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Patent Searching and Data


Title:
OBTAINMENT OF COCOA EXTRACTS RICH IN BIOACTIVE PEPTIDES WITH INHIBITING ACTIVITY OF ACE AND PEP ENZYMES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/012845
Kind Code:
A1
Abstract:
This relates to the obtainment of bioactive peptides from plant raw materials, specifically cocoa extracts, by enzyme treatment. Said biopeptides possess inhibiting activity of the angiotensin converting enzyme (ACE) and of the prolyl endopeptidase enzyme (PEP) in vitro and/or antioxidant activity in vivo, being utilisable in the food, dietetic and pharmaceutical industry.

Inventors:
MUGUERZA MARQUÍNEZ, Begoña (C/Marina Alta n°6 Esc.14 pta 5, Valencia, E-46015, ES)
MONZÓ OLTRA, Honorato (C/221, n°63, La Canyada - Paterna, E-46182, ES)
ALEPUZ RICO, Natalia (C/Camilo Dolç 99 3a, Alzira - Valencia, E-46600, ES)
BATALLER LEIVA, Esther (C/Palleter 44, 17a, Valencia, E-46008, ES)
GENOVÉS MARTÍNEZ, Salvador (C/Cheste 12, Aldaia - Valencia, E-46960, ES)
ENRIQUE LÓPEZ, María (C/Vall d'Uixo 65 1a, Castellón, E-12590, ES)
MARTORELL GUEROLA, Patricia (Avda. del Norte 37 9a, Picassent - Valencia, E-46220, ES)
RAMÓN VIDAL, Daniel (C/Francisco Tomás y Valiente 2, L'Eliana - Valencia, E-46183, ES)
Application Number:
ES2008/000540
Publication Date:
February 04, 2010
Filing Date:
August 01, 2008
Export Citation:
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Assignee:
NATRACEUTICAL, S.A. (Plaza América 2 - 9a planta, Valencia, E-46004, ES)
BIOPOLIS, S.L. (Polígono la coma, s/n, Paterna, ES)
MUGUERZA MARQUÍNEZ, Begoña (C/Marina Alta n°6 Esc.14 pta 5, Valencia, E-46015, ES)
MONZÓ OLTRA, Honorato (C/221, n°63, La Canyada - Paterna, E-46182, ES)
ALEPUZ RICO, Natalia (C/Camilo Dolç 99 3a, Alzira - Valencia, E-46600, ES)
BATALLER LEIVA, Esther (C/Palleter 44, 17a, Valencia, E-46008, ES)
GENOVÉS MARTÍNEZ, Salvador (C/Cheste 12, Aldaia - Valencia, E-46960, ES)
ENRIQUE LÓPEZ, María (C/Vall d'Uixo 65 1a, Castellón, E-12590, ES)
MARTORELL GUEROLA, Patricia (Avda. del Norte 37 9a, Picassent - Valencia, E-46220, ES)
RAMÓN VIDAL, Daniel (C/Francisco Tomás y Valiente 2, L'Eliana - Valencia, E-46183, ES)
International Classes:
A23G1/44; A23J3/34
Domestic Patent References:
WO1991019800A11991-12-26
WO1991019800A11991-12-26
WO2002042327A22002-05-30
WO2001041775A22001-06-14
WO1991019800A11991-12-26
Foreign References:
JP2008019228A2008-01-31
ES2264394B12008-06-01
ES2277516B12008-06-01
JP2008019228A2008-01-31
ES2264394B12008-06-01
ES2277516B12008-06-01
JPH06128287A1994-05-10
JPS6488282A1989-04-03
ES2253036B12007-07-16
JP2008019228A2008-01-31
US20070116779A12007-05-24
ES2286947A12007-12-01
Other References:
See also references of EP 2322041A4
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WU ET AL.: "Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats", J.AGRIC FOOD CHEM, vol. 49, 2001, pages 501 - 506
PEDROCHE ET AL.: "Utilisation of chickpea protein isolates for production of peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE)-inhibitory activity", JOURNAL OF THE SCIENCE OF FOOD AND AGRICULTURE, vol. 82, 2002, pages 960 - 965
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FUJITA ET AL.: "LKPNM: a product-type ACE- inhibitory peptide derived from fish protein", IMMUNOPHARMACOLOGY, vol. 82, 2002, pages 960 - 965
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KOCHHAR ET AL.: "Primary Structure of the Abundant Seed Albumin of Theobroma cacao by Mass Spectrometry", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 48, no. 11, 2000, pages 5593 - 5599
THEOBROMA CACAO L., CAFE, CACAO, THE, vol. 38, no. 2, 1994, pages 113 - 18
TAI ET AL.: "Nucleic Acid Sequence of a 21 kDa cocoa seed protein with homology to the soybean trypsin inhibitor (Kunitz) family of protease inhibitors", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 16, no. 5, 1991, pages 913 - 15
SPENCER ET AL.: "Cloning and sequencing of the cDNA encoding the major albumin of Theobroma cacao. Identification of the protein as a member of the Kunitz protease inhibitory family", PLANTA, vol. 183, no. 4, 1991, pages 528 - 35
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NAKAMURA Y; YAMAMOTO N; SAKAI K ET AL., J DAIRY SCI, vol. 78, 1995, pages 777 - 783
YOSHIMOTO, T.; TSURU, D., AGR. BIOL. CHEM., vol. 42, 1978, pages 2417
YOSHIMOTO, T.; WALTER, R.; TSURU, D., J. BIOL. CHEM., vol. 255, 1980, pages 4786
DRAKE ET AL.: "Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model", NEUROBIOL AGING, vol. 24, no. 3, 2003, pages 415 - 20
Attorney, Agent or Firm:
ARIZTI ACHA, Mónica (C/Hermosilla 3, Madrid, E-28001, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao, caracterizado por:

a) Ser un péptido que comprende entre 5 y 20 aminoácidos.

b) Poseer actividad inhibitoria de ECA in vitro.

c) Poseer actividad inhibitoria de PEP in vitro.

d) Poseer actividad antihipertensiva y/o actividad antidegenarativa y/o antioxidante in vivo.

2. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizado por comprender uno o más péptidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N0 1 , SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N06, SEQ. ID. N0 7, y SEQ. ID. N0 8.

3. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque se obtiene a partir de un producto de cacao con cascarilla denominado barquillo.

4. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el barquillo se ha desgrasado mediante prensado físico, hasta poseer entre un 5% y un 15% de grasa, preferiblemente un 10%.

5. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el producto desgrasado se disuelve en agua (del 5% al 20%) y se somete a una etapa de hidrólisis enzimática, añadiendo una o más enzimas a Ia solución acuosa obtenida y manteniendo Ia temperatura entre 40° C y 60° C, durante un periodo de tiempo de 1 a 24 horas, a un pH adecuado.

6. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque Ia hidrólisis enzimática

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) se lleva con una o más enzimas del grupo Termamyl, Alcalase, Neutrase, Ultraflo o Flavourzyme.

7. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque los péptidos bioactivos se obtienen por centrifugación, a partir del sobrenadante del extracto hidrolizado, una vez acabada Ia hidrólisis.

8. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el sobrenadante del extracto hidrolizado, una vez concentrado, posee una actividad inhibitoria de ECA in vitro de 73.9 % (IC50 = 0.4039 mg).

9. Producto bioactivo obtenido por hidrólisis enzimática a partir de extractos de cacao de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el sobrenadante del extracto hidrolizado, una vez concentrado, posee una actividad inhibitoria de PEP in vitro de 74.8 % (IC50 = 0.0946 mg).

10. Utilización del producto bioactivo de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, que comprende uno o más péptidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N0 1 , SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N0 6, SEQ. ID. N0 7, y SEQ. ID. N0 8, caracterizado porque se añade a alimentos funcionales en Ia cantidad necesaria para producir actividad antihipertensiva, y/o antidegenerativa y/o antioxidante.

11. Alimento funcional de acuerdo con Ia reivindicación 10, caracterizado porque comprende al menos un péptido bioactivo con actividad inhibitoria de ECA y PEP in vitro y actividad antihipertensiva, y/o antidegenerativa y/o antioxidante in vivo.

12. Utilización del producto bioactivo de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, que comprende uno o más péptidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N0 1 , SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N0 7, y SEQ. ID. N0 8, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de Ia hipertensión.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Description:
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE CACAO RICOS EN PÉPTIDOS BIOACTIVOS CON ACTIVIDAD INHIBIDORA DE LAS ENZIMAS ECA Y PEP

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a Ia obtención de péptidos bioactivos a partir de materias primas vegetales, concretamente de extractos de cacao por medio de un tratamiento enzimático. Dichos biopéptidos poseen actividad inhibidora de Ia enzima convertidora de Ia angiotensina (ECA) y de Ia enzima prolil endopeptidasa (PEPJ in vitro y/o actividad antioxidante in vivo, pudiendo utilizarse en Ia industria alimentaria, dietética y farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteínas presentes en los alimentos son precursoras de una gran cantidad de péptidos con algún tipo de actividad biológica especial, con propiedades útiles sobre diferentes procesos del organismo. Debido al gran interés por el desarrollo de productos naturales que aporten algún tipo de efecto beneficioso "extra" para Ia salud de Ia persona que los consuma, obtener alguno de estos biopéptidos formados a partir de diferentes materias primas vegetales, resultaría ser una buena oportunidad para desarrollar nuevos productos o ingredientes funcionales. La posibilidad de originar estos péptidos es un campo de investigación puntero en Ia industria de nutraceúticos, ya que permite originar nuevas aplicaciones en alimentos funcionales, dar valor añadido de subproductos y componentes alimentarios, mejorar las propiedades nutritivas de alimentos convencionales y desarrollar nuevos suplementos dietéticos o incluso nuevos medicamentos.

Algunos subproductos de Ia Industria Agroalimentaria tienen un contenido elevado en proteínas y péptidos bioactivos que aportan un valor añadido al mismo. Existen diversos mecanismos para favorecer el incremento de péptidos enriqueciendo considerablemente una matriz y asignándole unas características determinadas, como por ejemplo, antihipertensiva, antihiperglucémica, antineurodegenerativa, anticariogénica incluso antihiperlipidémica. Con Ia utilización de enzimas proteolíticas se pueden hidrolizar las proteínas por puntos específicos, capaces de originar un amplio espectro de péptidos en los hidrolizados obtenidos con múltiples efectos fisiológicos.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La presente invención se centra en Ia obtención de extractos de cacao ricos en péptidos con actividad inhibitoria de las enzimas ECA y PEP.

La enzima convertidora de Ia angiotensina, abreviadamente ECA, cataliza Ia conversión de Ia angiotensina I, inactiva, en angiotensina Il que es un potente vasoconstrictor, por Io que una de las terapias actuales usadas en el tratamiento de Ia hipertensión consiste en Ia administración de fármacos inhibidores de esta enzima. En los últimos años, debido a los efectos secundarios que provocan los fármacos, se han descrito inhibidores naturales que ayudarían al control de Ia hipertensión de manera menos agresiva. Entre otros, Takayanagi eí al., ("Angiotensin I converting enzyme-inhibitory peptides from wine"; Am.J.Enol.Vitic, 50:65-68 1999) describen péptidos del vino inhibidores de Ia ECA y Wu eí al., ("Hypotensive and physiological effect of angiotensine converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats"; J.Agric Food Chem, 49:501-506 2001) péptidos de Ia soja que tienen también un efecto inhibitorio sobre Ia ECA. Otros muchos trabajos como el de Pedroche eí al., ("Utilisation of chickpea protein isolates for production of peptides with angiotensin l-convering enzyme (ACE)-inhibitory activity"; Journal of the Science of Food and Agriculture, 82:960-965 2002); Tomita eí al., ("Potent Antibacterial Peptides Generated by Pepsin Digestión of Bovine Lactoferrin"; J Dairy Sci, 74:4137-4142 1991); Fujita eí al., ("LKPNM: a_product-type ACE- inhibitory peptide derived from fish protein"; Immunopharmacology, 82:960-965 2002); Pihlanto-Leppállá eí al., ("Angiotensine l-converting enzyme inhibitory properties of whey protein digests: concentration and characterization of active peptides"; J Dairy Research, 67:53-64 2000), y Yamamoto (Yamamoto., "Antihypertensive Peptides Derived from Food Proteins"; Biopolymers, 43(2): 129-134 1997), afirman que los péptidos derivados de diferentes matrices alimentarias producen inhibición de Ia enzima convertidora de angiotensina. Así, el documento JP 6128287 se refiere a Ia obtención de un péptido que inhibe Ia actividad de Ia angiotensina y se obtiene por hidrólisis de una proteína de Ia leche; y el JP 188282 describe veintitrés tripéptidos que son útiles como antihipertensivos y se obtienen por tratamiento de músculos de sardina con proteasas.

El documento ES 2 253 036 B1 describe péptidos bioactivos derivados de proteínas de Ia clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Dichos péptidos presentan actividad inhibidora de Ia enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) actividad antihipertensiva en ratas y/o actividad antioxidante. Tanto los hidrolizados completos, las fracciones de bajo peso molecular de los mismos, como sus péptidos constituyentes, podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o antihipertensiva y/o antioxidante.

Entre los documentos de patente que mencionan péptidos obtenidos del cacao, el WO 02/42327 A2 describe a partir del grano de cacao, Ia obtención y purificación de Ia albúmina 2S. Se menciona Ia hidrólisis enzimática de proteínas que origina precursores de aromas, péptidos y aminoácidos que dan lugar a aroma de cacao tras proceder a calentar con azúcar.

Aunque algunos autores encuentran en el chocolate inhibidores de ECA, esta inhibición está generalmente asociada a polifenoles, como es el caso de Actis-Goretta et al., ("Inhibition of Angiotensin Converting Enzyme Activity by Flavonol-Rich Foods"; Agrie. Food Chem, 54:229-234 2006) y del documento de patente WO 01/41775 A2 que describe el uso de polifenoles de cacao, en concreto procianidinas, en Ia modulación de rutas inflamatorias, en el mantenimiento de Ia salud vascular de mamíferos y como tratamientos antibacterianos. Sin embargo, el documento de patente JP 2008019228 describe un inhibidor de ECA para uso alimentario y para el tratamiento de Ia hipertensión que comprende una composición de aminoácidos derivados de extractos de cacao a los que se les ha extraído previamente los polifenoles. Dicho documento no especifica Ia secuencia de los péptidos/aminoácidos ni da un rango de su tamaño, ni tampoco menciona ningún tipo de hidrólisis enzimática en el proceso de aislamiento y/o purificación de los extractos que poseen Ia actividad inhibitoria de ECA.

La actividad prolil-endopeptidasa (PEP), esta relacionada con Ia pérdida de memoria y los procesos de aprendizaje ya que degrada neuropéptidos ricos en prolina tales como Ia vasopresina y Ia sustancia P implicados en estos procesos. Algunos estudios también señalan que esta enzima podría estar relacionada con Ia enfermedad de Alzheimer. Hasta Ia fecha diversos autores como Kim et al., ("Prolyl Endopeptidase Inhibitors from Green Tea"; Arch Pharm Res, 24 (4):292-296 2001) y Tezuka et al., ("Screening of crude drug extraets for prolyl endopeptidase inhibitory activity"; Phytomedicine, 6(3): 197-203 1999), afirman que los polifenoles de ciertos extractos vegetales producen Ia inhibición de Ia prolil endopeptidasa. También el documento de patente US 2007/0116779 describe el uso de grano de cacao como fuente de

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) polifenoles, como uno de los elementos de composiciones farmacéuticas, como inhibidor de ciertas enzimas implicadas en enfermedades neurodegenerativas como es el caso del Alzheimer o Parkinson.

Otros autores, como Maruyama et al., ("Prolyl Endopeptidase Inhibitory Activity of Peptides in the Repeated Sequence of various Proline-Rich proteins"; Journal of Fermentation and Bioengineering, 74:145-148 1992) y Asano et al., ("Inhibition of prolyl endopeptidase by synthetic peptide fragments of human β-casein";Agric.Biol.Chem, 55(3):825-828 1991) defienden que algunos fragmentos peptídicos inhiben Ia acción de Ia PEP, pero nadie hasta Ia fecha ha relacionado los péptidos del cacao como metabolitos inhibidores de dicha enzima.

Por Io tanto, debido a Ia demanda cada vez mayor de nuevos ingredientes y compuestos con este tipo de actividad inhibitoria, dadas las características tan saludables del cacao, se ha considerado Ia posibilidad de encontrar péptidos bioactivos a partir de sus extractos que tuvieran actividad ECA, y sorprendentemente se han encontrado varios que no solo poseen actividad inhibitoria de ECA in vitro, sino que dichos péptidos bioactivos poseen también actividad inhibitoria de PEP, in vitro. Además, también muestran actividad antioxidante in vivo según pruebas con C. elegans.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de obtención de extractos de cacao ricos en péptidos bioactivos con actividad inhibidora de las enzimas ECA y PEP in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antineurodegenerativa y/o actividad antioxidante in vivo, mediante Ia hidrólisis enzimática de dichos extractos.

En concreto Ia invención se basa en Ia obtención a partir del cacao, de extractos de cacao conteniendo péptidos bioactivos inhibidores de Ia enzima ECA así como de Ia enzima PEP con el objetivo de poder ser utilizados como ingredientes para su incorporación en alimentos funcionales. Los péptidos bioactivos se producen por hidrólisis de una o más proteínas o péptidos presentes en los extractos de cacao obtenidos. Para dicho fin se utilizan enzimas y condiciones de hidrólisis que permitan obtener los biopéptidos deseados.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Para estudiar estas inhibiciones se pueden emplear diferentes metodologías. Los ensayos in vitro, se basan en Ia determinación de Ia actividad enzimática de las enzimas ECA y PEP en presencia del inhibidor a ensayar, es decir en esta invención, los extractos de cacao ricos en péptidos. Sobre los extractos positivos se realizaron pruebas de dilución al objeto de determinar las IC 50 (concentración del hidrolizado necesaria para inhibir en un 50% Ia actividad de las enzimas ECA y PEP) y obtener datos cuantitativos con los que poder comparar los resultados.

Los péptidos bioactivos o los hidrolizados que los contienen pueden incorporarse a alimentos funcionales. Los extractos, una vez concentrados, se pueden utilizar no sólo en Ia industria alimentaria y en los productos dietéticos sino también en Ia industria farmacéutica mediante Ia fabricación de medicamentos, que con Ia cantidad adecuada de dichos péptidos pueden utilizarse en el tratamiento y prevención de enfermedades, tales como el control de Ia presión arterial, concretamente Ia hipertensión y también de tipo degenerativo como el Alzheimer, Parkinson, etc. También se pueden utilizar como antioxidantes.

Así, Ia invención encuentra nuevas aplicaciones del cacao, contribuyendo a su revalorización desde el punto de vista de Ia salud.

Se ha realizado una búsqueda de secuencias de los péptidos bioactivos objeto de Ia presente invención en distintas bases de datos. El resultado no ha dado ninguna secuencia idéntica y del mismo tamaño que las descritas en Ia presente invención.

Los resultados obtenidos son varios documentos de literatura no patente [ a) Sousa Silva et al., "Phylogenetic analysis of Theobroma (Sterculiaceae) based on Kunitz-like trypsin inhibitor sequences", Plant Systemics and Evolution (2005), 250(1-2), 93-104; b) Kochhar et al., "Primary Structure of the Abundant Seed Albumin of Theobroma cacao by Mass Spectrometry", Journal of Agricultural and Food Chemistry (2000), 48(11), 5593-5599; c) "Cloning and sequencing of a gene encoding a 21 kDa trypsin inhibitor from Theobroma cacao L.", Cafe, cacao, The (1994), 38(2), 113-18; d) Tai et al., "Nucleic Acid Sequence of a 21 kDa cocoa seed protein with homology to the soybean trypsin inhibitor (Kunitz) family of protease inhibitors", Plant Molecular Biology (1991), 16(5), 913-15; y e) Spencer et al., "Cloning and sequencing of the cDNA encoding the major albumin of Theobroma cacao. Identification of the protein as a member of the Kunitz protease inhibitory family", Planta (1991), 183(4), 528-35.] que

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) se refieren a secuencias que forman parte de los precursores 21-23 kD y del inhibidor de tripsina y que contienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a los péptidos buscados. Además, el documento de patente WO 91/19800 A1 reivindica dos proteínas de habas de cacao que tienen peso molecular de 21 kD o 23 kD, o un fragmento de las mismas que comprende al menos 6 aminoácidos, en donde Ia proteína o el fragmento, después de tostar, forma al menos uno de los componentes de sabor esenciales del cacao. Dicho documento identifica las dos proteínas de 21 kD y 23kD pero no identifica ni menciona ningún péptido aislado a partir de las mismas.

Por Io tanto, Ia presente invención se considera una invención de selección respecto a dicho documento, es decir, posee novedad ya que sus componentes, en este caso los péptidos bioactivos, no están descritos individualmente, y por tanto no forman parte del estado de Ia técnica per se. Además poseen actividad inventiva al ser Ia base de una invención totalmente distinta y sin relación con cualquier componente que una vez tostado confiera sabor al cacao, objeto de Ia invención del mencionado documento. De hecho, dicha invención es totalmente distinta al uso de los biopéptidos de Ia presente invención que se utilizan en alimentos funcionales y en Ia industria farmacéutica como controladores de Ia hipertensión, de Ia pérdida de Ia memoria y procesos neurodegenerativos, ya que no sólo inhiben Ia actividad de Ia enzima ECA sino que también inhiben Ia de PEP in vitro, e inicialmente los resultados in vivo indican que poseen también capacidad antioxidante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Esta invención proporciona un método de obtención de extractos de cacao ricos en péptidos con actividad antihipertensiva y antineurodegenerativa. En concreto Ia invención se basa en Ia obtención de diferentes extractos a partir de un subproducto del cacao (barquillo) y su hidrólisis enzimática para obtener péptidos bioactivos inhibidores de Ia enzima ECA y de Ia enzima PEP, con el objetivo de poder utilizarlos como ingredientes para su incorporación en alimentos funcionales. Los extractos obtenidos, según Io descrito en Ia presente invención, pueden ser útiles para su uso no sólo en Ia industria alimentaria, sino también en Ia industria de productos dietéticos e industria farmacéutica.

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con Ia purificación de los péptidos de los extractos de cacao obtenidos. Dependiendo de los péptidos presentes en el extracto

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) se lleva a cabo diferentes estrategias de purificación, por ejemplo, Ia concentración por intercambio catiónico o interacción hidrofóbica, y separación, por ejemplo por fase inversa o filtración en gel.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cromatograma de interacción hidrofóbica del extracto de barquillo. Figura 2. Cromatograma de fase inversa de Ia F 4 de interacción hidrofóbica. Figura 3. Cromatograma de fase inversa de Ia F5 de interacción hidrofóbica. Figura 4. Porcentaje de gusanos no paralizados observados en cada una de las condiciones ensayadas tras Ia inducción de Ia expresión de péptido Ab.

Figura 5. Supervivencia de Ia cepa CL4176 obtenida tras aplicar un estrés con H2O2 (2mM) y tras 1 semana de incubación con los distintos extractos (F11 , F12, F14, F18). ZPP: Z-prolil prolinal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para Ia obtención de péptidos bioactivos a partir de extractos de cacao. Dichos péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de aminoácidos denominadas: SEQ. ID. N 0 . 1 , SEQ. ID. N 0 . 2, SEQ. ID. N 0 . 3, SEQ. ID. N 0 . 4, SEQ. ID. N 0 . 5, SEQ. ID. N 0 . 6, SEQ. ID. N 0 . 7, y SEQ. ID. N 0 . 8 (Tabla 4), los cuales poseen actividad inhibitoria de Ia ECA y Ia PEP in vitro y/o actividad antioxidante in vivo. Además, Ia invención proporciona Ia utilización de dichos péptidos bioactivos como ingredientes funcionales para diferentes alimentos, considerando como alimentos cualquier composición destinada a Ia alimentación, independientemente de que esté en forma líquida o sólida.

El material de partida de Ia presente invención sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese uno o más de los péptido bioactivos de Ia Tabla 4. En una realización particular dicha materia prima es vegetal, concretamente el material de partida es el cacao. Theobroma cacao es el nombre científico que recibe el árbol del cacao o cacaotero. Cacao viene del maya (Ka'kaw) y Theobroma en griego significa alimento de los dioses.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Existen tres variedades principales de cacao: El criollo o nativo que es el cacao genuino y fue bautizado así por los españoles al llegar a México. Se cultiva en América en Venezuela, Honduras, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Guatemala, Trinidad, Jamaica, México y Granada; y en el Caribe, en Ia zona del océano índico y en Indonesia. Es un cacao reconocido como de gran calidad, de escaso contenido en tanino, reservado para Ia fabricación de los chocolates más finos. El forastero originario de Ia alta Amazonia. Se trata de un cacao normal, con el tanino más elevado. Es el más cultivado y proviene normalmente de África. El grano tiene una cascara gruesa, es resistente y poco aromático. Para neutralizar sus imperfecciones, requiere un intenso tueste, de donde proceden el sabor y el aroma a quemado de Ia mayoría de los chocolates. Por último los híbridos entre los que destaca el trinitario es un cruce entre el criollo y el forastero. Como su nombre sugiere, es originario de Trinidad donde, después de un terrible huracán que en 1727 destruyó prácticamente todas las plantaciones de Ia Isla, surgió como resultado de un proceso de cruce. El cacao de Ia presente invención puede pertenecer a cualquiera de las variedades anteriormente citadas, incluyendo cualquiera de sus híbridos.

En Ia presente invención Ia materia prima es vegetal y es un subproducto del cacao denominado barquillo, que es un cacao con cascarilla parcialmente desgrasado mediante prensado físico, con una proporción de grasa que puede oscilar entre el 5% y el 15%, preferiblemente el 10%, expresado en porcentaje de peso.

Dicho material de partida se disuelve en agua en una proporción que puede variar entre el 5% y 20%, preferiblemente el 10%. Una vez que el barquillo se ha disuelto en el agua se trata a diferentes temperaturas, por ejemplo entre 4O 0 C y 6O 0 C, preferiblemente 5O 0 C, durante diferentes tiempos, por ejemplo entre 1 y 24 horas, preferiblemente 1 , 6 , 18 ó 24 horas, con una o más enzimas hidrolíticas a diferentes concentraciones. Puede emplearse cualquier enzima capaz de proporcionar los péptidos de interés. Concretamente las enzimas usadas podrían ser tanto enzimas con actividad celulasa como es el caso de Ia enzima Termamyl, como enzimas con actividad proteasa, como son las enzimas Alcalase, Neutrase, Ultraflo o Flavourzyme. Se puede utilizar una sola enzima o combinaciones de dos o más enzimas, siempre que produzcan uno o más biopéptidos con las características deseadas. Las concentraciones de enzima usadas oscilarán entre los 0,10 y 10 μl_/L, y entre 0,5 y 2 μl_ de enzima por g de materia prima. Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura,

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) presión, concentración de enzima/s, tiempo de Ia reacción, etc se optimizan dependiendo de Ia o las enzimas utilizadas.

Para Ia obtención del extracto, una vez terminada Ia reacción de hidrólisis, se realiza una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos y se recoge el sobrenadante que contiene los péptidos bioactivos objeto de Ia presente invención.

Otro aspecto adicional de Ia invención se refiere a Ia purificación e identificación de los péptidos bioactivos obtenidos a partir de los extractos de cacao. Dado que los péptidos presentes en el extracto son de distinta longitud de aminoácidos y considerando que los péptidos bioactivos de interés tienen entre 5 y 20 aminoácidos se pueden llevar a cabo diferentes estrategias de purificación, tanto para eliminar los péptidos no deseados como para aislar y concentrar los péptidos objeto de Ia invención. Por ejemplo a partir de los hidrolizados, se pueden obtener fracciones de distinto peso molecular mediante ultrafiltración, pudiendo aislarse posteriormente subfracciones activas mediante concentración de intercambio iónico o de interacción hidrofóbica o cromatografía de alta eficacia en fase inversa o filtración en gel.

Las ventajas de Ia presente invención no sólo vienen dadas por los péptidos mostrados en Ia Tabla 4 denominados como SEQ. ID. N 0 . 1 , SEQ. ID. N 0 . 2, SEQ. ID. N 0 . 3, SEQ. ID. N 0 . 4, SEQ. ID. N 0 . 5, SEQ. ID. N 0 . 6, SEQ. ID. N 0 . 7, SEQ. ID. N 0 . 8, sino por Ia materia prima utilizada de donde dichos péptidos se pueden obtener o estar presentes inicialmente, por los hidrolizados completos y por todas las fracciones obtenidas a partir del cacao inicial que posean propiedades bioactivas, mostrando simultáneamente actividad inhibidora no sólo de Ia enzima ECA sino también de Ia PEP, y/o actividad antioxidante. Tanto los péptidos como los extractos que los contienen podrán incorporarse a alimentos funcionales así como formar parte de compuestos farmacéuticos o dietéticos, y ser empleados para ayudar en el tratamiento y prevención de diferentes enfermedades, especialmente Ia enfermedad cardiovascular y Ia degeneración cerebral.

Además, los péptidos bioactivos identificados en los hidrolizados (Tabla 4) pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por métodos recombinantes, conocidos por Ia persona experta en Ia materia.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran Ia invención aunque no deben considerarse como limitativa del alcance de Ia misma.

Ejemplo 1 : Obtención del extracto de cacao.

Para llevar a cabo el proceso se utilizó cacao de Ia variedad Forastero, procedente de Costa de Marfil.

El proceso de obtención del barquillo se realizó con semillas frescas de cacao obtenidas a partir de mazorcas de cacao según el proceso descrito en el documento de patente ES 2 286 947 A1 , de los mismos autores de Ia presente invención. El producto obtenido después del desgrasado por prensado se denomina torta si proviene de granos descascarillados o barquillo si proviene de granos con cascarilla, como en el caso de Ia presente invención.

Para Ia obtención del extracto de cacao se disolvió el barquillo, que había sido desgrasado por prensado en un extractor mecánico continuo, y poseía un contenido de grasa de 10 - 12%, en agua destilada a un proporción 1 :10 (p:v) y se mantuvo con agitación durante 1 hora a una temperatura de 5O 0 C . Tras Ia disolución en agua se realizó una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos, se recuperó el sobrenadante y se concentró con un rotavapor a 6O 0 C hasta sequedad. Se dejó en estufa a 8O 0 C durante 18 horas y se recuperó el polvo de cacao que se disolvió hasta alcanzar Ia concentración de 0.1 mg/ml.

Dicho extracto poseía las características siguientes: azúcares = 5,63 g/100 g; grasas = 10.61 g/100 g; proteínas = 1459 μg/ml; inhibición ECA=73.9% (IC 50= 5.3μl) e inhibición de PEP=74.8% (IC 50=22.4μl)

Ejemplo 2: Purificación de los péptidos del extracto de cacao.

Los sobrenadantes obtenidos tras Ia centrifugación del polvo concentrado se disolvieron en un volumen de agua hasta alcanzar Ia concentración de 0.1g/ml y entonces se filtraron por una membrana de 0.45 μm, quedando así preparados para iniciar el proceso de purificación mediante varias etapas cromatográficas.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La primera etapa del proceso consistió en someter a cada una de las muestras a una fase de concentración mediante cromatografía de interacción hidrofóbica, en un sistema cromatográfico ÁKTA Explorer (GE Healthcare, Amersham Biosciences AB). Para ello se empleó Ia columna HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub) y para Ia consecuente elución se empleó el tampón de equilibrado (100 mM fosfato sódico, 1 ,5 M (NH 4 J 2 SO 4 , pH =7) con un gradiente de 1 ,5 a OM de (NH 4 ) 2 SO 4 . Dicha elución se monitorizó a 214 nm y se evaluó en cada una de las fracciones de 10 mi obtenidas, las actividades biológicas de interés. Aquellas que poseen actividad se sometieron a una etapa de purificación mediante una primera ultrafiltración, empleando filtros de 10 kDa (Amicon Ultra, Millipore), y una posterior cromatografía de fase inversa de Ia fracción inferior a 10 kDa, empleando Ia columna RESOURCE RPC 3 mi (Amersham Biosciences) en un sistema cromatográfico ÁKTA Explorer (Amersham Biosciences) y utilizando un gradiente de elución amplio con los eluyentes 0,1% TFA en agua miliQ (A) y 0,1% TFA en acetonitrilo (B). La muestra se monitorizó a 214 nm y se evaluó de nuevo, en cada una de las fracciones obtenidas, en este caso de 2 mi, las actividades biológicas pertinentes, tras eliminar los disolventes empleados en el proceso, en este caso, se realizaron in vitro los ensayos de inhibición de las enzimas ECA y PEP.

Ejemplo 3: Obtención del extracto de cacao rico en péptidos bioactivos.

Siguiendo Io descrito en el ejemplo 1 , el extracto de cacao se trató durante una hora a 50° C con una combinación de las enzimas Termamyl y Alcalase, a una concentración de 1 μl/g de cada una de ellas. Al cabo de Ia hora se ¡nactivaron las enzimas, se realizó una centrifugación de unos 15 minutos a 4000 rpm, y se recogió el sobrenadante rico en péptidos y se llevó a cabo el ensayo de inhibición de Ia ECA y Ia PEP.

A.- Medida de Ia actividad inhibitoria de Ia ECA.

La medida de Ia actividad ECA se realizó según el método descrito por Cushman y Cheung (Cushman DW, Cheung HS. 1971. Biochem Pharmacol 20:1637-1648) modificado posteriormente por Nakamura (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78:777-783). Este método se basa en el empleo de Hippuril-L- Histidil-L-Leucina (Hip-His-Leu) como sustrato, ya que Ia actuación de ECA sobre dicho sustrato produce Ia liberación de ácido hipúrico, cuantificable mediante

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) espectrofotometría por lectura de Ia absorbancia a 228 nm tras su extracción con acetato de etilo.

El Hip-His-Leu se disolvió en 0.1 M tampón de borato sódico (pH 8.3) que contenía 0.3 M de NaCI. Entonces se añadieron 200 μl de Ia solución de Hip-His-Leu y se mezclaron con 80 μl de Ia solución de péptidos inhibidores de IECA. El pH se ajustó a 8.3 y se incubó Ia mezcla durante 3 min a 37 0 C. La reacción se inició por Ia adición de 20 μl de ECA disuelta en agua destilada (0.1 U/ml) y Ia mezcla se incubó durante 30 min a 37 0 C. La reacción se paró por Ia adición de 250 μl de 1 N HCI. El ácido hipúrico liberado por Ia ECA se extrajo con acetato de etilo, que se eliminó por evaporación a vacío, disolviéndose el residuo en 1 mi agua destilada, y se midió Ia densidad óptica de Ia muestra a 228 nm.

Se midió Ia inhibición que se expresó como porcentaje y también como Ia concentración de los componentes que inhibe el 50% de Ia actividad de ECA (IC 50 ). El resultado fue de 67.8% .

Una vez determinada Ia inhibición de ECA in vitro del extracto hidrolizado, se llevó a cabo un fraccionamiento y se midió Ia inhibición de ECA de las fracciones obtenidas por cromatografía de interacción hidrofóbica. La Figura 1 contiene el cromatograma de interacción hidrofóbica del extracto de barquillo hidrolizado.

Se midió Ia inhibición de ACE de todas las fracciones recogidas y los resultados de inhibición se muestran en Ia Tabla 1.

Tabla 1. Porcentaje de inhibición de ECA por las fracciones de interacción hidrofóbica.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

La fracciones con mayor actividad inhibitoria de ECA fueron F4 y F5 por se prosiguió Ia purificación por fase inversa de estas dos fracciones por separado.

Las Figuras 2 y 3 contienen los cromatogramas de fase inversa de las fracciones 4 y 5 de interacción hidrofóbica respectivamente.

Se midió Ia inhibición de ACE de las fracciones 15, 16, 17,18, 19, 20, 21 , 22 y 23 provenientes de Ia fracción 4 de interacción hidrofóbica y las fracciones 7, 8, 9 10, 11 , 12, 13, 14 y 15 provenientes de Ia fracción 5 de interacción hidrofóbica. Los resultados de inhibición se muestran en las Tablas 2 y 3 respectivamente.

Tabla 2. Porcentaje de inhibición de ECA por las fracciones de fase inversa provenientes de Ia fracción 4 de interacción hidrofóbica.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla 3. Porcentaje de inhibición de ECA por las fracciones de fase inversa provenientes de Ia fracción 5 de interacción hidrofóbica.

Las cuatro fracciones de fase inversa con mayor inhibición in vitro de Ia enzima ECA (F18HIC4, F11 HICF5, F12HICF5, F14HICF5) se analizaron por MALDI-TOF y se identificaron los péptidos presentes en las mismas responsables de dicha inhición.

La Tabla 4 contiene las secuencias peptídicas identificadas por MS/MS inhibidoras de ECA.

Tabla 4. Secuencias peptídicas identificadas por MS/MS inhibidoreas de ECA.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) B.- Medida de Ia actividad inhibitoria de Ia PEP.

La medida de actividad prolil-endopeptidasa se realizó siguiendo el método descrito por Yoshimoto (Yoshimoto, T. and Tsuru, D. 1978. Agr. Biol. Chem., 42, 2417; Yoshimoto, T., Walter, R. and Tsuru, D. 1980. J. Biol. Chem., 255, 4786), que se basa en el empleo del sustrato Z-Gly-Pro-p-nitroanilina, a partir del cual se libera p- nitroanilina, por Ia acción de Ia enzima PEP, cuantificable mediante espectrofotometría por lectura de Ia absorbancia a 410 nm.

La actividad inhibidora de PEP se determinó añadiendo a Ia mezcla de reacción Ia muestra a ensayar, en este caso se llevó a cabo Ia medida de Ia actividad inhibidora de PEP con el mismo extracto hidrolizado obtenido a partir del barquillo y enzimas proteolíticas y utilizado anteriormente para Ia determinación de ECA.

Se midió Ia inhibición y se expresó como % y también como Ia concentración de los componentes que inhibe el 50% de Ia actividad de PEP (IC 50 ). El resultado fue de 74.8% (IC 50 =0.0946mg).

Una vez determinada Ia inhibición de PEP in vitro del extracto de barquillo hidrolizado, se testó Ia inhibición de PEP de todas las fracciones de purificación obtenidas por fase inversa a partir de las fracciones 4 y 5 de interacción hidrofóbica, como se hizo con Ia enzima ECA.

Las tablas 5 y 6 contiene los valores de inhibición de Ia enzima PEP de las fracciones cromatográficas obtenidas en Ia purificación por fase inversa a partir de las fracciones 4 y 5 de interacción hidrofóbica respectivamente.

Tabla 5. Porcentaje de inhibición de ECA por las fracciones de fase inversa provenientes de Ia fracción 4 de interacción hidrofóbica.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Tabla 6. Porcentaje de inhibición de ECA por las fracciones de fase inversa provenientes de Ia fracción 5 de interacción hidrofóbica.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Estos resultados nos permiten concluir que las cuatro fracciones con mayor inhibición de ECA en las cuales hemos identificados diferentes péptidos responsables de esta inhibición, son las fracciones con mayor inhibición de Ia enzima PEP.

Por ello, es conveniente destacar que los péptidos identificados tras Ia purificación por interacción hidrofóbica y fase inversa de un extracto de barquillo tratado con proteasas son responsables de Ia inhibición tanto de Ia enzima ECA como de Ia enzima PEP.

Ejemplo 4. Evaluación de Ia capacidad antioxidante de los extractos en C.elegans.

A. Selección de fracciones con alta inhibición enzimática.

El objetivo de este estudio consistió en evaluar in vivo Ia funcionalidad de los extractos que han dado un resultado positivo en Ia inhibición in vitro de prolil-endopeptidasa. Para ello se utilizó el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Dicha funcionalidad está relacionada con Ia protección que puedan conferir dichos extractos en el desarrollo de enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer.

Se han seleccionado las cuatro fracciones que dieron resultados positivos en Ia inhibición in vitro de prolil-endopeptidasa y cuyos péptidos, presentes en las mismas, han sido identificados. Se trata de Ia fracción 18 de fase inversa proveniente de Ia fracción 4 de interacción hidrofóbica (F18HIC4) y las fracciones 11 , 12 y 14 de fase inversa provenientes de Ia fracción 5 de interacción hidrofóbica (F11 HICF5, F12HICF5, F14HICF5).

B. Ensayo de las fracciones con alta actividad inhibitoria en C.elegans in vivo.

Se ha llevado a cabo un ensayo de estrés oxidativo utilizando Ia cepa transgénica de

C. elegans CL4176, caracterizada por expresar el péptido D-amiloide humano (Ab1- 42) tras una inducción por temperatura.

Datos previos en Ia bibliografía indican que Ia formación de las placas de péptido Damiloide está precedida por estrés oxidativo (Drake et al, "Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer ' s disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model" Neurobiol Aging 2003, 24(3) :415-20). Por tanto,

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) resulta interesante evaluar si Ia hipotética disminución en el depósito fibrilar de péptidos Ab en las neuronas producida por Ia acción de alguna molécula o compuesto da lugar a una mayor resistencia frente a tratamientos de estrés oxidativo. Además, en estos animales transgénicos Ia expresión de dicho péptido produce una parálisis que puede ser evaluada tras Ia adición de Ia molécula o compuesto de interés.

Para llevar a cabo el experimento, se obtuvieron gusanos de Ia cepa CL4176 de edad sincronizada mediante cultivo en placas de NG a 16 0 C. Los huevos se recogieron en placas de NG que contenían 100 μl_ de cada fracción peptídico (F11 , F12, F14 y F18). Como control positivo se utilizó Z-prolil prolinal (100 μl_ de un stock de 1OmM en superficie de Ia placa. La concentración final fue de 0.1 mM. Como control negativo se utilizó medio NG. Tras 2 días de incubación, se aumentó Ia temperatura a 23 0 C para inducir Ia expresión de péptido Ab. Durante los 3 primeros días tras Ia inducción, se analizó el número de gusanos paralizados en cada condición ensayada. Después de 7 días de incubación en dichas condiciones los gusanos se sometieron a un estrés oxidativo. Para ello aquellos que no presentaban signos de parálisis se transfirieron a placas de medio S con H 2 O 2 (2 mM). Las placas se incubaron a 23 0 C y tras 5 horas se contabilizó el total de gusanos que sobrevivieron al tratamiento.

C. Resultados del ensayo de parálisis y de estrés oxidativo del organismo modelo Caenorhabditis elegans con las fracciones peptídicas identificadas.

La Figura 4 representa el porcentaje de gusanos no paralizados durante los 3 primeros días tras Ia inducción de Ia expresión de péptido Ab. En condiciones control (NG), el % de gusanos no paralizados se reduce a un 96,4% al tercer día, mientras que con el control positivo (Z-prolil prolinal) el porcentaje de gusanos no paralizados se mantiene en un 99.44%.

De las cuatro fracciones utilizadas, fue Ia fracción 11 Ia que mostró un mayor efecto reductor de Ia parálisis. En este caso, se determinó que un 98.64% permanecían no paralizados al tercer día de incubación. La fracciones F12, F14 y F18 dieron lugar a una menor reducción de Ia parálisis, observándose un 96.4, 94.48, y 92.46 % de gusanos no paralizados respectivamente al tercer día.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La Figura 5 muestra el porcentaje de supervivencia de gusanos tras 5 horas de aplicar un estrés oxidativo con H2O2 (2mM). En el caso de los gusanos que habían sido cultivados en NG con Ia fracción F11 se pudo determinar el mayor porcentaje de supervivencia (32.6%), siendo superior a Ia alcanzada en condiciones control NG (13.7%). La fracción F12 también proporcionó una mayor protección frente a estrés oxidativo, obteniendo una supervivencia del 18.2%. Finalmente, no se observó supervivencia en el caso de gusanos cultivados en presencia de las fracciones F14 y F18.

Estos resultados nos permiten concluir que los gusanos CL4176 cultivados en presencia de Ia fracción F11 presentan una disminución progresiva de Ia parálisis producida por Ia acumulación de péptido amiloide (Ab) en las células neuronales. Estos gusanos han mostrado una mayor resistencia al tratamiento de estrés oxidativo posiblemente producida, en parte, por los cuatro péptidos de los ocho identificados, presentes en esa fracción cuyas secuencias son RRSDLDNGTPVIF, DNYDNSAGKVWWT, TSTVWRLDNYDNSA, DNYDNSAGKWWVTTD. Cabe destacar que Ia fracción 12 también produce, aunque en menor grado, este efecto y en ella se identificaron tres péptidos de secuencias SDNEWAWMFK, LSDNEWAWMFK+ oxidación y SDNEWAWMF+ oxidación

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)