogieron en placas de NG que contenían 100 pL de cada fracción peptídica (F8, F9 y F10). Como control positivo se utilizó Z-prolil prolinal (100 pL de un stock de 10mM en superficie de la placa) con una concentración final de 0.1 mM; y vitamina C (25 ul de un stock de 0.04 mg/ml) con una concentración final de 0.1 pg/ml. Como control negativo se utilizó NG. Se ensayaron 100 gusanos/condición. Después de 7 días de incubación en dichas condiciones, los gusanos se sometieron a un estrés oxidativo. Para ello, se transfirieron los gusanos a placas de medio basal S con H ₂ 0 ₂ (2 mM). Las placas se incubaron a 20 °C y tras 5 horas se contabilizó el total de gusanos que sobrevivieron al tratamiento.

La Figura 5 muestra un incremento en la supervivencia de los gusanos que han sido tratados con los extractos peptídicos F8, F9 y F10 después de la realización del estrés oxidativo con H ₂ 0 ₂ (2 mM) durante 5 horas, respecto al control negativo NG.

C. Evaluación de la supervivencia de C.elegans tras la incorporación de las fracciones en el medio de cultivo.

Para llevar a cabo el experimento, se obtuvieron gusanos de la cepa CL2070 de edad sincronizada mediante cultivo en placas de NG a 20°C. Los huevos se recogieron en placas de NG que contenían 100 pL de cada fracción peptídica (F8, F9 y F10). Como control positivo se utilizó Z-prolil prolinal (100 pL de un stock de 10mM en superficie de la placa) con una concentración final de 0.1 mM; y vitamina C (25 ul de un stock de 0.04 mg/ml) con una concentración final de 0.1 g/ml. Como control negativo se utilizó NG. Se analizaron un total de 100 gusanos/condición. Se va observando cada dos días qué número de gusanos sobrevive en cada condición hasta que el número de gusanos vivos es prácticamente nulo.

La Figura 6 muestra la curva de supervivencia durante 21 días de los gusanos crecidos en diferentes condiciones. Se observa que tanto los controles positivos como las fracciones peptídicas prolongan la vida de los gusanos en comparación con el control negativo NG.