李桂英 (中国广东省广州市天河区科华街511号, Guangdong 0, 510640, CN)
AN, Taicheng (No. 511, Kehua Street Tianh, Guangzhou Guangdong 0, 510640, CN)
中国科学院广州地球化学研究所 (中国广东省广州市天河区科华街511号, Guangdong 0, 510640, CN)
LI, Guiying (No. 511, Kehua Street Tianh, Guangzhou Guangdong 0, 510640, CN)
李桂英 (中国广东省广州市天河区科华街511号, Guangdong 0, 510640, CN)
| 权 利 要 求 书 1、 一种具有降解四溴双酚 A能力的苍白杆菌 Wchrobactrum sp. ) , 其特征 在于： 所述苍白杆菌的名称为苍白杆菌 T， 于 2009年 10月 28日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M209246。 2、权利要求 1所述的具有降解四溴双酚 A能力的苍白杆菌在修复环境中的应 用。 3、根据权利要求 2所述的具有降解四溴双酚 A能力的苍白杆菌在修复环境中 的应用， 其特征在于： 所述苍白杆菌降解大气、 水体或土壤中的四溴双酚 A。 |
本发明属于微生物技术领域， 特别涉及一种具有降解四溴双酚 A能力的苍 白杆菌及其在环境修复中的应用。 背景技术
溴代阻燃剂 （BFRs) 由于其具有较高的持久性、 亲脂性、 环境稳定性、 难 降解性和生物放大作用等特性， 容易在人和动物体内累积， 并能够通过食物链 传递， 使处于高位营养级的生物受到毒害， 最终导致对人体健康的危害。 国外 已经开始关注溴代阻燃剂在自然界中的降解， 已有研究表明不同的溴代阻燃剂 可以在一定的条件下光降解或生物降解， 利用从环境中筛选的优势微生物能有 效地去除环境中的溴代阻燃剂。
四溴双酚 A是一种典型的溴代阻燃剂。 四溴双酚 A的生物降解特性已经成 为研究的焦点。 而苍白杆菌属是由 Holmes等在 1988年建立的新属。 细菌染色 为革兰氏阴性， 专性好氧， 接触酶阳性， 不水解明胶， 能利用各种氨基酸、 有 机酸和碳水化合物为碳源。 至今尚未筛选出苍白杆菌属中具有降解四溴双 酚 A 的菌株。 发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足， 本发明的首要目的在于提供一种具有降 解四溴双酚 A能力的苍白杆菌。
本发明的另一目的在于提供所述具有降解四溴 双酚 A能力的苍白杆菌的应 用。
本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种具有降解四溴双酚 A能力的苍 白杆菌， 名称为苍白杆菌 Wchrobactrum sp. ) T， 于 2009年 10月 28日保藏于 中国典型培养物保藏中心 （CCTCC) , 保藏编号为 CCTCC M209246;
所述具有降解四溴双酚 Α 能力的苍白杆菌具有如下的形态和生理生化特 性：
该苍白杆菌菌体的形态特性： a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显 镜观察，所筛选的苍白杆菌 的细胞染色为革兰氏阴性， 杆状， 菌体大小为 0.4〜0.8χ1.6〜2.2 μπι， 周生鞭毛； b. 菌落的形态特性： 在 LB固体培养基培养 24 h后， 菌落形态为圆形， 无 色， 透明， 菌落直径为 l〜2 mm ;
c. 主要的生理生化特征： 专性好氧， 严格呼吸代谢， 接触酶、 氧化酶阳性， 吲哚试验阴性， 不水解明胶， 在半固体 LB培养基上穿刺接种运动阴性。
所述具有降解四溴双酚 A能力的苍白杆菌的 16S rDNA序列如 SEQ ID: No.l 所示。
所述具有降解四溴双酚 A能力的苍白杆菌应用于修复环境， 所述的苍白杆 菌可降解环境中， 如大气、 水体和土壤中的四溴双酚 A。
本发明相对于现有技术， 具有如下的优点及有益效果：
( 1 )本发明首次从广东省贵屿地区土壤中筛选到 有降解四溴双酚 A能力 的苍白杆菌。
(2) 本发明的苍白杆菌降解四溴双酚 A的能力强， 底物浓度为 2 mg/L条 件下降解 84 h， 降解率可达 96.2%。 附图说明
图 1是本发明的苍白杆菌 T在电子显微镜下的形态图。 具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一歩详细 的描述， 但本发明的实施方式 不限于此。
实施例 1
本发明所述的具有降解四溴双酚 A 能力的苍白杆菌从广东省贵屿镇电子垃 圾高风险区的污泥中进行分离、 纯化而得。 其分离纯化方法如下： 所用的驯化培 养基为无机盐培养基 （g/L) (K 2 HP0 4 4.35， KH 2 P0 4 1.70, N NO 3 2.10， MgS0 4 0.20， MnSO 4 0.05 , FeS0 4 · 7H 2 O 0.01 , CaCl 2 * 2H 2 O 0.03 )。 首先将 3 g污泥加 入含四溴双酚 A 10 mg/L的无机盐培养基， 37°C驯化 7天后， 以 5%接种量移入含 四溴双酚 A 20 mg/L的无机盐培养基接着驯化一周， 以此类推逐步提高四溴双酚 A的浓度进行驯化， 四溴双酚 A的使用浓度分别为 30 mg/L、 40 mg/L、 50 mg/L。 驯化结束后以 5%的接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基 （牛肉膏 3.0 g/L, 蛋白 胨 10.0 g/L, NaCl 5.0 g/L, pH 7.4-7.6) 培养 12 h, 取 0.1 ml菌悬液 （稀释 10 - 1 〜 10- 7 )涂布在以四溴双酚 A为唯一碳源的固体琼脂平板（K 2 HP0 4 4.35 g/L, KH 2 P0 4 1.70 g/L，N¾N0 3 2.10 g/L，MgS0 4 0.20 g/L, MnS0 4 0.05 g/L, FeS0 4 · 7Η 2 Ο 0.01 g/L, CaCl 2 - 2H 2 0 0.03 g L, 琼脂粉 1.80 g L， 四溴双酚 A 10 m g /L)直到平板上 出现单一的纯菌落为纯菌。 挑选生长速度快、 边缘规则的菌落。
将挑选得到的菌落进行鉴定， 鉴定结果如下：
( 1 ) 菌体的形态特性：
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显 镜观察，所筛选的苍白杆菌 的细胞染色为革兰氏阴性;在电子显微镜下观 ，其形态为杆状，菌体大小为 0.4〜 0.8x1.6-2.2 μηι, 周生鞭毛， 如图 1所示；
b. 菌落的形态特性：在 LB固体培养基培养 24 h后，菌落形态为圆形，无色， 透明， 菌落直径为 l〜2 mm ;
c. 主要的生理生化特征： 专性好氧， 严格呼吸代谢， 接触酶、 氧化酶阳性， 吲哚试验阴性， 不水解明胶， 在半固体 LB培养基上穿剌接种运动阴性。
上述结果表明本发明所筛选的细菌与苍白杆菌 属的生理生化特性很相似。
(2) 采用 DNA提取方法提取细菌总 DNA。 采用细菌的 16S rDNA通用引 物扩增其 16S rDNA基因， 测序结果如下 （SEQ ID: No.l ): tggagccgtg tcgacagcct accatgcagt cgagcgcgta gcaatacgag cggcagacgg 60 gtgagtaacg cgtgggaatc tacccatcac tagggaataa ctcagggaaa cttgtgctaa 120 taccctatac gaccgagagg tgaaagattt atcggtgatg gatgagcccg cgttggatta 180 gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatcca tagctggtct gagaggatga 240 tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300 ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc atgccgcgtg agtgatgaag gccctagggt 360 tgtaaagctc tttcaccggt gaagataatg acggtaaccg gagaagaagc cccggctaac 420 ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gggctagcgt tgttcggatt tactgggcgt 480 aaagcgcacg taggcgggct aataagtcag gggtgaaatc ccggggctca accccggaac 540 tgcctttgat actgttagtc ttgagtatgg aagaggtgag tggaattccg agtgtagagg 600 tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cgggctcact ggtgcattac 660 tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aaacaggatt agataccctg ggtagtccac 720 gccgtaatcg atgaatgtta gccgttgggg agtttactct tcggtggcgc agctaacgca 780 ttaaacattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagcc 900 cttgacatcc cgatcgcggt tagtggagac actttccttc agttcggctg gatcggagac 960 aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020 gcgcaaccct cgcccttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaagggg actgccggtg 1080 ataagccgag aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta 1140 cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg cagcgagcac gcgagtgtga gctaatctcc 1200 aaaagccatc tcagttcgga ttgcactctg caactcgagt gcatgaagtt ggaatcgcta 1260 gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1320 cacaccatgg gagttggttt tacccgaagg cgctgtgcta accgcaagga ggcacgcgac 1380 cacggtaggg tcagcgatct ggcgtgaagt cggaaccaaa gttttagggg gc 1432 将长为 1432 bp的 16S rRNA基因序列与 Genbank中已登录的基因序列进行 比对分析发现菌株与 O rabi^ 扁 sp. CGL-x有最高的同源性达 98.1 %， 其中与 最相似的模式菌株 Ochrobactrum intermodium CCUG 2469T的同源性为 96.2%。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA基因序列结果， 本发明所筛选的细菌 应归属苍白杆菌属， 且为该属的一个新种， 命名为苍白杆菌 ( Ochrobactrum sp. T。
所述菌株于 2009年 10月 28日保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC ) , 保藏编号为 CCTCC M209246。 实施例 2
本发明筛选得到的苍白杆菌 T对四溴双酚 A具有降解能力：
在 1L的去离子水中加入 K 2 HP0 4 4.35 g， KH 2 P0 4 1.70 g， Ν¾Ν0 3 2.10 g， MgS0 4 0.20 g, MnS0 4 0.05 g, FeS0 4 · 7H 2 0 0.01 g, CaCl 2 . 2H 2 0 0.03 g, 100ml/ 瓶分装在 250ml的摇瓶中， 121 °C条件下灭菌 30 min后取出， 在无菌条件下加入 四溴双酚 A， 四溴双酚 A的浓度依次为 2 mg/L、 5 mg/L, 10 mg/L、 15 mg/L、 20 mg/L和 25 mg/L。 将斜面保存的苍白杆菌 Wchrobactrum sp. ) T接种至 LB培养 基中培养中， 在 30°C ， 220 r/min的摇床中活化菌体 15 h， 以 5%的接种量接入含 四溴双酚 A的无机盐培养基中， 30Ό下降解， 采用液相色谱测定降解率， 液相色 谱条件为： 80%甲醇， 18%水， 2%乙酸， 流速为 l ml/min， 四溴双酚 A的检测波 长为 210 nm。 在四溴双酚 A不同初始浓度时降解 84 h后测定降解率， 结果如表 1所示： 表 1 不同初始浓度的四溴双酚 A的降解率
从表 1中可以看出，本发明筛选得到苍白杆菌 T对四溴双酚 A的降解能力强， 最高可达 96.2%。 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、 修饰、 替 代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。
下面的说明与本申请说明书中此处提到的
保藏的微生物或其他生物材料相关：
-1 页码 1
-2 行号： 27
-3 保藏事项
-3-1 保藏单位名称 CCTCC 中国典型培养物保藏中心
-3-2 保藏单位地址 中国湖北省武汉市武汉大学， 邮政编码: 430072， Hube i
(GN)。
-3-3 保藏日期 2009年 10月 28日 （28. 10. 2009)
-3-4 保藏号 CCTCC M 209246
-5 本说明是对下列指定国
所有指定国
由受理局填写
-4 本表格与国际申请一起收到：
(是或否）
-4-1 受权官员 由国际局填写 -5 国际局收到本表格日期： -5-1 受权官员
Next Patent: PROCESS FOR PRODUCING BASIC LEAD CARBONATE