PAPILOMAVÍRUS HUMANO

[1] Campo da invenção

[2] A presente invenção se referea identificação de oligonucleotídeos e método para detecção e tipagem do papilomavírus humano. O presente método refere-se ao uso da tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos pela reação em cadeia da polimerase em duas etapas (duplicada) com múltiplos marcadores, também chamada em PCR-nested multiplex,utilizandooligonucleotídeos gerais consensuais seguidos por múltiplos oligonucleotídeos específicos e seus componentes (reagentes e condições de reação) para detectarsimultaneamente 40 tipos de papilomavírus humano presentes em fluídos e amostras de tecidos humanos, bem como realizar uma análise semi-quantitativa entre os tipos virais determinando a relação de dominância virai (carga virai) em infecções múltiplas. As sequências dos primers (iniciadores específicos ou oligonucleotídeos) gerais de consenso degenerados (1 ^â reação de PCR) e combinados, bem como os primers específicos combinados {2- reação de PCR - nested) para os tipos virais, que englobam não-oncogênicos, indeterminados eoncogênicos(6, 1 1 , 1 6, 1 8, 26, 30, 31 , 33, 34, 35, 39, 42, 43, 44, 45, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61 , 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 81 , 82, MM7, e MM8), são descritas e fazem parte da invenção que utiliza a PCR-nested multiplex para a tipagem simultânea de 40 tipos virais em um único tubo. O processo de detecção é realizado por fluorescência em sequenciadores por eletroforese capilar, os quais também permitem a determinação semi-quantitativa da carga virai dos tipos virais em infecções múltiplas. A invenção também pode ser utilizada para omonitoramento do tratamento das infecções por HPV tanto em homens quanto em mulheres.

Estado da Técnica [4] O HPV tem sido implicado na génese de várias lesões pré-cancerosas e neoplásicas, particularmente carcinomas do colo uterino, região anogenital, pele, trato respiratório e digestivo. Recomenda-se a pesquisa do HPV nos seguintes casos: mulheres com colpocitologia atípica ou "borderline", pacientes de alto risco (início sexual precoce com vários parceiros), indivíduos imunocomprometidos e parceiros de pacientes infectados pelo HPV.

[5] O HPV pode ser classificado em aproximadamente 100 tipos epiteliotrópicos diferentes, sendo que cerca de 40 tipos são exclusivamente mucosotrópicos. Aproximadamente um terço destes tipos mucosotrópicos de HPV foram isolados de carcinomas cervicais (HO GYF, BIRMAN R, BEARDSLAY L et al. 1998. New England J. Med. 338, p.423-428).

[6] O método de PCR (Patentes US 4,683,195 e 5,639,871 )foi introduzido como o método mais sensível para a detecção do DNA (ácido desoxirribonucleico) de HPV em espécimes clínicos. Os primeiros diagnósticos moleculares, utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foram desenvolvidos no final da década de 80 (MANOS MM, TING Y, WRIGHT DK eí al. 1989. CancerCell 7, p.209-214). Poucos HPVs tinham seus genomas sequenciados e, apesar disso, observou uma ampla variabilidade genética, o que implica no fato de que, mesmo utilizando regiões conservadas entre os vírus, há dificuldade na detecção. Esta variabilidade virai tem estimulado o desenvolvimento de testes simples e universais usando a PCR (reação em cadeia de polimerase) permitindo a detecção de um largo espectro dos principais genótipos de HPV (MANOS MM, TING Y, WRIGHT DK eí al. 1989. Câncer Celi 7, p.209-214; SNIJDERS PJF., VAN DE BRULE AJF, SCHRIJNEMAKERS HJF eí al. 1990. J. Gen. Virol. 71 , p173-181 ).

[7] Muitas patentes têm sido descritas procurando a tipagem do HPV, usando regiões genômicas distintas ou similares, ou ainda usando mistura de técnicas como a PCR e hibridações, e também usando alvos diferenciados, podendo ser DNA ou RNA. Dentre as várias publicações e patentes relevantes citam-se algumas a seguir, fazendo um comparativo com a presente invenção:

[8] A JP2012075437A refere-se à descrição de 13 pares de primers (sondas) para detecção multiplex de 13 tipos virais de alto risco apenas. A detecção ocorre por eletroforese convencional e não utiliza o PCR nested (duplicado). A diferença com a presente invenção está na detecção de 40 tipos virais com 40 pares de primers diferentes em PCR nested, que inclui uma primeira amplificação geral e uma segunda amplificação específica duplicada multiplex. Além do mais a detecção proposta nessa invenção é muito superior por ser simultânea em uma única reação com eletroforese capilar por fluorescência à laser.

[9] A patente DE19903056A1 refere-se à detecção de tipos virais por PCR nested. Utiliza 4 primers na primeira reação e 8 sondas na segunda e reivindicam que detectam aproximadamente 30 tipos virais, especificando apenas 6 tipos virais (6, 1 1 , 16, 18, 31 , 33), sendo os últimos 4 classificados como de alto risco. A detecção é feita por hibridação com duas sondas específicas em blots de membrana (strips). Diferentemente da presente invenção que utiliza uma amplificação primária com vários primers gerais degenerados (10), além de mais três primers como controle interno (beta- globina). A segunda reação ocorre simultaneamente com mais 40 pares de primers específicos com detecção por fluorescência à laser em eletroforese capilar, e não por hibridação, o que torna a presente tecnologia mais competitiva e de alto desempenho, com menos manipulações.

[10] A patente KR2004047238A reivindica apenas as sequências de três conjuntos de pares de primers, 6 ao todo, para detecção geral de vários tipos de HPV de forma inespecífica por PCR convencional, sendo que existem amplificações comuns entre eles, provavelmente devido à grande variabilidade virai. O método de detecção não é explorado. Não existe qualquer similaridade com a presente invenção. [1 1 ] A patente CN102229930A utiliza uma tecnologia de PCR em tempo real multiplex para detecção de 18 tipos virais de alto risco. A patente descreve 18 pares de primers e suas sondas associadas, sendo uma tecnologia diferente da PCR nested com detecção simultânea de 40 tipos virais por fluorescência reivindicadas na presente invenção, com sensibilidade comparável. Contudo a referida patente necessita de vários multiplex, pois a PCR em tempo real possui no máximo até 4 fluoróforos possíveis, o que permite a detecção simultânea de somente 4 tipos de cada vez, portanto não apresentando o alto desempenho reivindicado pela presenteinvenção que realiza o teste em um único tubo para tipagemsiul de 40 tipos virais.

[12] A patente US 6,482,588 B1 descreve duas regiões amplificadas com 3 primers (SGP1 , SGp2 e SGP3), sendo o último comum à extremidade da região amplificada pelos primers MY1 1 /MY09, ou seja, fora da região da presente invenção, além de usar uma plataforma diferente conhecida como Li PA, ou também slot-blot reverso. As sondas usadas nesse sistema são menores e muito diferentes da presente invenção.

[13] A patente WO 2008/089519 A1 reivindica a detecção de 17 tipos virais por PCR em tempo real com multiplex de 4 conjuntos de primers. A patente também reivindica dois primers para detecção geral {screening), demonstrando ser superior ao sistema de diagnóstico "Captura Híbrida 2". Nenhuma sequência dosprimersreinvindicados coincide com os primers da presente invenção, contudo a tecnologia reivindicada naquela patente requer múltiplos painéis de primers, enquanto que a presente invenção propõe a amplificação em um único tubo de 40 tipos virais.

[14] Um outro sistema semelhante à patente anterior foi desenvolvido para quantificação de sete tipos virais de alto risco por PCR em tempo real em multiplex (SCHMITZ M, SCHEUNGRABER C, HERRMANN J et al. 2009. J. Clin.Virol, 44, p.302-307). Esta técnica utiliza 7 pares de primer e sete sondas, os quais possuem sequências bem diferentes da presente invenção que detecta 40 tipos virais por outra tecnologia.

[15] A patente WO 201 1 /088573 A1 é um deposito recente, depositada nove anos mais tarde que a patente que originou a presente invenção, a qual detectava 32 tipos virais com 32 pares de primers (PI0302987-5 de 16/07/2003). O depósito WO 201 1 /088573 A1 baseia-se na amplificação com o par de primers GP5+/GP6+ (SNIJDERS PJF, VAN DE BRULE AJF, SCHRIJNEMAKERS HJF et al. 1990. J. Gen. Virol. 71 , p.173-181 ; Patente WO 91 /10675), mas com detecção por hibridação com 46 sondas no sistema Luminex, que se baseia emcitometria de fluxo com microesferas fluorescentes. A presente invenção baseia-se na amplificação por PCR nested com detecção fluorescente em sistema de eletroforese capilar. É importante enfatizar que estas sequências funcionam como sondas de hibridação no equipamento Luminex, enquanto que na presente invenção se refere a um dos primers do par que reconhece o tipo virai por PCR nested e detecção por fluorescência em eletroforese capilar.

[16] Contudo, a frequência de lesões com resultados falso-negativos para a presença de HPV tem aumentado, sugerindo que uma parte substancial de tipos virais não está sendo detectada e consequentemente os estudos epidemiológicos bem como as ações para a prevenção e tratamento têm sido prejudicadas.

[17] Com o intuito de buscar uma metodologia capaz de realizar a tipagem rápida, eficiente e mais sensível dos papilomavírus humanos que englobam pelo menos os 40 tipos virais mais frequentes associados a lesões do colo uterino e pênis, dentre os mais de 100 tipos já descritos, desenvolveu-se uma técnica variante da PCR (Patente US 4,683,195 e 5,639,871 ), a PCR Nested, com múltiplos primers simultâneos (também chamada de PCR Multiplex), descrita pela primeira vez em 1994 (Patente US 5,364,759) para a genotipagem simultânea de STRs (repetições curtas consecutivas de DNA). A presente invenção apresenta essa técnica associada a um equipamento de eletroforese capilar com detecção por fluorescência foi aplicada para a detecção simultânea de 40 tipos do vírus HPV em um único tubo, englobando os tipos mais frequentes em amostras frescas ou conservadas em parafina do colo uterino, região anogenital, pele, trato respiratório e digestivo.

[18] Importante enfatizar que a presente invenção também propiciou a determinação da carga virai relativa entre os vírus infectantes em uma amostra, após a realização de uma série de diluições da mesma, permitindo, assim, a verificação da dominância virai na lesão, propiciando a adoção de critérios específicos para o tratamento e observações clínicas conforme o tipo de vírus dominante. Caso o tipo dominante seja de alto risco, como o HPV16, o risco de câncer in situ é muitas vezes aumentado, subsidiando as medidas terapêuticas e profiláticas a serem adotadas.

[19] Listagem de figuras

[20] A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descrição detalhada, em consonância com as figuras em anexo, onde:

[21 ] FIGURA 1 representa esquematicamente a plataforma comercial de larga escala da PCR Nested Multiplex utilizada para detectar simultaneamente os 40 tipos do HPV em uma única amostra, em um ensaio realizado em duas etapas com duração média de 6 horas.

[22] FIGURA 2 demonstra os dados utilizados para a construção de um novo PeakFilter no softwareFragment Profiler do sequenciador automático capilar (MegaBace 1000) específico para cada tipo de HPV.

[23] Referente à FIGURAI , a plataforma comercial de PCR Nested Multiplex é extremamente específica, dispondo-se da utilização de pr/mersespecíficos marcados, onde os 40 tipos de HPV amplificados isoladamente são submetidos à corrida eletroforética em um sequenciador automático. Utiliza-se o padrão interno de peso molecular ETRox-550 (GE Healthcare) para a análise das amostras. Como controle da amplificação é utilizado o gene Beta-Globina, presente em todos os ensaios.

[24] Referente à FIGURA2, construiu-se um novo PeakFilter no softwareFragment Profiler para permitir a leitura eletroforética e análise dos dados, contemplando as três marcações fluorescentes (FAM, HEX e TAMRA).

[25] Descrição da invenção

[26] Para melhor compreensão do método proposto segue abaixo uma descrição detalhada da invenção.

[27] O DNA virai é obtido a partir de células do colo cervical, raspado peniano, ânus, boca, pele, blocos de parafina entre outras amostras de origem humana (GRIFFITH et al. 2001 . Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vols. 1 , 2 and 3). O fragmento da \ - reação de PCR que amplifica uma região genômica específica do HPV (L1 ) é usado como base para a degeneração e o desenho e síntese de novos marcadores, sequência esta amplificada pelos primers degenerados MY09 e MY1 1 que constituem parte da Patente US 5,364,758. Neste sentido, foram desenvolvidos 10 primers, 5no sentido de leitura do DNA e 5 no anti-sentido, formando 25 combinações de pares de primers. Estas combinações de primers podem detectar a presença de vírus em células descamadas de qualquer amostra orgânica a ser testada, podendo detectar todos os tipos de HPV descritos na literatura, baseando-se nas sequências depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). A tipagem do vírus é obtida a partir de uma segunda reação chamada nested (ou duplicada), a qual é executada a partir de 40 pares deprimers específicos. Os primers foram combinados em uma reação multiplex em um tubo único possibilitando a análise específica de 40 tipos de virais do HPV.

[28] As reações de amplificação do HPV foram realizadas em duas etapas, a primeira com a utilização de dez pr/mersdegenerados e modificados (ID Sequências n- 01 , 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09 e 10) gerando um fragmento de 450 pares de bases (PCR-OUT). Esta reação é realizada para detecção do vírus nos pacientes, amplificando uma região comum aos 40 tipos de papilomavírus. É composta de 1 X tampão Taq Platinum, 25-30 pmoles de cada primer degenerado e modificado de consenso, 1 ,5 U Taq DNA polimerase, 200 μΜ de dNTPs, 2 pmoles de cada primer do gene de controle interno da beta globina (ID Sequências n ² 1 1 e 12) e 7 μΙ_ de DNA para um volume final de 30 μΙ_. As condições da reação foram: 40 ciclos de 94 ^Q C por 1 min., 50 ^Q C por 1 min., 72 ^Q C por 2 min., e extensão final a 72 ^Q C por 5 min. e 4 ^Q C por 5 min.

[29] Na segunda etapa, 2 μΙ_ do produto amplificado na primeira reação foram usados como templateem cada mix, de acordo com a reação Multiplex- Nested previamente padronizada. Esta reação consiste de 1 X tampão taqPhoneutria, 0,5 pmol de pr/mersespecíficos (ID Sequências n- 14 a 93) para os 40 tipos de papilomavírus, 0,2 pmol de cada primer do gene constitutivo da beta-globina (ID Sequências n- 12 e 13), 1 ,0 U Taq DNA polimerase, 200 μΜ de dNTPs, 1 X de enhancer para um volume final de 15 μΙ_. As condições da reação foram: 95 ^Q C por 1 min., 36 ciclos de 95 ^Q C por 1 min., 56 ^Q C por 1 min., 72 ^Q C por 40 s., e extensão final a 72 ^Q C por 5 min. e 4 ^Q C por 5 min. Dois microlitros do produto amplificado são submetidos à corrida eletroforética em capilar no sequenciador MegaBace 1000® (GE Healthcare), sendo utilizado o padrão interno de peso molecular ET550-R (GE Healthcare) para a análise das amostras. Como controle da amplificação é utilizado o gene da Beta-Globina, presente em todos os ensaios.

[30] A seguir encontram-se a identidade e as sequências dos oligonucleotídeos (direção 5'→3') usados para a amplificação nas duas reações sequenciais de PCR (Nested Multiplex). As sequências estão divididas em oligonucleotídeos gerais (1 ^â reação) e específicos {2- reação), totalizando as Seq. ID N° 01 a Seq. ID N° 93.