АНАЛОГИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ КАК СРЕДСТВА КОРРЕКЦИИ СПЛАЙСИНГА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИИ ДЮШЕНА

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ [0001] Изобретение относится к области молекулярной медицины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) - тяжелое заболевание, которое характеризуется прогрессирующей мышечной дистрофией, приводящей в конечном итоге к полной потере способности передвигаться и ранней смерти больного [Flanigan К.М. Duchenne and Becker muscular dystrophies. Neurol. Clin. 2014; 32: 671-688]. Несмотря на то, что Всемирная организация здравоохранения относит это заболевание к категории редких, поскольку по приблизительным подсчетам им страдает 1 мальчик из 3600 (около 20000 новых случаев ежегодно), МДД является наиболее распространенной генетической болезнью, диагностируемой в детстве. МДД относится к нейродегенеративным миопатиям и обусловлена мутациями в гене DMD, локализованном в Х-хромосоме. Ген DMD содержит примерно 2.4 х 10 ⁶ пар нуклеотидов, 79 экзонов и является одним из крупнейших генов в человеческом геноме. Мутации в гене DMD, как правило, затрагивают район между экзонами 45 и 55 и могут быть унаследованы, но приблизительно в 35% случаев возникают спонтанно. Белок дистрофии имеет молекулярную массу около 427 кДа и отвечает за соединение цитоскелета каждого мышечного волокна с основной базальной пластинкой внеклеточного матрикса через белковый комплекс, который состоит из многих субъединиц. Недостаток этого белка, обусловленный делециями и нонсенс-мутациями в гене DMD, нарушающими рамку считывания, приводит к некрозу мышечных волокон и замене мышечной ткани на жировую и соединительную [Muntoni F., Wood M.J. A. Targeting RNA to treat neuromuscular disease. Nature Rev. Drug Discov. 2011; 10: 621-637]. Симптомы заболевания обычно возникают у мальчиков до 5 лет и могут проявиться уже в раннем детстве. Основным симптомом МДД является мышечная слабость, которая в первую очередь связана с атрофией мышц, а именно скелетной мышечной ткани, мышц сердца, диафрагмы и дыхательных мышц (на более поздних стадиях). В связи с прогрессирующим ухудшением работы мышц, больной теряет возможность двигаться; большинство пациентов старше 12 лет уже не могут передвигаться без инвалидной коляски. Больные МДД, как правило, умирают в возрасте не старше 30 лет вследствие расстройства дыхательной и сердечной деятельности. До настоящего времени, несмотря на активно

1

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ведущиеся исследования, все еще не существует иного способа лечения этой болезни, кроме сугубо симптоматического.

[0003] Ранее было показано, что влияние мутации удается компенсировать путем коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина за счет пропуска мутантного экзона с помощью производного олигонуклеотида, пространственно блокирующего соответствующий сайт сплайсинга [Wilton S.D., Fall A.M., Harding P.L., McClorey G. et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the guman dystrophin gene transcript. Mol. Ther. 2007; 15: 1288-1296; Saleh A.F., Arzumanov A.A., Gait M.J. Overview of alternative oligonucleotide chemistries for exon skipping. Methods Mol Biol. 2012; 867: 365-378; Jarver P., O'Donovan L., Gait M.J. A chemical view of oligonucleotides for exon skipping and related drug applications. Nucleic Acid Ther. 2014; 24: 37-47] (рис. 1). Пропуск экзона приводит к восстановлению нормальной рамки считывания и биосинтезу укороченного, но частично функционального дистрофина, что вызывает переход болезни в более мягкую клиническую форму мышечной дистрофии Беккера [Flanigan К.М. Duchenne and Becker muscular dystrophies. Neurol. Clin. 2014; 32: 671-688]. До последнего времени клинические испытания как потенциальные трапевтические препараты для лечения МДД проходили такие аналоги олигонуклеотидов, как олиго-2'-0-метилрибонуклеозидтиоф осфаты (2'- ОМе PS-олигонуклеотиды) [Goemans N.M., Tulinius М., Van den Akker J.T., Burm D.E. et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. New England J. Med. 2011, 364: 1513-1522] (рис. 2, а) и фосфордиамидные морфолиновые олигонуклеотиды (PMO) [Mendell J.R., Rodino-Clapac L.R., Sahenk Z., Roush C. et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 2013; 66: 637-647] (рис. 2, б). Однако, результаты клинических испытаний показали недостаточную эффективность обоих кандидатов. Таким образом, для достижения терапевтического результата при лечении МДД сохраняет свою актуальность создание новых аналогов олигонуклеотидов с улучшенными свойствами по сравнению с существующими прототипами.

[0004] Олигонуклеотидные препараты для лечения МДД, как правило, вводят путем внутривенной или подкожной инъекции, после чего они должны через кровоток попасть в мышечные клетки различных скелетных тканей, диафрагму и сердечную мышцу. В олиго- 2'-0-метилрибонуклеотидтиофосфат� �х (2'-ОМе PS-олигонуклеотидах), участвовавших в клинических испытаниях в отношении МДД, вместо фосфодиэфирной группы присутствует тиофосфатная группа (PS), которая не только приводит к возрастанию устойчивости олигонуклеотидов к действию сывороточных нуклеаз, но и придает благоприятные для терапевтического применения свойства за счет связывания с белками сыворотки [Eckstein F. Phosphorothioate oligonucleotides: what is their origin and what is unique

2

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) about them? Nucleic Acid Ther. 2014; 24: 374-387]. Однако наличие значительного суммарного отрицательного заряда препятствует эффективному проникновению 2'-ОМе PS-олигонуклеотидов в мышечные клетки. Как 2'-ОМе PS-олигонуклеотиды, так и морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) демонстрируют относительно низкий уровень проникновения в мышечные ткани in vivo, в особенности, в сердечную мышцу. Для обеспечения терапевтического эффекта требуются повторные инъекции высоких доз обоих типов аналогов [Yin Н. et al. Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide - mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol. Ther. 2011; 19: 1295-1303; Betts C. et al. Pip6-PMO, a new generation of peptide-oligonucleotide conjugates with improved cardiac exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy treatment. Molecular Therapy Nucleic Acids. 2012; 1: e38; Lehto T. et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 3207-3217]. В то же время, частичная или полная замена отрицательно заряженных фосфодиэфирных групп электронейтральными группами в случае морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) приводит к улучшению проникновения незаряженных олигонуклеотидов в мышечные клетки и повышению уровня пропуска экзона как в культуре мышечных волокон H2k mdx мыши, так и in vivo по сравнению с заряженными PS-олигонуклеотидами [Fletcher S. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic administration of a morpholino antisense oligonucleotide. J Gene Med. 2006; 8: 207-216]. Для повышения эффективности доставки антисмысловых препаратов в клетки были предложены пептидные конъюгаты морфолинов (Р-РМО), в которых последовательность аналога олигонуклеотида связана ковалентной связью с последовательностью векторного пептида (cell-penetrating peptides, СРР) [Jarver P. et al. Peptide-mediated cell and in vivo delivery of antisense oligonucleotides and siRNA. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2012; 1: е27]. Было показано, что конъюгаты Р-РМО попадают в мышечные клетки и ткани in vivo гораздо эффективнее и в меньших дозах, чем неконъюгированные (свободные) олигонуклеотиды. Например, конъюгат морфолинового РМО с поликатионным В-пептидом RXRRBRRXRRBRXB, богатым остатками аргинина (R), оказался способен вызывать восстановление биосинтеза функционального дистрофина в мышечных клетках мышей линии mdx с мутацией в экзоне 23 гена дистрофина при дозах в 10-100 раз ниже, чем неконъюгированный РМО [Jearawiriyapaisarn N. et al. Sustained dystrophin expression induced by peptide-conjugated morpholino oligomers in the muscles of mdx mice. Mol. Ther. 2008; 16: 1624-1629; Wu B. et al. Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modifies morpholino oligomer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 14814-14819; Yin H. et al. Cell-penetrating peptide-conjugated

3

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum. Mol. Gen. 2008; 17: 3909-3918]. Дополнительным преимуществом электронейтральных аналогов олигонуклеотидов является относительная простота конъюгации с поликатионными пептидами [Shabanpoor F. et al. Bi-specific splice- switching PMO oligonucleotides conjugated via a single peptide active in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nucleic Acids Res. 2014; 43: 29-39]. Однако, и для конъюгатов Р-РМО наблюдается существенно меньшее проникновение в диафрагму и, в особенности, в сердечную мышцу, чем в скелетную мышечную ткань. Таким образом, для достижения значимого клинического результата при лечении МДД сохраняет свою актуальность создание новых видов аналогов олигонуклеотидов с улучшенным проникновением в мышечные клетки и ткани по сравнению с существующими прототипами.

[0005] Данное изобретение раскрывает использование для коррекции сплайсинга с целью лечения мышечной дистрофии Дюшена (МДД) аналогов олигонуклеотидов, содержащих вместо одной или нескольких фосфодиэфирных групп (вплоть до полного их замещения) фосфор илгуанидиновые группы, такие как 1, 1,3,3- тетраметилфосфорилгуанидиновая группа (Tmg) и 1,3-диметил-2- имидазолидиниминогруппа (Dmi) (рис. 2, в) [Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125]. Фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды и способ их получения являются предметом заявок на патенты [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ JV22014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014]. Было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) обладают физико-химическими и биологическими свойствами, благоприятных для их использования как терапевтических агентов, в частности, способностью образовывать устойчивые комплементарные комплексы как с ДНК, так и с РНК [Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125] и устойчивостью к действию ферментов, расщепляющих фосфодиэфирную связь [Lebedeva N.A., Anarbaev R.O., Kupryushkin M.S., Rechkunova N.I., Pyshnyi D.V., Stetsenko D.A., Lavrik O.I. Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2046- 2053; Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova N.V., Kuznetsova A.A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V., Fedorova O.S. Mol. BioSyst. 2016, 12, 67-75]. Так как при замещении фосфорилгуанидиновой группой химической модификации подвергается исключительно межнуклеотидная фосфатная группа, это открывает возможность для создания ФГО на основе различных вариантов сахарофосфатного остова, например, с

4

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) использованием дезоксирибозы (R ² = Н, рис. 2, в) или 2-О-метилрибозы (R ² = ОСНз, рис. 2, в).

[0006] В данном изобретении раскрывается биологическая активность фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с сахарофосфатным остовом на основе 2-О-метилрибозы, определенная путем экспериментов в клеточной модели МДД in vitro в культуре мышечных волокон мыши H2k mdx и in vivo на мышах линии mdx, которая сравнима или превосходит активность наиболее успешных из существующих аналогов - фосфордиамидных морфолиновых олигонуклеотидов (РМО). Фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды также могут быть использованы для коррекции сплайсинга in vitro и in vivo в виде конъюгатов с пептидами (ПФГО), показывая при этом сравнимые результаты с пептидными конъюгатами морфолиновых олигонуклеотидов (Р-РМО).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Существующие в настоящее время аналоги олигонуклеотидов не обеспечивают потребности фармацевтического рынка в высокоэффективных и селективных терапевтических препаратах для лечения генетических болезней, таких как мышечная дистрофия Дюшена (МДД), являющаяся объектом данного изобретения. Несмотря на относительно большое число терапевтических кандидатов, проходивших клинические испытания, на рынок с 1998 г. поступило всего пять олигонуклеотидных препаратов. Терапевтические кандидаты на основе олигонуклеотидных производных двух типов: этеплирсен (Eteplirsen) из числа морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и дрисаперсен (Drisapersen) - олиго-2'-0-метилрибонуклеотид, модифицированный тиофосфатными группами - показали способность эффективно вызывать пропуск человеческого экзона 51 и до недавнего времени проходили клинические испытания. По итогам Фазы III клинических испытаний дрисаперсена осенью 2013 г. основной участник - фирма GlaxoSmith Kline (GSK) признала результаты испытаний неудовлетворительными и вышла из состава консорциума. В то же время, в 2013 г. компания Sarepta Therapeutics (www . repta. com) анонсировала, что морфолиновый олигонуклеотид этеплирсен (А VI- 4658) успешно прошел Фазу III клинических испытаний в отношении мышечной дистрофии Дюшена [Sarepta Therapeutics, Efficacy Study of AVI-4658 to Induce Dystrophin Expression in Selected Duchenne Muscular Dystrophy Patients, ClinicalTrials.gov. US Government, NIH, 30.10.2012, www.clmicaitrials.gov/ct2/shosv/NCT01.3962391. В 2014 г. компания Sarepta Therapeutics обратилась в Федеральную службу пищевых продуктов и лекарств США (Food & Drug Administration, FDA) с заявкой на одобрение допуска этеплирсена на фармацевтический рынок США. Это свидетельствует о наличии

5

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) преимуществ у морфолинов перед 2'-0-метильными тиофосфатами при лечении МДД.

Авторы заявки считают, что производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, будучи в силу отсутствия отрицательного заряда концептуально ближе к морфолиновым олигонуклеотидам, чем к тиофосфатам, имеют высокие шансы оказаться подходящими инструментами для коррекции сплайсинга при МДД, что подтверждается приведенными в заявке примерами.

[0008] Однако, и морфолиновый олигонуклеотид этеплирсен для лечения МДД, по итогам экспертизы в январе 2015 г. не получил одобрения FDA ввиду недостаточной терапевтической эффективности, что может быть связано, в том числе, с его недостаточным накоплением в критически важных тканях организма, таких как диафрагма и миокард.

[0009] В силу отсутствия прорывных медицинских технологий нерешенным остается ряд глобальных задач, к которым, помимо генетических болезней и рака можно отнести инфекционные заболевания, вызываемые как вирусами (ВИЧ, лихорадка Эбола, гепатиты, грипп и т.д.), так и бактериями (туберкулез и нозокомиальные инфекции, вызываемые штаммами патогенов с множественной лекарственной устойчивостью).

[0010] В настоящее время на фармацевтическом рынке при отсутствии практически значимой конкуренции с российской стороны целиком доминируют западные решения. В то же время, круг предлагаемых для клинического использования видов аналогов олигонуклеотидов ограничен. Это тиофосфаты (предложены более 30 лет назад), siPHK (предложены более 15 лет назад), LNA (предложены 20 лет назад, срок действия патента истек) и морфолиновые олигонуклеотиды (предложены 20 лет назад, срок действия патента истек). Число новых аналогов, разработанных в более позднее время, и показавших свою перспективность как потенциальные терапевтические средства, например, трицикло-ДНК [Goyenvalle A., Griffith G., Babbs A., El Andaloussi S., Ezzat К., Avril A., Dugovic В., Chaussenot R., Ferry A., Voit Т., Amthor H., Biihr C, Schiirch S., Wood M.J.A. et al. Functional correction in mouse models of muscular dystrophy using exon-skipping tricyclo-DNA oligomers. Nature Medicine. 2015; 21: 270-275], остается весьма небольшим.

[ООН] Раскрытые в заявке на патент РФ и заявке WO2016/028187 А1 фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) обладают свойствами, которые делают их перспективными кандидатами для разработки терапевтических препаратов, действующих путем коррекции сплайсинга по антисмысловому механизму [Zamecnik P., Stephenson М. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 280-284]. Данный механизм лежит в основе способа лечения МДД, что предложено использовать в настоящем проекте. По сравнению с ГИК и РМО, структура фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов наиболее близка природным нуклеиновым кислотам, так как модификации подвергается только фосфатная группа, а

6

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) углеводный остаток сохраняется неизменным. Кроме того, структура новых аналогов позволяет вводить дополнительные функциональные группы как в боковую цепь фосфорилгуанидиновой группы, так и в остаток сахара с целью улучшить их сродство к мРНК и проникновение в клетки. В то же время химический синтез этих производных относительно несложен, что позволяет прогнозировать конкурентные преимущества в себестоимости продукта по сравнению с большинством существующих прототипов. Кроме того, спектр возможных производных, которые могут быть синтезированы на основе фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, в силу легкости их дополнительной химической модификации также значительно шире, чем у большинства существующих прототипов. Это позволяет планировать получение продуктов, недоступных конкурентам, использующим разработанные ранее методы, и ориентироваться на новые сегменты фармацевтического рынка.

[0012] Для синтеза фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов используется автоматизированный твердофазный синтез по фосфитамидному методу, который обеспечивает универсальность и простоту получения терапевтических препаратов для лечения МДД, а также их умеренную стоимость. В то же время способ синтез морфолиновых олигонуклеотидов сильно отличается от наиболее эффективного в настоящее время фосфитамидного метода и поэтому несовместим с большинством уже разработанных модифицирующих реагентов, в том числе, реагентов для введения флуоресцентных меток и т.д. [Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187-195]. Также, по некоторым данным, синтез морфолиновых олигонуклеотидов сопровождается побочными реакциями по остаткам гуанина.

[0013] На основании литературных данных о незаряженных морфолиновых олигонуклеотидах и собственных предварительных результатов авторы заявки предположили, что нейтральные фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды могут проникать в мышечные клетки не хуже морфолиновых аналогов и лучше, чем отрицательно заряженные 2'-ОМе тиофосфаты. Для наиболее эффективного проникновения в мышечные клетки и распределения в наиболее важные органы и ткани - такие, как сердечная мышца и диафрагма - может быть использована конъюгация с пептидами. Известно, что конъюгаты морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) с векторными пептидами, обеспечивающими проникновение в клетки (cell penetrating peptides, СРР) - т.н. Р-РМО являются активными агентами для коррекции сплайсинга при МДД, в частности, Р-РМО на основе оптимизированного пептида Pip6a. Для обеспечения эффективного проникновения фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов в критически важные мышечные ткани типа сердечной мышцы была осуществлена конъюгация фосфорилгуанидиновых

7

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) олигонуклеотидов с пептидом Pip6a, облегчающим проникновение в мышечные клетки и обеспечивающим попадание конъюгата в диафрагму и сердце.

[0014] Следует отметить, что в отличие от морфолинов, предложенная в заявке на патент РФ JVT22014134380 и заявке WO2016/028187 А1 фосфорилгуанидиновая модификация касается только фосфатной группы, но не затрагивает остатка сахара, что позволяет комбинировать фосфорилгуанидиновую модификацию с другими, предложенными ранее химическими модификациями остатка (дезокси)рибозы с целью придания олигонуклеотиду благоприятных свойств. Так, для повышения сродства к РНК- мишени в антисмысловых олигонуклеотидах дезоксирибоза могут быть заменена на 2-0- метилрибозу или 2-фтор-2-дезоксирибозу. Данные аналоги олигорибонуклеотидов обладают рядом преимуществ по сравнению с ДНК, а именно: высокой скоростью гибридизации с РНК и повышенной устойчивостью дуплексов с РНК [Y. Hou et al. Biochemistry. 1996. V.35. Р.15340-15348; М. Majlessi et al. Nucl. Acids. Res. 1998. V.26. P.2224-2229]. Это является существенным для повышения эффективности коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина при воздействии на нее антисмыслового ол игону кл еотид а .

[0015] В качестве клеточной линии для изучения способности фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов восстанавливать биосинтез укороченного на один экзон, но функционального дистрофина были использованы мышечные волокна мыши H2k mdx, экспрессирующие мутантный ген дистрофина. В данной клеточной линии мутация в гене дистрофина приводит к образованию стоп-кодона в 23 экзоне мРНК, терминируя тем самым биосинтез дистрофина [Muntoni F, Wood MJ. Nat Rev Drug Discov. 2011. V. 10. P. 621-637]. На автоматическом синтезаторе ASM-800 (Россия) с использованием разработанных и оптимизированных авторами протоколов твердофазного фосфитамидного синтеза были синтезированы фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды, содержащие дезоксирибозу, 2-О-метилрибозу или 2'-фтор-2-дезоксирибозу. Антисмысловые олигонуклеотиды были направлены на 5 '-регион сплайсингового участка интрона 23 с целью обеспечить пропуск экзона 23 для восстановления тем самым биосинтеза укороченного дистрофина, который способен выполнять биологические функции своего полноразмерного аналога. В качестве контрольных были использованы соответствующие морфолиновые олигонуклеотиды с той же последовательностью нуклеотидов. Параллельно был проведен синтез векторного пептида Pip6a с последующей его конъюгацией с фосфорилгуанидиновыми ол игону кл еотид ами.

[0016] Отобранные фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды были исследованы на способность корректировать мутацию в гене DMD путем пропуска экзона 23 пре-мРНК

8

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) дистрофина в клетках мышиных мышечных волокон линии H2k mdx. Эффективность пропуска экзона была определена при помощи метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР и анализом реакционных смесей методом гель-электрофореза в агарозе. Для получения количественных характеристик радиоавтограф агарозного геля был переведен в цифровую форму. Процент пропуска экзона рассчитывался как отношение площади пика мРНК с делецией 23 экзона (Δ23) к сумме площадей пиков полноразмерной пре-мРНК, мРНК Δ23 и мРНК Δ23+Δ22.

[0017] Олигонуклеотиды и их пептидные конъюгаты, показавшие высокую активность в культуре мышечных клеток in vitro были далее использованы для изучения коррекции сплайсинга в мышечной ткани мышей линии mdx in vivo после однократной внутримышечной инъекции в переднюю болыиеберцовую мышцу tibialis anterior (ТА). Активность фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов и их пептидных конъюгатов при этом была сравнима с активностью уже известных морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и их пептидных конъюгатов (Р-РМО), которые являются наиболее эффективными в настоящее время средствами для коррекции сплайсинга при МДД.

[0018] На завершающем этапе были проведены эксперименты in vivo на мышах линии mdx путем внутривенной инъекции наиболее активных в культуре клеток олигонуклеотидов и конъюгатов. В этих экспериментах были использованы мыши линии mdx возрастом 4.5-5.5 недель и массой 25-30 г. Опыты были проведены согласно процедурам, одобренным Министерством внутренних дел Великобритании. Олигонуклеотиды в виде раствора с25% диметилсульфоксида (DMSO) были введены в хвостовую вену мышей в условиях обезболивания. Две недели спустя мыши были усыплены вдыханием С0 ₂ , и полученные образцы мышечной ткани, диафрагмы и миокарда хранились при -80°С после замораживания в охлажденном изопентане. Визуализация дистрофина и количественное его определение в образцах тканей были проведены при помощи иммуногистохимического анализа и Вестерн-блоттинга, как описано в ссылке [Betts С et al 2012 Mol Ther Nucl Acids 1: е38]. Эффективность пропуска экзона была определена при помощи ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени. Анализ биомаркеров токсичности был проведен путем определения показателей клинической биохимии в образцах плазмы крови, отобранных из яремной вены мышей линии mdx сразу после усыпления вдыханием углекислого газа.

[0019] Ранее авторами было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе ДНК способны образовывать комплементарные комплексы с ДНК или РНК, устойчивость которых лишь незначительно

9

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) отличается от устойчивости природных дуплексов ДНК с ДНК и ДНК с РНК [Купрюшкин

М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125]. Это позволило предположить, что ФГО могли бы послужить подходящими антисмысловыми агентами для коррекции сплайсинга при мышечной дистрофии Дюшена (МДД). Ожидалось, что уровень пропуска экзона будет в основном определяться эффективностью доставки олигонуклеотида в мышечные клетки. Для проверки этой гипотезы были исследованы тиофосфатные производные олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов (2'-ОМе PS-олигонуклеотиды), содержащие ограниченное число фосфорилгуанидиновых Tmg-rpynn электронейтрального характера, уменьшивших суммарный отрицательный заряд олигонуклеотида.

Табл. 1. Последовательности олигонуклеотидов с 1,1,3,3-тетраметилгуанидиновой группой (Tmg), использованных для коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.

a Последовательности олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, LNA - строчными буквами; ⁶ s - межнуклеотидная тиофосфатная группа -P(=S)(0 ^" )-; " Flu - остаток 5'- флуоресцеина; ^г звездочкой (*) обозначено положение межнуклеотидной Tmg-группы.

[0020] Была изучена активность новых олигонуклеотидных производных, содержащих четыре фосфорилгуанидиновые группы Tmg на месте 3' -концевых фосфатных

10

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) групп, в экспериментах по коррекции сплайсинга мутантной пре-мРНК дистрофина с пропуском экзона 23 в культуре mdx мышиных мышечных клеток с использованием 2'- ОМе PS олигонуклеотидов в качестве положительного контроля как в присутствии, так и в отсутствии трансфектанта Lipofectamine 2000 (рис. 3).

[0021] Эксперимент показал, что в присутствие Lipofectamine 2000 модифицированный Tmg-группами олигонуклеотид (Ml 62) не проявил преимущества перед контрольным 2'-ОМе PS-олигонуклеотидом (М560). Корректирующая активность смешанных 2'-OMe/LNA PS олигонуклеотидов как с Tmg-группами (М662), так и без Tmg- групп (М563) заметно уступала активности контрольного 2'-ОМе PS -олигонуклеотида (М560), а олиго-2'-0-метилрибонуклеотид, содержащий обычные фосфатные группы (Ml 59), вообще не проявил корректирующей сплайсинг активности (рис. 3).

[0022] В то же время в условиях свободного проникновения без всякого трансфектанта (гимноз) в течение 24 ч в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) 2'-ОМе PS-олигонуклеотид, модифицированный четырьмя Tmg-группами (М162), показал более высокую активность по пропуску экзона 23, чем контрольный 2' - ОМе PS-олигонуклеотид (М560) (рис. 4). Можно сделать вывод, что присутствие даже четырех модифицирующих Tmg-групп в составе олигонуклеотида с 3' -конца не только обеспечивает эффективную защиту от действия З'-экзонуклеаз, присутствующих в сыворотке, но и обеспечивает улучшенное проникновение модифицированного Tmg- группами олигонуклеотида в мышечные клетки в отсутствие трансфектанта. В то же время наибольший уровень пропуска экзона (>70%) был достигнут с помощью пептидного конъюгата морфолинового олигонуклеотида Pip6a-PMO в концентрации 0.5 мкМ (рис. 5).

[0023] Следует также отметить, что 2'-ОМе PS-олигонуклеотиды с четырьмя Tmg- группами не проявляли цитотоксичности в отношении мышечных клеток H2k mdx при концентрации до 20 мкМ и времени инкубации до 24 ч.

[0024] Можно заключить, что PS-олигонуклеотиды, модифицированные электронейтральными фосфорилгуанидиновыми группами Tmg, в условиях модельной коррекции мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) в культуре клеток in vitro показали биологическую активность, сопоставимую с активностью контрольного 2' -ОМе PS- олигонуклеотида без модификации при отсутствии выраженной цитотоксичности. В то же время в условиях свободного проникновения без трансфектанта (гимноз) при добавлении сыворотки Tmg-модифицированный олигонуклеотид превосходил по своей активности контрольный олигонуклеотид без модификации, что можно объяснить повышенной биологической устойчивостью нового олигонуклеотидного аналога и улучшенным проникновением его в мышечные клетки. Таким образом, фосфорилгуанидиновые

11

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) производные олигонуклеотидов являются перспективными кандидатами на роль терапевтических средств для лечения мышечной дистрофии Дюшена методом пропуска экзона. Авторы предположили, что было бы целесообразно исследовать коррекцию сплайсинга при помощи электронейтральных олигонуклеотидов, полностью замещенных фосфорилгуанидиновыми группами по всем межнуклеотидным положениям.

[0025] Для проверки этого предположения с использованием ранее раскрытого способа [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ j\°2014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014] авторами были получены два незаряженных 20-звенных ФГО М634 и М551 с остовом на основе 2-дезоксирибозы (2'-дезокси-ФГО) и 2-О-метилрибозы (2'-0-метил-ФГО), соответственно, содержащие 1,3-диметил-2- имидазолидиниминогруппы (Dmi) (рис. 2, в) по всем межнуклеотидным положениям (табл. 2). В качестве положительного контроля был использован 25-звенный морфолиновый олигонуклеотид (РМО) 5 ' -GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT [Lehto Т., Castillo Alvaraz A., Gait M.J., Coursindel Т., Wood M.J.A., Lebleu В., Boisguerin P. // Nucleic Acids Res. 2014. V. 42. N° 5. P. 3207-3217]. Также было исследовано влияние добавления 5 экв. липопептида Pal-RXR4 или St-STl (табл. 3), способных доставлять незаряженные олигонуклеотиды в клетки в составе пептидных наночастиц [Jarver P., Zaghloul Е.М., Arzumanov А.А., Saleh A.F., McClorey G., Hammond S.M., Hallbnnk M., Langel ΐΐ, Smith CLE., Wood M.J., et al. // Nucleic Acid Ther. 2015. V. 25. J s 2. P. 65-77]. Клетки H2k mdx инкубировали при концентрации олигонуклеотида 1 мкМ или 5 мкМ в отсутствие или в присутствии липопептида в течение 4 ч. После выделения из клеток суммарной РНК результаты коррекции сплайсинга анализировали с помощью электрофореза продуктов ОТ- ПЦР в агарозном геле (рис. 6).

Табл. 2. Последовательности и молекулярные массы олигонуклеотидов, использованных для изучения коррекции сплайсинга в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.

Код Последовательность, 5'-3 '' Молекулярная масса,

Расч. [М] Эксп. [М]

М159 GGCCAAACCUCGGCUUACCU 6598.39 6595.06

М560 Gs ^e GsCsCsA _s A _s A _s CsCsUsCsGsGsCsUsU _s A _s CsCsU 6887.57 6884.27

12

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) M162 GsGsCsCsA _s A _s AsCsCsUsCsGsGsCsU ^#2 U ^# AC ^# C ^# U 7195.99 7193.64

M634 g 7845.82 7843.30

M551 G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*CnjnJ*A*C*C*U 8390.24 8387.98 ^a 2'-0-Метилрибонуклеотиды обозначены прописными буквами, 2'-дезоксирибонуклеотиды - строчными буквами; ⁶ по данным ESI LC -MS/MS; ^е (s) - положение тиофосфатной группы (PS); ^г ( ^# ) - положение Tmg- группы; ^д (*) - положение Dmi-группы.

Табл. 3. Последовательности липопептидов, использованных в качестве добавок при трансфекции олигонуклеотидов в клетки H2k mdx.

Код Последовательность

Pal-RXR4 Пальмитоил-Arg- -Ahx ^a -Arg-Arg-Ahx-Arg-Arg-Ahx-Arg-Arg-Ahx-Arg-aMiifl St-STl Стеароил-Ser-Ar '-Thr-Om-Ser-Ser-Tyr-Om-Thr-Arg-Ser-Thr-Arg-Ser-Om-Gly-ам� �д ^а Ahx - ε-аминогексановая кислота.

[0026] Денситометрическая обработка полученных данных ОТ-ПЦР (рис. 7) показала, что 20-звенный 2' -О-метил-ФГО М551 проявляет антисмысловую активность по коррекции сплайсинга in vitro в культуре клеток H2k mdx, которая соответствует или несколько превышает активность 25-звенного морфолинового олигонуклеотида (РМО). Активность 20-звенного 2'-дезокси-ФГО М634 была существенно ниже. Добавка 5 мкМ липопептида Pal-RXR4 или St-STl к РМО или 2' -О-метил-ФГО М551 (оба 1 мкМ) оказывала заметный положительный эффект на коррекцию сплайсинга.

[0027] Таким образом, было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе 2-О-метилрибозы способны корректировать сплайсинг мутантной пре-мРНК дистрофина in vitro в культуре мышечных волокон мыши H2k mdx, которая является лабораторной моделью мышечной дистрофии Дюшена. При этом степень пропуска экзона, вызываемая 2' -О-метил-ФГО длиной 20 нт, хорошо соответствовала или несколько превосходила активность, показанную морфолиновым олигонуклеотидом (РМО) длиной 25 нт. Следует отметить, что РМО являются одним из видов антисмысловых олигонуклеотидов, которые в настоящее время проходят клинические испытания как потенциальные лекарственные препараты для терапии мышечной дистрофии Дюшена (МДД) [Mendell J.R., Rodino-Clapac L.R., Sahenk Z., Roush К., Bird L., Lowes L.P., Alfano L., Gomez A.M., Lewis S., Kota J., et al. // Ann. Neurol. 2013. V.

13

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 66. N° 5. P. 637-647]. В то же время аналогичный ФГО с остовом на основе 2-дезоксирибозы проявил значительно меньшую активность по коррекции сплайсинга in vitro. Добавление липопептида, способного доставлять в клетки незаряженные аналоги олигонуклеотидов [Jarver P., Zaghloul Е.М., Arzumanov А.А., Saleh A.F., McClorey G., Hammond S.M., Hallbrink M, Langel Tj., Smith CLE., Wood M.J., et al. // Nucleic Acid Ther. 2015. V. 25. J s 2. P. 65-77], увеличивало степень пропуска экзона как в случае РМО, так и в случае 2' -0-метил-ФГО. Из полученных результатов можно сделать вывод, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе 2'-0-метил-РНК являются перспективными терапевтическими кандидатами для лечения МДД, в том числе при доставке их с помощью пептидов.

[0028] Анализ выживаемости клеток гепатокарциномы Huh-7 методом MTS показал, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды М551 и М634, также как и олиго-2'-0- метилрибонуклеозидтиофосфаты (PS) и морфолины (РМО), не проявляли токсичности при инкубации в течение 4 ч при концентрации от 5 до 60 DM (рис. 8).

Табл. 4. Последовательности и молекулярные массы фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с 5'-концевой 1 -(4-азидобутил)фосфорамидной группой, использованных для конъюгации с пептидом Pip6a.

Молекулярная масса ⁶

Код Последовательность, 5'-3 ' ^а

Расч. [М] Эксп. [М]

04 8509.45 8506.08

05 Flu p _N G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U 9053.87 9051.57

Об p _N G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U 8566.21 8563.68

07 p _N C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*U 8566.21 8563.65 ^а Остатки 2'-дезоксирибонуклеотидов обозначены строчными буквами, 2'-0-метилрибонуклеотидов - прописными буквами; ⁶ По данным ESI LC-MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; ^β Flu - остаток флуоресцеина; ^г PN - -(4-азидобутил)-фосфорамидная группа >P(=0)-NH(CH ₂ )4N ₃ ; ^д Звездочкой (*) обозначено положение Dmi-группы; Dmi - 1,3-диметил-2-имидазолидиниминогр� �ппа.

[0029] Для получения конъюгатов фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов с векторными пептидами (ПФГО) может быть использован способ «клик»-химии [Kolb Н.С., Finn M.G., Sharpless К.В., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004-2021], основанный на

14

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) использовании катализируемого солями меди(1) 1,3-диполярного циклоприсоединения алкилазидов к алкинам (CuAAC) [Тогт е С. W., Christensen С, Meldal М., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064; Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., Sharpless K.B., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599]. Для конъюгации было использовано производное векторного пептида Pip6a [Lehto Т., Castillo Alvaraz A., Gait M.J., Coursindel Т., Wood M.J.A., Lebleu В., Boisguerin P., Nucleic Acids Res., 2014, 42, 3207-3217], содержащее алкинильную группу. Необходимые для конъюгации производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), содержащие азидобутильную группу, были получены согласно разработанным методикам [Стеценко Д. А., Купрюшкин М.С., Пышный Д. В., заявка на патент РФ N° 2014117293, приоритет от 29.04.2014; Купрюшкин М.С., Апухтина B.C., Васильева СВ., Пышный Д.В., Стеценко Д.А., Изв. Акад. Наук, Сер. Хим., 2015, 7, 1678-1681]. Последовательности полученных азидобутильных производных ФГО 04-07 приведены в табл. 4. Схема синтеза азидобутильных производных ФГО показана на рис. 9.

Табл. 5. Последовательности и молекулярные массы полученных З'-аминоалкильных

производных фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО).

Молекулярная масса ⁶

Код Последовательность, 5 '-3 ' ^А

Расч. [М] Эксп. [М]

08 g* ^e c*g*c*c*a*a*a*c*a*NH2 ^z 4136.69 4135.14

09 C*A*G*A*G*U*U*C*U*C*A*G*G*A*U*G*U*A*NH2 7896.67 7897.88

О10 G*A*G*A*C*U*U*A*C*C*A*C*U*U*C*C*U*U*NH2 7753.63 7755.39

ОН G*U*C*C*A*G*C*C*C*C*A*U*G*G*A*NH2 6563.27 6563.60

012 C*A*G*U*C*A*C*U*G*A*A*A*A*U*C*C*U*U*U*C*U*A*NH2 9483.21 9484.66

013 G*G*U*U*U*U*G*G*U*G*G*U*G*C*A*C*A*U*C*G*A*NH2 9213.06 9214.48

014 C*C*A*U*G*G*C*A*U*U*C*A*G*G*G*U*A*C*U*U*U*G*G*NH2 10025.35 10026.65

015 A*C*A*C*C*A*C*A*A*U*C*G*C*U*C*C*C*U*C*NH2 8148.82 8150.38

016 Ρ1υ ^ό *Α*Ο*υ*€*υ*€*Ο*Α*0*υ*υ*Ο*€*υ*Α*€*� �*^2* ^ε 7955,78 7962,82 ^Ж

018 A*G*U* C*U*C* G*A*C* U*U*G* C*U*A* С*С*ли2* 7183,47 7184,62 ^а Остатки 2'-дезоксирибонуклеотидов обозначены строчными буквами, остатки 2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, остатки 2'-фтор-2'-дезоксирибонуклеотидов подчёркнуты; ⁶ По данным ESI

15

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) LC-MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; ^β Звёздочкой (*) обозначено положение Dmi- группы; NH2 - 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7а); Flu - остаток флуоресцеина; 2-гидроксиметил- 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7Ь); По данным MALDI-TOF MS.

[0030] Одним из наиболее простых способов конъюгации пептидов и олигонуклеотидов является образование амидной связи в растворе или на твёрдой фазе между С-концевой карбоксильной группой пептида и аминогруппой аминоалкильного производного олигонуклеотида [Venkatesan N., Kim В.Н., Chem. Rev., 2006, 106, 3712-3761; Lu К., Duan Q.-P., Ma L., Zhao D.-X., Bioconjugate Chem., 2010, 21, 187-202]. В этой связи представляют интерес производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), содержащие первичную аминогруппу, которая может образовывать амидную связь с карбоксильной группой пептида. Наиболее простым является синтез 3' -концевых аминоалкильных производных олигонуклеотидов, для которого можно использовать подходящий полимерный носитель, содержащий защищенную аминогруппу. В настоящее время коммерчески доступны два основных полимерных носителя для получения 3'- аминоалкильных производных олигонуклеотидов: З'-PT-Amino-Modifier С6 CPG (Glen Research 20-2956) на основе тримеллитовой кислоты (рис. 10, 5а) и З'-Amino-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research 20-2957) с Fmoc-защищенной аминогруппой в боковой цепи (рис. 10, 5Ь).

[0031] С использованием полимерного носителя (5а) был разработан эффективный метод автоматизированного твердофазного синтеза ФГО с З'-аминогексильной группой (рис. 10, 7а). Была оптимизирована методика одновременного удаления защитных групп и отщепления 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ от полимера с раскрытием фталимидной группы (6а) при помощи реагента АМА (смеси 40% водного метиламина с 25% водным аммиаком 1 : 1) в течение 15 мин при 65оС. Реагент АМА показал наилучший результат при деблокировании олигонуклеотидов, содержащих все четыре основания (см. табл. 5), в то время как использование 25% раствора аммиака при 55оС требовало длительного времени и иногда приводило к побочным реакциям.

[0032] Полученные 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ содержали Dmi-группы по всем межнуклеотидным положениям и 6-аминогексильную группу, присоединенную к 3' -концу также при помощи фосфорилгуанидиновой Dmi-группы (см. рис. 10, табл. 5). Предполагается, что 6- аминогексильная группа (рКа около 10) при физиологических значениях рН около 7 будет протонирована. Вероятно, из-за присутствия положительного заряда полученные 3'-ΝΗ2- ФГО показали лучшую растворимость в воде, чем полностью нейтральные ФГО, не

16

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) содержащие аминогруппы. 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ были использованы для конъюгации с пептидом

Pip6a путем фрагментной конденсации в растворе с образованием стабильной амидной связи между С-концевой карбоксильной группой пептида и З'-аминогексильной группой ФГО. Первичная структура пептида Pip6a приведена в табл. 6.

Табл. 6. Первичная структура пептида Pip6a.

Pip6a Ac-RXRRBRRXRYQFLIRXRBRXRB -ОН В = β-аланин, X = ε-аминокапроновая кислота

[0033] Так как С-концевой аминокислотой в Pip6a является β-аланин, то рацемизация при активации карбоксильной группы невозможна, боковые цепи Arg, Туг и Gin не требуют защиты, а Ν-конец блокирован ацетильной группой. Поэтому пептид Pip6a особенно подходит для фрагментной конденсации в растворе путем образования амидной связи. Также амидная конденсация в растворе более эффективно протекает с незаряженными аналогами нуклеиновых кислот, такими как морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) и пептидно- нуклеиновые кислоты (ПНК, англ. PNA) [Deuss P.J., Arzumanov А.А., Williams D.L., Gait M.J., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 7621-7630]. К незаряженным аналогам принадлежат и раскрытые в настоящей заявке фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) на основе 2'-ОМе РНК (табл. 5). В настоящей заявке раскрыт способ получения конъюгатов фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), например, с остовом на основе 2'-0-метилрибозы и 2'-фтор-2'- дезоксирибозы, с пептидом путем фрагментной конденсации в растворе с образованием стабильной амидной связи между З'-аминогексильной группой ФГО и С-концевой карбоксильной группой пептида. Схема конъюгации пептида с ФГО приведена на рис. 11. Получены и охарактеризованы модельные пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО). Типичные профили элюции конъюгатов приведены на рис. 12 и 13. Структура конъюгатов была подтверждена с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (рис. 14).

Табл. 7. Последовательности и молекулярные массы полученных производных фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с остовом на основе 2-О-метилрибозы и 2-фтор- 2-дезоксирибозы .

17

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) M177 (20 нт AS) G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*UNH2 ^j 8664.39 8665.08 ^Й

M178 (20 нт Scr) C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*UNH2 8664.39 8665.24 ^Й

T134 (20 нт AS) 0*0*С*С*А*А*А*С*С*и*С*0*0*С*и*и*А*С*С*Щя2» ^е 8695.22 8694.00

T136 (20 нт Scr) C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*UAT«2 ^» 8695.22 8688.00

T013, T016,

T021, T027,

G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U*G*A*A*A*U*NH2 10848.97 10846.36 T099, T102

(25 нт AS)

T014, T018,

T028, ТЮО,

C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*U*A*U*C*G*A*NH2 10826.23 10823.26 ТЮЗ

(25 нт Scr+)

T133 (25 нт AS) G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U*G*A*A*A*U*,v _tf 2» 10880.30 10881.00

T135 (25 нт 10856.00

С*А*и*и*0*С*С*А*А*С*С*А*0*и*С*С*С*0*0*и*А*� �*С*0*А*#я2» 10856.25

Scr+)

F032 G*C*A*A*A*A*G*C*A*G*G*G*U*A*G*A*U*A*A*U*C*ffl2. 8816.84 8826.87

F033 C*C*A*U*G*G*C*A*U*U*C*A*G*G*G*U*A*C*U*U*U*G*G*,v _tf 2» 9769.66 9780.81 ^a Остатки 2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, остатки 2'-фтор-2'- дезоксирибонуклеотидов подчеркнуты; ⁶ По данным ESI LC -MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; ^β Звездочкой (*) обозначено положение Dmi-группы; ^г ΝΗ2 - 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7а); ^д По данным MALDI-TOF MS, [М+Н] ⁺ ; ^е _Ш 2* - 2-гидроксиметил-6-аминогексильна� � группа (рис. 10, 7Ь).

[0034] Конъюгаты пептида Pip6a (табл. 6) с антисмысловым 20-звенным ФГО М177

(20 нт AS) и 20-звенным ФГО Ml 78 случайной последовательности, но совпадающего с М177 состава (20 нт Scr) (табл. 7), полученные по раскрытой методике (Пример 4), были использованы для определения уровня пропуска экзона в мышиной клеточной модели МДД. Была определена зависимость степени коррекции сплайсинга от концентрации конъюгата в условиях, аналогичных опыту с неконъюгированными олигонуклеотидами (Пример 2). Анализ продуктов количественного ОТ-ПЦР суммарной РНК, выделенной из мышечных клеток после инкубации с антисмысловыми олигонуклеотидами, показал, что активность конъюгата Pip6a-M177 по коррекции сплайсинга проявлялась, начиная с концентрации 0.125 мкмМ, а в концентрации 1 мкМ конъюгат демонстрировал уровень пропуска экзона более 70%, что практически не отличается от эффекта, вызываемого лучшим из имеющихся на сегодняшний день клинических кандидатов Pip6a-PMO (рис. 15).

18

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В то же время в меньших концентрациях эффективность Pip6a-M177 снижалась. Конъюгат

ФГО Ml 78 со случайной последовательностью показал весьма незначительную активность (порядка 10% от целевого М177), что свидетельствует о том, что конъюгат М177 действительно проявляет специфическую зависимую от последовательности антисмысловую активность. Однако, уровень активности конъюгата Pip6a-M178 оказался большим, чем ожидалось для случайной последовательности (Scr). Было выдвинуто предположение, что имела место загрязнение образца конъюгата М178 небольшим количеством антисмыслового конъюгата М177, который совпадает с конъюгатом М178 по молекулярной массе. Такая контаминация могла иметь место при обессоливании ФГО Ml 77 и Ml 78 друг за другом на одном и том же картридже PolyPak II (Glen Research, США) ввиду более выраженной фиксации ФГО на полимерной матрице картриджа в силу отсутствия заряда и, как следствие, более гидрофобного характера ФГО по сравнению с обычными олигонуклеотидами. Для того, чтобы избежать в будущем трудностей с выявлением контаминации с помощью масс-спектрометрии было принято решение в случае ФГО длиной 25 нт заменить один из нуклеотидов случайной последовательности ФГО с С на А для получения детектируемой разницы в молекулярной массе (табл. 7, 25 нт Scr+).

[0035] Коррекция сплайсинга с помощью конъюгатов пептида Pip6a с антисмысловым 20-звенным ФГО М177 (20 нт AS) и 20-звенным ФГО М178 случайной последовательности, но совпадающего с М177 состава (20 нт Scr) по сравнению с контрольным конъюгатом 25-звенного РМО и свободными (неконъюгированными) ФГО была исследована in vivo при однократной внутримышечной инъекции 1 нмоль каждого соединения в переднюю болыиеберцовую мышцу tibialis anterior (ТА) мышей линии mdx. В экспериментах были использованы мыши линии mdx возрастом 4.5-5.5 месяцев. Опыты проводились согласно процедурам, одобренным Министерством внутренних дел Великобритании. Конъюгаты в количестве 1 нмоль в физиологическом растворе были введены в мышцу ТА мышей в условиях обезболивания. Две недели спустя мыши были усыплены вдыханием С0 ₂ , и полученные образцы мышечной ткани исследованы на эффективность пропуска экзона по уровню РНК при помощи количественной ОТ-ПЦР. Результаты определения восстановления биосинтеза дистрофина в ТА по уровню РНК приведены на рис. 16.

[0036] Визуализация дистрофина в образцах мышечной ткани проводились при помощи иммуногистохимического анализа, как описано в работе [Betts С, Saleh A.F., Arzumanov A. A., Hammond S.M., Godfrey С, Coursindel Т., Gait M.J., Wood M.J. A., Mol. Therapy Nucleic Acids, 2012, 1, е38]. Результаты определения восстановления биосинтеза

19

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) дистрофина в ТА по уровню белка приведены на рис. 17. Анализ биомаркеров токсичности путем определения показателей клинической биохимии в образцах плазмы крови, отобранных из яремной вены мышей линии mdx сразу после усыпления вдыханием углекислого газа не выявил признаков острой токсичности конъюгатов ФГО с пептидом Pip6a.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

[0037] Раскрытые авторами в данной заявке результаты позволяют сделать следующие выводы о достижении технического результата изобретения:

[0038] 1. Предложенные в качестве потенциальных антисмысловых агентов для коррекции сплайсинга при мышечной дистрофии Дюшена (МДД) фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) на основе 2'-0-метил-РНК показывают биологическую активность по пропуску экзона в мышиной клеточной модели МДД, сравнимую с активностью свободных РМО, использованных в качестве контроля. Было показано, что прибавление липопептида потенцирует активность свободных (неконъюгированных) ФГО.

[0039] 2. Полученные производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов

(ФГО), например, пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО), например, ПФГО на основе пептида Pip6a показывают биологическую активность по коррекции сплайсинга в мышиной клеточной модели МДД, сравнимую с активностью пептидных конъюгатов морфолиновых олигонуклеотидов (РМО), которые являются наиболее активными из имеющихся в настоящее время потенциальных терапевтических средств для лечения МДД. Активность ПФГО зависит от последовательности, что подтверждает антисмысловой механизм их действия.

[0040] 3. ПФГО вызывают коррекцию сплайсинга in vivo, отмеченную как по уровню РНК (ОТ-ПЦР), так и белка (иммуногистохимический анализ), при внутримышечной инъекции мышам линии mdx, экспрессирующим ген дистрофина с мутацией в экзоне 23, не вызывая при этом заметных токсических эффектов согласно показателям клинической биохимии. При этом биологическая активность ПФГО превосходит биологическую активность свободных (неконъюгированных) ФГО и зависит от последовательности, что соответствует антисмысловому механизму их действия. Активность ПФГО как in vitro, так и in vivo сопоставима с активностью лучшего из существующих прототипов потенциальных терапевтических гентов для лечения МДД - пептидных конъюгатов морфолиновых олигонуклеотидов (Р-РМО).

[0041] Таким образом, раскрытые в данной заявке фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО), например, с остовом на основе 2-О-метилрибозы, а также

20

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) производные ФГО, например, пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО) являются новыми перспективными потенциальными терапевтическими агентами для коррекции сплайсинга при лечении мышечной дистрофии Дюшена (МДД).

[0042] Результаты, показанные фосфорилгуанидиновыми олигонуклеотидами в отношении мышечной дистрофии Дюшена (МДД) как самими по себе (т.е., в условиях гимноза), так и при доставке олигонуклеотидов в мышечную ткань с помощью пептидов могут быть в дальнейшем использованы при разработке олигонуклеотидной терапии других заболеваний, связанных с экспрессией определенных генов. Это может послужить решению важной проблемы современной молекулярной медицины, связанной с недостаточной эффективностью существующих методов олигонуклеотидной терапии.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0043] Термин «нуклеотид» используется для обозначения химического соединения, содержащего нуклеозид или модифицированный нуклеозид, и хотя бы одну фосфатную группу, присоединенную к нему ковалентной связью. Примером ковалентной связи независимо и без ограничений является эфирная связь между 3', 2' или 5'-гидроксильной группой нуклеозида и фосфатной группой.

[0044] Термин «олигонуклеотид» используется для обозначения химического соединения, состоящего из двух или более нуклеотидов, соединенных между собой в полимерную цепь. Олигонуклеотид может представлять собой фрагмент ДНК или РНК. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двуцепочечными, т.е. содержать две цепи с высокой степенью комплементарности. При этом любая из цепей или обе могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению.

[0045] Олигонуклеотид как полимер из двух или более нуклеотидов может иметь любую длину. Например, олигонуклеотид может иметь минимальную длину в 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Опционально, олигонуклеотид может иметь максимальную длину в 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,

55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, ПО, 120, 130, 140,

150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330,

340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, или 500 нуклеотидов, хотя и более длинные олигонуклеотиды могут быть использованы в

21

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) отдельных вариантах применения днного изобретения. Для примера, может быть получен олигонуклеотид, состоящий из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.

[0046] В олигонуклеотидах, являющихся предметом настоящего изобретения, один или несколько, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов, или же все нуклеотиды могут содержать модифицированную в соответствии с настоящим изобретением фосфатную группу.

[0047] Термины «модифицированный нуклеотид» и «модифицированный олигонуклеотид» используются для обозначения нуклеотида или олигонуклеотида, соответственно, которые содержат химическую модификацию, например, заместители в остатке сахара, в фосфатной группе и/или в гетероциклическом основании. Примером химической модификации может служить введение модифицированного нуклеотида, опциональной химической группировки на 3'- и/или 5'-конец олигонуклеотида (например, остатка 3' -«инвертированного» нуклеозида), конъюгация с остатком высокомолекулярного соединения низкой иммуногенности (например, полиэтиленгликоля (ПЭГ)), конъюгация с низкомолекулярными соединениями (например, холестерином), конъюгация с пептидами (например, пептидами, облегчающими проникновение в клетки), замещение в фосфатной группе (например, тиофосфатную группу). Химическая модификация гетероциклических оснований может включать в себя, в том числе, замещение по С-5 пиримидинового нуклеотида, замещение по С -7 7-деазапуринового нуклеотида, замещение по экзоциклической аминогруппе, введение остатков 4-тиоурацила, 5-бром- и/или 5- иодурацила и пр. Модификация остатка сахара может включать в себя введение 2- аминонуклеотида, 2-фторнуклеотида, 2-О-метилрибонуклеотида, 2-0- аллилрибонуклеотида, 2-0-Р-метоксиэтилрибонуклеотида, «замкнутого» нуклеотида (locked nucleic acid. LNA) и/или трицикло-ДНК нуклеотида. Связи между центральным атомом фосфора в фосфатной группе могут осуществляться, в том числе, через атом кислорода (обычный фосфат), атом азота (Ν3'-Ρ5' фосфорамид) или атом серы (3'- тиофосфат); соответственно, 3'- и/или 5'-конец нуклеозида может оканчиваться, в том числе, гидроксильной группой, как в природном нуклеозиде, З'-аминогруппой (Ν3'-Ρ5' фосфорамид) или З'-меркаптогруппой (З'-тиофосфат). Аналоги нуклеозидов также могут входить в состав модифицированных нуклеотидов или модифицированных ол игону кл еотид ов .

22

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0048] Нуклеотиды или олигонуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть выделены или получены в очищенном виде.

[0049] Термин «нуклеозид» используется для обозначения химического соединения, содержащего остаток сахара и остаток гетероциклического основания. Примеры нуклеозидов могут включать, в том числе, рибозу, 2-дезоксирибозу, 2-О-метилрибозу, арабинозу и т.п. Примеры гетероциклических оснований могут включать в себя, в том числе, тимин, урацил, цитозин, аденин, гуанин, пурин, гипоксантин, ксантин, 2- аминопурин, 2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин. 5-фторурацил, 5-хлорурацил. 5- бромурацил. 5-иодурацил. 5-трифторметилурацил. 5-фторцитозин. 5 -хлор цитозин. 5- бромцитозин. 5-иодцитозин. 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 5- пропинилурацил. 5-пропинилцитозин, 7-деазааденин, 7-деазагуанин, 7-деаза-8-азааденин, 7-деаза-8-азагуанин, изоцитозин, изогуанин и т.п.

[0050] Термин «аналог нуклеозида» используется для обозначения модифицированного нуклеозида, в котором остаток сахара заменен иной циклической или ациклической структурой. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменен иной циклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и трицикло-ДНК. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменен иной ациклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК, англ. peptide nucleic acids, PNA) и глицериновых нуклеиновых кислот (GNA).

[0051] Также, термин «аналог нуклеозида» используется для обозначения нуклеозида, содержащего химическую модификацию, например, заместитель в остатке сахара и/или в гетероциклическом основании. Примеры таких аналогов нуклеозидов могут включать в себя, в том числе, 2-замещенные 2-дезоксинуклеозиды, такие как 2-амино и 2- фтор, и рибонуклеозиды, такие как 2-О-метил, 2-О-аллил, 2-Ο-β- метоксиэтилрибонуклеозиды, «замкнутые» нуклеозиды (LNA) и т.п.

[0052] Термин «аналоги олигонуклеотидов» используется для обозначения модифицированных олигонуклеотидов, содержащих, в том числе, химическую модификацию фосфатной группы и/или же таких, в которых нуклеозиды заменены аналогами нуклеозидов. Примеры аналогов олигонуклеотидов могут включать, в том числе, тиофосфаты (PS), селенофосфаты, дитиофосфаты, фосфорамиды, боранофосфаты, фосфордиамидные производные морфолиноолигонуклеотидов (РМО), трицикло-ДНК и пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК, ΡΝΑ).

[0053] Термин «фосфатная группа» используется здесь для обозначения остатка фосфорной кислоты НЗР04, в котором один или более атомов водорода замещен

23

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) органическим радикалом с получением, соответственно, фосфомоноэфирной, фосфодиэфирной или фосфотриэфирной группы.

[0054] Термин «модифицированная фосфатная группа» используется здесь для обозначения фосфатной группы, в которой любой из атомов кислорода замещен любой химической группой. Примерами заместителей могут быть, в том числе, атомы серы или селена, иминогруппа (NR) или остаток борана (ВНЗ-). Предпочтительными примерами модифицированной фосфатной группы являются тиофосфатная группа и фосфорилгуанидиновая группа.

[0055] В зависимости от заместителей, фосфатная группа и модифицированная фосфатная группа могут быть хиральными. В случае, если стереохимическая конфигурация не обозначена, структура включает в себя как Rp, так и Sp конфигурацию, как раздельно, таки и в виде смеси: например, рацемической смеси (рацемата).

[0056] Указанные соединения также могут включать в себя более одного хирального центра. В таком случае следует считать, что структура охватывает все возможные энантиомеры и диастереомеры.

[0057] Термин «защищенный олигонуклеотид» используется здесь для обозначения олигонуклеотида или модифицированного олигонуклеотида, содержащего одну или более защитных групп.

[0058] Термин «незащищенный олигонуклеотид» используется здесь для обозначения олигонуклеотида или модифицированного олигонуклеотида, из состава которого были удалены одна или более защитных групп.

[0059] Упоминаемые в тексте нуклеозиды, нуклеотиды и олигонуклеотиды подразумевают как их защищенные производные, так и незащищенные производные.

[0060] Термин «защитная группа» обозначает химическую группу, которая используется для временного блокирования реакционного сайта в органическом соединении и может удаляться в определенных условиях. Примеры защитных групп могут включать, в том числе, ацетильную (Ас), бензоильную (Bz), изобутирильную (Ibu), т- бутилфеноксиацетильную (Тас), левулинильную (Lev), метильную (Me), β-цианэтильную (СЕ), аллильную (АН), о-хлорфенильную (o-QPh), 4,4'-диметокситритильную (DMTr), 4- метокситритильную (ММТг), т-бутилдиметилсилильную (TBDMS), триизопропилсилилоксиметильную (ТОМ) и другие группы.

[0061] Термин «линкер» используется здесь для обозначения химической группы для присоединения органического соединения к полимерному носителю, которая способна расщепляться в особых условиях с отщеплением соответствующего органического соединения от соответствующего полимерного носителя. Примеры линкеров могут

24

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) включать, в том числе, сукцинильный, дигликолильный, оксалильный, гидрохинон-0,0'- диацетильный (Q- линкер), фталоильный, 4,5-дихлорфталоильный, малонильный, глутарильный, диизопропилсилильный, 1, 1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-� �иильный и другие линкеры.

[0062] Термин «линкер» может также относиться к ненуклеотидным химическим группам, введённым в состав модифицированного олигонуклеотида (межнуклеотидные линкеры), или ненуклеотидным химическим группам, соединяющим нуклеотид с иной химической модификацией, например, флуоресцентной меткой или гасителем флуоресценции. Известные примеры линкеров включают, в том числе, остаток фосфата 1,2- додекандиола (DD).

[0063] Термин «полимерный носитель» используется здесь для обозначения полимерного носителя, используемого в твердофазном олигонуклеотидном синтезе. Примеры полимерных носителей могут включать, в том числе, стекло с контролируемым размером пор (CPG), полистирольные смолы, TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®, поливиниловый спирт, ацетат целлюлозы и т.п. Термин «полимерный носитель» используется также в отношении разновидностей подложек для параллельного олигонуклеотидного синтеза, независимо включая, без ограничений, диски из фильтровальной бумаги, мультипиновые системы, многолуночные планшеты и т.п.

[0064] Фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидов, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут использоваться для получения терапевтических олигонуклеотидов аналогично таким известным терапевтическим производным олигонуклеотидов, как siPHK [Angell & Baulcombe, EMBO J., 1997, 16, 3675; Voinnet & Baulcombe, Nature, 1997, 389, 553; Fire, A. et al, Nature, 1998, 391; Fire, A., Trends Genet., 1999, 15, 358, Sharp, Genes Dev., 2001, 15, 485; Hammond et al, Nature Rev. Genet., 2001, 2, 1110; Tuschl, ChemBioChem, 2001, 2, 239], рибозимы, ДНКзимы, аптамеры [Gould, L. et al, Science, 1990, 249, 505; патент WO 91/19813], антисмысловые (антисенс) олигонуклеотиды (ПНК, РМО, LNA, «гапмеры»). Олигонуклеотидные терапевтические агенты применяются для лечения ряда заболеваний, в том числе вирусных инфекций, рака, глазных болезней, в том числе возрастных, предотвращения нежелательной неоваскуляризации, заболеваний, вызванных расстройством сплайсинга, такими как мышечная дистрофия Дюшена, а также в качестве антихолестериновых средств. Опционально, терапевтический олигонуклеотид может использоваться в виде конъюгата с ковалентно-присоединенным пептидом, в том числе, для улучшения проникновения в клетки, например, как описано в патенте WO 2009/147368.

25

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0065] Соответственно, олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, предназначается для использования в медицине в качестве лекарственного средства или терапевтического агента. В другом применении олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, предназначается для получения медикамента или лекарственной формы для использования при лечении заболевания. В другом применении используется метод лечения заболевания, состоящий во введении в организм пациента олигонуклеотида, являющегося предметом настоящего изобретения, с целью лечения заболевания.

[0066] Олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, может входить в состав медикамента или лекарственной формы. Медикамент или лекарственная форма могут включать олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, в выделенном или очищенном виде, а также фармацевтически допустимые добавки.

[0067] Медикаменты или лекарственные формы, включающие олигонуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть введены в организм пациента различными способами, включая, в том числе, парентеральный, внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, пероральный и интраназальный. Медикаменты и лекарственные формы могут пребывать в жидком или твердом виде. Жидкие формы могут быть введены путем инъекции в соответствующую часть тела человека или животного.

[0068] Предпочтительно, введение осуществляется в терапевтически эффективном количестве (дозе), т.е. в количестве, достаточном для произведения терапевтически благотворного эффекта. Введенное количество (доза) и временной регламент введения будут зависеть от природы и тяжести заболевания. Соответствующие терапевтические решения, равно как и дозировки, находятся в компетенции практикующих врачей и, как правило, принимают во внимание вид заболевания, состояние пациента, способ введения и другие факторы, известные специалистам. Примеры соответствующих методов и протоколов можно найти в медицинской литературе, например, в справочнике [Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th Ed, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins].

[0069] Способы использования олигонуклеотидов, являющихся предметом настоящего изобретения, могут включать в себя как их применение in vitro, так и in vivo. Термин «in vitro» в данном случае подразумевает эксперименты с материалами, биологическими образцами, клетками и/или тканями в лабораторных условиях или в культурах клеток и/или тканей. В то же время термин «in vivo» в данном случае подразумевает эксперименты и процедуры с использованием живых многоклеточных организмов.

26

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0070] Объектами использования олигонуклеотидов, являющихся предметом настоящего изобретения, могут быть растения, животные, предпочтительно, млекопитающие, и, более предпочтительно, люди, в том числе пациенты мужского или женского пола.

[0071] Настоящее изобретение включает сочетание изложенных вариантов и предпочтительных аспектов, за исключением тех случаев, когда сочетание очевидно недопустимо или подчеркнуто непозволительно.

[0072] Заглавия разделов введены исключительно для организационных нужд и не должны быть интерпретированы как рамки, ограничивающие обсуждение материала.

[0073] Повсеместно в данном описании, включая последующую Формулу изобретения, за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное, выражение «включать» и вариации «включает» и «включая» подразумевают прибавление оговоренной целой части или стадии, или группы целых частей или стадий, но не исключение любой другой целой части или стадии, или группы целых частей или стадий.

[0074] Следует учитывать, что в данном Описании и сопутствующей Формуле изобретения употребленные форм единственного числа подразумевают также формы множественного числа, за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное. Интервалы могут быть выражены от «около» одного значения до «около» другого значения. В тех случаях, когда используется такой интервал, иной вариант применения может включать точные значения границ интервала. Аналогично, когда величины выражены приблизительно с использованием обозначения «около», следует понимать, что точные значения границ интервала составляют иной вариант применения.

[0075] Хотя данное изобретение было описано на примере конкретных вариантов применения, специалистам в данной области будут очевидны многочисленные изменения и дополнения, которые могут быть внесены в основные способы использования настоящего изобретения без отклонения от его духа и выхода за его рамки.

[0076] Вдобавок, многие изменения могут быть внесены с целью приспособления конкретной ситуации, материала, состава, процесса, стадии или стадий процесса, к объективному духу и охвату настоящего изобретения. Все подобные изменения рассматриваются как лежащие в пределах охвата приведенной Формулы изобретения.

[0077] Варианты применения настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы в виде Примеров со ссылками на сопутствующие Рисунки. Другие варианты и аспекты применений могут быть понятны специалистам в данной области. Все документы, цитируемые в тексте, включены для сравнения.

27

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ПРИМЕРЫ

[0078] Ниже следуют примеры, которые приводятся для иллюстрации технического применения данного изобретения.

Общие методы

[0079] Последовательности 2'-дезокси- и 2'-0-метил-ФГО были получены с помощью автоматического синтезатора ДНК/РНК ASM-800 компании «Биоссет» (Новосибирск, Россия) в масштабе 0.2 мкмоль по описанным методикам [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ 2014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014]. Олигонуклеотиды анализировали и выделяли обращенно-фазовой (оф) ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США) с колонкой Zorbax SB-C 18 (5 мкм) 4.6x 150 мм в градиенте ацетонитрила в 20 мМ ацетате триэтиламмония, рН 7 от 0 до 40% в течение 30 мин при скорости потока 2 мл/мин. Для контроля чистоты олигонуклеотидов, сохраняющих отрицательный заряд, использовали денатурирующий гель-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) с 20% метилен-бис-акриламида, с последующей визуализацией полосок путем окрашивания красителем Stains- АН. Молекулярные массы модифицированных олигонуклеотидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Bruker Reflex III Autoflex Speed (Германия) в варианте положительных или отрицательных ионов с использованием 3-гидроксипиколиновой кислоты в качестве матрицы либо масс- спектрометрии ESI LC-MS/MS на приборе Agilent G6410A (США) в режиме регистрации отрицательных или положительных ионов. Образцы готовили, растворяя олигонуклеотиды в буфере 20 мМ ацетат триэтиламмония в 60% водном ацетонитриле до концентрации 0.1 мМ. Объем анализируемого образца составлял 10 мкл. Анализ проводили с использованием в качестве элюента 80% водного ацетонитрила при скорости потока 0.1 мл/мин. Использовали стандартные параметры настройки масс-спектрометра. Молекулярные массы олигонуклеотидов рассчитывали, используя наборы экспериментальных значений m/z, определенные для каждого анализируемого образца.

[0080] Пептиды были синтезированы с помощью пептидного синтезатора Liberty компании СЕМ (США) в масштабе 0.1 ммоль согласно Fmoc/t-Bu схеме на полимерной подложке Fmoc-PAL-PEG-PS (Applied Biosystems). Ν-концевой остаток жирной кислоты (пальмитиновой или стеариновой) вводили при помощи 10 экв. РуВОР и 20 экв. DIEA в ДМФА. Пептиды отщепляли от подложки при обработке смесью 95% трифторуксусной

28

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) кислоты (ТФУ), 2.5% триизопропилсилана и 2.5% воды в течение 3 ч. Пептиды очищали с помощью офВЭЖХ на колонке Phenomenex Jupiter 10-μ С18 10x250 мм в градиенте ацетонитрила в 0.1% водной ТФУ от 0 до 40% за 30 мин при скорости потока 10 мл/мин. Молекулярные массы пептидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Voyager DE Pro Workstation компании Perseptive Biosystems (США) в режиме регистрации положительно заряженных ионов с использованием в качестве матрицы раствора 10 мг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитриле, содержащем 3% ТФУ.

[0081] Мышиные миобласты H2k mdx культивировали в культуральных флаконах, покрытых желатином (0.01%), при 33°С в атмосфере 10% С0 ₂ в среде DMEM (РАА Laboratories), содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS Gold, РАА Laboratories), 2% куриного эмбрионального экстракта (Seralab), 1% смеси антибиотиков пенициллина, стрептомицина и неомицина (PSN, Gibco) и 3 пг/мкл γ-интерферона (PeproTech). Клетки высевали в покрытые желатином (0.01%) 24-луночные планшеты до плотности 4х 10 ⁵ клеток/мл и инкубировали двое суток при 33°С в атмосфере 10% С0 ₂ как недифференцированные миобласты. Для дифференциации в мышечные волокна клетки далее инкубировали в среде DMEM с 5% лошадиной сыворотки (Sigma) и 1% PSN при 37°С в атмосфере 5% С0 ₂ в течение 5 суток. Дифференциацию клеток контролировали путем измерения уровня тропонина Т с помощью Вестерн блоттинга. Клетки инкубировали с олигонуклеотидами РМО, 2'-дезокси-ФГО или 2'-0-метил-ФГО в концентрации 1 мкМ или 5 мкМ, в отсутствие векторного пептида или в присутствии 5 мкМ пептида (5 экв.). Трансфекцию проводили в конечном объеме 500 мкл в течение 4 ч в среде OptiMEM. После инкубации с олигонуклеотидом клетки инкубировали в течение 20 ч в среде DMEM с 10% FBS при 37°С, дважды промывали PBS и лизировали с помощью 1 мл Trizol (TRI Reagent® RNA Isolation Reagent, Sigma). Суммарную РНК выделяли при помощи экстракции Trizol в соответствии с протоколом производителя. Количественное определение РНК проводили с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000с (ThermoFisher Scientific).

[0082] Эффективность пропуска экзона определяли при помощи метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР и анализом реакционных смесей методом гель-электрофореза в агарозе. Для ПЦР использовали набор GenAMP RNA PCR (Invitrogen Life Technology), 400 нг матрицы РНК и пару праймеров Exon20Fo 5 ' -С AGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3 ' и Exon20Ro 5'- TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3'. Для ПЦР использовали следующий цикл: первая стадия 30 мин при 42°С, 15 мин при 94°С и 5 мин при 5°С; вторая стадия 2 мин при 95°С, затем 30

29

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) циклов по 30 сек при 95°С, 1 мин при 58°С, 2 мин при 72°С и завершающее удлинение 10 мин при 72°С. Для гнездовой ПЦР использовали ДНК-полимеразу Amplitaq Gold (Invitrogen Life Technology) и пару праймеров Exon20Fi 5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3' и Exon20Ri 5 '-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3' . Использовали следующий цикл: 10 мин при 95°С, затем 22 цикла по 30 сек при 95°С, 1 мин при 58°С, 2 мин при 72°С и завершающее удлинение 10 мин при 72°С. Продукты разделяли путем электрофореза в 2.5% агарозном геле в 0.5% ТВЕ (100 В, 1 ч) с визуализацией полос окрашиванием красителем SYBR Gold (Molecular Probes). Результаты разделения документировали с помощью системы Fluor-S с охлаждаемой CCD камерой (BioRad) и обрабатывали с помощью программы Quantity One (BioRad). Степень пропуска экзона (%) рассчитывали как отношение площади пика мРНК с делецией 23 экзона (Δ23) к сумме площадей пиков полноразмерной пре-мРНК, мРНК Δ23 и мРНК Δ23+Δ22.

[0083] ПРИМЕР 1. Определение активности олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов, содержащих одновременно 1, 1,3,3-тетраметилгуанидиновые группы (Tmg) и тиофосфатные группы (PS), при коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.

[0084] Были синтезированы следующие последовательности 20-звенных олигонуклеотидов: контрольные олиго-2'-0-метилрибонуклеотид (2'-ОМе РО) М159 и 2'- ОМе PS-олигонуклеотид М560, и олиго-2'-0-метилрибонуклеотид М162, содержащий наряду с 14 отрицательно заряженными тиофосфатными (PS) группами с 5 '-конца четыре электронейтральные 1, 1,3,3-тетраметилфосфорилгуанидино вые группы (Tmg) с З'-конца, уменьшающие суммарный отрицательный заряд олигонуклеотида (табл. 1). При трансфекции олигонуклеотидов (1 мкМ, 4 ч) с помощью трансфицирующего реагента Lipofectamine 2000 в клетки мышечных волокон мыши H2k mdx, несущих мутацию в экзоне 23 гена дистрофина, 2'-ОМе РО-олигонуклеотид М159 не проявил активности, наибольшую активность (21% пропуска экзона) показал PS-олигонуклеотид М560, а активность олигонуклеотида М162 составила около от активности М560 (рис. 3). Это можно объяснить негативным влиянием снижения суммарного отрицательного заряда олигонуклеотида в случае Ml 62 на образование комплекса с катионным липидом Lipofectamine 2000. В то же время, без трансфицирующего реагента (т.е. в условиях гимноза) в течение 24 ч в присутствии 10% FBS Ml 62 в более высокой концентрации (5 мкМ) показал примерно вдвое большую активность, чем М560 (рис. 4).

30

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0085] ПРИМЕР 2. Определение активности олигодезоксирибо- и олиго-2'-0- метилрибонуклеотидов, содержащих 1,3-диметил-2-имидазолидиниминогр� �ппы (Dmi) по всем межнуклеотидным положениям, при коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.

[0086] Для биологических исследований были использованы производные олигодезокси- и олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов М634 и М551, соответственно. Оба олигонуклеотида содержали Dmi-группы, уменьшающие суммарный отрицательный заряд (рис. 2, в). Была изучена активность новых олигонуклеотидных производных, содержащих фосфорилгуанидиновые Dmi-группы в 2-дезоксирибонуклеотидном остове и 2'-0- метилрибонуклеотидном остове в экспериментах по коррекции сплайсинга мутантной пре- мРНК дистрофина с пропуском экзона 23 в культуре мышиных мышечных волокон Н2к mdx. Последовательности олигонуклеотидов приведены в табл. 2. В качестве положительного контроля был использован морфолиновый олигонуклеотид (РМО) 5'- GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT как в отсутствие всякого трансфекционного агента, так и в присутствии 5 мкМ векторных пептидов Pal-RXR4 и St-STl (табл. 3). Анализ продуктов ОТ-ПЦР суммарной РНК, выделенной из мышечных клеток после инкубации с антисмысловыми олигонуклеотидами (рис. 6), показал, что как в отсутствие трансфекционного реагента при концентрациях олигонуклеотида 1 мкМ и 5 мкМ, так и в присутствии 5 мкМ векторного пептида ФГО М551 с остовом на основе 2'-ОМе-РНК проявил антисмысловую активность на таком же или несколько более высоком уровне, чем контрольный РМО (рис. 7). В то же время ФГО М634 с остовом на основе ДНК показал значительно меньшую активность, что может быть связано с его меньшим сродством к РНК, чем у 2'-метил-ФГО. При этом длина обоих ФГО составляла 20 нт, в то время как у РМО - 25 нт.

[0087] ПРИМЕР 3. Конъюгация фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с пептидом при помощи «клик»-химии.

[0088] 4-Азидобутильную группу вводили на 5'-конец полимерно-связанного ФГО

(1) путём конденсации с коммерческими 6-флуоресцеиновым амидофосфитом (Glen Research 10-1964) или фосфорилирующим реагентом II (Glen Research 10-1901) с получением 2-цианэтилфосфитных производных (2а) или (2Ь), соответственно (рис. 9). Полученные фосфиты после реакции Штаудингера с 1,4-диазидобутаном [Стеценко Д. А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ N° 2014117293, приоритет от 29.04.2014], 5'-детритилирования, отщепления от полимерного носителя и удаления

31

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) защитных групп превращали в соответствующие 1Ч-(4-азидобутил)фосфорамидные производные ФГО, которые выделяли офВЭЖХ, как описано выше (см. раздел Общие методы). Молекулярные массы ФГО определяли с помощью масс-спектрометрии ESI (табл. 4).

[0089] Конъюгацию азидных производных ФГО 4Ь (Об и 07) с алкинильным производным векторного пептида Pip6a проводили в соответствии с опубликованным протоколом [Ustinov A.V., Dubnyakova V.V., Korshun V.A., Tetrahedron, 2008, 64, 1467- 1473]. К 15 мкл 0.733 мМ раствора азид-модифицированного олигонуклеотида в воде было добавлено 12 мкл 0.916 мМ раствора алкинилированного пептида в диметилсульфоксиде (ДМСО). Реакцию проводили при 5 -кратном избытке пептида путём добавления 10 мкл водного раствора CuS0 ₄ (550 мМ, 50 экв.), 4.4 мг ТВТА (50 экв.), 10 мкл водного раствора аскорбиновой кислоты (840 мМ, 50 экв.) и 20 мкл 0.2 М ацетата триэтиламмония (ТЕАА), рН 7. После встряхивания реакционной смеси в течение 12 ч при комнатной температуре конъюгат в виде основного пика выделяли с помощью ионообменной хроматографии.

[0090] ПРИМЕР 4. Конъюгация фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с пептидом при помощи фрагментной конденсации в растворе.

[0091] Пептид Pip6a (табл. 6) получали твердофазным синтезом по Fmoc-схеме с помощью пептидного синтезатора MultiPep (Intavis AG, ФРГ). ФГО 7a,b (250 нмоль) растворяли в 100 мкл сухого DMSO. 100 мМ раствор пептида, 300 мМ растворы TSTU и DIPEA в NMP смешивали в пропорции 1 :4:3,8: 12 по отношению к олигонуклеотиду для предварительной активации пептида с образованием Ν-гидроксисукцинимидного эфира 9 (рис. 11). Смесь встряхивали на шейкере и оставляли на 30 мин при комнатной температуре, затем прибавляли к раствору ФГО в DMSO. Конъюгацию проводили при 37°С в течение 4- 5 ч, останавливали реакцию прибавлением 3 объемов дистиллированной воды и выделяли пептидный конъюгат 10а или 10b ионнообменной (ио) ВЭЖХ (рис. 12). Выделенную фракцию обессоливали на мембранном фильтре Amicon Ultra- 15 Centrifugal filters Ultra 3k (Merck Millipore, США) согласно протоколу производителя и обессоленный раствор пептидного конъюгата в воде лиофилизовали в течение 16 ч. Выход конъюгации составлял 25-50% по олигонуклеотиду (см. рис. 13). Структура конъюгатов была подтверждена с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (рис. 14).

32

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)