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Title:
OPHIOBOLIN COMPOUND MOTHER NUCLEUS SYNTHETIC GENE AUOS AND APPLICATION THEREFOR
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/150357
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided are an ophiobolin compound mother nucleus synthetic gene AuOS and application therefor. The gene is derived from Aspergillus ustus 094102, and a gene sequence, a cDNA sequence and an amino acid sequence of an encoding AuOS protein are shown as SEQ ID NO. 1-3 respectively. The AuOS protein has the functions of extension of catalysis substrate chain length and structure cyclization, can react with IPP by using DMAPP, GPP, FPP and GGPP as substrates to produce an ophiobolin compound mother nucleus and can be used for preparing an ophiobolin compound and studying a biosynthetic pathway of the ophiobolin compound.

Inventors:
HONG KUI (CN)
MENG HUIYING (CN)
CHAI HANGZHEN (CN)
YIN RU (CN)
DENG ZIXIN (CN)
Application Number:
PCT/CN2016/076822
Publication Date:
September 29, 2016
Filing Date:
March 21, 2016
Export Citation:
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Assignee:
UNIV WUHAN (CN)
International Classes:
C12N15/54; C12N1/21; C12N9/10; C12N15/70; C12N15/79; C12P1/00; C12R1/70
Foreign References:
CN104673813A2015-06-03
Other References:
DATABASE GenBank [O] 4 January 2016 (2016-01-04), PRIEBE, S. ET AL.: "Hypothetical Protein ASPCAL05226 [Aspergillus Calidoustus", XP055315415, Database accession no. CEL04094.1
CHIBA, R. ET AL.: "Identification of Ophiobolin F Synthase by a Genome Mining Approach: A Sesterterpene Synthase from Aspergillus clavatus", ORGANIC LETTERS, vol. 15, no. 3, 1 February 2013 (2013-02-01), pages 594 - 597, XP055315416, ISSN: 1523-7060
Attorney, Agent or Firm:
WUHAN KEHAO INTELLECTUAL PROPERTY ATTORNEYS (SPECIAL GENERAL PARTNERSHIP) (CN)
武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) (CN)
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Claims:
权利要求书

[权利要求 1] 一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因, 其特征在于: 为焦曲霉 0941

02的 AMOS基因, 其基因序列如 SEQ ID N0.1所示。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的蛇孢假壳素类化合物母核合成基因, 其特征在 于: 所述的 AMOS基因的 cDNA序歹 IJ如 SEQ ID N0.2所示。

[权利要求 3] 权利要求 1或 2所述的蛇孢假壳素类化合物母核合成基因编码的 AuOS 蛋白, 其特征在于: 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.3所示。

[权利要求 4] 一种表达权利要求 3所述的 AuOS蛋白的载体, 其特征在于: 为含有权 利要求 1或 2所述基因的真核或原核表达载体。

[权利要求 5] —种表达权利要求 3所述的 AuOS蛋白的宿主细胞, 其特征在于: 含有 权利要求 4所述的载体。

[权利要求 6] 权利要求 1或 2所述的基因或权利要求 3所述的蛋白在制备蛇孢假壳素 类化合物中的应用。

[权利要求 7] 权利要求 1或 2所述的基因或权利要求 3所述的蛋白在研究蛇孢假壳素 类化合物的生物合成途径中的应用。

Description:
发明名称:一种蛇孢假壳素类化合物母核合成 基因^ «α^及其应用 技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域, 具体涉及一种从焦曲霉 094102 ( Aspergillus ustus

094102) 中克隆得到的蛇孢假壳素 (ophiobolin) 类化合物母核合成基因 AMOS及 其应用。

背景技术

[0002] 1957年 Orsenigo从植物病原真菌 Bipolaris 中分离到第一个蛇孢假壳素类 化合物, 即蛇孢假壳素 A (M. ORSENIGO. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta da Helmintosporium oryzae. Phytopath. Z. 1957

29, 189-196) , 到目前为止已发现该类化合物 30余种, 其来源菌株均属于丝状 真菌。

蛇孢假壳素 (ophiobolin) 类化合物属于二倍半萜烯化合物, 其结构特征是均 具有一个三轮列的 C5-C8-C5环母核结构 (图 1 ) 。 到目前为止发表的具有 C5-C8- C5环母核结构的蛇孢假壳素类化合物主要有蛇 假壳素 A、 C、 F、 H、 M、 L (

M. ORSENIGO. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta da Helmintosporium oryzae. Phytopath. Z. 1957, 29, 189-196) 、 蛇孢假壳素 0、 Q 、 R、 S (CL Tipton , T Tovrea, G Whitehurst.The effect of ophiobolin A on glucose uptake by animal cells.Nutr.Rep.Int. l981,23:723-727) 等。 该类化合物显示 广谱的抗菌活性 (如抗真菌、 抗细菌) 和抗线虫、 抗病毒等活性, 此外还对多 种肿瘤细胞株具有显著细胞毒活性。 据报道, 该家族的蛇孢假壳素 0不仅能抑制 乳腺癌细胞株 MCF-7的增殖 (Tingting Yang, Zhenyu Lu, Li Meng, et al. The novel agent ophiobolin 0 induces apoptosis and cell cycle arrest of MCF-7 cells through activation of MAPK signaling pathways. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.

2012, 22, 579-585) , 还能逆转乳腺癌耐药细胞株 MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性

(Wenxia Sun, Cuiting Lv, Tonghan Zhu, et al. Ophiobolin-0 reverses adriamycin resistance via cell cycle arrest and apoptosis sensitization in adriamycin-resistant human breast carcinoma (MCF-7/ADR) cells. Marine Drugs. 2013, 11, 4570-4584

[0004] 由于蛇孢假壳素类化合物广泛而重要的生物活 性, 提高该类化合物的产量以及 阐明其合成机制的研究引起了关注。 从 1992年幵始陆续有关于蛇孢假壳素类化 合物及其母核化学合成的报道, 但该类化合物的复杂结构使其化学合成的研究 极具挑战性, 到目前仅完成了蛇孢假壳素 A的全合成 (Kazuhiro Tsuna, Naoyoshi

Noguchi, Masahisa Nakada. Enantioselective total synthesis of (+)-ophiobolin A. Chemistry-A European Journal. 2013, 19, 5476-5486; Ke Li, Cheng Wang, Gang Yin. et al. Construction of the basic skeleton of ophiobolin A and variecolin. Organic &

Biomolecular Chemistry. 2013, 11, 7550-7558) , 而且合成步骤繁琐不易操作。

[0005] 从蛇孢假壳素类化合物的生物合成机制入手, 利用其生物合成相关基因的超表 达或异源表达来提高该类化合物产量的相关研 究显得更有价值。 从 1967年到 196 9年, Canonica (L. Canonica, A. Fiecchi, M. G. Kienle, et al. Tetrahedron Letters. 1967, 35, 3371-3376) 和 Nozoe (S. Nozoe, M. Morisaki, S. Okuda, et al. Tetrahedron Letters. 1968, 19, 2347-2349; S. Nozoe, M. Morisaki. Chemical Communications.

1969, 1319- 1320.) 等利用同位素标记初步确定蛇孢假壳素类化合 物的三环母核 来自香叶基法尼基焦磷酸 (GFPP) 的成环, 但未涉及到蛇孢假壳素类化合物合 成相关的基因或酶。 直到 2013年, Ryota等为了挖掘新代谢产物, 用 A^er^ZZ^ o/ Z 表达系统对来自棒曲霉 NRRL 1 ( Aspergillus clavatus NRRL 1 ) 的

ACLA_7 50基因进行异源表达, 发现主体产物是蛇孢假壳素 F (Ryota Chiba,

Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597) , 证明了该 GGPPS就是 AcOS ( A. clavatus NRRL 1 ophiobolin

F合成酶) 。 这是蛇孢假壳素类化合物生物合成相关酶的首 次报道。 AcOS属于 嵌合型萜类合成酶, 其 N端和 C端分别包含萜类合成酶结构域和 E-IPPS (反式异 戊烯基焦磷酸合成酶) 结构域。 但其酶学方面研究并不深入, 例如有关 E-IPPS 结构域的底物专一性的研究, 即该结构域更倾向于识别并结合四种底物即二 甲 基烯丙基焦磷酸 (DMAPP) 、 香叶基焦磷酸 (GPP) 、 法尼基焦磷酸 (FPP) 和 香叶基香叶基焦磷酸 (GGPP) 中的哪一种尚有待明确。

[0006] 目前已知蛇孢假壳素类化合物的母核均包含三 轮列的 C5-C8-C5环, 但母核包含 的烯键数目和位置却不尽相同, 如蛇孢假壳素 E比蛇孢假壳素 F多出 C 10 -C 14 fPC 1 2 -C 13 两个烯键, 暗示其成环机制并非完全相同。 因此有必要挖掘更多蛇孢假壳 素类化合物母核合成相关蛋白, 从系统研究角度深入探讨其成环机理。 但目前 仅有棒曲霉 NRRL 1菌株中蛇孢假壳素 F合成酶的报道。

技术问题

[0007] 本发明的目的在于提供一种蛇孢假壳素类化合 物母核合成基因, 本发明的目的 还在于提供该基因的应用。

问题的解决方案

技术解决方案

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:

[0009] 一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因, 为焦曲霉 094102 (保藏编号为 CCTC C NO: M 208153) 中克隆得到的 AMOS基因, 其基因序列如 SEQ ID N0.1所示。 所述的 AMOS基因含有 3个内含子, 其 cDNA大小为 2178bp, 序列如 SEQ ID N0.2 所示。 所述的蛇孢假壳素类化合物包括具有一个三轮 列的 C5-C8-C5环母核结构 特征的一系列蛇孢假壳素类化合物, 如蛇孢假壳素 K、 6-表蛇孢假壳素 Κ、 蛇孢 假壳素 G、 6-表蛇孢假壳素 G、 6-表蛇孢假壳素 Q、 蛇孢假壳素 U、 6-表蛇孢假壳 素 V和蛇孢假壳素 W等。

[0010] 所述的 AMOS基因编码的蛋白, 命名为 AuOS蛋白, 其氨基酸序列如 SEQ ID

N0.3所示。 AuOS蛋白包含了两个结构域, 即 N端约 324个氨基酸组成的萜类合成 酶结构域和 C端约 401个氨基酸组成的 E-IPPS (反式异戊烯基焦磷酸合成酶) 结 构域。 其中, 萜类合成酶结构域含有两个用于识别 Mg 2+和底物的特征性保守基 序 DDEID和 NDLFSYEKE , E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性 保 守基序 DDIED和 DDYQN。

[0011] 本发明所述的 AuOS蛋白可通过用各种表达系统 (如大肠杆菌和链霉菌等所有 原核表达系统, 以及毕赤酵母、 酿酒酵母和米曲霉等所有真核表达系统) 对 AMOS基因进行异源表达得到, 同吋 AuOS蛋白可通过用各种纯化方法 (如镍离子 金属螯合亲合层析等) 得到。

[0012] 上述 AuOS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的 能, AuOS蛋白能以 DM APP (二甲基烯丙基焦磷酸) 、 GPP (香叶基焦磷酸) 、 FPP (法尼基焦磷酸) 和 GGPP (香叶基香叶基焦磷酸) 这 4种化合物为底物, 分别添加 IPP吋直接合成 蛇孢假壳素类化合物的母核。

发明的有益效果

有益效果

[0013] 基于上述 AuOS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的 能, AMOS基因不仅 可以用于进一步解析蛇孢假壳素类化合物的生 物合成途径, 而且有助于蛇孢假 壳素合成酶酶学领域的深入研究, 同吋 AuOS蛋白可以催化底物制备蛇孢假壳素 类化合物的母核, 经过氧化还原等修饰手段得到蛇孢假壳素类化 合物, 在蛇孢 假壳素类化合物的产量提高方面也有着重要的 意义。

[0014] 本发明首次发现了焦曲霉 094102的 AMOS基因, 其编码的蛋白可以以 DMAPP为 底物从头合成蛇孢假壳素类化合物母核, 可以以体外酶促反应形式或以基因工 程菌形式合成蛇孢假壳素类化合物母核, 该母核还可通过化学或生物的方式进 行结构修饰而产生系列具有重要药用价值的化 合物。

对附图的简要说明

附图说明

[0015] 图 1是蛇孢假壳素 (ophiobolin) 类化合物母核的结构图。

[0016] 图 2是焦曲霉 094102AMOS基因编码的蛋白 AuOS与棒曲霉 NRRL 1 AcOS蛋白的 氨基酸序列比对结果。

[0017] 图 3是 AMOS

基因异源表达蛋白的表达结果图, 其中, 1 : pET28a诱导前, 2: pET28a诱导后

, 3: pET28a- AiiOS诱导前, 4: pET28a- AMOS诱导后, M: Page Ruler Prestained

Protein Ladder °

[0018] 图 4是 AMOS基因异源表达蛋白的纯化结果图, M: Page Ruler Prestained Protein Ladder。 [0019] 图 5是以 DMAPP、 IPP为底物体外反应的色谱图。

[0020] 图 6是以 DMAPP、 IPP为底物体外反应的质谱图。

[0021] 图 7是以 FPP、 IPP为底物体外反应的色谱图。

[0022] 图 8是以 FPP、 IPP为底物体外反应的质谱图。

[0023] 图 9是以 GPP、 IPP为底物体外反应的色谱图。

[0024] 图 10是以 GPP、 IPP为底物体外反应的质谱图。

[0025] 图 11是以 GGPP、 IPP为底物体外反应的色谱图。

[0026] 图 12是以 GGPP、 IPP为底物体外反应的质谱图。

本发明的实施方式

[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的 描述, 下述实施例仅用来说明本 发明, 并不限制本发明的范围。

[0028] 本发明所提供的蛇孢假壳素类化合物母核合成 基因, 是从焦曲霉 094102 (

Aspergillus ustus 094102) 中克隆得到, 命名为 AMOS基因, 其基因序列如 SEQ ID N0.1所示。 AMOS基因含有 3个内含子, 其 cDNA大小为 2178bp, 序列如 SEQ ID N0.2所示。 AMOS基因编码的蛋白, 命名为 AuOS蛋白, 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.3所示。

[0029] 从公共数据库上搜索焦曲霉 094102 AuOS蛋白的同源序列进行比对, 结果显示 目标蛋白 AuOS与来自棒曲霉 NRRL 1 ( Aspergillus clavatus NRRL l ) 的 AcOS ( A. clavatus NRRL 1 ophiobolin F合成酉每) (Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597) 同源性较高 (65%) 。 AuOS蛋白属于嵌合型萜类合成酶, 其 N端和 C 端分别包含约 324个氨基酸组成的萜类合成酶结构域和 401个氨基酸组成的 E -IPPS (反式异戊烯基焦磷酸合成酶) 结构域, 这两个保守结构域与其蛋白功能 密切相关。 其中, 萜类合成酶结构域含有两个用来识别 Mg 2+和底物的特征性保 守基序 DDEID和 NDLFSYEKE、 E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征 性保守基序 DDIED和 DDYQN (图 2) 。 [0030] 实施例 1 AMOS基因克隆

[0031] 1、 焦曲霉 094102菌株的 RNA提取

[0032] 以焦曲霉菌株 094102的菌丝为材料, 用德国 QIAGEN公司的 RNeasy Mini

Kit (50) 试剂盒 (货号为 74104) 提取总 RNA, 具体操作如下:

[0033] ( 1) 估算菌丝样品的用量。 每次微量提取一般需要 50 mg菌丝。

[0034] (2) 用液氮将样品研磨成粉末, 转移至 1.5 mL塑料离心管中。

[0035] (3) 在离心管中加入 450 Buffer RLT (Lysis buffer) (Buffer

RLT使用前每 l mL加 ΙΟ μί β-巯基乙醇) , 在振荡器上振荡 1-3 min混匀 (振荡器 振荡吋必须使管底溶液振荡起来) 。

[0036] (4) 4 °C 13000xg离心 2 min, 将上清液转移至另一干净的 1.5 mL塑料离心管中

(下层有机相和中间层含有 DNA、 蛋白质和其他杂质, 避免触及或吸取) 。

[0037] (5) 加入 0.5倍体积无水乙醇, 充分颠倒混匀, 制得混合溶液。

[0038] (6) 将上述混合溶液转移到离心吸附柱中, 4 °C 8000xg离心 15 s, 弃穿透液。

[0039] (7) 将 700 Buffer RW1 (wash buffer) 加入到离心吸附柱中, 4 °C 8000xg 离心 15 s, 弃穿透液。

[0040] (8) 将离心吸附柱转移到新的收集管 (无 RNA酶) 中, 加入 500 Buffer

RPE (wash buffer) , 4 °C 8000xg离心 15 s, 弃穿透液。

[0041] (9) 加入 500 Buffer RPE (wash buffer) (Buffer RPE使用前力口 4倍体积无 水乙醇) , 4。C 13000xg离心 2 min。

[0042] ( 10) 将离心吸附柱转移到新的收集管 (无 RNA酶) 中, 4 °C 13000xg离心 1 min°

[0043] ( 11) 将离心吸附柱转移到新的 1.5

mL塑料离心管 (无 RNA酶) 中, 加入 30-50 RNase-free water, 4 °C 8000xg离 心 1 min, 离心管中的溶液即为去除 DNA污染的 RNA样品。

[0044] ( 12) 取 40 μΟ ΝΑ样品转移到新的 1.5

mL塑料离心管 (无 RNA酶) 中, 加 DNase l和 DNase l buffer各 5 L, 37 °C处理 2 h。

[0045] ( 13) 加入 5 L 50 mM EDTA, 65 °C处理 10 min后 -80 °C保存。 [0046] 2、 反转录

[0047] 采用美国赛默飞世尔科技公司的 Revert Aid First strand cDNA synthesis kit (货号 为 K1621) 进行反转录, 操作步骤如下:

[0048] ( 1) 取上述制备的 RNA样品 2 μ β , 加入 ΙμΙ^ ΙΟμΜ Oligo(dT) 18 , RNase-free water补足至 12 μL, 65 °C处理 5 min后置冰上冷却 5 min, 4 °C 13000xg离心 2 min

[0049] (2) 加入 4 L 5xReaction buffer, 1 Ribo Lock RNase Inhibitor, 1

RevertAid RT, 2 10 mM dNTP Mix, RNase-free water补足至 20 L。 42 °C处理 60 min后 70 °C处理 5 min。

[0050] 3、 AMOS基因的扩增

[0051] 根据焦曲霉 094102菌株的基因组测序结果, 设计扩增 AMOS基因的引物:

[0052] 正向引物 AMOS-F: 5, - CAT ATGATGGAGT ATAAGT ACTCGACC-3, (为了便 于其表达载体的构建, 引入酶切位点 fel) ;

反向引物 AMOS-R: 5'- AAGCTT TCAAACCTTCAGCAGCTCCA-3' (为了便于 其表达载体的构建, 引入酶切位点 Himmi) 。

[0054] 反应体系为: 1 美国 New England Biolabs公司的 Pfu高保真 DNA聚合酶, 21 灭菌去离子水, 1 L Pfu高保真 DNA聚合酶自带的 5xNF buffer, 正向、 反向引 物各 2.5 L ( 10 μΜ) , cDNA模板 2 L。

[0055] PCR扩增条件为: 95 °C预变性 3 min; 95 °C变性 30 s ; 53 °C退火 20 s, 72 °C延 伸 70 s, 35个循环; 72 °C充分延伸 10 min。

[0056] 4、 目的 DNA回收

[0057] PCR产物电泳后, 按照德国 OMEGA公司的 Gel Extraction Kit ( 100) (货号: D2500-01) 的说明书, 从琼脂糖凝胶中回收目的 DNA片段。 具体操作步骤如下

[0058] ( 1) 使用三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 (简称为 TAE) 缓冲液制作 1.0%的琼脂糖凝 胶, 对目的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

[0059] (2) 在紫外灯下切下含有目的 DNA片段的凝胶, 用纸巾吸尽凝胶表面的液体

(此吋应尽量切除不含目的 DNA部分的凝胶, 尽量减小凝胶体积, 提高 DNA回 收率) 。

[0060] (3) 切碎胶块 (胶块切碎后可以加快胶块融化吋间, 提高 DNA回收率) 。

[0061] (4) 称量胶块重量, 计算胶块体积。 按每 100 mg琼脂糖凝胶 400 的比例加 入 Binding buffer, 50-60 °C处理约 10 min (每隔 2 min混匀一次, 直至胶块完全融 化) 。

[0062] (5) 将融化的胶溶液转移到收集管的吸附柱内, 室温 lOOOOxg离心 1 min, 弃 滤液。

[0063] (6) 加入 500 L XP2 (Binding buffer) 至吸附柱中, 室温 10000xg离心 1 min, 倒掉收集管中的滤液, 将吸附柱放回到收集管中。

[0064] (7) 加入 700 L SPW (Wash buffer) 至吸附柱中, 室温 10000xg离 1 min, 倒 掉收集管中的滤液, 将吸附柱放回到收集管中。

[0065] (8) 加入 300 L SPW (Wash buffer) 至吸附柱中, 室温 10000xg离心 1 min, 倒掉收集管中的滤液, 将吸附柱放回到收集管中。

[0066] (9) 室温 10000xg幵盖离心 2 min。

[0067] ( 10) 将吸附柱放入另一干净的 1.5 mL塑料离心管中, 在吸附柱模的中央处加 入 30-50 μL Elution buffer或无菌水, 室温放置 2-5 min后室温 10000xg离心 1 min。

[0068] ( 11) 回收产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

[0069] 5、 目的 DNA的克隆

[0070] 回收的目的 DNA于 16 °C与pEASY-Blunt载体连接 2-4

h, 连接产物转化大肠杆菌 TOP 10感受态细胞, 过夜培养后采用快速检验的方法 初步筛选阳性克隆子, 方法如下:

[0071] ( 1) 用无菌牙签在转化平板上挑取约 20个单克隆子, 在含有氨苄抗性 (100 g/mL) 的 LA平板上划线, 于 37 °C培养 8 h。

[0072] (2) 在 1.5 mL塑料离心管中加入 30 L STE溶液 (20 mM Tris-HCl, 25 mM

EDTA, 75 mM NaCl) , 用牙签将扩大培养后的单克隆子分别挑取到上 述塑料离 心管中涡旋处理约 2min, 使其充分混匀。

[0073] (3) 加入等体积氯仿:酚:异戊醇 ( V:V:V = 24:25: 1) , 轻摇混匀后, 室温 10000 xg离心 5min。 [0074] (4) 上清液用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 初步确定克隆子含有的质粒是否插 入外源片段。

[0075] 用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量 提取试剂盒对含有外源片段的克 隆子进行质粒抽提, 具体操作如下:

[0076] ( 1) 将单克隆子接入含氨苄抗性 (lOO g/mL) 的 5 mL LB培养基中, 于 37 °C 条件下, 220 r/min过夜培养后转移 2 mL菌液至 2 mL塑料离心管中, 于室温 12000 xg离心 l min, 弃上清。

[0077] (2) 加入 250 Buffer 1, 于漩涡振荡器上剧烈震荡, 使菌体充分重悬。

[0078] (3) 加入 250 Buffer 2, 温和颠倒离心管 5-6次, 直到体系变清亮为止。

[0079] (4) 加入 350 Buffer 3, 温和颠倒离心管 3-5次以充分混匀。

[0080] (5) 室温 12000xg离心 10

min, 将上清液小心转入收集管的吸附柱中, 室温 12000xg离心 1 min, 倒掉收集 管中的液体, 将吸附柱放回收集管。

[0081] (6) 加入 500 Buffer D, 室温 12000xg离心 1 min, 倒掉收集管中的液体, 将 吸附柱放回收集管。

[0082] (7) 加入 600 Buffer W, 室温 12000xg离心 1 min, 倒掉收集管中的液体, 将吸附柱放回收集管。

[0083] (8) 再次加入 300 Buffer W, 室温 12000xg离心 1 min。

[0084] (9) 将吸附柱转移到另一干净 1.5 mL塑料离心管中, 在吸附膜的中央处悬空 加入 50-100 μL Buffer E后室温静置 1 min, 室温 12000xg离心 1 min洗脱克隆子的 质粒。

[0085] 将获得的质粒用美国 New England Biolabs公司的高保真限制性内切酶 M 和 Hz'mmi双酶切 (2 L Cutsmart buffer, 0. 5 λ, ΝάεΙ, 0.5 ^l^ Hindm , 1

质粒 DNA, 16 μί άάΗ 2 0 , 37 °C处理 1 h) 后, 用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 确定克隆子携带的外源 DNA片段是否是目的 DNA片段。 取 1 mL含有目的 DNA片 段的克隆子菌液送交擎科测序公司测序, 测序结果证实该克隆子的确含有目的 D NA片段, 且目的 DNA片段没有出现突变。 将该阳性克隆子的重组质粒命名为 pEASY -Blunt- AuOS。

[0086] 实施例 2 AuOS蛋白的表达和纯化

[0087] 1、 含 AMOS基因大肠杆菌表达载体的构建

[0088] 构建含 AMOS

基因的大肠杆菌表达载体, 经热激转化法转入大肠杆菌 BL21 (DE3) , 进一步 验证 AMOS基因的功能。

[0089] 用限制性内切酶 和 H^ifln从含有目的基因的重组质粒 pEASY

-Blunt- AMOS中切下目的片段, 同吋用 M 和 H^iffll双酶切 pET28a载体, 琼脂 糖凝胶电泳分离后, 用 OMEGA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和 pET28a载 体的大片段。 利用 T4 DNA连接酶将 基因正向插入到 pET28a载体中, 将连 接产物转化大肠杆菌 TOP 10感受态细胞, 经克隆子快速检验和质粒酶切验证鉴 定后, 获得大肠杆菌重组表达载体 pET28a- AMOS。

[0090] 2、 AMOS基因的表达

[0091] 将重组质粒 pET28a- A M OS及 pET28a质粒通过热激转化法分别转入表达宿主菌 大 肠杆菌 BL21 (DE3) 中, 用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量 提取试 剂盒对转化子进行质粒抽提, 经限制性内切酶 Mfel和 H m/ m酶切验证鉴定, 成 功获得分别含重组质粒 pET28a- A M OS及 pET28a质粒的大肠杆菌表达菌株。

[0092] 分别挑取含重组质粒 pET28a- A M OS及 pET28a质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3) 单 菌落接种至含卡那霉素抗性 (50 g/mL) 的 5 mL LB培养基, 于 37 °C, 220 r/min 过夜培养。 按 1%的接种量将新鲜菌液接种至含卡那霉素抗性 (50 g/mL) 的 5 mL LB培养基中, 继续培养 2-3 h至 OD 6 。。达至 IJO.4-0.6日寸, 加入 IPTG至终浓度为 1 mM, 于 37 °C下诱导培养约 3-5 h (诱导前分别取出 1 mL菌液作为对照) 。 分别 取出诱导前和诱导后的菌液 200 μί, 加入 5xSDS-PAGE样品缓冲液煮沸 30 min, 室温 12000xg离心 10 min, 各取 10 上清液进行 SDS-PAGE检测, 结果 (图 3) 表明目的蛋白在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中成功表达。

[0093] 3、 AuOS蛋白的纯化

[0094] 取 5 mL过夜培养的含重组质粒 pET28a- AuOS

的大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌液按 1%的接种量接种至含卡那霉素抗性 (50 g/mL ) 的 500 mL LB培养基中, 于 37 °C条件下, 220 r/min培养至 OD 6 。。达 Sj0.4-0.6曰寸 , 加入 IPTG至终浓度为 1 mM, 于 37 °C下诱导培养约 3-5 h。 然后室温 5000 r/min 离心 5 min收集诱导表达后的大肠杆菌菌体, 用无菌 ddH 2 0悬浮菌体, 室温 5000 r/min离心 5 min后去除上清 (重复两次, 彻底清洗细胞) 。 之后用 HEPES缓冲液 悬浮菌体, 室温 5000 r/min离心后去除上清。 将 10 mL HEPES缓冲液加入菌体细 胞中, 充分混匀后将细胞悬液置冰水浴中超声 (参数: 超声 5 mS, 间歇 5 mS, 功率 300 W) 处理 30 min。 然后室温 23000 rpm离心 20 min, 取上清液用 0.45 μηι 滤膜过滤后进行蛋白纯化。 纯化方法如下:

[0095] (1) 取适量镍珠基质上柱, 使基质里的无水乙醇在重力作用下充分流出。

[0096] (2) 用 20 mL无菌 ddH 2 0冲洗柱子。

[0097] (3) 用 20 mL HEPES缓冲液平衡柱子。

[0098] (4) 将含有目标蛋白的上清液加入柱子中, 收集流穿液, 进行 SDS-PAGE检

[0099] (5) 分别以含 2 mM、 5 mM、 25 mM、 50 mM、 100 mM、 200 mM、 300 mM 和 500mM咪唑的洗脱液 (用 HEPES缓冲液稀释的咪唑溶液) 进行洗脱, 收集流 出液, 进行 SDS-PAGE检测。

[0100] SDS-PAGE检测结果显示用含 50 mM和 100 mM咪唑的洗脱液进行洗脱吋, 获得 较纯的蛋白 (图 4) 。 用 lOkDa的超滤浓缩管浓缩该较纯的蛋白溶液至 2.5 mL后 , 用 GE Healthcare的 PD-10脱盐柱 (货号为 17-0851-01) 对浓缩后的蛋白溶液进 行脱盐处理, 具体操作如下:

[0101] (1) 用 10 mL平衡缓冲液平衡柱子, 弃废液, 重复 4次。

[0102] (2) 加入 2.5 mL蛋白液至完全浸入柱子, 弃废液。

[0103] (3) 加入 3.5mL洗脱液并收集流出液 (该流出液即为完成脱盐处理的蛋白溶液

) -80°C保藏备用。

[0104] 实施例 3 AuOS蛋白的功能分析

[0105] 为了确定 AuOS蛋白的功能, 以美国 Sigma- Aldrich公司的 DMAPP (二甲基烯丙 基焦磷酸) 、 GPP (香叶基焦磷酸) , FPP (法尼基焦磷酸) 和 GGPP (香叶基 香叶基焦磷酸) 为底物, 分别添加 IPP (异戊烯焦磷酸) 来设计体外反应。 反应 体系 (50 μϋ : 220 μΜ DMAPP (或 GPP、 FPP、 GGPP) , 340 μΜ ΙΡΡ , 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) 、 2 mM DTT (二硫苏糖醇) 、 5 mM MgCl 2 和 9.4 μΜ AuOS , 30 °。反应3 1。 反应结束后, 用等体积乙酸乙酯萃取 3次, 用氮吹仪将有机溶剂 吹干, 50 乙酸乙酯溶解后进行 GC-MS (气相色谱-质谱) 检测。 检测结果如下

( 1 ) 以 DMAPP和 ΙΡΡ为底物按照上述反应体系进行体外反应, 反应产物用上 述方法处理后进行 GC-MS检测, 检测结果: 通过分析色谱图, 在 T=16.986 min吋 检测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰, 通过分析质谱图, 得到蛇孢假壳素 类化合物母核的特征质荷比 (Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al.

Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3),

594-597) (如 m/z=55、 69、 81、 95、 121、 135、 147、 229、 247、 325、 358等) , 色谱图如图 5所示, 质谱图如图 6所示。

(2) 以 FPP和 IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应, 反应产物用上述方 法处理后进行 GC-MS检测, 检测结果: 通过分析色谱图, 在 T=16.974 min吋检测 到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰, 通过分析质谱图, 得到蛇孢假壳素类化 合物母核的特征质荷比 (Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al.

Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3),

594-597) (如 m/z=55、 69、 81、 95、 121、 135、 147、 229、 247、 325、 358等) , 色谱图如图 7所示, 质谱图如图 8所示。

(3) 以 GPP和 IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应, 反应产物用上述方 法处理后进行 GC-MS检测, 检测结果: 通过分析色谱图, 在 T=16.983 min吋检测 到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰, 通过分析质谱图, 得到蛇孢假壳素类化 合物母核的特征质荷比 (Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al.

Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3),

594-597) (如 m/z=55、 69、 81、 95、 121、 135、 147、 229、 247、 325、 358等 , 色谱图如图 9所示, 质谱图如图 10所示。

(4) 以 GGPP和 IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应, 反应产物用上述 方法处理后进行 GC-MS检测, 检测结果: 通过分析色谱图, 在 T=16.978 min吋检 测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰, 通过分析质谱图, 得到蛇孢假壳素类 化合物母核的特征质荷比 (Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al.

Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3),

594-597) (如 m/z=55、 69、 81、 95、 121、 135、 147、 229、 247、 325、 358等) , 色谱图如图 11所示, 质谱图如图 12所示。

[0110] 以上结果表明 AuOS蛋白能用 DMAPP、 GPP、 FPP和 GGPP这 4种化合物为底物

, 分别添加 IPP吋合成蛇孢假壳素类化合物的母核。 由此可知 AuOS蛋白同吋具有 催化底物链长延伸和结构环化的功能, 能够以 DMAPP从头合成 C5-C8-C5骈环母 核结构。

序列表自由内容

[0111] SEQUENCE LISTING

[0112]

[0113] <110>武汉大学

[0114]

[0115] <120>一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基 AuOS及其应用

[0116]

[0117] <130> 1

[0118]

[0119] <160> 5

[0120]

[0121] <170> Patentln version 3.5

[0122]

[0123] <210> 1

[0124] <211> 2350 [0125] <212> DNA

[0126] <213> Aspergillus ustus

[0127]

[0128] <400> 1

[0129] atggagtata agtactcgac catcgtcgac agttccaagt gggaccccga gggcctgatc 60 [0130]

[0131] gaggggatcc ctctgcggaa gcacgaagcc ggggacctgg aagaggtcgg ttcgttccgg 120 [0132]

[0133] gtccaggagg actggcgccg cctggtcggg cccgtggaga atccgttccg gggctccctg 180 [0134]

[0135] ggacccgaga tcagtttcat cacatacacc gtgccggaat gtttgccgga gaggctagag 240 [0136]

[0137] gccatcagct atgggcttga ctatggcttc ctgcatgatg gtatgtcatg gttgctgctt 300

[0138]

[0139] gcctgtgcgc cgaacacgaa agctaacccg cccaccactc attcttttag acgagatcga 360 [0140]

[0141] cacgaaaatc gaagaggccg agctcgacga cgtcggcgca gccctggccc agggcggatc 420 [0142]

[0143] gaccggcaag atccaagagg ggaccaaatc ctcggggaag cgcaagatgg ccgcgcagct 480 [0144]

[0145] gctccgcgag atgatggccc tcgacccgga gcgggccatg acactggcca agagttgggc 540 [0146]

[0147] gcagggtgtg cagcactcgg ccagacgggt ggaggagaag gactggaagt cgcttgacga 600 [0148]

[0149] gtacatcccc ttccggtgta tggacctggg gtacatgcac tggcacgggc tggtgacctt 660 [0150]

[0151] tgggtgtgcg attaccgtcc ccgaggaaga ggaggaggag agacggacgc tcctcgagcc 720 [0152]

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[0293] <212> PRT

[0294] <213> Aspergillus ustus

[0295]

[0296] <400> 3

[0297]

[0298] Met Glu Tyr Lys Tyr Ser Thr He Val Asp Ser Ser Lys Tip Asp Pro

[0299] 1 5 10 15

[0300]

[0301]

[0302] Glu Gly Leu lie Glu Gly lie Pro Leu Arg Lys His Glu Ala Gly Asp

[0303] 20 25 30

[0304]

[0305]

[0306] Leu Glu Glu Val Gly Ser Phe Arg Val Gin Glu Asp Trp Arg Arg Leu

[0307] 35 40 45

[0308]

[0309]

[0310] Val Gly Pro Val Glu Asn Pro Phe Arg Gly Ser Leu Gly Pro Glu lie

[0311] 50 55 60

[0312]

[0313]

[0314] Ser Phe lie Thr Tyr Thr Val Pro Glu Cys Leu Pro Glu Arg Leu Glu

[0315] 65 70 75 80

[0316]

[0317]

[0318] Ala lie Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr Gly Phe Leu His Asp Asp Glu lie

[0319] 85 90 95

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[0350] Glu Glu Arg Arg Thr Leu Leu Glu Pro Ala Val lie Ala Cys Leu Met [0351] 210 215 220

[0352]

[0353]

[0354] Thr Asn Asp Leu Phe Ser Tyr Glu Lys Glu Lys Asn Asp Asn Asn Pro [0355] 225 230 235 240

[0356]

[0357]

[0358] Gin Asn Ala Val Ala Val lie Met Lys lie His Lys Cys Ser Glu Glu [0359] 245 250 255

[0360]

[0361]

[0362] Glu Ala Arg Asp lie Cys Lys Gin Arg lie Arg Leu Glu Cys Arg Lys [0363] 260 265 270

[0364]

[0365]

[0366] Tyr Ala Arg lie Val Lys Glu Thr Leu Ala Arg Thr Asp lie Ser Leu [0367] 275 280 285

[0368]

[0369]

[0370] Asp Leu Lys Arg Tyr lie Glu lie Met Gin Tyr Thr Val Ser Gly Asn [0371] 290 295 300

[0372]

[0373]

[0374] Trp Ala Trp Ser Thr Gin Cys Pro Arg Tyr His Ala Asp Ala Lys Phe [0375] 305 310 315 320

[0376] [ ονο]

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[0406] Leu Pro Ser Lys Gly Phe Arg Asp Gin Ala lie Asp Ser Leu Asn Thr

[0407] 435 440 445

[0408]

[0409]

[0410] Trp Leu Arg Val Pro Thr Lys Thr Thr Lys Met lie Lys Asp Val lie

[0411] 450 455 460

[0412]

[0413]

[0414] Lys Met Leu His Ser Ala Ser Leu Met Leu Asp Asp lie Glu Asp Asn

[0415] 465 470 475 480

[0416]

[0417]

[0418] Ser Pro Leu Arg Arg Gly Lys Pro Ser Thr His Val lie Tyr Gly Asn

[0419] 485 490 495

[0420]

[0421]

[0422] Ala Gin Thr lie Asn Ser Ala Thr Tyr Gin Tyr Thr Glu Ala Thr Gly

[0423] 500 505 510

[0424]

[0425]

[0426] Leu Ala Ala Arg Leu Pro Asn Pro Thr Ser Leu Arg lie Tyr Leu Glu

[0427] 515 520 525

[0428]

[0429]

[0430] Glu Val Gin Gin Leu Tyr lie Gly Gin Ser Tyr Asp Leu Tyr Trp Thr

[0431] 530 535 540

[0432] [0433]

[0434] His Asn Ala Leu Cys Pro Ser lie Pro Glu Tyr Leu Lys Met Val Asp

[0435] 545 550 555 560

[0436]

[0437]

[0438] Gin Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Met Leu Thr Arg Leu Met Val Ser

[0439] 565 570 575

[0440]

[0441]

[0442] Glu Ser Pro Ala Arg Ser Ser lie Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Pro Leu

[0443] 580 585 590

[0444]

[0445]

[0446] Ser His Leu lie Gly Arg Phe Phe Gin lie Arg Asp Asp Tyr Gin Asn

[0447] 595 600 605

[0448]

[0449]

[0450] Leu Ala Ser Ala Glu Tyr Ala Arg Gin Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Leu

[0451] 610 615 620

[0452]

[0453]

[0454] Asp Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Thr Leu lie His Cys lie Asn Thr Leu

[0455] 625 630 635 640

[0456]

[0457]

[0458] Glu Ala Glu Ala Ser Leu Ala Ser Glu Lys Met Ala Leu Arg Ala Phe

[0459] 645 650 655

[0460] [0461]

[0462] Leu lie Lys Arg Arg Val Asp Ser Ser Leu Ser Asn Glu Ser Lys Arg

[0463] 660 665 670

[0464]

[0465]

[0466] Glu Val Leu Asp lie Met Lys Lys Thr Lys Ser Leu Glu Tyr Thr Leu

[0467] 675 680 685

[0468]

[0469]

[0470] Gly Val Leu Arg Ala Leu Gin Ala Glu Leu Glu Lys Glu Val Asp Ser

[0471] 690 695 700

[0472]

[0473]

[0474] Leu Glu Ala Lys Phe Gly Glu Glu Asn Phe Ser Leu Arg Met Met Leu

[0475] 705 710 715 720

[0476]

[0477]

[0478] Glu Leu Leu Lys Val

[0479] 725

[0480]

[0481]

[0482] <210> 4

[0483] <211> 27

[0484] <212> DNA

[0485] <213> Artificial Sequence

[0486]

[0487] <220>

[0488] <223>正向引物 AuOS-F [0489]

[0490] <■> 4

[0491] catatgatgg agtataagta ctcgacc

[0492]

[0493]

[0494] <210> 5

[0495] <211> 26

[0496] <212> DNA

[0497] <213> Artificial Sequence

[0498]

[0499] <220>

[0500] <223>反向引物 AuOS-R

[0501]

[0502] <■> 5

[0503] aagctttcaa accttcagca gctcca

[0504]