Campo da invenção

[001] A invenção refere-se de forma geral à amplificação e detecção de ácidos nucleicos. Particularmente, são providos métodos, oligonucleotídeos e kit de diagnóstico para confirmar e discriminar simultaneamente, em uma única uma etapa, os agentes etiológicos das meningites bacterianas, mais especificamente, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae.

Antecedentes da Invenção

[002] As meningites bacterianas são um problema de saúde pública mundial. A meningite é uma infecção grave e causa inflamação nas membranas que revestem o cérebro afetando o sistema nervoso central. Os três principais agentes etiológicos das meningites bacterianas são a Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae, representando mais de 80% dos casos de meningites bacterianas. Além de meningite, esses agentes podem causar doença invasiva ao invadir a corrente sanguínea, podendo estar essa associada ou não à meningite. Em casos de suspeita de meningite, amostras de sangue ou líquor (LCR) são coletadas e analisadas por métodos laboratoriais microbiológicos ou imunológicos. A detecção rápida do agente etiológico facilita a escolha do tratamento do paciente levando a um melhor prognóstico. Antibióticos profiláticos são administrados aos contatos do paciente para reduzir a transmissão e disseminação da infecção. Exames laboratoriais convencionais podem levar mais de 36 horas para o diagnóstico a partir de um material clínico suspeito e um grande número de resultados falso negativos podem ser liberados pela natureza fastidiosa dos agentes etiológicos, dificultando sua detecção pelos métodos convencionais. Por essas razões, o diagnóstico rápido dessas infecções é fundamental para se determinar o tratamento adequado evitando consequências graves para o paciente e auxiliando o monitoramento epidemiológico.

[003] Os três principais agentes etiológicos das meningites bacterianas (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae ) são caracterizados como bactérias de difícil cultivo e detecção em material clínico, pelos métodos laboratoriais convencionais. Os agravos causados por esses patógenos são considerados muito graves com evolução rápida e 20% de letalidade ou sequelas como surdez, lesões cerebrais e amputação de membros ou extremidades. Por essas razões o diagnóstico rápido desses agentes é de extrema importância para o manejo rápido dos pacientes possibilitando um melhor prognóstico. Alguns métodos de diagnóstico molecular já foram desenvolvidos para a detecção desses patógenos. Esses métodos são baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) podendo ser da forma convencional ou pela PCR convencional (qPCR), mais sensível, sendo o sistema Taqman o mais utilizado. O sistema Taqman utiliza os mesmos reagentes da PCR convencional, com a adição de uma sonda fluorescente para indicar a presença do alvo e, consequentemente, o diagnóstico positivo. Essas sondas têm um custo bastante elevado se comparado aos outros reagentes utilizados na reação e por serem três alvos distintos, é necessária a utilização de três sondas diferentes, encarecendo ainda mais o sistema.

[004] Existe, portanto, na técnica, uma necessidade de um método de diagnóstico rápido e economicamente efetivo, que permita a detecção e discriminação dos agentes etiológicos acima mencionados.

[005] Os presentes inventores desenvolveram um método mais económico e rápido, baseado na PCR em tempo real. [006] A presente invenção consiste, portanto, no desenho de iniciadores para detecção e discriminação dos agentes etiológicos das meningites bacterianas Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae por PCR em tempo real (qPCR). Estes iniciadores e sondas compõem um protocolo para detecção simultânea dos agentes etiológicos anteriormente citados, utilizando a metodologia de qPCR.

[007] Os principais benefícios da tecnologia são: a possibilidade de uma identificação rápida dos agentes etiológicos das meningites bacterianas, pela PCR em tempo real, além do melhor prognóstico para os pacientes. Ainda, é também proporcionado maior alcance para exame de diagnóstico de meningites bacterianas, por apresentar custo potencialmente menor que o atualmente utilizado. Impende comentar que apesar da drástica redução de custos proporcionada pelos métodos e kits da presente invenção, a qualidade da análise é mantida com alta sensibilidade e especificidade.

[008] Assim, a implementação da tecnologia aqui descrita pode significar o atendimento à necessidade por metodologias para a conclusão segura do diagnóstico, com alta especificidade e sensibilidade.

[009] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes a seguir.

Sumário da Invenção

[0010] Em um aspecto, a invenção provê oligonucleotídeos capazes de detectar o DNA dos agentes etiológicos das meningites bacterianas de forma diferencial.

[0011] Em um aspecto particular, a invenção provê iniciadores para serem utilizadas no método da presente invenção.

[0012] Em um aspecto particular, a invenção provê sondas para serem utilizadas no método da presente invenção.

[0013] Em um aspecto particular, os iniciadores utilizados na detecção do DNA de N. meningitidis tem como gene alvo o gene nspA. Em um aspecto mais específico, os iniciadores para detecção do gene nspA são mostrados nas SEQ ID NOs: 1 e 2.

[0014] Em um aspecto particular, os iniciadores utilizados na detecção do DNA de H. influenza tem como gene alvo o gene P6. Em um aspecto mais específico, os iniciadores para detecção do gene P6 são mostrados nas SEQ ID NOs: 3 e 4.

[0015] Em um aspecto particular, os iniciadores utilizados na detecção do DNA de S. pneumoniae tem como gene alvo o gene ply. Em um aspecto mais específico, os iniciadores para detecção do gene ply são mostrados nas SEQ ID NOs: 5 e 6.

[0016] Em uma concretização, o oligonucleotídeo adequado como sonda é marcado com uma marcação detectável, preferencialmente, um grupamento fluorescente, compreendendo um par de fluoróforo doador e um quencher.

[0017] Em um outro aspecto particular, a sonda para detecção de N. meningitidis tem a sequência mostrada em SEQ ID NO: 7.

[0018] Em um outro aspecto particular, a sonda para detecção de H. influenzae tem a sequência mostrada em SEQ ID NO: 8.

[0019] Em um outro aspecto particular, a sonda para detecção de S. pneumoniae tem a sequência mostrada em SEQ ID NO: 9.

[0020] Em um outro aspecto adicional, é provido um método para detecção e discriminação dos agentes etiológicos das meningites bacterianas, compreendendo as etapas de:

a) produzir pelo menos um amplicon usando pelo menos dois oligonucleotídeos iniciadores, ditos oligonucleotídeos como definidos acima;

b) e detectar pelo menos um amplicon.

[0021] Em uma concretização opcional, o amplicon é detectado através de pelo menos um oligonucleotídeo sonda.

[0022] Em uma concretização opcional, o amplicon é detectado através das diferenças de temperatura de melting (TMj.

[0023] Em uma modalidade particular, o amplicon de N. meningitidis apresenta uma TM~ 85,8°C Em uma outra modalidade o amplicon de H. influenzae apresenta uma TM ~80°C. Em uma outra modalidade o amplicon de S. pneumoniae apresenta uma TM ^~ 77°C.

[0024] Em uma concretização do referido método, a dita etapa de produzir pelo menos um amplicon compreende pelo menos um de amplificação por PCR uniplex, multiplex, qualitativo, ou em tempo real.

[0025] Em outra concretização, o método permite discriminar entre infecções por N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae.

[0026] Um outro aspecto da invenção diz respeito a um kit para diagnóstico e discriminação de infecção por N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, compreendendo: a) pelo menos um par de oligonucleotídeos adequado como iniciador; e/ou b) opcionalmente pelo menos um oligonucleotídeo adequando como sonda; e c) opcionalmente, instruções para uso.

[0027] Em uma concretização, o kit da invenção ainda inclui oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar e discriminar os agentes etiológicos das meningites bacterianas. Em uma concretização adicional, estes agentes etiológicos bacterianos são selecionados de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae.

[0028] Em uma modalidade opcional, o kit inclui oligonucleotídeos sonda que permitem a detecção do amplicon obtido a partir da amplificação utilizando os oligonucleotídeos iniciadores da presente invenção.

[0029] Adicionalmente, em uma concretização, o kit da invenção ainda inclui um controle negativo e/ou um controle positivo de reação.

Breve Descrição das Figuras

[0030] Figura 1. PCR pelo sistema Taqman uniplex com N. meningitidis para determinação do limite de detecção (LD). IA: 242 ng/pL e 242 pg / pL. 1B: 2,42pg/pL e 242 fg/pL.

[0031] Figura 2. PCR pelo sistema Taqman uniplex com H. influenzae para determinação do LD. 2A 109 ng/pL e 2B: 1,09 pg/pL e 109 fg/pL

[0032] Figura 3. PCR pelo sistema Taqman uniplex com S. pneumoniae para determinação do LD. 3A: 0,479 ng/ pL. 3B:479 fg/ pL e 200 fg/ pL

[0033] Figura 4. PCR pelo sistema Taqman multiplex com N. meningitidis para determinação do LD com 2,42 ng/pL, 242 pg/pL e 242 fg/pL.

[0034] Figura 5. PCR pelo sistema Taqman multiplex com H. influenzae para determinação do LD com 1,09 ng/pL, 1,09 pg/pL e 200 fg/pL.

[0035] Figura 6. PCR pelo sistema Taqman multiplex com S. pneumoniae para determinação do LD com 0,479 ng/pL, 4,79 pg/pL e 200 fg/pL.

[0036] Figura 7. PCR pelo sistema HRM uniplex com N. meningitidis para determinação do LD com 2,42 ng/pL, 2,42 pg/pL e 242 fg/pL.

[0037] Figura 8. PCR pelo sistema HRM uniplex com H. influenzae para determinação do LD com l,09ng/pL, l,09pg/pL e 200fg/pL.

[0038] Figura 9. PCR pelo sistema HRM uniplex com S. pneumoniae para determinação do LD com 0,47 ng/pL, 479 fg/pL e 200 fg/pL.

[0039] Figura 10. PCR pelo sistema HRM uniplex/multiplex de S. pneumoniae INCQS 00543 (BinC), H influenzae INCQS 00434 (BinB) e N. meningitidis INCQS 00140 (BinA), demostrando as curvas padrão de dissociação (TM) para os três alvos. A detecção de cada agente está diretamente associada às respectivas temperaturas de 77°C, 80°C e 85,8°C.

[0040] Figura 11. PCR pelo sistema Taqman multiplex com detecção de N meningitidis de referência (INCQS 00140) a partir de material clínico, indicando a detecção do agente etiológico pela correlação com a especificidade dos oligos e do comprimento de onda do canal do fluoróforo

(FAM).

[0041] Figura 12. PCR pelo sistema Taqman multiplex com detecção de S. pneumoniae de referência (INCQS 00543) a partir de material clínico, indicando a detecção do agente etiológico pela correlação com a especificidade dos oligos e do comprimento de onda do canal do fluoróforo

(Cy5).

[0042] Figura 13. PCR pelo sistema HRM multiplex com detecção de

S. pneumoniae de referência (INCQS 00543) e a partir de material clínico, indicando a detecção do agente etiológico pela correlação com a temperatura de melting (TM=77°C).

[0043] Figura 14. PCR pelo sistema HRM multiplex com detecção de

N. meningitidis de referência (INCQS 00164) e a partir de material clínico, indicando a detecção do agente etiológico pela correlação com a temperatura de melting (TM ^~ 85,8°C).

[0044] Figura 15. PCR pelo sistema multiplex por HRM com controles negativos de acordo com a Tabela 1 (a seguir). Os oligonucleotídeos apresentaram especificidade para os microrganismos alvo, não havendo interferência quando utilizados controles negativos.

Descrição Detalhada da Invenção

[0045] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular são bem conhecidas de um técnico no assunto, podendo ser encontradas, por exemplo, em Ausubel et ai, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1987- 2008), incluindo todos os suplementos; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^a edição, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações.

[0046] A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo“cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[0047] A invenção aqui descrita refere-se a novos oligonucleotídeos para amplificação, detecção, diferenciação dos agentes etiológicos das meningites bacterianas, particularmente, N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae e métodos e kits relacionados. Mais especificamente, a presente invenção provê oligonucleotídeos, incluindo iniciadores e, opcionalmente, sondas, que são adequados para a detecção e discriminação de A. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae. _

Oligonucleotídeos e kits de diagnóstico

[0048] “Oligonucleotídeo” refere-se a qualquer polímero curto de nucleotídeos, em que os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos, dideoxirribonucleotídeos, nucleotídeos degenerados, e similares. Ditos oligonucleotídeos são preferencialmente fita simples. O comprimento de ditos oligonucleotídeos pode variar, e é usualmente menor que 150 nucleotídeos (nt), preferencialmente, na faixa de 10-100 nt, mais preferencialmente na 10-60 nt, ainda mais preferencialmente de 13-50 nt. Podem ainda apresentar modificações químicas, tais como uma etiqueta (“tag”) ou uma marcação, por exemplo, fluorescente, radioativa, biotinilada, DIG (digoxigenina), e similares. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser tanto forward (senso) quanto reverso (antisenso). [0049] Em um aspecto, os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção incluem iniciadores e, opcionalmente, sondas. A não ser que seja informado em contrário, as sequências são apresentadas na direção de 5’ para 3’. Ditos oligonucleotídeos podem estar em várias formas, por exemplo, em solução/suspensão em um solvente adequado e em uma concentração desejada, secos ou liofilizados. O técnico no assunto tem conhecimento dos solventes, concentrações e condições de estocagem adequadas para os oligonucleotídeos da invenção. Em particular, o técnico no assunto tem conhecimento de como preparar ditos oligonucleotídeos como soluções de estoque. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem apresentar vários graus de pureza, que podem ser avaliados por um técnico no assunto, por exemplo, através de cromatografia por HPLC.

[0050] Além disto, deve ser aqui lembrado que, apesar das funções preferidas poderem ser mencionadas em relação a alguns oligonucleotídeos, é óbvio que um dado oligonucleotídeo pode assumir diversas funções, e pode ser utilizado em diferentes formas de acordo com a presente invenção. Como é de conhecimento do técnico no assunto, em algumas situações, a sequência de um iniciador pode ser usada como sonda e vice-versa, além de ser aplicável em procedimentos de hibridização, detecção etc. Assim, observa-se que os produtos de acordo com a presente invenção, especialmente, inter alia, os oligonucleotídeos, não estão limitados aos usos aqui mostrados, mas, ao contrário, os usos devem ser interpretados de forma ampla, independente do uso aqui indicado.

[0051] Além disto, quando um oligonucleotídeo é descrito como sendo útil como sonda capaz de se ligar a um amplicon, o técnico no assunto também entende que a sequência complementar deste oligonucleotídeo é igualmente útil como uma sonda para se ligar ao mesmo amplicon. O mesmo ocorre com as sequências descritas como úteis como iniciadores. Adicionalmente, é também óbvio que qualquer iniciador adequado para um protocolo multiplex pode ser também, dentro do significado e escopo da presente invenção, ser utilizado em um protocolo singleplex. O mesmo se aplica a um iniciador adequado para um protocolo de PCR em tempo real, que pode ser usado em um protocolo de PCR convencional, dentro do significado da presente invenção.

[0052] Os termos “hibridizar” e “anelar” são usados de forma intercambiável e significam a interação de pareamento de bases de um ácido nucleico com outro ácido nucleico que resulta na formação de uma fita dupla, tripla, ou outras estruturas mais complexas. Em algumas concretizações, a interação primária é específica, por exemplo, C/G e A/T, pela ligação por pontes de hidrogénio.

[0053] O técnico no assunto, a este respeito, entende que os oligonucleotídeos da presente invenção, isto é, os iniciadores e sondas, não precisam ser completamente complementares a uma parte da sequência do alvo. O iniciador pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de um iniciador. O mesmo se aplica a uma sonda, ou seja, uma sonda pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de uma sonda. Portanto, um iniciador ou uma sonda, em uma concretização, não necessita ser completamente complementar à sequência alvo. Em uma concretização, o iniciador ou a sonda pode se hibridizar ou anelar com uma parte do alvo para formar uma fita dupla. As condições de hibridização de um ácido nucleico são descritas por Joseph Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Haymes et al, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Assim, uma vez que não é necessário haver complementariedade completa para ocorrer anelamento, um técnico no assunto entenderá que as sequências de iniciadores e de sondas aqui descritas podem ser modificadas até certo grau sem a perda de suas utilidades como iniciadores e sondas específicas para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae.

[0054] Com relação à definição de“iniciador”, um técnico no assunto sabe que inclui qualquer oligonucleotídeo fita simples capaz de se anelar a um molde alvo complementar, em condições de estringência adequada, e que serve como ponto de início para a síntese de um produto de extensão (amplicon) a partir do iniciador, pela elongação da fita por uma DNA polimerase em condições adequadas. Estas condições incluem 4 tipos diferentes de deoxinucleosídeos trifosfatos e DNA polimerase ou transcriptase reversa em condições de temperatura adequadas e em uma solução tampão adequada. O comprimento do iniciador pode variar de acordo com diversos fatores, mas o comprimento típico de um iniciador é de 10-50 nt, preferencialmente 15-30 nt, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nt. De acordo com a presente invenção, é preferível que cada iniciador tenha de 15-30 nt. Os iniciadores forward e reverse são iniciadores que se ligam, respectivamente, a uma extremidade 3’ e a uma extremidade 5’ de uma região específica do alvo que é amplificado pela reação de PCR.

[0055] Os oligonucleotídeos específicos para cada espécie para utilização no sistema Taqman e HRM de PCR em tempo real, foram desenhados a partir das sequências dos genes-alvo exclusivos de cada microrganismo com o auxílio do software Oligo ArchitectSIGMA (http://www.oligoarchitect.com/). As sequências foram obtidas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

[0056] Preferencialmente, estes iniciadores são, mas não limitados particularmente a um iniciador compreendendo pelo menos 10 a 15 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 1 a 6, e suas sequências complementares. Os iniciadores das SEQ ID Nos: 1 e 2 são capazes de amplificar uma região do gene nspA de N. meningitidis enquanto que os iniciadores das SEQ ID Nos: 3 e 4 são capazes de amplificar uma região do gene P6 de H. influenzae enquanto que os iniciadores das SEQ ID Nos: 5 e 6 são capazes de amplificar uma região do gene ply de S. pneumoniae. O iniciador também pode consistir de qualquer fragmento das sequências de SEQ ID Nos: 1 a 6 capazes de amplificar os genes alvos das espécies de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, e suas sequências complementares.

[0057] Em uma modalidade alternativa, é utilizada uma sonda para detecção do amplicon obtido com a PCR. A definição de sonda também é conhecida por um técnico no assunto, e inclui qualquer oligonucleotídeo que seja capaz de hibridizar com uma sequência alvo complementar em condições de hibridização adequadas. Uma vez que a sonda é marcada, ela pode ser usada para detectar a presença de determinadas sequências nucleotídicas. As sondas podem ser preparadas na forma de fita simples de DNA, fita dupla de DNA, de RNA ou híbrido DNA-RNA. O comprimento típico de uma sonda é de 10-60 nt, preferencialmente, 15-55 nt, mais preferencialmente 20-50 nt, mais preferencialmente 30-45 nt, ainda mais preferencialmente 10-30 nt. Assim, de acordo com a presente invenção, a sonda pode incluir ou compreender pelo menos 8-15 nucleotídeos consecutivos das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 7 a 9. A sonda também pode compreender ou consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 7 e 9, e suas sequências complementares.

[0058] Cada sonda foi marcada com um fluoróforo diferente para que pudessem ser utilizadas simultaneamente em um sistema multiplex. Para cada fluoróforo foi utilizado o quencher adequado.

[0059] Vários formatos de sondas podem ser utilizados para realizar uma PCR em tempo real, como as sondas marcadas com fluorescência. Mais especificamente, as sondas podem ser do tipo FRET (fluorescence resonance energy transfer) que incluem, mas não estão limitadas a sondas do tipo TaqMan™, Molecular Beacon™, Scorpion™, e LUX™. Em uma forma de concretização preferida, as sondas de acordo com a invenção são do tipo TaqMan™.

[0060] Mais especificamente, com relação à sonda TaqMan™, um oligonucleotídeo, cuja região 5’ terminal é modificada com um fluoróforo e a região 3’ terminal é modificada com um quencher, é adicionada à reação de PCR. Também se entende que é possível ligar o fluoróforo na região 3’ terminal e o quencher na região 5’ terminal. Os produtos de reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5’ -> 3’ da DNA polimerase. Os fluoróforos, que se referem a compostos fluorescentes que emitem luz com a excitação por luz tendo um comprimento de onda mais curto que a luz que é emitida, podem ser, mas não estão limitados a, FAM, TAMRA, VIC, JOE, TET, HEX, ROX, RED610, RED670, NED, Cy3, Cy5, e Texas Red. Os quenchers podem ser, mas não estão limitados ao, 6- TAMRA, BHQ-1,2,3 e MGB-NFQ. A escolha do par f 1 u o r óf o ro- qu en ch e r pode ser feita de forma que o espectro de excitação do quencher tenha uma sobreposição com o espectro de emissão do fluoróforo. Um exemplo é o par FAM-TAMRA, FAM-MGB, VIC-MGB e assim por diante. Um técnico no assunto saberá reconhecer outros pares apropriados.

[0061] Em uma forma de concretização preferencial de acordo com a invenção, as propriedades de espectro de ditas sondas são escolhidas de forma que uma sonda não interfira com a outra. Em particular, quando as sondas são usadas em reações multiplex, cada sonda terá o seu próprio fluoróforo sendo espectral e significativamente diferente de outra sonda, isto é, os espectros de absorção/emissão das diferentes sondas são essencialmente não-sobrepostos. Isto permite, de forma vantajosa, a detecção de cada sonda individualmente, já que os sinais individuais não interferem uns com os outros durante a detecção. [0062] A fluorescência emitida durante a reação de amplificação do ácido nucleico alvo é medida com o objetivo de monitorar o acúmulo de produtos de amplificação específicos. O sinal de fluorescência é proporcional à quantidade do amplicon específico produzido. Na presença das sequências alvos de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, a fluorescência irá aumentar. Na ausência das sequências alvos, a fluorescência manter-se-á consistentemente baixa ao longo da reação.

[0063] Em uma forma de concretização preferencial, os fluoróforos são selecionados do grupo consistindo em HEX, Cys-5 e FAM.

[0064] Em uma forma de concretização preferencial, os quenchers são selecionados do grupo consistindo em BHQ-1 e 3.

[0065] Além disto, em uma forma de concretização, para prover um padrão (controle interno) para determinar a extração do ácido nucleico de uma amostra biológica a ser testada, potencialmente compreendendo a sequência alvo de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, ou para determinar a presença ou ausência de potenciais inibidores de reação, podem- se utilizar iniciadores capazes de amplificar, e sondas capazes de detectar, amplicons resultantes da amplificação de sequências endógenas humanas. Exemplo não- limitante é utilizar iniciadores que tenham como alvo, por exemplo, os RNAs da beta-globina humana, beta-actina, RNase e GAPDH.

[0066] Ainda, para prover um controle positivo para a amplificação dos alvos e/ou para facilitar a quantificação dos agentes etiológicos de interesse em uma dada amostra biológica a ser analisada, um controle positivo externo pode ser incorporado. Na presente invenção, pode-se utilizar cepas de referência de diferentes sorogrupos e sorotipos, uma amostra de ácido nucleico contendo cópias dos alvos de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, por exemplo, um cassete ou vetor compreendendo a sequência alvo a ser amplificada. Ilustrativamente, e de forma não limitativa, os sorotipos e sorogrupos de referência utilizados pelos presentes inventores são listados na Tabela 1, a seguir, onde são também listados os micro-organismos de referência a serem detectados.

[0067] Da mesma forma, pode-se incorporar um controle negativo de reação. Este controle pode ser uma amostra de ácido nucleico que não contenha nenhuma cópia do gene alvo de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, por exemplo, amostras extraídas de outras espécies bacterianas de referência diferentes de N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae. Ilustrativamente, mas de forma não limitativa, os presentes inventores utilizaram como micro-organismos de referência para o controle negativo Neisseria perflva (ATCC11076), Moraxella catarralis (ATCC25238), Streptococcus agalactiae (ATCC 13813), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Listeria monocytogenes (ATCC 15313), Acinetobactersp. (ATCC 14293) ou Escherichia coli (ATCC 11775).

[0068] Um outro aspecto da invenção é um kit usado para diagnosticar e diferenciar infecções causadas por A. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, de forma simultânea, compreendendo pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos. Por “conjunto de oligonucleotídeos” entende-se qualquer combinação compreendendo pelo menos um oligonucleotídeo, preferencialmente, pelo menos dois, por exemplo, de 2 a 20 oligonucleotídeos. Dito conjunto pode, por exemplo, compreender pelo menos um iniciador, ou pelo menos um par de iniciadores. Alternativamente, o dito conjunto por compreender, além de pelo menos um iniciador ou pelo menos um par de iniciadores, pelo menos uma sonda. Ditos oligonucleotídeos podem ser mantidos separados, ou parcialmente misturados, ou totalmente misturados.

[0069] Preferencialmente, dito kit compreende pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos de acordo com a invenção, desenhados especificamente para N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae. Os ditos oligonucleotídeos podem ser mantidos tanto separadamente, ou parcialmente misturados, ou totalmente misturados. Os oligonucleotídeos podem ser providos na forma seca, ou solubilizados em um solvente adequado, de acordo com o conhecimento da arte. Por exemplo, solventes adequados incluem TE, água ultrapura, e similares.

[0070] Em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção pode também conter reagentes adicionais adequados para a reação de amplificação, incluindo água, água livre de nuclease, água livre de RNase, água livre de DNase, água ultrapura, sais (tais como sais de magnésio, potássio), tampões (como os tampões convencionais de PCR, conhecidos na arte), enzimas, incluindo polimerases termoestáveis, como Taq, Vent, Pwo, Pfu, transcriptase reversa, e similares, nucleotídeos como deoxinucleotídeos, dideoxinucleotídeos, dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, outros reagentes, como aditivos, inibidores de RNase ou DNase, e polinucleotídeos tais como poliT, polidT, e outros oligonucleotídeos, como iniciadores e sondas para outros patógenos, e para controles internos, como um controle positivo (ex. beta-globina humana) ou um fago (ex. MS2). Os reagentes podem ser providos em uma forma concentrada para diluição para uma concentração apropriada pelo usuário final. Ainda, pelo menos parte dos reagentes pode ser provida na forma de pré-mix.

[0071] Ditos reagentes podem estar acomodados em recipientes, que para os fins da presente invenção incluem, mas não se limitam a, microtubos, tubos, placas de PCR com diferentes quantidades de poços, chips, ou qualquer outro meio adequado e inerte onde a reação de amplificação possa ocorrer, e que não reaja com os fluidos e soluções da presente invenção. Além disto, o recipiente pode ser ainda rotulado e identificado, por exemplo, com cores, para evitar a confusão e prover facilidade de uso para um técnico no laboratório.

[0072] Ainda, em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção contém instruções para o uso do mesmo. Ditas instruções podem estar em um folheto, cartão, ou similares. Ditas instruções podem estar sob duas formas: uma detalhada, trazendo informações exaustivas com relação ao kit e ao uso do mesmo, possivelmente também incluindo dados de literatura; e outra simples, na forma de um guia rápido, trazendo informações essenciais necessárias para o uso do kit.

[0073] Em uma forma preferida, dito kit é um kit de diagnóstico, especialmente um kit de diagnóstico in vitro. Mais preferencialmente, o dito kit é um kit para diagnóstico e diferenciação de N meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae.

[0074] Em outra forma de concretização da presente invenção, o kit diagnóstico pode ainda incluir um kit para extração e isolamento de ácidos nucleicos a partir de uma amostra biológica. Dito kit para extração pode compreender um tampão de lise, um tampão de lavagem e um tampão de eluição. O kit de extração pode ainda ser provido com recipientes vazios e colunas de adsorção para extração e isolamento de ácidos nucleicos.

[0075] Polinucleotídeos de agentes etiológicos das meningites, mais especificamente, N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae, são os alvos ou a fonte do alvo para a reação de amplificação da presente invenção. A expressão “sequência alvo”, ou simplesmente “alvo”, se refere a uma sequência de ácido nucleico que serve como um molde para a amplificação em uma reação de PCR. Estas sequências de ácido nucleico podem conter deoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou seus análogos. A sequência pode ser um gene ou fragmento de gene, mRNA, cDNA, DNA total isolado, RNA total isolado, e similares.

[0076] Mais especificamente, as sequências-alvo da presente invenção estão são transcritas a partir do gene nspA de N. meningitidis, gene P6 de H. influenzae, e gene ply de S. pneumoniae.

[0077] Em uma concretização, a sequência alvo está presente em uma amostra de material biológico coletada a partir de um indivíduo. Por “amostra”, portanto, entende-se qualquer substância ou material biológico que possa conter algum agente etiológico de meningite bacteriana, particularmente, uma ou mais cepas de N. meningitidis, H. influenzae ou S. pneumoniae. As mostras incluem, mas não está limitada a sangue, plasma, soro, líquor e similares.

[0078] Os procedimentos para a extração e purificação de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Exemplos de métodos para extrair ácidos nucleicos a partir de sangue total são ensinados, por exemplo, em Casareale et al. (Genome Res., 2: 149-153, 1992) e na Patente U.S. n° 5,334,499.

[0079] Uma vez que os iniciadores estão preparados, a amplificação de ácido nucleico alvo pode ser realizada por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a, PCR convencional, PCR em tempo real, RT-PCR, nested-PCR, PCR semi-quantitivo e outros. De forma preferencial, o método utilizado é PCR em tempo real.

[0080] "Amplificação" refere-se aos procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores e polimerases que geram múltiplas cópias de um ácido nucleico alvo. Tais reações de amplificação são conhecidas pelo técnico no assunto como “PCR” (reação em cadeia da polimerase), que por sua vez, inclui, para fins desta invenção, qualquer método baseado em PCR, incluindo PCR convencional, qualitativo, semi- quantitativo, em tempo real, reação de transcrição reversa (RT-PCR), PCR singleplex, multiplex, e similares.

[0081] Um“amplicon” ou“produto de PCR”, os termos sendo usados de forma intercambiável, referem-se ao um ácido nucleico (ou coletivamente, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico) que foi sintetizado durante os procedimentos de amplificação. Um amplicon é tipicamente, mas não exclusivamente, um fragmento de DNA. [0082] Por“transcrição reversa” (RT) entende-se o fenômeno em que uma cópia de cDNA é produzida a partir de uma molécula de RNA. O cDNA resultante pode ser usado como molde para PCR.

[0083] Por “RT-PCR” compreende-se uma reação em que uma molécula de RNA é transcrita reversamente para produzir um produto (cDNA) e o cDNA é subsequentemente amplificado em uma reação de PCR. Tipicamente, tanto a transcrição reversa quanto as reações de PCR da reação de RT-PCR são realizadas em um único tubo.

[0084] Por“PCR quantitativo” (qPCR), entende-se qualquer método baseado em PCR que permita a estimativa da quantidade inicial de uma determinada sequência alvo em uma dada amostra.

[0085] Por“PCR em tempo real” compreende-se qualquer método baseado em PCR que permita monitorar a fluorescência emitida durante a reação, como um indicador da produção do produto de PCR ou amplicon durante cada ciclo de PCR, ao contrário da detecção ao final da realização de todos os ciclos nos métodos de PCR convencionais.

[0086] Como usado aqui,“PCR multiplex” refere-se a qualquer reação de PCR que tenha por objetivo a amplificação simultânea de mais de um alvo. Por exemplo, a PCR multiplex inclui PCR biplex (dois alvos), PCR tríplex (três alvos), e assim por diante. PCR multiplex inclui reações de PCR com mais do que um par de iniciadores, por exemplo, dois pares de iniciadores. Neste caso, poderá haver quatro iniciadores diferentes, mas também é possível que haja um iniciador em comum, por exemplo, o iniciador forward, e dois iniciadores reversos distintos. PCR multiplex também inclui reações de PCR com um único par de iniciadores, mas com mais de uma sonda. Ainda, como exemplos não limitantes, a amplificação multiplex inclui reações de amplificação de diferentes genes, diferentes alelos de um único gene e/ou diferentes fragmentos de um único gene.

[0087] Um “tampão” é uma composição adicionada à reação de amplificação, compreendendo um agente tamponante, que modifica a estabilidade, atividade e/ou longevidade de um ou mais componentes da reação de amplificação, através da regulagem do pH da reação de amplificação. Os agentes tamponantes da invenção são compatíveis com a atividade da polimerase a ser utilizada, qual seja, uma DNA polimerase. Agentes tamponantes são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a Tris, Tricina, MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfônico), e HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazina-etanosulfônico).

[0088] Além disto, os tampões de PCR podem geralmente conter até cerca de 70 mM KC1 e cerca de 1,5 mM ou mais de MgC12, a cerca de 50-500 mM de cada um dos nucleotídeos dATP, dCTP, dGTP e dTTP.

[0089] Os tampões da invenção podem ainda conter aditivos. Um aditivo é um composto adicionado a uma composição que modifica a estabilidade, a atividade e/ou a longevidade de um ou mais componentes da composição. Em algumas concretizações, a composição é uma composição de amplificação. Em algumas concretizações, um aditivo inativa enzimas contaminantes, estabiliza o dobramento de proteínas e/ou diminui a agregação. De acordo com a invenção, aditivos podem ser adicionados para melhorar a seletividade do anelamento de um iniciador e/ou de uma sonda, desde que o aditivo não interfira com a atividade da DNA polimerase.

[0090] Exemplos de aditivos são, mas não estão limitados a, betaína, glicerol, formamida, KC1, CaC12, MgOAc, MgC12, NaCl, NH40Ac, Nal, Na(C03)2, LiCl, MnOAc, NMP, trealose, DMSO, etileno glicol, ditiotreitol (“DTT”), pirofosfatase (incluindo, mas não limitado a pirofosfatase inorgânica de Thermoplasma acidophilum ("TAP")), albumina de soro bovino (“BSA”), propileno glicol, glicinamida, CHES, Percoll™, ácido aurintricarboxílico, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N- dodecil-N,N-dimetilamino-N-óxido), Zwittergente 3-10, Xwittergente 3-14, Xwittergente SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, SSB de E. coli, RecA, 7- deazaG, dUTP, UNG, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, zwittergente, esteróis, cátions, e quaisquer outros químicos, proteínas, ou cofatores que podem alterar a eficiência da amplificação.

[0091] Como aqui usado, o termo“termoestável”, quando aplicado à enzima, refere- se a uma enzima que retém sua atividade biológica em temperaturas elevadas (por exemplo, a 55°C ou mais), ou retém sua atividade biológica após ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento. Polimerases de nucleotídeos termoestáveis são particularmente preferidas para a presente invenção, uma vez que eliminam a necessidade de adicionar enzima antes de cada ciclo de PCR.

[0092] A “atividade de polimerase” refere-se a uma atividade enzimática que catalisa a polimerização de deoxirribonucleotídeos. Geralmente, a enzima irá iniciar a síntese na extremidade 3’ do iniciador anelado à sequência alvo, e irá prosseguir em direção à extremidade 5’ da fita molde. Em determinadas concretizações, essa enzima é uma DNA polimerase termoestável.

[0093] Exemplos não limitantes de DNA polimerases termoestáveis incluem, mas não se limitam a, polimerases isoladas de Thermus aquaticus (Taq polimerase), Thermus thermophilus (Tth polimerase), Thermococcus litoralis (Tli ou VENT™ polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu ou DEEPVENT™ polimerase), Pyrococcus woosii (Pwo polimerase) e outras espécies de Pyrococcus , Bacillus stearothermophilus (Bst polimerase), Sulfolobus acidocaldarius (Sac polimerase), Thermoplasma acidophilum (Tac polimerase), Thermus rubber (Tru polimerase), Thermus brockianus (DYNAZYME™ polimerase) (Tne polimerase), Thermotoga maritime (Tma) e outras espécies de Thermotoga genus (Tsp polimerase), e Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth polimerase). [0094] A reação de PCR pode conter mais do que uma enzima polimerase termoestável com propriedades complementares, resultando em amplificação mais eficiente das sequências alvos. Por exemplo, uma polimerase com alta habilidade de amplificar segmentos grandes de nucleotídeos pode ser complementada com outra polimerase com capacidade de corrigir erros ocorridos durante a elongação da sequência de ácido nucleico alvo, assim criando uma reação de PCR que pode amplificar uma sequência alvo longa com alta fidelidade. A polimerase termoestável pode ser usada em sua forma selvagem, ou, alternativamente, a polimerase pode ser modificada para conter um fragmento de uma enzima ou para conter uma mutação que forneça propriedades benéficas para facilitar a reação de PCR. Em uma concretização, a polimerase pode ser a Taq polimerase. Muitas variantes da Taq polimerase com propriedades melhoradas são conhecidas e incluem, mas não são limitadas a AmpliTaq™, fragmento Stoffel, SuperTaq™, SuperTaq™ plus, LA Taq™, LApro Taq™, e EX Taq™.

[0095] Como já mencionado mais acima, a expressão“condições de hibridização” refere-se às condições que permitem que o iniciador ou sonda se anelem à sequência nucleotídica de interesse. Estas condições são dependentes da temperatura e da força iônica da solução na qual a hibridização ocorre. Estas são as condições de estringência. Como é compreendido por um técnico no assunto, a estringência de andamento pode ser alterada de forma a identificar ou detectar sequências de polinucleotídeo idênticas ou relacionadas. Como será apreciado por um técnico no assunto, a temperatura de melting, Tm, pode ser calculada por fórmulas conhecidas na arte, dependendo de diversos parâmetros, como o comprimento do iniciador ou sonda em número de nucleotídeos, ou ingredientes presentes no tampão e condições. Para tanto, ver, por exemplo, T. Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 e J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

[0096] As faixas de temperatura de anelamento podem variar de cerca de 50°C e 65°C, mas os iniciadores podem ser desenhados para serem ótimos em cerca de 58°C a 62°C. Uma consideração adicional ao desenhar os iniciadores é o conteúdo de guanina e de citosina. Geralmente, o conteúdo de GC para um iniciador pode ser de cerca de 30-70%, mas pode ser menor e pode ser ajustado de forma apropriada por um técnico no assunto. O anelamento de oligonucleotídeos complementares ou parcialmente complementares a um determinado alvo pode ser obtido pela modificação das condições de anelamento visando o aumento ou diminuição da estringência, por exemplo, ajustando a temperatura ou a concentração de sal no tampão. Tais modificações para manter a especificidade para N. meningitidis, H. influenzae ou S. pneumoniae podem ser realizadas de forma rotineira por um técnico no assunto.

[0097] Para a amplificação, um par de iniciadores de um tipo específico pode ser usado sozinho (por exemplo, um iniciador forward e um iniciador reverso de N. meningitidis ; um iniciador forward e um iniciador reverso de H. influenzae; ou um iniciador forward e um iniciador reverso de S. pneumoniae , e assim por diante). A amplificação multiplex pode ser usada para amplificar regiões dos genes alvo de N. meningitidis, H. influenzae ou S. pneumoniae. As concentrações finais dos iniciadores podem ser ajustadas de forma apropriada, variando de cerca de 10 pmol a 50 pmol (em 20 pl) de cada um dos iniciadores representados por SEQ ID Nos: 1 a 6.

[0098] As concentrações finais das sondas também podem ser ajustadas de forma apropriada por um técnico no assunto, variando de cerca de 50 nM a 1000 nM. Mais preferencialmente, a concentração final varia de cerca de 100 cerca de 300 nM, mais preferencialmente, de 150 a 250 nM de cada uma das sondas representadas por SEQ ID Nos: 7 a 9.

[0099] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para detectar a presença de N. meningitidis , H. influenzae ou S. pneumoniae, de forma simultânea, a partir de ácidos nucleicos extraídos de uma amostra biológica. O método abrange a mistura em um recipiente adequado os dNTPs, a DNA polimerase, tampão, pelo menos um iniciador e pelo menos uma sonda conforme descritos no presente pedido, o ácido nucleico extraído da amostra biológica, e submeter o recipiente contendo a mistura a incubação em um termociclador.

[00100] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para detectar a presença de N. meningitidis, H. influenzae ou S. pneumoniae , compreendendo realizar uma reação de polimerase em cadeia usando pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores forward de SEQ ID Nos: 1, 3 e 5, e pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores reversos de SEQ ID Nos: 2, 4 e 6. O técnico no assunto tem conhecimento das condições de reação de PCR, em particular, as condições de ciclagem termal, por exemplo, temperaturas, duração, número de ciclos, taxa de aquecimento/resfriamento, etc. Em uma concretização preferida, as condições de reação de PCR incluem condições adequadas para uma PCR multiplex. Em uma outra concretização preferida, ditas condições incluem aquelas adequadas para uma PCR multiplex quantitativa em tempo real. Em outra concretização opcional, o dito método compreende a etapa de colocar a amostra na presença de sonda(s) em condições adequadas ao andamento de dita(s) sonda(s) ao amplicon.

[00101] Em outra concretização preferida, o método compreende a etapa de detectar pelo menos um amplicon em tempo real, permitindo a avaliação da presença ou ausência de N. meningitidis, H. influenzae ou S. pneumoniae na amostra. Isto é atingido, de forma não limitativa pelas medições de intensidade de fluorescência ou da TM dos amplicons.

[00102] Os procedimentos de medição de fluorescência e TM são conhecidos na arte. [00103] Em uma concretização preferida, pelo menos uma etapa, preferencialmente várias etapas, mais preferencialmente a maioria das etapas, é realizada em uma placa de PCR, incluindo aquelas com 24 poços, 48 poços, 96 poços e 384 poços. O uso de placas garante, de forma vantajosa, que as amostras possam ser processadas em paralelo durante a reação. Além disto, permite que o método seja realizado em larga escala, o que economiza tempo.

[00104] Em outra forma preferida, pelo menos uma etapa, preferivelmente várias etapas, mais preferivelmente a maioria das etapas é realizada em um termociclador. A seguir estão alguns termocicladores para PCR em tempo real com sistema HRM: RotorGene Q 5-plex HRM da Qiagen; 7500 Fast Real Time PCR System e Quant Studio 6 da Thermo Fisher, BIO-MA-6000 da INNOVA MOLARRAY ; PCRmax Eco 48 da COLE-PARMER entre outros.

[00105] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos abaixo, que têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. As várias modificações ou sugestões à luz dos mesmos que podem ser sugeridas por um técnico no assunto estão incluídas no espírito e no escopo das reivindicações. Em particular, apesar de serem adequados para a detecção via protocolos multiplex e/ou em tempo real, os métodos, oligonucleotídeos, conjuntos de oligonucleotídeos e kits da presente invenção são, obviamente, também adequados para protocolos singleplex, duplex , tríplex e similares, qualitativo, PCR convencional e PCR em tempo real com sistema Taqman, e combinações dos mesmos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Micro-organismos de referência

[00106] As cepas utilizadas co o referência fazem parte da Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária - CMRVS do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde-INCQS da FIOCRUZ. Foram utilizadas cepas de referência de diferentes sorogrupos e sorotipos para garantir a especificidade do sistema na detecção das três espécies objeto do estudo. Outras espécies foram utilizadas como controles negativos, A Tabela 1 mostra a lista completa de micro-organismos de referência utilizados.

Tabela 1. Lista completa dos Micro-organismos de Referência utilizados

Exemplo 2. Desenho dos iniciadores e sondas

[00107] Os oligonucleotídeos específicos para cada espécie para utilização no sistema Taqman e HRM de PCR em tempo real, foram desenhados a partir das sequências dos genes-alvo exclusivos de cada microrganismo com o auxílio do software Oligo Architect SIGMA (http://www.oligoarchitect.com/). As sequências foram obtidas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A Tabela 2 mostra os iniciadores e sondas utilizados para as reações de amplificação por PCR com as respectivas marcações nas sondas com fluoróforos (repórter) e quencher, Os mesmos foram sintetizados no Instituto Carlos Chagas - FOCOCRUZ, Curitiba, Brasil. Cada sonda foi marcada com um fluoróforo diferente para que pudessem ser utilizadas simultaneamente em um sistema multiplex. Para cada fluoróforo foi utilizado o quencher adequado.

Tabela 2. Iniciadores e Sondas utilizados na presente invenção

[00108] De acordo com a presente invenção, os iniciadores forward são representados pelas SEQ ID NOs: 1, 3 e 5, respectivamente, enquanto os iniciadores reversos são representados pelas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6, respectivamente.

[00109] As sondas utilizadas na modalidade opcional da presente invenção são representadas pelas SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente.

[00110] A melhor concentração dos iniciadores e das sondas para cada alvo, foi determinada para otimizar a reação tanto para os DNA extraídos de cepas bacterianas controle quanto para as amostras clínicas (líquor, sangue, soro). Exemplo 4. Limites de detecção (LD) das bactérias de referência pelo Sistema Taqman

[00111] Todos os reagentes (MasterMix), iniciadores e sondas utilizados nos ensaios aqui descritos para o sistema Taqman foram fornecidos pelo Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP-PR). Em um outro aspecto, pode ser utilizado qualquer Mastermix comercial para o sistema Taqman disponível.

[00112] Para a determinação do limite de detecção de DNA dos microrganismos utilizados como controle, após a extração e determinação da concentração do DNA, o mesmo foi diluído de forma seriada e os respectivos LD e Cycle Threshold (CT) para cada microrganismo foram estabelecidos (Tabela 3).

[00113] Os CTs são valores gerados através do traçado da linha de threshold. Estes valores indicam em que ciclo da corrida a amplificação iniciou. Todas as amostras acima da linha de threshold são consideradas positivas. Os CTs apresentam-se tabelados, de acordo com as concentrações de DNA. A tabela 3 apresenta os resultados de CT referentes à PCR em Tempo Real realizada com sistema Taqman uniplex, para atingir o limite de detecção. Para cada alvo foi determinado um LD e CT específicos.

Tabela 3. LD pelo sistema Taqman uniplex com diluições do DNA genômico de cada alvo. Os valores em negrito indicam ao valor do LD e seu respectivo

CT.

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[00114] As figuras 1, 2 e 3 mostram os gráficos de Análise de Quantificação extraídos da corrida para o LD de todos os DNA com as concentrações detectadas e seus respecti vos CT, conforme listado na tabela 4.

[00115] Para determinar a sensibilidade de detecção dos alvos de fornia simultânea (multiplex) pelo sistema Taqman, foram utilizados os mesmos iniciadores e sondas em um único experimento, A estratégia utilizada foi a inclusão dos três sistemas de iniciadores/sondas e um DNA de cada alvo de cada vez em uma única corrida já que não há registro até o momento de co- infecção por mais de um dos agentes etiológico aqui analisados. Os referidos gráficos correspondem as figuras 4, 5 e 6, A utilização do sistema multiplex contribui com economia de reagentes e de tempo. A tabela 4 mostra em negrito o limite de detecção dos alvos pelo multiplex.

Tabela 4. LD pelo sistema Taqman multiplex com diluições do DNA genômico de cada alvo. Os valores em negrito indicam o valor de LD e seu respetivo CT.

Exemplo 5. Limites de detecção uniplex e multiplex por PCR pelo sistema HRM

Para o sistema de detecção por HRM foi utilizado o MasterMix da Qiagen“Type-It HRM” Cat. 206542 que possui a seguinte fórmula:

- HotStarTaq® PlusDNA Polymerase

- Type-it HRM PCR Buffer (with EvaGreen® dye)

- Q-Solution®

- dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Os iniciadores foram adquiridos na ThermoFisher.

[00116] A detecção dos alvos pelo sistema HRM apresenta-se listada na tabela 5. As figuras 7, 8 e 9 mostram as análises quantitativas pelo HRM com as curvas e os CTs para cada alvo. A figura l O mostra as curvas padrão de dissociação ou melting (TM) para cada alvo (uniplex). Nota-se que a detecção de cada alvo é realizada pelos picos da curva de dissociação de cada microrganismo com TM diferente, 77°C para S. pneumoniae, 80°C para H influenzae , e 85 ,8°C para N. menigiíidis, que pode ser utilizado de forma inequívoca para o diagnóstico desses agentes. As figuras 1 1 e 12 mostram o sistema HRM multiplex com a mesma estratégia utilizada para o sistema Taqman multiplex, onde os três sistemas de iniciadores/sondas e um DNA de cada alvo de cada vez são utilizados em uma única corrida. Os testes realizados tanto pelo sistema HRM uniplex quanto pelo multiplex, apresentaram resultados de TM iguais quando foram utilizados como alvo os DNA genômicos dos microrganismos de referência.

Tabela 5. LD pelo sistema HRM uniplex com diluições do DNA genômico de cada alvo. Os valores em negrito indicam o valor do LD e seu respetivo CT

Exemplo

6. Teste com material clínico pelo Sistema Taqman

[00117] Após a determinação dos LD pelo sistema Taqman com DNA genômico de microrganismos de referência, de forma individual (uniplex) e simultânea (multiplex), foram iniciados os experimentos com material clínico de pacientes com suspeita de meningite bacteriana por um dos três agentes estudados. Em seguida os resultados foram comparados com a PCR convencional.

[00118] Foi utilizado material clínico humano (sangue, soro e LCR) recebido pelo LACEN-RJ de hospitais públicos coletado de pacientes com suspeita de doença invasiva por um dos três agentes aqui listados. Parte desse material é enviado ao nosso laboratório (LMR/INCQS) em um trabalho de colaboração para detecção do agente enológico nos casos de diagnóstico negativo por testes laboratoriais convencionais nos LACEN.

[00119] Os experimentos uniplex e multiplex apresentaram resultados similares, O primeiro experimento por Taqman multiplex demonstrou boa especificidade na reação. A figura 11 demostra o teste multiplex com o DNA de referência de Neisseria meningitidis e o material clínico em duplicada, indicando que o mesmo se refere ao agente mencionado. As demais amostras apresentaram-se negativas pois não foi obtida a curva referente à amplificação e todas reagiram de forma linear. Na figura 12 é possível observar o teste multiplex, com o gráfico similar ao anterior. Neste teste foi utilizado DNA de referência de S. pneumoniae e material clínico, indicando a presença do DNA do microrganismo.

Exemplo 7. Teste com material clínico pelo Sistema HRM

[00120] Paralelamente aos testes realizados com sistema Taqman, de acordo com o exemplo anterior, foram incluídos nos experimentos com sistema HRM multiplex, material clínico para a determinação do agente etiológico. A detecção dos agentes foi possível devido as diferenças da temperatura de melting (TM). N meningitidis apresentou TM~ 85,8°C, H, influenzae = 80°C e S, pneumoniae = 77°C, Os testes uni e multiplex apresentaram TM com temperaturas iguais. A figura 13 apresenta a detecção de S, pneumoniae e a figura 14 ilustra a detecção de N. meningitidis.

Exemplo 8. Comparação entre os diferentes sistemas de PCR [00121] Os resultados obtidos pelos sistemas Taqman e HRM mostraram que ambas as metodologias são eficientes no diagnóstico das meningites bacterianas, pois apresentaram resultados semelhantes entre eles com maior sensibilidade para o sistema HRM conforme mostrado na tabela 6. Quando comparados à PCR, convencional, os métodos baseados na PCR em tempo real (Taqman e HRM) demonstraram maior sensibilidade. O sistema HRM por não utilizar sonda marcada, apresenta melhor custo-benefício para a detecção rápida dos três agentes etiológicos aqui analisados. A especificidade dos iniciadores e sondas para cada microrganismo alvo foi comprovada através de testes com controle negativo, conforme listado na tabela 1 e apresentado na Figura 15. Para a leitura dos resultados, a PCR convencional necessita de uma etapa adicional de corrida de eletroforese em gel de agarose para visualização das bandas de DNA o que não é necessário na qPCR pois o resultado é plotado em gráficos podendo ser visualizado em tempo real, com software específico em computador acoplado ao termociclador, A tabela 6 compara a detecção de DNA de N. meningilidis, H, influenzae e S. pneumoniae a partir de diferentes amostras clínicas pelos sistemas Taqman, HRM e PCR convencional, todos na forma simultânea (multiplex). Para os sistemas de PCR Taqman e HRM foram utilizados os mesmos iniciadores (Taqman, HRM) e sondas (Taqman). Para o PCR convencional foram utilizados iniciadores diferentes mas com os mesmos genes como alvo, direcionados para regiões que compreendem as mesmas regiões amplificadas pelos iniciadores utilizados nos sistema Taqman e HRM.

Tabela 6. Comparação da detecção dos agentes etiológicos por PCR convenciona] e PCR em tempo real (Taqman e HRM). (Nm ^~ N meningitidis,

Hi =H. influenzae e Sp -S. pneumoniae, NEG ~ resultado negativo).

[00122] A sensibilidade do teste foi avaliada pela determinação dos

Limites de Detecção (LD) mostrados anteriormente. Os dois sistemas de detecção Taqman e HRM, foram também testados frente a um painel de amostras clínicas pré-analisadas por PCR convencional com resultados positivos para Nm, Sp e negativos. Os resultados estão na Tabela 6 e mostram que de um modo geral os sistemas Taqman e HRM foram mais sensíveis que a PCR convencional confirmando a presença de DNA do agente etiológico das amostras positivas por PCR convencional e de algumas negativas. Todas as amostras clínicas utilizadas nesse painel foram obtidas de pacientes com suspeita clínica de doença invasiva por um dos agentes etiológicos, portanto, a detecção de DNA bacteriano pelos sistemas Taqman e HRM de amostras consideradas negativas por PCR convencional mostra a maior sensibilidade dos dois novos sistemas de diagnóstico. Em apenas uma amostra do painel, o sistema Taqman não detectou DNA do agente etiológico que foi detectado pela PCR convencional e pelo HRM. A especificidade dos sistemas Taqman e

HRM foi avaliada frente a um painel de linhagens bacterianas de referência caracterizadas como invasivas já detectadas em pacientes com sintomas similares aos causados pelos três agentes etiológicos estudados (Tabela 1). Os dois sistemas identificaram apenas cepas das espécies aqui estudadas (TV, meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae).

[00123] E evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.