Optische Anordnung zur Beleuchtung und/oder Beobachtung eines Objektes

Die Erfindung bezieht sich auf eine optische Anordnung zur Beleuchtung und/oder Beobachtung eines Objektes, nutzbar als Immersionskondensor im Zusammenhang mit Immersionsmedi- en, die eine Brechzahl n _e > 1 haben, insbesondere zur Anwendung in Mikroskopen mit einer Aperturblende zum Einstellen der gewünschten Beleuchtungs- bzw. Beobachtungsapertur.

Die stetig wachsenden Anforderungen an die Beleuchtung und/oder Beobachtung von Objekten, insbesondere in der Mikroskopie, erfordern optischen Anordnungen, die definierte Beleuchtungsverhältnisse für ein möglichst großes Spektrum an Objekten schaffen und außerdem die verschiedenartigsten Kontrastverfahren zur Beobachtung nutzbar machen können.

Des weiteren ist es erforderlich, die Beleuchtungs- bzw. Beobachtungssysteme so auszubilden, daß bei einer der jeweiligen Beobachtungsaufgabe angepaßten Brennweite die Aperturblendenebene gut zugänglich ist und auch eine hinreichend gute Leuchtfeldblendenabbildung erfolgt.

Mittels Aperturblenden und Leuchtfeldblenden lassen sich dann sowohl die Beleuchtungsapertur als auch die Größe des beleuchteten Feldes an das jeweils benutzte Objektiv anpassen. Dieses auch als Köhlersche Beleuchtung bezeichnete Prinzip ist im Stand der Technik bekannt und wird im Zusammenhang mit Trockenkondensoren und ölimmersionskondensoren zur Beobachtung dünner Proben eingesetzt.

öl als Immersionsmedium beispielsweise erlaubt es, die Beleuchtungsapertur zu erhöhen und bei relativ transparenten

Proben das Auflösungsvermögen zu steigern. Nachteiligerweise besitzen Immersionsöle eine relativ niedrige Oberflächenspannung, so daß ölsäulen bis etwa 0,4 mm gerade noch möglich sind. Damit kann maximal bis zu diesen 0,4 mm in das zu beobachtende Präparat hineinfokussiert werden, um in diesen Tiefen die notwendigen klar definierten Beleuchtungsverhältnisse zu erzielen.

Voraussetzung dafür ist jedoch weiterhin, daß die Brechzahl der Probensubstanz nicht zu weit unter der Brechzahl des Immersionsöles liegt und die Leuchtfeldblendenabbildung von hinreichend guter Qualität ist. Dem steht gegenüber, daß in zunehmendem Maße lebende Zellen und Gewebeschnitte in physiologisch wäßrigem Medium untersucht werden. Das heißt die Brechzahl des Immersionsöles ist für solche Anwendungsfälle zu hoch.

Es sei angemerkt, daß im Rahmen dieser Erfindungsbeschreibung die Begriffe Objekt, Probe und Probensubstanz als Synonyme zu verstehen sind.

Insbesondere bei solchen biologischen Proben, bei denen Wert auf die Beobachtung biologischer Funktionen gelegt wird, ist es notwendig, die Zellen in ihrer dreidimensionalen Umgebung zu belassen, damit sie auch während der Dauer der Beobachtung ihre natürlichen Funktionen möglichst gut weiter ausüben. Dabei weisen die Proben allerdings eine verhältnismäßig große Dicke auf, beispielsweise mehrere 100 μm, und die Brechzahlen des Cytoplasmas und anderer Zellbestandteile liegen weniger bei der Brechzahl der Immersionsöle, sondern eher in der Nähe der Brechzahlen von Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder Glycerin.

Hinzu kommt, daß ein großer Arbeitsabstand zwischen der Frontoptik einer optischen Anordnung zur Beleuchtung bzw. Beobachtung der Trägerplatte, auf der die Probe aufgebracht ist, wünschenswert ist, um innerhalb einer so dicken Probe fokussieren zu können.

Nachteiligerweise erfüllen die im Stand der Technik verfügbaren optischen Anordnungen zur Beleuchtung bzw. Beobachtung von Proben nicht oder nur ungenügend die Anforderungen einer großen Apertur bei zugleich großem Arbeitsabstand.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine optische Anordnung der eingangs genannten Art zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik behebt und sowohl über eine große Apertur verfügt als auch einen großen Arbeitsabstand ermöglicht.

Die erfindungsgemäß vorgeschlagene optische Anordnung weist eine maximale Apertur NA > 1.0 und einen Arbeitsabstand AA > 1 mm auf und ist zur Verwendung mit einem Immersionsmedium mit einer Brechzahl n _e > 1 ausgebildet.

Sie besteht in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung aus zwei Linsengruppen, von denen

- eine erste Linsengruppe bildseitig angeordnet ist und eine Gruppenbrennweite Fi im Bereich von -100 mm bis +50 mm hat, und

- die zweite Linsengruppe objektseitig angeordnet ist und eine Gruppenbrennweite F ₂ im Bereich von +50 mm bis +3 mm besitzt.

In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung sind die Abstände zwischen der ersten Linsengruppe und der zweiten Linsengruppe zwecks Anpassung an unterschiedliche Immersionsmedien variabel.

Als Immersionsmedien können vorteilhaft Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder Glycerin bzw. Glycerin-Wasser- Gemische Anwendung finden, wobei ein beliebig genaues Angleichen der Brechzahl des Immersionsmediums an die mittlere Brechzahl der Probe möglich ist.

Auf diese Weise kann bei nahezu unverändert hoher Abbildungsqualität beliebig weit in die Probe hinein fokussiert werden. Die Beleuchtungsbündel werden lediglich durch intransparente Strukturen in der Probe gestört, d.h. in der Regel gebeugt, was aber für eine Abbildung der Strukturen unabdingbar ist.

Ein wesentlicher weiterer Vorteil besteht darin, daß sich bei Nutzung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung im Zusammenhang mit den vorgenannten Immersionsmedien Abbildungsfehler vermeiden lassen, welche beispielsweise bedingt sind durch sphärische Fehler, die bei Durchgang der Beleuchtungsbündel durch einen dicken Raum mit einer Brechzahl auftreten, die verschieden ist von der Brechzahl des Immersionsmediums. Damit ist es zugleich möglich, den Kontrast der Abbildung zu steigern. Eine Verwaschung des Leuchtfeldblendenbildes wird vermieden.

Der Vorteil der Verwendung von Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder Glycerin bzw. von Glycerin-Wasser- Gemischen gegenüber der Verwendung von öl als Immersionsmedium ist auch dadurch begründet, daß die Oberflächenspan-

nung von Wasser höher ist als die von öl und dadurch auch größere Wassersäulen möglich sind, bevor es zu einem Abreißen des Immersionsfilmes kommt.

Der so erzielbare größere Arbeitsabstand zwischen einem Trägerglas für die Probe und der Frontlinsenfassung eines Beleuchtungs- und Beobachtungssystems erlaubt es, variabel tief in dicke Proben hineinzufokussieren, womit es auch möglich ist, die Detektionseffizienz bei sogenannter ,,NDD" (Non-Descanned-Detection) zu erhöhen.

Hierbei wird mit einem gepulsten Infrarotlaser die Probe beleuchtet, was (in der Regel) zu einer 2-Photonenanregung eines Fluoreszenzfarbstoffes führt. Die 2-Photonenanregung ist ein nichtlinearer optischer Prozeß, für den nur im Fokus und während des Pulses der Laserstrahlung ausreichend hohe Energiedichten vorhanden sind. Das Wissen, wo sich dieser Fokus gerade befindet, wird zur Rekonstruktion von Bildern der jeweils beobachteten Probe genutzt. Dazu muß das Fluoreszenzlicht möglichst vollständig eingesammelt werden. Das gelingt nur dann, wenn Beleuchtungs- und Beobachtungssysteme mit einer so hohen Apertur und einer so großen Eingangsschnittweite des lichtsammelnden Systems zur Verfügung stehen, daß Licht überhaupt erst aus den Regionen der Probe erfaßt werden kann, in denen die Fluoreszenzphotonen emittiert werden. Mit der erfindungsgemäßen optischen Anordnung wird diese Forderung erfüllt.

Nachfolgend werden konkrete Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen optischen Anordnung beschrieben.

So ist bevorzugt vorgesehen, daß die erste Linsengruppe als ein Kittglied ausgebildet ist, das aus einer Linse positi-

ver und einer Linse negativer Brechkraft besteht, während die zweite Linsengruppe aus einer Einzellinse und einer Linsenuntergruppe zusammengesetzt ist.

Vorteilhaft ist die Einzellinse der zweiten Linsengruppe als Asphäre ausgebildet, und die Linsenuntergruppe umfaßt eine Mutterkugel und eine Füllkugel.

Das zu beobachtende Objekt ist auf ein Trägerglas aufgebracht, und es ist ein Immersionsmedium mit einer Brechzahl n _e im Bereich von 1.01 bis 1.51 vorhanden. Besonders vorteilhaft ist Wasser als Immersionsmedium vorgesehen.

Dabei sollte die Brechzahl n _e des Glases, aus dem die Füllkugel besteht, zwischen der Brechzahl n _e des Immersionsmediums und der Brechzahl n _e des Glases liegen, aus dem die Mutterkugel gefertigt ist.

Die Aperturblende kann zwischen der ersten Linsengruppe und der zweiten Linsengruppe angeordnet sein. Im Rahmen der Erfindung liegt es jedoch auch, je nach konkretem Optikdesign die Aperturblende in anderen, ebenfalls geeigneten Lufträumen zwischen den Linsen oder ganz am Ende der optischen Baugruppen anzuordnen.

Außerdem umfaßt die Erfindung auch Ausgestaltungen, bei denen nicht nur die Abstände zwischen den Linsengruppen, sondern auch die Abstände zwischen den Linsengruppen und der Aperturblende variabel sind.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines konkreten Ausführungsbeispieles näher erläutert werden.

Wie aus der zur Erläuterung dienenden Zeichnung (Fig.) ersichtlich ist, sind eine bildseitig angeordnete erste Linsengruppe 1 und eine objektseitig angeordnete zweite Linsengruppe 2 vorhanden. Zwischen der Linsengruppe 1 und der Linsengruppe 2 ist eine Aperturblende 3 angeordnet.

Die erste Linsengruppe 1 ist als Kittglied ausgebildet und besteht aus einer Linse 1.1 mit negativer und aus einer Linse 1.2 mit positiver Brechkraft.

Die zweite Linsengruppe 2 besteht aus einer Einzellinse 2.1 und einer Linsenuntergruppe 2.2. Die Einzellinse 2.1 ist als Asphäre ausgebildet. Die Linsenuntergruppe 2.2 umfaßt eine Mutterkugel 2.21 und eine Füllkugel 2.22.

Eine zu beobachtende Probe 4 ist auf ein Trägerglas 6 aufgebracht. Als Immersionsmedium 5 ist hier beispielsweise Wasser vorgesehen.

Die Konstruktionsdaten für die Radien r der optisch wirksamen Lichtaustritts- und Lichteintrittsflächen, die Glasdik- ken d, die Luftabstände a, die Glassorten, die Brechzahlen n _e und freien Durchmessern FRD sind in nachfolgender Tabelle angegeben.

Vorteilhafterweise liegt die Brechzahl der Glassorte, aus welcher die Füllkugel 2.22 besteht, zwischen der Brechzahl n _e des Immersionsmediums 5 und der Brechzahl n _e der Glassorte, aus der die Mutterkugel 2.21 gefertigt ist.

Die mit dieser optischen Anordnung erzielte maximale Apertur liegt bei 1.2, und das maximale Feld, welches beleuchtbar ist, hat einen Durchmesser von 2 mm. Der Arbeitsabstand AA liegt bei 2 mm.

Zwecks Anpassung der optischen Anordnung an unterschiedliche Immersionsmedien kann vorgesehen sein, daß mindestens einer der in der vorstehenden Tabelle angegebenen Luftabstände a variabel ist.

Denkbar ist es weiterhin, diese optische Anordnung zur Beleuchtung und/oder Beobachtung der Probe 4 als Multi- Immersions-LD-Kondensor auszubilden, wobei LD für „Long Working Distance" steht. Damit ist es möglich, stufenlos zwischen verschiedenen Immersionsmedien, wie Wasser und Glycerin, hin- und herzuwechseln.

Mit Mischungen aus diesen beiden Immersionsmedien ist ein perfektes „Indexmatching" möglich, das heißt ein beliebig genaues Angleichen der Brechzahl n _e des Immersionsmediums 5 an die mittlere Brechzahl n _e der Probe 4.

Besonders vorteilhaft ist ein solcher Immersions-LD- Kondensor in Verbindung mit LD-Wasserobjektiven nutzbar. Damit läßt sich eine simultane Fokussierung bei Durchbewegung der Probe durch den gemeinsamen Fokus von Beleuchtungssystem und Beobachtungssystem erzielen.

Bezugszeichenliste

1 Linsengruppe

1. 1, 1.2 Linse

2 Linsengruppe

2. 1 Einzellinse _{l C} 2N. 2 Linsenuntergruppe

2. 21 Mutterkugel

22 Füllkugel

3 Aperturblende

4 Probe

5 Immersionsmedium

6 Trägerglas

AA Arbeitsabstand a Luftabstände