TíTULO

OLIGONUCLEóTIDOS DIRIGIDOS AL GEN ARN RIBOSóMICO 23S DE ACIDOBACTERIAS Y SU UTILIZACIóN.

SECTOR DE LA TéCNICA

El sector principal de aplicación es la biotecnología en aquellos campos que requieran la detección de Acidobacterias tanto cultivadas como no cultivadas. Entre los campos de aplicación figuran la conservación de obras y objetos de arte, estudios biogeoquímicos y trabajos in situ sobre cualquier tipo de muestras.

ESTADO DE LA TéCNICA

Hoy en día, los microorganismos pueden ser identificados sin necesidad de ser cultivados utilizando técnicas moleculares como la amplificación por PCR ("Polymerase Chain Reaction") y secuenciación, "Fluorescent In Situ Hybridization" (FISH) o hibridación in situ con sondas de ADN marcadas fluorescentemente, o con el empleo de microarrays de ADN. Estas técnicas requieren el uso de oligonucleótidos o sondas específicas diseñadas para detectar genes determinados. Uno de los genes o fragmentos de ADN más utilizados con este fin es el del ARN ribosómico 16S ya que el número de copias por célula de este gen es más elevado que el de otras secuencias.

Los procedimientos de PCR y FISH son habituales en laboratorios de biología molecular. Ambos requieren el uso de oligonucleótidos que constan de una secuencia de unos 15-30 nucleótidos de longitud. En el caso de sondas de ADN, estos oligonucleótidos son marcados, generalmente, en su lado terminal 5' con un colorante fluorescente o radioisótopos.

Estos oligonucleótidos, también llamados primers o cebadores, en la reacción PCR sirven para amplificar el gen o fragmento de ADN de interés. Una reacción positiva indicaría la presencia de microorganismos del tipo buscado. El procedimiento FISH permite una rápida detección con la utilización de sondas de ADN marcadas fluorescentemente, permitiendo la rápida detección de células determinadas in situ (De Long et al. 1989). El uso de microarrays se está extendiendo en los últimos años ya que permite la utilización de numerosos oligonucleótidos simultáneamente dirigidos a la

detección de diversos grupos microbianos o genes sobre un mismo portaobjetos o membrana (Peplies et al. 2003).

Estas técnicas constituyen los métodos más importantes que tenemos disponibles hoy en día para la detección de microorganismos no cultivables en ambientes naturales (Amann et al. 2001) y en muestras médicas (Moter y Gδbel 2000). Se han publicado muchos primers generales para microorganismos y para algunos grupos específicos así como sondas oligonucleotídicas para el rRNA (Loy et al. 2003).

Las Acidobacterias constituyen una División bacteriana hasta hoy constituida por tan solo tres especies cultivadas Acidobacterium, Holophaga y Geothrix. Sin embargo, recientemente, se ha descubierto la existencia de mayor número de Acidobacterias utilizando métodos moleculares basados en secuencias del gen 16S rRNA obtenidas por PCR. Se sabe que las Acidobacterias constituyen una fracción altamente significativa de la comunidad microbiana presente en suelos y monumentos, pueden alcanzar el 25 % de presencia en muestras de cuevas, por ejemplo. Su papel en la biogeoquímica de estos ecosistemas, dada su elevada presencia, es sin duda de gran importancia. Esta abundancia justifica la necesidad de conocer con mayor detalle dichas acidobacterias para lo cual es preciso su previa identificación.

Dado el interés por descubrir y comprender el papel de las Acidobacterias y sus implicaciones en los ecosistemas donde se desarrollan, se hace necesaria la existencia de una metodología capaz de detectar y catalogar en subgrupos estos microorganismos de la manera más fiable y precisa posible. Dentro de las Acidobacterias se hace necesaria la diferenciación de distintos subgrupos debido a la gran diversidad metabólica entre las Acidobacterias. Como ejemplo, ponemos el caso de Geothrix que es una de las tres especies cultivadas de Acidobacterias y se sabe que reduce hierro durante su metabolismo y crecimiento. Si deseamos proteger pinturas rupestres con coloración rojiza debido a hematites como en la Cueva de Altamira (Cantabria, España), la presencia de Acidobacterias altamente relacionadas con Geothrix (es decir, pertenecientes al mismo subgrupo) indicaría un alto riesgo ya que la reducción de hierro desencadenaría la decoloración de los pigmentos rojizos de esas pinturas de tanto valor

histórico y cultural. Por tanto, en cuanto a la aplicación práctica de la detección de Acidobacterias resulta importante la diferenciación de sus distintos subgrupos.

Las Acidobacterias descubiertas hasta ahora, mediante técnicas moleculares basadas en los genes de ARN ribosómico 16S, han sido clasificadas en ocho (8) subgrupos (Hugenholtz et al. 1998), siendo los correspondientes a las especies cultivadas los subgrupos número 1 y 8. Estos 8 subgrupos pueden caracterizarse en el gen ARN ribosómico 16S por las siguientes secuencias, con los números de acceso dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): subgrupo 1, D26171; subgrupo 3, AF013515; subgrupo 4-1, U68644; subgrupo 4-IL AF013530; subgrupo 4-III, AF013560; subgrupo 5, Z95707; subgrupo 6, Z95733; subgrupo 7-1, Z95729; subgrupo 7-II, Z95713; subgrupo 8, U41563.

Trabajos posteriores llevados a cabo por nuestro grupo (con 16S y 23S) han dado lugar al descubrimiento de nuevas secuencias que al ser clasificadas en base a su distancia filogenética no pertenecen a ninguno de los 8 subgrupos diferenciados con el 16S, indicando la existencia de nuevos subgrupos distintos.

El gen de ARN ribosómico 23 S es de mayor longitud (unas 3000 bases) que el ARN ribosómico 16S (unas 1500 bases). Tanto el gen 16S como el 23 S de ARN ribosómico se encuentran en todas las bacterias y ambos reflejan fielmente la filogenia microbiana. El gen de ARN ribosómico 23 S presenta zonas con gran variabilidad entre microorganismos distintos mientras que las diferencias encontradas entre genes ARN ribosómicos 16S son menores debido a su menor tamaño. El gen 23 S ARN ribosómico ofrece por tanto más posibilidades para la diferenciación de microorganismos distintos y mayores opciones para el diseño de oligonucleotidos específicos para la detección de microorganismos determinados y, concretamente, para el análisis de la diversidad microbiana. En contrapartida, el trabajo de secuenciación del 16S es más fácil que el del 23 S por ser aquel más corto y esta es la razón por la que hasta el momento el gen ARN ribosómico 16S sea el gen más utilizado.

En la presente invención se han diseñado primers y sondas que permiten la detección del gen ARN ribosómico 23 S de las Acidobacterias y la diferenciación de 13 subgrupos (justificados por su clasificación filogenética)

Referencias

Amann R, Fuchs BM, Behrens S. 2001. The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridisation. Curr Opin Biotechnol 12: 231-236. DeLong EF, Wickham GS, Pace NR. 1989. Phylogenetic stains: ribosomal RNA based probes for the identification of single cells. Science 243: 1360-1363.

Hugenholtz, P., Goebel, B.M., and Pace, N.R. 1998. Impact of Culture-Independent

Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. J Bacteriol 180:

4765-4774.

Loy A, Horn M, Wagner M. 2003. ProbeBase: an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res 31: 514-516.

Moter A, Gδbel UB. 2000. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J Microbiol Methods 41: 85-112. Peplies J, Glockner FO, Amann R. 2003. Optimization strategies for DNA microarray- based detection of bacteria with 16S rRNA-targeting oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol. 69: 1397-407.

BREVE DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Tal como se ha mencionado previamente se hace necesaria una tecnología capaz de detectar y catalogar en subgrupos a los microorganismos pertenecientes al grupo de las Acidobacterias, de la manera más rápida, fiable y precisa posible. La presente invención se refiere a la detección de Acidobacterias, utilizando secuencias de nucleótidos como sondas o primers (cebadores), y su aplicación en búsquedas de presencia, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias.

La presente invención describe sondas y oligonucleótidos de ADN específicos diseñados para la detección de las Acidobacterias y de los diversos subgrupos conocidos de Acidobacterias basándose en el gen ARN ribosómico 23 S.

Constituye, por tanto, un objeto de la presente invención una secuencia aislada de nucleótidos que comprende una secuencia complementaria inversa a una secuencia parcial del gen ARN ribosómico 23 S de Acidobacterias, y puede seleccionarse entre las siguientes: a) secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22 b) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con niveles de similitud superiores al 70% c) secuencia de nucleótidos que híbrida con las secuencias de nucleótidos definidas en a) y b) d) secuencia complementaria a cualquiera de la secuencias definidas en a)-c).

Asimismo, constituye otro objeto de la presente invención un kit de detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende al menos una secuencia o sonda de las mencionadas anteriormente.

El método de detección, cuantificación, e identificación de Acidobacterias que utiliza al menos una secuencia, o una sonda, o un kit de los mencionados anteriormente, constituye igualmente un objeto de la invención

La presente invención presenta el diseño de secuencias de oligonucleótidos para la detección bien como primer o sonda de Acidobacterias en aplicaciones como por ejemplo, pero no restringido a, la amplificación por PCR, FISH, microarrays de ADN o reacciones de transcripción inversa a partir de ARN, así como el empleo de esos oligonucleótidos como reactivo o método para la detección de Acidobacterias. Estos oligonucleótidos van dirigidos a detectar específicamente las Acidobacterias utilizando secuencias únicas del gen de ARN ribosómico 23 S de estos microorganismos.

La utilización de estos oligonucleótidos permite la detección rápida de Acidobacterias sin necesidad de cultivar estos microorganismos con la utilización de técnicas moleculares (PCR, FISH, microarrays).

En otro aspecto la presente invención se relaciona con la utilización de una o más secuencias, o sondas, o kits, objetos de la presente invención, en la detección, identificación y/o cuantificación de Acidobacterias y los subgrupos (13) de esta división bacteriana en cualquier tipo de muestras, preferentemente en muestras ambientales, biológicas y/o médicas.

BREVE DESCRIPCIóN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS Figura 1. árbol filogenético general de las Acidobacterias basado en secuencias del gen ARN ribosómico 23 S mostrando los diversos subgrupos de esta División bacteriana, así como los correspondientes oligonucleótidos dirigidos a cada uno de los subgrupos. Flechas continuas indican que la sonda no presenta ambigüedades dentro del grupo, y flechas discontinuas indican la existencia de ambigüedades para algunas secuencias clasificadas dentro del grupo.

Figura 2. Análisis electroforético en gel de agarosa que muestra los productos de PCR obtenidos con la utilización del primer propuesto ACIPHY631 (reverse) y el primer universal 616 (forward). La detección positiva de acidobacterias se comprueba rápidamente por la presencia de producto ("muestra positiva") y su ausencia denota la ausencia de acidobacterias ("muestra negativa") en otra muestra analizada. Se presenta el resultado de un gradiente de temperatura de hibridación de los primers al ADN molde durante la PCR (desde 53 hasta 62.3°C) para cada muestra.

Figura 3. Microfotografías mostrando la detección de Acidobacterias. La técnica utilizada es FISH con la sonda de ADN propuesta ACITEN1713. A, fotografía utilizando luz de excitación verde con el colorante Cy3 unido a la sonda mencionada que muestra la presencia de los filamentos correspondientes a Acidobacterias del subgrupo 10. B, fotografía utilizando luz de excitación azul y el colorante SYBR Green I que tifie inespecíficamente ADN mostrando todas las bacterias presentes en la muestra. C, fotografía en contraste de fases de la misma muestra de A y B. Las flechas indican las células de Acidobacteria a las que se dirigía la sonda.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN.

Un objeto de la presente invención es una secuencia aislada de nucleótidos que comprende una secuencia complementaria inversa a una secuencia parcial del gen ARN ribosómico 23 S de Acidobacterias, y puede seleccionarse entre las siguientes: a) secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,

SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22 b) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con niveles de similitud superiores al 70% c) secuencia de nucleótidos que hibrida con las secuencias de nucleótidos definidas en a) y b) d) secuencia complementaria a cualquiera de la secuencias definidas en a)-c).

La invención se relaciona con el diseño de secuencias de oligonucleótidos dirigidas a detectar específicamente las Acidobacterias en cualquier tipo de muestra, así como a identificar el subgrupo al que pertenecen. Estos oligonucleótidos utilizan secuencias únicas del gen ARN ribosómico 23 S de estos microorganismos y pueden ser empleadas como primers para la amplififcación de fragmentos del gen ARN ribosómico 23 S de las Acidobacterias (por PCR o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos), como sondas de ADN para análisis por FISH, o microarrays de ADN.

Tras realizar análisis filogenéticos exhaustivos de las secuencias conocidas y otras obtenidas durante nuestros experimentos, hemos observado que la utilización del gen de ARN ribosómico 23 S proporciona una secuencia de mayor longitud que la del gen ARN ribosómico 16S y existe un gran número de posiciones en esta secuencia que ofrecen gran interés para el diseño de sondas de hibridación y oligómeros o primers para su amplificación. Entre estas posiciones, hemos detectado la existencia de cortas secuencias únicas y características correspondientes a los distintos subgrupos de Acidobacterias. Estas secuencias han sido utilizadas para el diseño de primers que permiten la amplificación de fragmentos del gen de ARN ribosómico 23 S de Acidobacterias y de sondas de ADN que marcadas con colorantes fluorescentes sirven para la rápida detección de Acidobacterias en cualquier tipo de muestras. Constituye por tanto otro objeto de la presente invención, una sonda de ácido nucleico que comprenda al menos una secuencia de las mencionadas anteriormente (secuencias SEQ ID NO: 1 - 22)

Las secuencias correspondientes a Acidobacterias se han clasificado en 13 subgrupos basados en el gen ARN ribosómico 23 S (Figura 1).

Utilizando las secuencias y sondas propuestas en la presente invención (Tabla 1) se puede detectar y distinguir cada uno de esos subgrupos o detectar cualquier Acidobacteria entre un grupo de microorganismos.

Constituye, asimismo, otro objeto de la presente invención un kit de detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende al menos una secuencia o sonda de las mencionadas anteriormente. Otro objeto de la invención lo constituye un método de detección, cuantificación, e identificación de Acidobacterias en el que utiliza al menos una secuencia, o una sonda, o un kit de los mencionados anteriormente.

En otro aspecto la presente invención se relaciona con la utilización de una o más secuencias, o sondas, o kits, objetos de la presente invención, en la detección, identificación y/o cuantificación de Acidobacterias y los subgrupos (13) de esta división bacteriana en cualquier tipo de muestras, preferentemente en muestras ambientales, biológicas y/o médicas.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos propuestas y localización en el gen ARN ribosómico 23 S de Acidobacterium capsulatum.

EJEMPLO DE REALIZACIóN DE LA INVENCIóN Ejemplo 1.

Detección de la presencia de Acidobacterias tras amplificación por PCR de fragmentos del gen ARN ribosómico 23S a partir de muestras ambientales. Una muestra de la pared de la cueva de Altamira se recogió en un tubo de 1.5 mi estéril. La muestra se congeló hasta su posterior análisis. Se extrajo el ADN con el kit de extracción Nucleospin food (Macherey-Nagel, Alemania). Un microlitro de la solución de ADN se utilizó en una reacción de PCR siguiendo el procedimiento estandard. Se utilizó la taq ADN polimerasa Extaq (Takara) y las condiciones recomendadas para esta enzima en su manual de utilización. Los primers utilizados fueron el oligonucleótido propuesto ACIPHY631 en la presente invención (Tabla 1) específico para Acidobacterias y el primer universal 616F (5'- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG). Se ensayaron una muestra positiva (con Acidobacterias) y otra negativa (sin Acidobacterias). Los productos de amplificación se observaron en geles de agarosa (1.5% agarosa en TAE 0.5x) siguiendo procedimientos establecidos en laboratorios de Biología Molecular. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se observa que la presencia de Acidobacterias se revela por la obtención de un producto de PCR del tamaño esperado (muestra positiva) mientras que la ausencia de Acidobacterias (o presencia por debajo del nivel de detección) resultaa en la ausencia de producto de amplificación y por tanto en la ausencia de la banda esperada (muestra negativa) en el gel de agarosa. Así queda demostrada la utilidad del oligonucleótido propuesto en la detección de Acidobacterias.

Ejemplo 2. Detección de Acidobacterias por FISH utilizando los oligonucleótidos propuestos como sondas de ADN.

Una muestra de la pared de la cueva de Altamira se recogió en un tubo de 1.5 mi estéril. La muestra se suspendió en paraformaldehido (PFA) al 4% y se mantuvo a 4°C durante 4 h. Se centrifugó a 10.000 x g durante 5 minutos, se retiró el sobrenadante y se suspendió en solución de PBS (Phosphate Buffered Solution). El PBS se eliminó tras centrifugación, la muestra se resuspendió nuevamente en PBS y se almacenó a -20 ⁰ C hasta que fue hibridada a las sondas fluorescentes.

La preparación de la muestra sobre un portaobjetos y su hibridación con una sonda de ADN marcada fluorescentemente se realizó tal y como lo describió Zimmermann et al. (2001) siguiendo el protocolo estandard para FISH. La estringencia idónea para cada sonda de ADN se obtuvo tras comparar el mismo procedimiento llevado a cabo a distintas concentraciones de formamida tal y como ha sido previamente descrito (por ejemplo, Zimmermann et al. 2001). La observación de las muestras hibridadas se realizó con un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axiophot.

La sonda diseñada fue sintetizada con el mareaje fluorescente Cy 3 por Thermos Corporation (Alemania). Las secuencias de nucleótidos correspondientes a las sondas utilizadas se muestran en la Tabla 1. Este ejemplo demuestra que con las sondas utilizadas podemos detectar Acidobacterias de subgrupos específicos in situ por microscopía. El ejemplo presentado detecta Acidobacterias del subgrupo 10.

Referencias

Zimmermann, J., W. Ludwig, K. -H. Schleifer. 2001. DNA polynucleotide probes generated from representatives of the genus Acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples. System. Appl. Microbiol. 24: 238-244.